CN111850050A - 一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法 - Google Patents

Abstract

一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法，属于基因工程技术领域。针对现有多轮基因编辑方法费时费力的问题，本发明提供了一种基因编辑工具，包括如下三种sgRNA表达母质粒：pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒，其中，每种母质粒除能表达用于编辑目的基因的sgRNA外，还能表达靶向另外两种母质粒中的一种的sgRNA；在实施基因编辑过程中，由上述三种母质粒构建的基因编辑质粒循环使用时，宿主细胞中先使用的基因编辑质粒或筛选标记被后使用的基因编辑质粒所消除。本发明缩短了编辑周期、加快了多轮基因编辑速度，更少的培养次数还可以减少基因组自发突变的可能。

Description

一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法。

背景技术

基因编辑被广泛地应用到多种物种的改造，被广泛地应用于基础科研以及应用研究。比如通过基因编辑的手段，大量满足不同需求的菌株被成功构建。经典的细菌基因编辑方法是通过噬菌体来源的重组酶(如λRed，RecET)介导的同源重组完成的。这种方案一般包括两个步骤。第一步，同源片段被重组进特定基因组位置，但是由于重组效率低，在此步骤必须同时引入筛选标记。第二步，去除第一步中的筛选标记，从而在多轮基因编辑中重复使用相同的筛选标记。在第二步中，尽管已有多种去除方法，但是去除效率都不是100％，因此需要挑取单克隆进行分离以及验证。这些使得现有方法费时费力。

近几年CRISPR/Cas方法也被广泛地应用到多种物种的基因编辑，其中包括多种细菌的基因组改造。Cas蛋白的高效核酸酶活性导致基因组形成双链断裂，形成了一个强大的负筛，仅有重组成功的细胞才能存活，因此这种方法仅需要一次重组。但是由于在编辑不同基因时，需要引入不同的sgRNA(即sgRNA表达模块的引入也需要筛选标记)，因此在完成一轮基因编辑之后，需要去除旧的sgRNA表达质粒，然后引入新的sgRNA表达质粒。目前的质粒去除方法也无法保证100％的效率，依然需要挑单克隆进行纯化并验证。

因此现有技术方案中，都需要筛选标记的去除或者质粒的消除步骤，而且由于消除效率不是100％，还需要额外的挑单克隆和验证步骤，这不仅费时费力，而且额外培养次数还增大了基因组自发突变的风险。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种免质粒消除的多轮基因编辑方法，能够解决现有多轮基因编辑方法费时费力(需要额外筛选标记去除或者质粒消除步骤)的问题。

为了解决上述技术问题，本发明基于CRISPR/Cas9系统，设计三个版本的sgRNA表达母质粒(pRock系列、pPaper系列和pScissors系列)，每种质粒除能表达sgRNA(sgRNA-editing)用于基因编辑外，额外表达能够靶向另外一种质粒的sgRNA(sgRNA-curing)，从而具有互相循环消除的特性：在实施基因编辑的同时，pRock系列能消除pScissors系列，pPaper系列消除pRock系列，pScissors系列能消除pPaper系列。具体技术方案如下：

一种基因编辑工具，包括如下三种sgRNA表达母质粒，分别为pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒，其中，每种母质粒除含有表达用于编辑目的基因的sgRNA外，还含有表达靶向另外两种母质粒中的一种的sgRNA；在实施基因编辑过程中，由上述三种母质粒构建的基因编辑质粒循环使用时，宿主细胞中先使用的基因编辑质粒或筛选标记被后使用的基因编辑质粒所消除。

在本发明的一个实施例中，所述pRock系列母质粒携带四环素抗性基因表达模块以及用于质粒消除的引导RNA，所述引导RNA靶向pScissors系列母质粒中阿普拉霉素抗性基因编码区GATGGGCAGGTACTTCTCCT序列；所述四环素抗性基因表达模块正义链的5’端和反义链的5’两端分别带有TCAACCCAGTCAGCTCCTTCAGG和TCAACCCAGTCAGCTCCTTCTGG序列；

所述pPaper系列母质粒携带氯霉素抗性基因表达模块以及用于质粒消除的引导RNA，所述引导RNA靶向pRock系列质粒中四环素抗性基因编码区TCAACCCAGTCAGCTCCTTC序列；所述氯霉素抗性基因表达模块正义链的5’端和反义链的5’两端分别带有TCGCAAGATGTGGCGTGTTAAGG和TCGCAAGATGTGGCGTGTTATGG序列；

所述pScissors系列母质粒携带阿普拉霉素抗性基因表达模块以及用于质粒消除的引导RNA，所述引导RNA靶向pPaper系列质粒中氯霉素抗性基因编码区TCGCAAGATGTGGCGTGTTA序列；所述阿普拉霉素抗性基因表达模块正义链的5’端和反义链的5’两端分别带有GATGGGCAGGTACTTCTCCTAGG和GATGGGCAGGTACTTCTCCTTGG序列。即，每个系列质粒的被靶向序列(RPS-tag)在抗性基因表达模块两侧各被额外重复一次(位于不同DNA链，使用不同PAM序列)，从而提高消除效率。

在本发明的一个实施例中，所述pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒均包含序列TCTGCTAATCCTGTTACCAGTGG。这段序列为被靶向序列，使得所有质粒可以被已有技术方案中pCas消除。

在本发明的一个实施例中，每种母质粒中用于质粒消除的引导RNA的启动子为PlacIQ，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；用于编辑目的基因的sgRNA的启动子为J23119，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；每种母质粒中用于质粒消除的引导RNA表达模块与用于编辑目的基因的sgRNA表达模块在质粒中分别被复制起始序列和抗性基因表达模块隔开，隔开的目的在于减少同源重组；所述复制起始序列核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一个实施例中，所述pRock系列母质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述pPaper系列母质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述pScissors系列母质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了上述的基因编辑工具的制备方法，步骤如下：

(1)共同模板质粒pRPS的构建：

将用于消除质粒的引导RNA框架表达模块、复制起始序列p15A与壮观霉素抗性基因表达模块连接后转化大肠杆菌，经筛选鉴定后提取获得重组质粒，记为pRPS质粒；

(2)pRock系列母质粒构建：

a.抗性替换：以步骤(1)获得的pRPS质粒为模板，扩增获得除壮观霉素抗性基因之外的序列；以pSB1T3质粒为模板，扩增获得四环素抗性基因表达模块；上述两个扩增片段连接后转化大肠杆菌，筛选后提取获得具有四环素抗性的质粒，记为pRPS-T质粒；

b.靶向序列引入：将寡核苷酸BsaI-G.S35F，序列为5’cgccgatgggcaggtacttctcct3’与BsaI-G.S35R，序列为5’aaacaggagaagtacctgcccatc3’进行等摩尔浓度比例混合，以0.1℃/s的速度从98℃缓慢降温到16℃，得到的产物与BsaI酶切后的pRPS-T质粒连接，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，记为pRPS-TkG质粒；

c.用于目的基因编辑的sgRNA框架引入：以pTarget质粒为模板，扩增得到用于编辑目的基因的sgRNA表达模块，插入到所述pRPS-TkG质粒中，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，即为pRock系列母质粒；

(3)pPaper系列母质粒构建：

a.抗性替换：以步骤(1)获得的pRPS质粒为模板，扩增获得除壮观霉素抗性基因之外的序列；以pSB1C3质粒为模板，扩增获得氯霉素抗性基因表达模块；上述两个扩增片段连接后转化大肠杆菌，筛选后提取获得具有氯霉素抗性的质粒，记为pRPS-C质粒；

b.靶向序列引入：将寡核苷酸BsaI-T.S53F，序列为5’cgcctcaacccagtcagctccttc3’与BsaI-T.S53R，序列为5’aaacgaaggagctgactgggttga3’进行等摩尔浓度比例混合，以0.1℃/s的速度从98℃缓慢降温到16℃，得到的产物与BsaI酶切后的pRPS-C质粒利用DNA连接，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，记为pRPS-CkT质粒；

c.用于目的基因编辑的sgRNA框架引入：以pTarget质粒为模板，扩增得到用于编辑目的基因的sgRNA表达模块；插入到所述pRPS-CkT质粒中，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，即为pPaper系列母质粒；

(4)pScissors系列母质粒构建

a.抗性替换：以步骤(1)获得的pRPS质粒为模板，扩增获得除壮观霉素抗性基因之外的序列；以pMDIAI质粒为模板，扩增获得阿普拉霉素抗性基因表达模块；上述两个扩增片段连接后转化大肠杆菌，筛选后提取获得具有阿普拉霉素抗性的质粒，记为pRPS-G质粒；

b.靶向序列引入：将寡核苷酸BsaI-C.S15F，序列为5’cgcctcgcaagatgtggcgtgtta3’与BsaI-C.S15R，序列为5’aaactaacacgccacatcttgcga3’进行等摩尔浓度比例混合，以0.1℃/s的速度从98℃缓慢降温到16℃，得到的产物与BsaI酶切后的pRPS-G质粒连接，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，记为pRPS-GkC质粒；

c.用于目的基因编辑的sgRNA框架引入：以pTarget质粒为模板，扩增得到用于编辑目的基因的sgRNA表达模块，插入到所述pRPS-GkC质粒中，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，即为pScissors系列母质粒。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所述用于消除质粒的引导RNA框架表达模块的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；扩增所用的引物为H-KX-F：5’cttattaatcagataaaatattccactggtaacagg3’和引物KX-R：5’ccagtcgattggctgagc3’；

所述复制起始序列p15A，是以pBAD30质粒为模板，以引物H-P15AF：5’ctcgagatatcaagcttcgctagcggagtgtatac3’和引物P15AR：5’aatattttatctgattaataagatgatcttcttg3’扩增获得的；

所述壮观霉素抗性基因表达模块以pTarget质粒为模板，以引物SpecR：5’gagctcagccaatcgactgg3’和引物H-Spec-F：5’gcgaagcttgatatctcgagttcatgtgcagc3’扩增获得的。

在本发明的一个实施例中，步骤(2)中a所述的扩增获得四环素抗性基因表达模块所用的引物为H-V2T-F：5’gaagcttgatatctcgagtcaacccagtcagctccttcaggctcgagattctcatgtttgacagc3’和H-V2T-R：5’cgactggcgagcggcatctcaacccagtcagctccttctggttaggtcgaggtggcccg3’；

步骤(2)中c所述的pRPS-TkG质粒，经引物VE-F：5’cgctagcggagtgtatac3’和VE-R：5’gaagcttgatatctcgag3’扩增，扩增产物经DpnI酶切，酶切产物与所述用于编辑目的基因的sgRNA表达模块经体外重组方法进行连接；

步骤(3)中a所述扩增获得氯霉素抗性基因表达模块所用的引物为H-V2C-F：5’gaagcttgatatctcgagtcgcaagatgtggcgtgttaaggctcgtgatacgcctatttttatagg3’和H-V2C-R：5’cgactggcgagcggcatctcgcaagatgtggcgtgttatggttacgccccgccctgcc3’；

步骤(3)中c所述pRPS-CkT质粒，经引物VE-F：5’cgctagcggagtgtatac3’和VE-R：5’gaagcttgatatctcgag3’扩增，扩增产物经DpnI酶切，酶切产物与所述用于编辑目的基因的sgRNA表达模块经体外重组方法进行连接；

步骤(4)中a所述扩增获得阿普拉霉素抗性基因表达模块所用的引物为H-V2G-F：5’gaagcttgatatctcgaggatgggcaggtacttctcctaggggatggatataccgaaaaaatcgc3’和H-V2G-R：5’cgactggcgagcggcatcgatgggcaggtacttctccttggttagccaatcgactggcg3’；

步骤(4)中c所述pRPS-GkC质粒、经引物VE-F：5’cgctagcggagtgtatac3’和VE-R：5’gaagcttgatatctcgag3’扩增，扩增产物经DpnI酶切，酶切产物与所述用于编辑目的基因的sgRNA表达模块经体外重组方法进行连接；

步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中所述以步骤(1)获得的质粒pRPS为模板，扩增获得除壮观霉素抗性基因表达模块之外的序列所用的引物为：

H-P15AF：5’ctcgagatatcaagcttcgctagcggagtgtatac3’和B0014-R：5’gatgccgctcgccagtcgattg3’；所述以pTarget质粒为模板，得到用于编辑目的基因的sgRNA表达模块所用的引物为：

H-J119F：5’ctcgagatatcaagcttcgttgacagctagctcagtcc3’和

H-gRNAR4：5’gtatacactccgctagcgctcgagtagggataacagg3’。

本发明还提供了上述的基因编辑工具在基因编辑中的应用。

本发明还提供了一种利用上述基因编辑工具进行多轮基因编辑的方法，步骤如下：

(1)起始步骤：准备含有pCas质粒的菌株，制备感受态；

(2)循环步骤：

a.根据待编辑的基因序列设计sgRNA，利用上述制备的基因编辑工具，获得用于编辑目的基因的pRock系列质粒、pPaper系列质粒或pScissors系列质粒，完成第一次基因编辑，获得重组菌；

b.鉴定阳性菌落，经培养后制备感受态细胞；

c.重复步骤a及b，制备下一个目的基因的基因编辑质粒，按照pRock系列质粒、pPaper系列质粒、pScissors系列质粒的三种质粒循环顺序向步骤b制备的感受态细胞中转入另外一种质粒，完成所述的下一个目的基因的编辑；

(3)结束步骤：完成所有基因编辑步骤后，IPTG诱导去除最后一个sgRNA表达质粒。

有益效果

本发明实现了快速多轮的基因编辑方法：按照pRock系列、pPaper系列、pScissors系列的循环使用顺序实施多轮基因编辑时，不需要单独的质粒消除步骤以及消除的确认步骤。在进行每一轮基因编辑的同时能够消除上一轮基因编辑的质粒，所挑取的基因编辑阳性克隆同时已经消除了上一轮的sgRNA表达质粒。本发明将每一轮基因编辑所需要的培养次数减少到两次，相比现有基因编辑技术(每轮基因编辑最少培养四次)，缩短了编辑周期、加快了多轮基因编辑速度(如图1所示)，同时减少基因组自发突变的可能。

定义和缩写：

Kan：卡那霉素。

Spec：壮观霉素。

Cm：氯霉素。

Tet：四环素。

Apm：阿普拉霉素。

HL：左同源臂。

HR：右同源臂。

GOI：感兴趣的基因。

sgRNA-curing：用于消除质粒的引导RNA。

sgRNA-editing：用于编辑目的基因的引导RNA。

focA-pflB基因：甲酸转运蛋白，丙酮酸甲酸裂解酶；CP009273(949065..949922,complement),CP009273(946728..949010,complement)。

atpFH基因：ATP合酶F0复合体亚基b，ATP合酶F1复合体亚基δ；CP009273(3913778..3914248,complement),CP009273(3913230..3913763,complement)。

poxB基因：丙酮酸氧化酶；(904787..906505,complement)。

frdBC基因：延胡索酸还原酶铁硫蛋白，延胡索酸还原酶膜蛋白亚基；CP009273(4369600..4370334,complement),CP009273(4369194..4369589,complement)。

adhE基因：乙醛乙醇脱氢酶；CP009273(1290902..1293577,complement)。

ldhA基因：乳酸脱氢酶；CP009273(1436111..1437100,complement)。

sucA基因：酮戊二酸脱氢酶；CP009273(754162..756963)。

附图说明

图1是本发明所述的基因编辑工具用于多轮基因编辑的原理示意图；

图2是本发明三种sgRNA表达质粒代表设计图(A)以及pPaper系列质粒构建流程代表图(B)；

图3是pPaper系列质粒消除pRock系列质粒测试结果；

图4是pScissors系列质粒消除pPaper系列质粒测试结果；

图5是pRock系列质粒消除pScissors系列质粒测试结果；

图6是pRock/pPaper/pScissors系列质粒构建流程；

图7是利用本发明进行连续多轮基因编辑流程图；

图8是利用本发明构建丙酮酸生产菌株示意图；A：代谢通路以及被编辑的基因B：菌株构建流程；C：基因敲除验证(每组中左侧泳道为野生型对照，右侧泳道为所构建菌株)；

图9是利用本发明构建的丙酮酸生产菌株摇瓶发酵结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

高保真DNA聚合酶PrimeSTAR和DNA连接试剂盒购自TaKaRa公司；快速PCR预混液RapidTaq Mix和多片段体外重组试剂盒(货号C115)购自Vazyme Biotech公司；提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自Omega Bio-tek公司；核酸内切酶DpnI和BsaI购自New England Biolabs公司；感受态制备试剂盒(货号B529303)和引物购自上海生工生物。相应的操作步骤按照产品说明书进行。

pCas、pTarget、pMDIAI质粒可从MolecularCloud获取：MC_0000011，MC_0000012，MC_0000009。

pSB1C3、pSB1T3质粒可以从iGEM元件库获得。

pBAD30：ATCC87401。

BW25113:CGSC#:7636。

LB培养基配方：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。固体培养基加入1.75％琼脂粉，相应抗生素添加浓度：卡那霉素25ng/ml，壮观霉素100ng/ml，氯霉素33ng/ml，四环素17ng/ml，阿普拉霉素100ng/ml。

实施例1.本发明所述基因编辑工具的制备方法。

本实施例中所述基因编辑工具，包括如下三种sgRNA表达质粒，分别为pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒，其中，每种母质粒除含有表达用于编辑目的基因的sgRNA框架外，还含有表达靶向另外两种母质粒中的一种的sgRNA；在实施基因编辑过程中，由上述三种母质粒构建的基因编辑质粒循环使用时宿主细胞中先使用的基因编辑质粒或筛选标记被后使用的基因编辑质粒所消除，下面举例描述其制备方法：

一、pRock、pPaper、pScissors共同模板质粒pRPS的构建。

1.扩增sgRNA-curing框架部分。

全基因合成序列，记为KX(包含可被pCas质粒消除的识别序列，PlacIQ-sgRNA-curing，B0014终止子)：

cttattaatcagataaaatattccactggtaacaggattagcagagcgagatcttggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgccagagaccaaagaggagaaaggatcccgggtctagaggtctccgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgcatgcaaataataaaaaagccggattaataatctggctttttatattctctctctagtatataaacgcagaaaggcccacccgaaggtgagccagtgtgagagctcagccaatcgactgg

以H-KX-F(5’cttattaatcagataaaatattccactggtaacagg3’)和KX-R(5’ccagtcgattggctgagc3’)为引物，用PrimeSTAR扩增并纯化。

2.扩增复制起始序列p15A。

以pBAD30质粒为模板，以H-P15AF(5’ctcgagatatcaagcttcgctagcggagtgtatac3’)和P15AR(5’aatattttatctgattaataagatgatcttcttg3’)为引物，用PrimeSTAR扩增并纯化。

3.扩增壮观霉素抗性部分。

以pTarget质粒为模板，以SpecR(5’gagctcagccaatcgactgg3’)和H-Spec-F(5’gcgaagcttgatatctcgagttcatgtgcagc3’)为模板，用PrimeSTAR扩增，DpnI酶切过夜后纯化。

4.多片段重组。

用体外多片段重组试剂盒，将以上三个片段重组，转化TOP10菌株，涂壮观霉素平板培养。挑菌培养，测序确认阳性保留，所得质粒记为pRPS。

二、pRock、pPaper、pScissors系列母质粒构建。

pRock、pPaper、pScissors系列质粒设计如图2中A所示，构建过程以pPaper系列为例如图2中B所示。pRock、pPaper、pScissors系列母质粒构建过程说明如下：

1.pRock系列母质粒构建

a.抗性替换：以pSB1T3质粒为模板，以H-V2T-F(5’gaagcttgatatctcgagtcaacccagtcagctccttcaggctcgagattctcatgtttgacagc3’)和H-V2T-R(5’cgactggcgagcggcatctcaacccagtcagctccttctggttaggtcgaggtggcccg3’)为引物，用PrimeSTAR扩增，DpnI酶切过夜后纯化。以步骤一所得质粒pRPS为模板，以H-P15AF(5’ctcgagatatcaagcttcgctagcggagtgtatac3’)和B0014-R(5’gatgccgctcgccagtcgattg3’)为模板，用PrimeSTAR扩增并纯化。这两个片段利用体外多片段重组试剂盒重组，转化TOP10涂四环素平板培养。挑菌培养，测序确认阳性保留，所得质粒记为pRPS-T。

b.靶向序列引入：用BsaI酶切pRPS-T，胶回收纯化。将寡核苷酸BsaI-G.S35F(5’cgccgatgggcaggtacttctcct3’)与BsaI-G.S35R(5’aaacaggagaagtacctgcccatc3’)进行等比例混合，以0.1℃/s的速度从98℃缓慢降温到16℃，将此产物与酶切后的pRPS-T利用DNA连接试剂盒进行连接，转化TOP10涂四环素平板培养。挑菌培养，测序确认阳性保留，所得质粒记为pRPS-TkG。

c.sgRNA-editing引入：以pTarget质粒为模板，以H-J119F(5’ctcgagatatcaagcttcgttgacagctagctcagtcc3’)和H-gRNAR4(5’gtatacactccgctagcgctcgagtagggataacagg3’)为引物，用PrimeSTAR扩增并纯化。以pRPS-TkG质粒为模板，以VE-F(5’cgctagcggagtgtatac3’)和VE-R(5’gaagcttgatatctcgag3’)为引物，用PrimeSTAR扩增，DpnI酶切过夜后纯化。这两个片段用体外多片段重组试剂盒重组，转化TOP10涂四环素平板培养。挑菌培养，测序确认阳性保留，所得质粒记为pRock，即pRock系列的母质粒。

2.pPaper系列母质粒构建。

a.抗性替换：以pSB1C3质粒为模板，以H-V2C-F(5’gaagcttgatatctcgagtcgcaagatgtggcgtgttaaggctcgtgatacgcctatttttatagg3’)和H-V2C-R(5’cgactggcgagcggcatctcgcaagatgtggcgtgttatggttacgccccgccctgcc3’)为引物，用PrimeSTAR扩增，DpnI酶切过夜后纯化。以步骤一所得质粒pRPS为模板，以H-P15AF(5’ctcgagatatcaagcttcgctagcggagtgtatac3’)和B0014-R(5’gatgccgctcgccagtcgattg3’)为模板，用PrimeSTAR扩增并纯化。这两个片段利用体外多片段重组试剂盒重组，转化TOP10涂氯霉素平板培养。挑菌培养，测序确认阳性保留，所得质粒记为pRPS-C。

b.靶向序列引入：用BsaI酶切pRPS-C，胶回收纯化。将寡核苷酸BsaI-T.S53F:(5’cgcctcaacccagtcagctccttc3’)与BsaI-T.S53R:(5’aaacgaaggagctgactgggttga3’)进行等比例混合，以0.1℃/s的速度从98℃缓慢降温到16℃，将此产物与酶切后的pRPS-C利用DNA连接试剂盒进行连接，转化TOP10涂氯霉素平板培养。挑菌培养，测序确认阳性保留，所得质粒记为pRPS-CkT。

c.sgRNA-editing引入：以pTarget质粒为模板，以H-J119F(5’ctcgagatatcaagcttcgttgacagctagctcagtcc3’)和H-gRNAR4(5’gtatacactccgctagcgctcgagtagggataacagg3’)为引物，用PrimeSTAR扩增并纯化。以pRPS-CkT质粒为模板，以VE-F(5’cgctagcggagtgtatac3’)和VE-R(5’gaagcttgatatctcgag3’)为引物，用PrimeSTAR扩增，DpnI酶切过夜后纯化。这两个片段用体外多片段重组试剂盒重组，转化TOP10涂氯霉素平板培养。挑菌培养，测序确认阳性保留，所得质粒记为pPaper，即pPaper系列的母质粒。

3.pScissors系列母质粒构建

a.抗性替换：以pMDIAI质粒为模板，以H-V2G-F(5’gaagcttgatatctcgaggatgggcaggtacttctcctaggggatggatataccgaaaaaatcgc3’)和H-V2G-R(5’cgactggcgagcggcatcgatgggcaggtacttctccttggttagccaatcgactggcg3’)为引物，用PrimeSTAR扩增，DpnI酶切过夜后纯化。以步骤一所得质粒pRPS为模板，以H-P15AF(5’ctcgagatatcaagcttcgctagcggagtgtatac3’)和B0014-R(5’gatgccgctcgccagtcgattg3’)为模板，用PrimeSTAR扩增并纯化。这两个片段利用体外多片段重组试剂盒重组，转化TOP10涂阿普拉霉素平板培养。挑菌培养，测序确认阳性保留，所得质粒记为pRPS-G。

b.靶向序列引入：用BsaI酶切pRPS-G，胶回收纯化。将寡核苷酸BsaI-C.S15F(5’cgcctcgcaagatgtggcgtgtta3’)与BsaI-C.S15R(5’aaactaacacgccacatcttgcga3’)进行等比例混合，以0.1℃/s的速度从98℃缓慢降温到16℃，将此产物与酶切后的pRPS-G利用DNA连接试剂盒进行连接，转化TOP10涂阿普拉霉素平板培养。挑菌培养，测序确认阳性保留，所得质粒记为pRPS-GkC。

c.sgRNA-editing引入：以pTarget质粒为模板，以H-J119F(5’ctcgagatatcaagcttcgttgacagctagctcagtcc3’)和H-gRNAR4(5’gtatacactccgctagcgctcgagtagggataacagg3’)为引物，用PrimeSTAR扩增并纯化。以pRPS-GkC质粒为模板，以VE-F(5’cgctagcggagtgtatac3’)和VE-R(5’gaagcttgatatctcgag3’)为引物，用PrimeSTAR扩增，DpnI酶切过夜后纯化。这两个片段用体外多片段重组试剂盒重组，转化TOP10涂阿普拉霉素平板培养。挑菌培养，测序确认阳性保留，所得质粒记为pScissors，即pScissors系列的母质粒。

实施例2.pRock、pPaper、pScissors互相消除结果测试。

1.pPaper消除pRock测试。

(1)转化pCas以及pRock系列母质粒于W3110菌株，获得菌株CasR。

(2)转化pPaper系列母质粒于CasR，分别取等量转化产物涂Kan+Cm以及Kan+Cm+Tet平板，对比获得pPaper消除pRock消除效果。如图3所示，pPaper能够有效消除pRock。

(3)转化实施例1获得的pRPS-C于CasR，分别取等量转化产物涂Kan+Cm以及Kan+Cm+Tet平板，对比获得无gRNA for curing的情况下的消除效果，即阴性对照。如图3所示，相较于pPaper，pRPS-C转化效率低且不能有效消除pRock，消除pRock的效率为26.07±27.02％.

pPaper消除pRock的效率高达99.99％(1-3/21200)。

2.pScissors消除pPaper测试。

(1)转化pCas以及pPaper于W3110菌株，获得菌株CasP。

(2)转化pScissors于CasP，分别取等量转化产物涂Kan+Apm以及Kan+Apm+Cm平板，对比获得pScissors消除pPaper消除效果。如图4所示，pScissors能够有效消除pPaper。

(3)转化实施例1获得的pRPS-G于CasP，分别取等量转化产物涂Kan+Apm以及Kan+Apm+Cm平板，对比获得无gRNA for curing的情况下的消除效果，即阴性对照。如图4所示，相较于pScissors，pRPS-G转化效率低且不能有效消除pPaper，消除效率为19.05％±11.38％。

pScissors消除pPaper的效率高达100％(1-0/17280)。

3.pRock消除pScissors测试。

(1)转化pCas以及pScissors于W3110菌株，获得菌株CasS。

(2)转化pRock于CasS，分别取等量转化产物涂Kan+Tet以及Kan+Tet+Apm平板，对比获得pRock消除pScissors消除效果。如图5所示，pRock能够有效消除pScissors。

(3)转化实施例1获得的pRPS-T于CasP，分别取等量转化产物涂Kan+Tet以及Kan+Tet+Apm平板，对比获得无gRNA for curing的情况下的消除效果，即阴性对照。如图5所示，相较于pRock，pRPS-T转化效率低且不能有效消除pScissors，消除效率为20.69％±16.70％

pRock消除pScissors的效率高达100％(1-0/20800)。

实施例3 pRock、pPaper、pScissors系列质粒的构建。

本发明所制备的基因编辑工具pRock、pPaper、pScissors系列母质粒可广泛用于目的基因的编辑实验，本实施例中以丙酮酸合成途径的相关基因为例，描述用本发明所制备的基因编辑工具构建基因编辑载体的方法。

具体pRock、pPaper、pScissors系列质粒按照图2设计。体系构建完成，新的质粒只需要从实施例1所获得的母质粒出发开始构建，分四个片段扩增，引物设计以及质粒构建按照体外多片段重组试剂盒说明书进行，流程如图6所示。以下分三个系列进行分别举例说明。

1.pRock系列质粒的构建。

以构建敲除E.coli BW25113中focA-pflB基因的pRock-Δ(focA-pflB)质粒为例说明如下：

(1)质粒骨架扩增。

以实施例1所得pRock质粒为模板，以TargetVF2(5’cctgttatccctactcgag3’)和TargetVR(5’actagtattatacctaggactgagc3’)为引物，用PrimeSTAR扩增，DpnI酶切过夜后纯化。

(2)sgRNA-editing扩增。

以pTarget质粒为模板，以H-KfocA-pflB-gF(5’cctaggtataatactagtctttcatctgacccagagcggttttagagctagaaatagca3’)和gRNAR5(5’gtaatagatctaagcttctgc3’)为引物，加粗的碱基为用于编辑目的基因的sgRNA的引导序列，用PrimeSTAR扩增并纯化。

(3)左右同源臂扩增。

以BW25113基因组为模板，以Pre_KfocA-pflBF(5’gttgcccatatcacgggtaaattcac3’)和Aft_KfocA-pflBR(5’tggaccgaatggacgatggagtttaac3’)为引物，用PrimeSTAR扩增并纯化。以此产物为模板，分别以H-KfocA-pflBHLF(5’gaagcttagatctattacgttcatctgtttgagatcgag3’)和KfocA-pflBHLR(5’taattagatttgactgaaatcgtacag3’)、H-KfocA-pflBHRF(5’ttcagtcaaatctaattagcggccgccacactaactctctctttattaagtc3’)和H-KfocA-pflBHRR(5’tcgagtagggataacaggtgcaatatctgaatgcgtttg3’)为引物，用PrimeSTAR扩增并纯化，分别获得左右同源臂片段。

(4)多片段体外重组。

按照体外多片段重组试剂盒说明，将以上四个片段进行重组，反应产物转化TOP10，涂四环素平板培养。以菌落为模板，以Y-Target2F(5’ctagatctttgacagctagctcagtcctaggtataatac3’)和P15A_endF(5’acatgaagcacttcactgac3’)为引物，用RapidTaq Mix进行菌落PCR验证，阳性菌落用引物P15A_endF(5’acatgaagcacttcactgac3’)、P15A_headR(5’cagaccaaaacgatctcaag3’)、TheadR2(5’cagaccaaaacgatctcaag3’)进行测序，确认正确保存，即获得用于focA-pflB基因敲除的质粒pRock-Δ(focA-pflB)。

按照以上类似的方法，构建用于atpFH基因敲除的质粒pRock-ΔatpFH和用于poxB敲除的pRock-ΔpoxB，其中：构建pRock-ΔatpFH质粒所引入的sgRNA-editing的引导序列为：5’gctgttagcagcttcatcca3’,左右同源臂扩增所用模板为BW25113基因组，左同源臂扩增所用引物为5’gaagcttagatctattactacctgtctgacggtcaccgatg 3’和5’agcgtacgcggtcgtcttgag3’，右同源臂扩增所用引物为：5’aagacgaccgcgtacgctgcggccgccacagcacaatgcctctatttag 3’和5’tcgagtagggataacaggtcattcctgtcaacttaatccttg 3’。

构建pRock-ΔpoxB质粒所引入的sgRNA-editing的引导序列为：5’cgccagatattgcgggtgaa3’,左右同源臂扩增所用模板为BW25113基因组，左同源臂扩增所用引物为5’gaagcttagatctattactcaacatgcagcgccagattg3’和5’ggcgaaaacaaactggctaagg3’，右同源臂扩增所用引物为：5’agccagtttgttttcgccgcggccgccatggttctccatctcctgaatg3’和5’tcgagtagggataacaggtggcagaaaataacgttaccgaag3’。

2.pPaper系列质粒的构建。

以构建敲除E.coli BW25113中frdBC基因的pPaper-ΔfrdBC质粒为例说明如下：

(1)质粒骨架扩增。

以实施例1所得pPaper质粒为模板，以TargetVF2(5’cctgttatccctactcgag3’)和TargetVR(5’actagtattatacctaggactgagc3’)为引物，用PrimeSTAR扩增，DpnI酶切过夜后纯化。

(2)sgRNA-editing扩增。

以pTarget质粒为模板，以H-KfrdBC-gF(5’cctaggtataatactagtgacgtgtttcgggcagacttgttttagagctagaaatagca3’)和gRNAR5(5’gtaatagatctaagcttctgc3’)为引物，加粗的碱基为用于编辑目的基因的sgRNA的引导序列，用PrimeSTAR扩增并纯化。

(3)左右同源臂扩增。

以BW25113基因组为模板，以Pre_KfrdBCF(5’cattccactgtttagcggtaagttc3’)和Aft_KfrdBCR(5’ctgtgaaacccgcattaaaggtctg3’)为引物，用PrimeSTAR扩增并纯化。以此产物为模板，分别以H-KfrdBCHLF(5’gaagcttagatctattacgtaattgtgcgatgcacaatatc3’)和KfrdBCHLR(5’taactgtggttgccaccatc3’)、H-KfrdBCHRF(5’tggtggcaaccacagttagcggccgctcagccattcgccttctccttc3’)和H-KfrdBCHRR(5’tcgagtagggataacaggtgaacaagcgacagagcgtg3’)为引物，用PrimeSTAR扩增并纯化，分别获得左右同源臂片段。

(4)多片段体外重组。

按照体外多片段重组试剂盒说明，将以上四个片段进行重组，反应产物转化TOP10，涂氯霉素平板培养。以菌落为模板，以Y-Target2F(5’ctagatctttgacagctagctcagtcctaggtataatac3’)和P15A_endF(5’acatgaagcacttcactgac3’)为引物，用RapidTaq Mix进行菌落PCR验证，阳性菌落用引物P15A_endF(5’acatgaagcacttcactgac3’)、P15A_headR(5’cagaccaaaacgatctcaag3’)、CheadR2(5’atggtgaaagttggaacctc3’)进行测序，确认正确保存，即获得用于frdBC基因敲除的质粒pPaper-ΔfrdBC。

按照以上类似的方法，构建用于adhE基因敲除的质粒pPaper-ΔadhE、用于ackA敲除的pPaper-ΔackA，其中：构建pPaper-ΔadhE质粒所引入的sgRNA-editing的引导序列为：5’ctggtcagtgtacaggcaag3’，左右同源臂扩增所用模板为BW25113基因组，左同源臂扩增所用引物为5’gaagcttagatctattacgttctgccgcttagtggatgtg 3’和5’taatcagtagcgctgtctggcaac 3’，右同源臂扩增所用引物为：5’agacagcgctactgattagcggccgccataatgctctcctgataatgttaaac 3’和5’tcgagtagggataacaggtgtctgataactggtcatgctg3’。

构建pPaper-ΔackA质粒所引入的sgRNA-editing的引导序列为：cagccacttctatgtaaccc，左右同源臂扩增所用模板为BW25113基因组，左同源臂扩增所用引物为5’gaagcttagatctattacatgggtaaacttaaggcgaacag 3’和5’catggaagtacctataattgatacgtg 3’，右同源臂扩增所用引物为：5’attataggtacttccatggcggccgctgatttcacaccgccagctcag 3’和5’tcgagtagggataacagggtttgttaacgataacgccggtgatg 3’。

3.pScissors系列质粒的构建。

以构建敲除E.coli BW25113中ldhA基因的pScissors-ΔldhA质粒为例说明如下：

(1)质粒骨架扩增。

以实施例1所得pScissors质粒为模板，以TargetVF2(5’cctgttatccctactcgag3’)和TargetVR(5’actagtattatacctaggactgagc3’)为引物，用PrimeSTAR扩增，DpnI酶切过夜后纯化。

(2)sgRNA-editing扩增。

以pTarget质粒为模板，以H-KldhA-gF(5’cctaggtataatactagtgctgatacgcgcggtgaatagttttagagctagaaatagca3’)和gRNAR5(5’gtaatagatctaagcttctgc3’)为引物，加粗的碱基为用于编辑目的基因的sgRNA的引导序列，用PrimeSTAR扩增并纯化。

(3)左右同源臂扩增。

以BW25113基因组为模板，以Pre_KldhAF(5’agggtgtgccgctttattgttg3’)和Aft_KldhAR(5’acatccagttcgctgactgtaagttg3’)为引物，用PrimeSTAR扩增并纯化。以此产物为模板，分别以H-KldhAHLF(5’gaagcttagatctattaccattacccaacggcaaacgctg3’)和KldhAHLR(5’taatcttgccgctcccctgcattc3’)、H-KldhAHRF(5’aggggagcggcaagattagcggccgccataagactttctccagtgatgttg3’)和H-KldhAHRR(5’tcgagtagggataacaggcagtttatcgatattgatccaggtg3’)为引物，用PrimeSTAR扩增并纯化，分别获得左右同源臂片段。

(4)多片段体外重组。

按照体外多片段重组试剂盒说明，将以上四个片段进行重组，反应产物转化TOP10，涂阿普拉霉素平板培养。以菌落为模板，以Y-Target2F(5’ctagatctttgacagctagctcagtcctaggtataatac3’)和P15A_endF(5’acatgaagcacttcactgac3’)为引物，用RapidTaqMix进行菌落PCR验证，阳性菌落用引物P15A_endF(5’acatgaagcacttcactgac3’)、P15A_headR(5’cagaccaaaacgatctcaag3’)、GheadR2(5’atcagttaccgtgagctgc3’)进行测序，确认正确保存，即获得用于ldhA基因敲除的质粒pScissors-ΔldhA。

按照以上类似的方法，构建用于sucA基因敲除的质粒pScissors-ΔsucA，其中：构建pScissors-ΔsucA质粒所引入的sgRNA-editing的引导序列为：gccgtacctcaaccacgaat，左右同源臂扩增所用模板为BW25113基因组，左同源臂扩增所用引物为5’gaagcttagatctattactcgacgggctgtatgaatgtattc 3’和5’catcgtgatcccttaagcatc 3’,右同源臂扩增所用引物为：5’gcttaagggatcacgatggcggccgcgaaacagcaacaagatctggttaatg 3’和5’tcgagtagggataacaggagatgtttttccacatcttcacgag 3’。

实施例4利用pRock、pPaper、pScissors系列质粒进行多轮基因编辑的方法。

以实施例3中构建的pRock、pPaper、pScissors系列质粒进行多轮基因编辑，基本流程如图7所示，构建丙酮酸生产菌株BWQ08-dNK(消除质粒后的菌株命名为此名)为例说明如下：

1.起始步骤。

pCas质粒转入大肠杆菌BW25113感受态细胞，在Kan平板30℃培养，记为菌株BWQ00。挑单菌落培养，制备感受态细胞。

2.循环步骤。

(1)使用pRock系列质粒进行基因编辑。

第一次培养：转化实施例3获得的质粒pRock-Δ(focA-pflB)于BWQ00，涂Kan+Tet平板30℃培养。以Pre_KfocA-pflBF和Aft_KfocA-pflBR为引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落记为BWQ01。

第二次培养：挑单菌落于液体LB(Kan+Tet)，30℃培养，保菌并制备感受态细胞。

(2)使用pPaper系列质粒进行基因编辑。

第一次培养：转化实施例3获得的质粒pPaper-ΔfrdBC于BWQ01感受态细胞，涂Kan+Cm平板30℃培养。以Pre_KfrdBCF和Aft_KfrdBCR为引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落记为BWQ02。

第二次培养。挑单菌落于液体LB(Kan+Cm)，30℃培养，保菌并制备感受态细胞。

(3)使用pScissors系列质粒进行基因编辑。

第一次培养：转化实施例3获得的质粒pScissors-ΔldhA于BWQ02感受态细胞，涂Kan+Apm平板30℃培养。以Pre_KldhAF和Aft_KldhAR为引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落记为BWQ03。

第二次培养：挑单菌落于液体LB(Kan+Apm)，30℃培养，保菌并制备感受态细胞。

(4)再次使用pRock系列进行基因编辑。

第一次培养：转化实施例3获得的质粒pRock-ΔatpFH于BWQ03感受态细胞，涂Kan+Tet平板30℃培养。筛选阳性菌落记为BWQ04。

第二次培养：挑单菌落于液体LB(Kan+Tet)，30℃培养，保菌并制备感受态细胞。

(5)更多轮的基因编辑。

类似于以上步骤，按照“pRock系列→pPaper系列→pScissors系列”的循环使用顺序，使用实施例3中所获得的系列质粒pPaper-ΔadhE、pScissors-ΔsucA、pRock-ΔpoxB和pPaper-ΔackA分别对基因adhE、sucA、poxB和ackA进行敲除，分别获得菌株BWQ05、BWQ06、BWQ07、BWQ08，流程如图8所示。

3.结束步骤。

所有基因编辑完成后，单菌落液体培养时加入1mM IPTG，30℃培养，诱导去除最后一个sgRNA表达质粒，获得单菌落后42℃培养去除pCas质粒。BWQ08消除pCas和最后一个sgRNA表达质粒后的菌株命名为BWQ08-dNK。基因编辑验证结果如图8中C所示。将该菌株用于摇瓶发酵生产丙酮酸，以未改造的BW25113为对照(WT)，结果如图9所示。改造后菌株丙酮酸产量达到10.66±0.13g/L，显著高于未改造菌株的0.65±0.25g/L。同时，乙酸副产物由未改造菌株的3.72±0.42g/L降低到2.03±0.48g/L，表明，利用本发明制备的基因编辑工具能够顺利实现目的基因的敲除。

本领域技术人员应该理解，上述各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行，相关试剂盒操作按照说明书要求进行。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法

<130>

<160> 95

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> PlacIQ

<400> 1

tggtgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga tagcgcc 37

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> J23119

<400> 2

ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagt 35

<210> 3

<211> 843

<212> DNA

<213> p15A

<400> 3

cgctagcgga gtgtatactg gcttactatg ttggcactga tgagggtgtc agtgaagtgc 60

ttcatgtggc aggagaaaaa aggctgcacc ggtgcgtcag cagaatatgt gatacaggat 120

atattccgct tcctcgctca ctgactcgct acgctcggtc gttcgactgc ggcgagcgga 180

aatggcttac gaacggggcg gagatttcct ggaagatgcc aggaagatac ttaacaggga 240

agtgagaggg ccgcggcaaa gccgtttttc cataggctcc gcccccctga caagcatcac 300

gaaatctgac gctcaaatca gtggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 360

tttccccctg gcggctccct cgtgcgctct cctgttcctg cctttcggtt taccggtgtc 420

attccgctgt tatggccgcg tttgtctcat tccacgcctg acactcagtt ccgggtaggc 480

agttcgctcc aagctggact gtatgcacga accccccgtt cagtccgacc gctgcgcctt 540

atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggaaagacat gcaaaagcac cactggcagc 600

agccactggt aattgattta gaggagttag tcttgaagtc atgcgccggt taaggctaaa 660

ctgaaaggac aagttttggt gactgcgctc ctccaagcca gttacctcgg ttcaaagagt 720

tggtagctca gagaaccttc gaaaaaccgc cctgcaaggc ggttttttcg ttttcagagc 780

aagagattac gcgcagacca aaacgatctc aagaagatca tcttattaat cagataaaat 840

att 843

<210> 4

<211> 2493

<212> DNA

<213> pRock系列母质粒

<400> 4

ccactggtaa caggattagc agagcgagat cttggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 60

gatagcgccg atgggcaggt acttctcctg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 120

aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttgcatgcaa 180

ataataaaaa agccggatta ataatctggc tttttatatt ctctctctag tatataaacg 240

cagaaaggcc cacccgaagg tgagccagtg tgagagctca gccaatcgac tggcgagcgg 300

catctcaacc cagtcagctc cttctggtta ggtcgaggtg gcccggctcc atgcaccgcg 360

acgcaacgcg gggaggcaga caaggtatag ggcggcgcct acaatccatg ccaacccgtt 420

ccatgtgctc gccgaggcgg cataaatcgc cgtgacgatc agcggtccag tgatcgaagt 480

taggctggta agagccgcga gcgatccttg aagctgtccc tgatggtcgt catctacctg 540

cctggacagc atggcctgca acgcgggcat cccgatgccg ccggaagcga gaagaatcat 600

aatggggaag gccatccagc ctcgcgtcgc gaacgccagc aagacgtagc ccagcgcgtc 660

ggccgccatg ccggcgataa tggcctgctt ctcgccgaaa cgtttggtgg cgggaccagt 720

gacgaaggct tgagcgaggg cgtgcaagat tccgaatacc gcaagcgaca ggccgatcat 780

cgtcgcgctc cagcgaaagc ggtcctcgcc gaaaatgacc cagagcgctg ccggcacctg 840

tcctacgagt tgcatgataa agaagacagt cataagtgcg gcgacgatag tcatgccccg 900

cgcccaccgg aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gacgctctcc 960

cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt tgagcaccgc 1020

cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac agtcccccgg ccacggggcc 1080

tgccaccata cccacgccga aacaagcgct catgagcccg aagtggcgag cccgatcttc 1140

cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc cggtgatgcc 1200

ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcca caggacgggt gtggtcgcca tgatcgcgta 1260

gtcgatagtg gctccaagta gcgaagcgag caggactggg cggcggccaa agcggtcgga 1320

cagtgctccg agaacgggtg cgcatagaaa ttgcatcaac gcatatagcg ctagcagcac 1380

gccatagtga ctggcgatgc tgtcggaatg gacgatatcc cgcaagaggc ccggcagtac 1440

cggcataacc aagcctatgc ctacagcatc cagggtgacg gtgccgagga tgacgatgag 1500

cgcattgtta gatttcatac acggtgcctg actgcgttag caatttaact gtgataaact 1560

accgcattaa agcttatcga tgataagctg tcaaacatga gaatctcgag cctgaaggag 1620

ctgactgggt tgactcgaga tatcaagctt cgctagcgga gtgtatactg gcttactatg 1680

ttggcactga tgagggtgtc agtgaagtgc ttcatgtggc aggagaaaaa aggctgcacc 1740

ggtgcgtcag cagaatatgt gatacaggat atattccgct tcctcgctca ctgactcgct 1800

acgctcggtc gttcgactgc ggcgagcgga aatggcttac gaacggggcg gagatttcct 1860

ggaagatgcc aggaagatac ttaacaggga agtgagaggg ccgcggcaaa gccgtttttc 1920

cataggctcc gcccccctga caagcatcac gaaatctgac gctcaaatca gtggtggcga 1980

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gcggctccct cgtgcgctct 2040

cctgttcctg cctttcggtt taccggtgtc attccgctgt tatggccgcg tttgtctcat 2100

tccacgcctg acactcagtt ccgggtaggc agttcgctcc aagctggact gtatgcacga 2160

accccccgtt cagtccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 2220

ggaaagacat gcaaaagcac cactggcagc agccactggt aattgattta gaggagttag 2280

tcttgaagtc atgcgccggt taaggctaaa ctgaaaggac aagttttggt gactgcgctc 2340

ctccaagcca gttacctcgg ttcaaagagt tggtagctca gagaaccttc gaaaaaccgc 2400

cctgcaaggc ggttttttcg ttttcagagc aagagattac gcgcagacca aaacgatctc 2460

aagaagatca tcttattaat cagataaaat att 2493

<210> 5

<211> 2048

<212> DNA

<213> pPaper系列母质粒

<400> 5

ccactggtaa caggattagc agagcgagat cttggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 60

gatagcgcct caacccagtc agctccttcg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 120

aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttgcatgcaa 180

ataataaaaa agccggatta ataatctggc tttttatatt ctctctctag tatataaacg 240

cagaaaggcc cacccgaagg tgagccagtg tgagagctca gccaatcgac tggcgagcgg 300

catctcgcaa gatgtggcgt gttatggtta cgccccgccc tgccactcat cgcagtactg 360

ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca caaacggcat gatgaacctg 420

aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca tggtgaaaac 480

gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca aaactggtga aactcaccca 540

gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat aggccaggtt 600

ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga aatcgtcgtg 660

gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg tgtaacaagg 720

gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgaa attccggatg 780

agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt gcttattttt 840

ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat aggtacattg 900

agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata tatcaacggt 960

ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa atctcgataa 1020

ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg aacctcttac 1080

gtgcccgatc aactcgagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 1140

cctataaaaa taggcgtatc acgagcctta acacgccaca tcttgcgact cgagatatca 1200

agcttcgcta gcggagtgta tactggctta ctatgttggc actgatgagg gtgtcagtga 1260

agtgcttcat gtggcaggag aaaaaaggct gcaccggtgc gtcagcagaa tatgtgatac 1320

aggatatatt ccgcttcctc gctcactgac tcgctacgct cggtcgttcg actgcggcga 1380

gcggaaatgg cttacgaacg gggcggagat ttcctggaag atgccaggaa gatacttaac 1440

agggaagtga gagggccgcg gcaaagccgt ttttccatag gctccgcccc cctgacaagc 1500

atcacgaaat ctgacgctca aatcagtggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 1560

aggcgtttcc ccctggcggc tccctcgtgc gctctcctgt tcctgccttt cggtttaccg 1620

gtgtcattcc gctgttatgg ccgcgtttgt ctcattccac gcctgacact cagttccggg 1680

taggcagttc gctccaagct ggactgtatg cacgaacccc ccgttcagtc cgaccgctgc 1740

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggaaa gacatgcaaa agcaccactg 1800

gcagcagcca ctggtaattg atttagagga gttagtcttg aagtcatgcg ccggttaagg 1860

ctaaactgaa aggacaagtt ttggtgactg cgctcctcca agccagttac ctcggttcaa 1920

agagttggta gctcagagaa ccttcgaaaa accgccctgc aaggcggttt tttcgttttc 1980

agagcaagag attacgcgca gaccaaaacg atctcaagaa gatcatctta ttaatcagat 2040

aaaatatt 2048

<210> 6

<211> 2255

<212> DNA

<213> pScissors系列母质粒

<400> 6

ccactggtaa caggattagc agagcgagat cttggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 60

gatagcgcct cgcaagatgt ggcgtgttag ttttagagct agaaatagca agttaaaata 120

aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttgcatgcaa 180

ataataaaaa agccggatta ataatctggc tttttatatt ctctctctag tatataaacg 240

cagaaaggcc cacccgaagg tgagccagtg tgagagctca gccaatcgac tggcgagcgg 300

catcgatggg caggtacttc tccttggtta gccaatcgac tggcgagcgg catcgcattc 360

ttcgcatccc gcctctggcg gatgcaggaa gatcaacgga tctcggccca gttgacccag 420

ggctgtcgcc acaatgtcgc gggagcggat caaccgagca aaggcatgac cgactggacc 480

ttccttctga aggctcttct ccttgagcca cctgtccgcc aaggcaaagc gctcacagca 540

gtggtcattc tcgagataat cgacgcgtac caacttgcca tcctgaagaa tggtgcagtg 600

tctcggcacc ccatagggaa cctttgccat caactcggca agatgcagcg tcgtgttggc 660

atcgtgtccc acgccgagga gaagtacctg cccatcgagt tcatggacac gggcgaccgg 720

gcttgcaggc gagtgaggtg gcaggggcaa tggatcagag atgatctgct ctgcctgtgg 780

ccccgctgcc gcaaaggcaa atggatgggc gctgcgcttt acatttggca ggcgccagaa 840

tgtgtcagag acaactccaa ggtccggtgt aacgggcgac gtggcaggat cgaacggctc 900

gtcgtccaga cctgaccacg agggcatgac gagcgtccct cccggaccca gcgcagcacg 960

cagggcctcg atcagtccaa gtggcccatc ttcgaggggc cggacgctac ggaaggagct 1020

gtggaccagc agcacaccgc cgggggtaac cccaaggttg agaagctgac cgatgagctc 1080

ggcttttcgc cattcgtatt gcacgacatt gcactccacc gctgatgaca tcagtcgatc 1140

atagcacgat caacggcact gttgcaaata gtcggtggtg ataaacttat catccccttt 1200

tgcttatgga gctgcacatg aacccattca aaggccggca ttttcagcgt gacatcattc 1260

tgtgggccgt acgctggtac tgcaaatacg gcatcagtta ccgtgagctg cattttccgc 1320

tgcataaccc tgcttcgggg tcattatagc gattttttcg gtatatccat cccctaggag 1380

aagtacctgc ccatcctcga gatatcaagc ttcgctagcg gagtgtatac tggcttacta 1440

tgttggcact gatgagggtg tcagtgaagt gcttcatgtg gcaggagaaa aaaggctgca 1500

ccggtgcgtc agcagaatat gtgatacagg atatattccg cttcctcgct cactgactcg 1560

ctacgctcgg tcgttcgact gcggcgagcg gaaatggctt acgaacgggg cggagatttc 1620

ctggaagatg ccaggaagat acttaacagg gaagtgagag ggccgcggca aagccgtttt 1680

tccataggct ccgcccccct gacaagcatc acgaaatctg acgctcaaat cagtggtggc 1740

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggcggctcc ctcgtgcgct 1800

ctcctgttcc tgcctttcgg tttaccggtg tcattccgct gttatggccg cgtttgtctc 1860

attccacgcc tgacactcag ttccgggtag gcagttcgct ccaagctgga ctgtatgcac 1920

gaaccccccg ttcagtccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 1980

ccggaaagac atgcaaaagc accactggca gcagccactg gtaattgatt tagaggagtt 2040

agtcttgaag tcatgcgccg gttaaggcta aactgaaagg acaagttttg gtgactgcgc 2100

tcctccaagc cagttacctc ggttcaaaga gttggtagct cagagaacct tcgaaaaacc 2160

gccctgcaag gcggtttttt cgttttcaga gcaagagatt acgcgcagac caaaacgatc 2220

tcaagaagat catcttatta atcagataaa atatt 2255

<210> 7

<211> 337

<212> DNA

<213> KX

<400> 7

cttattaatc agataaaata ttccactggt aacaggatta gcagagcgag atcttggtgc 60

aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc cagagaccaa agaggagaaa ggatcccggg 120

tctagaggtc tccgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 180

aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct ttttttgcat gcaaataata aaaaagccgg 240

attaataatc tggcttttta tattctctct ctagtatata aacgcagaaa ggcccacccg 300

aaggtgagcc agtgtgagag ctcagccaat cgactgg 337

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<400> 8

gatgggcagg tacttctcct 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<400> 9

tcaacccagt cagctccttc agg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<400> 10

tcaacccagt cagctccttc tgg 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<400> 11

tcaacccagt cagctccttc 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<400> 12

tcgcaagatg tggcgtgtta agg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<400> 13

tcgcaagatg tggcgtgtta tgg 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<400> 14

tcgcaagatg tggcgtgtta 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<400> 15

gatgggcagg tacttctcct agg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<400> 16

gatgggcagg tacttctcct tgg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<400> 17

tctgctaatc ctgttaccag tgg 23

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> BsaI-T.S53F

<400> 18

cgcctcaacc cagtcagctc cttc 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> BsaI-T.S53R

<400> 19

aaacgaagga gctgactggg ttga 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> BsaI-C.S15F

<400> 20

cgcctcgcaa gatgtggcgt gtta 24

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> BsaI-C.S15R

<400> 21

aaactaacac gccacatctt gcga 24

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> H-KX-F

<400> 22

cttattaatc agataaaata ttccactggt aacagg 36

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> KX-R

<400> 23

ccagtcgatt ggctgagc 18

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> H-P15AF

<400> 24

ctcgagatat caagcttcgc tagcggagtg tatac 35

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> P15AR

<400> 25

aatattttat ctgattaata agatgatctt cttg 34

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> SpecR

<400> 26

gagctcagcc aatcgactgg 20

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> H-Spec-F

<400> 27

gcgaagcttg atatctcgag ttcatgtgca gc 32

<210> 28

<211> 65

<212> DNA

<213> H-V2T-F

<400> 28

gaagcttgat atctcgagtc aacccagtca gctccttcag gctcgagatt ctcatgtttg 60

acagc 65

<210> 29

<211> 59

<212> DNA

<213> H-V2T-R

<400> 29

cgactggcga gcggcatctc aacccagtca gctccttctg gttaggtcga ggtggcccg 59

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> VE-F

<400> 30

cgctagcgga gtgtatac 18

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> VE-R

<400> 31

gaagcttgat atctcgag 18

<210> 32

<211> 66

<212> DNA

<213> H-V2C-F

<400> 32

gaagcttgat atctcgagtc gcaagatgtg gcgtgttaag gctcgtgata cgcctatttt 60

tatagg 66

<210> 33

<211> 58

<212> DNA

<213> H-V2C-R

<400> 33

cgactggcga gcggcatctc gcaagatgtg gcgtgttatg gttacgcccc gccctgcc 58

<210> 34

<211> 65

<212> DNA

<213> H-V2G-F

<400> 34

gaagcttgat atctcgagga tgggcaggta cttctcctag gggatggata taccgaaaaa 60

atcgc 65

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> H-V2G-R

<400> 35

cgactggcga gcggcatcga tgggcaggta cttctccttg gttagccaat cgactggcg 59

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> B0014-R

<400> 36

gatgccgctc gccagtcgat tg 22

<210> 37

<211> 38

<212> DNA

<213> H-J119F

<400> 37

ctcgagatat caagcttcgt tgacagctag ctcagtcc 38

<210> 38

<211> 37

<212> DNA

<213> H-gRNAR4

<400> 38

gtatacactc cgctagcgct cgagtaggga taacagg 37

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> BsaI-G.S35F

<400> 39

cgccgatggg caggtacttc tcct 24

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> BsaI-G.S35R

<400> 40

aaacaggaga agtacctgcc catc 24

<210> 41

<211> 59

<212> DNA

<213> H-KfocA-pflB-gF

<400> 41

cctaggtata atactagtct ttcatctgac ccagagcggt tttagagcta gaaatagca 59

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> gRNAR5

<400> 42

gtaatagatc taagcttctg c 21

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> Pre_KfocA-pflBF

<400> 43

gttgcccata tcacgggtaa attcac 26

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> Aft_KfocA-pflBR

<400> 44

tggaccgaat ggacgatgga gtttaac 27

<210> 45

<211> 39

<212> DNA

<213> H-KfocA-pflBHLF

<400> 45

gaagcttaga tctattacgt tcatctgttt gagatcgag 39

<210> 46

<211> 27

<212> DNA

<213> KfocA-pflBHLR

<400> 46

taattagatt tgactgaaat cgtacag 27

<210> 47

<211> 52

<212> DNA

<213> H-KfocA-pflBHRF

<400> 47

ttcagtcaaa tctaattagc ggccgccaca ctaactctct ctttattaag tc 52

<210> 48

<211> 39

<212> DNA

<213> H-KfocA-pflBHRR

<400> 48

tcgagtaggg ataacaggtg caatatctga atgcgtttg 39

<210> 49

<211> 39

<212> DNA

<213> Y-Target2F

<400> 49

ctagatcttt gacagctagc tcagtcctag gtataatac 39

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> P15A_endF

<400> 50

acatgaagca cttcactgac 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> P15A_headR

<400> 51

cagaccaaaa cgatctcaag 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> TheadR2

<400> 52

cagaccaaaa cgatctcaag 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<400> 53

gctgttagca gcttcatcca 20

<210> 54

<211> 41

<212> DNA

<213> 序列

<400> 54

gaagcttaga tctattacta cctgtctgac ggtcaccgat g 41

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> 序列

<400> 55

agcgtacgcg gtcgtcttga g 21

<210> 56

<211> 49

<212> DNA

<213> 序列

<400> 56

aagacgaccg cgtacgctgc ggccgccaca gcacaatgcc tctatttag 49

<210> 57

<211> 42

<212> DNA

<213> 序列

<400> 57

tcgagtaggg ataacaggtc attcctgtca acttaatcct tg 42

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<400> 58

cgccagatat tgcgggtgaa 20

<210> 59

<211> 39

<212> DNA

<213> 序列

<400> 59

gaagcttaga tctattactc aacatgcagc gccagattg 39

<210> 60

<211> 22

<212> DNA

<213> 序列

<400> 60

ggcgaaaaca aactggctaa gg 22

<210> 61

<211> 49

<212> DNA

<213> 序列

<400> 61

agccagtttg ttttcgccgc ggccgccatg gttctccatc tcctgaatg 49

<210> 62

<211> 42

<212> DNA

<213> 序列

<400> 62

tcgagtaggg ataacaggtg gcagaaaata acgttaccga ag 42

<210> 63

<211> 19

<212> DNA

<213> TargetVF2

<400> 63

cctgttatcc ctactcgag 19

<210> 64

<211> 25

<212> DNA

<213> TargetVR

<400> 64

actagtatta tacctaggac tgagc 25

<210> 65

<211> 59

<212> DNA

<213> H-KfrdBC-gF

<400> 65

cctaggtata atactagtga cgtgtttcgg gcagacttgt tttagagcta gaaatagca 59

<210> 66

<211> 25

<212> DNA

<213> Pre_KfrdBCF

<400> 66

cattccactg tttagcggta agttc 25

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<213> Aft_KfrdBCR

<400> 67

ctgtgaaacc cgcattaaag gtctg 25

<210> 68

<211> 41

<212> DNA

<213> H-KfrdBCHLF

<400> 68

gaagcttaga tctattacgt aattgtgcga tgcacaatat c 41

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> KfrdBCHLR

<400> 69

taactgtggt tgccaccatc 20

<210> 70

<211> 48

<212> DNA

<213> H-KfrdBCHRF

<400> 70

tggtggcaac cacagttagc ggccgctcag ccattcgcct tctccttc 48

<210> 71

<211> 38

<212> DNA

<213> H-KfrdBCHRR

<400> 71

tcgagtaggg ataacaggtg aacaagcgac agagcgtg 38

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> CheadR2

<400> 72

atggtgaaag ttggaacctc 20

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<400> 73

ctggtcagtg tacaggcaag 20

<210> 74

<211> 40

<212> DNA

<213> 序列

<400> 74

gaagcttaga tctattacgt tctgccgctt agtggatgtg 40

<210> 75

<211> 24

<212> DNA

<213> 序列

<400> 75

taatcagtag cgctgtctgg caac 24

<210> 76

<211> 53

<212> DNA

<213> 序列

<400> 76

agacagcgct actgattagc ggccgccata atgctctcct gataatgtta aac 53

<210> 77

<211> 40

<212> DNA

<213> 序列

<400> 77

tcgagtaggg ataacaggtg tctgataact ggtcatgctg 40

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<400> 78

cagccacttc tatgtaaccc 20

<210> 79

<211> 41

<212> DNA

<213> 序列

<400> 79

gaagcttaga tctattacat gggtaaactt aaggcgaaca g 41

<210> 80

<211> 27

<212> DNA

<213> 序列

<400> 80

catggaagta cctataattg atacgtg 27

<210> 81

<211> 48

<212> DNA

<213> 序列

<400> 81

attataggta cttccatggc ggccgctgat ttcacaccgc cagctcag 48

<210> 82

<211> 44

<212> DNA

<213> 序列

<400> 82

tcgagtaggg ataacagggt ttgttaacga taacgccggt gatg 44

<210> 83

<211> 59

<212> DNA

<213> H-KldhA-gF

<400> 83

cctaggtata atactagtgc tgatacgcgc ggtgaatagt tttagagcta gaaatagca 59

<210> 84

<211> 22

<212> DNA

<213> Pre_KldhAF

<400> 84

agggtgtgcc gctttattgt tg 22

<210> 85

<211> 26

<212> DNA

<213> Aft_KldhAR

<400> 85

acatccagtt cgctgactgt aagttg 26

<210> 86

<211> 40

<212> DNA

<213> H-KldhAHLF

<400> 86

gaagcttaga tctattacca ttacccaacg gcaaacgctg 40

<210> 87

<211> 24

<212> DNA

<213> KldhAHLR

<400> 87

taatcttgcc gctcccctgc attc 24

<210> 88

<211> 51

<212> DNA

<213> H-KldhAHRF

<400> 88

aggggagcgg caagattagc ggccgccata agactttctc cagtgatgtt g 51

<210> 89

<211> 43

<212> DNA

<213> H-KldhAHRR

<400> 89

tcgagtaggg ataacaggca gtttatcgat attgatccag gtg 43

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 序列

<400> 90

gccgtacctc aaccacgaat 20

<210> 91

<211> 42

<212> DNA

<213> 序列

<400> 91

gaagcttaga tctattactc gacgggctgt atgaatgtat tc 42

<210> 92

<211> 21

<212> DNA

<213> 序列

<400> 92

catcgtgatc ccttaagcat c 21

<210> 93

<211> 52

<212> DNA

<213> 序列

<400> 93

gcttaaggga tcacgatggc ggccgcgaaa cagcaacaag atctggttaa tg 52

<210> 94

<211> 43

<212> DNA

<213> 序列

<400> 94

tcgagtaggg ataacaggag atgtttttcc acatcttcac gag 43

<210> 95

<211> 19

<212> DNA

<213> GheadR2

<400> 95

atcagttacc gtgagctgc 19

Claims (10)

1.一种基因编辑工具，其特征在于，包括如下三种sgRNA表达母质粒，分别为pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒，其中，每种母质粒除含有表达用于编辑目的基因的sgRNA外，还含有表达靶向另外两种母质粒中的一种的sgRNA；在实施基因编辑过程中，由上述三种母质粒构建的系列基因编辑质粒循环使用时，宿主细胞中先使用的基因编辑质粒或筛选标记被后使用的基因编辑质粒所消除。

2.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其特征在于，所述pRock系列母质粒携带四环素抗性基因表达模块以及用于质粒消除的引导RNA，所述引导RNA靶向pScissors系列母质粒中阿普拉霉素抗性基因编码区GATGGGCAGGTACTTCTCCT序列；所述四环素抗性基因表达模块正义链的5’端和反义链的5’两端分别带有TCAACCCAGTCAGCTCCTTCAGG和TCAACCCAGTCAGCTCCTTCTGG序列；

所述pPaper系列母质粒携带氯霉素抗性基因表达模块以及用于质粒消除的引导RNA，所述引导RNA靶向pRock系列质粒中四环素抗性基因编码区TCAACCCAGTCAGCTCCTTC序列；所述氯霉素抗性基因表达模块正义链的5’端和反义链的5’两端分别带有TCGCAAGATGTGGCGTGTTAAGG和TCGCAAGATGTGGCGTGTTATGG序列；

所述pScissors系列母质粒携带阿普拉霉素抗性基因表达模块以及用于质粒消除的引导RNA，所述引导RNA靶向pPaper系列质粒中氯霉素抗性基因编码区TCGCAAGATGTGGCGTGTTA序列；所述阿普拉霉素抗性基因表达模块正义链的5’端和反义链的5’两端分别带有GATGGGCAGGTACTTCTCCTAGG和GATGGGCAGGTACTTCTCCTTGG序列。

3.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其特征在于，所述pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒均包含序列TCTGCTAATCCTGTTACCAGTGG。

4.根据权利要求2所述的基因编辑工具，其特征在于，每种母质粒中用于质粒消除的引导RNA的启动子为PlacIQ，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；用于编辑目的基因的sgRNA的启动子为J23119，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；每种母质粒中用于质粒消除的引导RNA表达模块与用于编辑目的基因的sgRNA表达模块在质粒中分别被复制起始序列和抗性基因表达模块隔开，所述复制起始序列核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其特征在于，所述pRock系列母质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述pPaper系列母质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述pScissors系列母质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6.权利要求1-5任意一项所述的基因编辑工具的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)共同模板质粒pRPS的构建：

将用于消除质粒的引导RNA框架表达模块、复制起始序列p15A与壮观霉素抗性基因表达模块连接后转化大肠杆菌，经筛选鉴定后提取获得重组质粒，记为pRPS质粒；

(2)pRock系列母质粒构建：

a.抗性替换：以步骤(1)获得的pRPS质粒为模板，扩增获得除壮观霉素抗性基因之外的序列；以pSB1T3质粒为模板，扩增获得四环素抗性基因表达模块；上述两个扩增片段连接后转化大肠杆菌，筛选后提取获得具有四环素抗性的质粒，记为pRPS-T质粒；

b.靶向序列引入：将寡核苷酸BsaI-G.S35F，序列为5’cgccgatgggcaggtacttctcct3’与BsaI-G.S35R，序列为5’aaacaggagaagtacctgcccatc3’进行等摩尔浓度比例混合，以0.1℃/s的速度从98℃缓慢降温到16℃，得到的产物与BsaI酶切后的pRPS-T质粒连接，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，记为pRPS-TkG质粒；

c.用于目的基因编辑的sgRNA框架引入：以pTarget质粒为模板，扩增得到用于编辑目的基因的sgRNA表达模块，插入到所述pRPS-TkG质粒中，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，即为pRock系列母质粒；

(3)pPaper系列母质粒构建：

a.抗性替换：以步骤(1)获得的pRPS质粒为模板，扩增获得除壮观霉素抗性基因之外的序列；以pSB1C3质粒为模板，扩增获得氯霉素抗性基因表达模块；上述两个扩增片段连接后转化大肠杆菌，筛选后提取获得具有氯霉素抗性的质粒，记为pRPS-C质粒；

b.靶向序列引入：将寡核苷酸BsaI-T.S53F，序列为5’cgcctcaacccagtcagctccttc3’与BsaI-T.S53R，序列为5’aaacgaaggagctgactgggttga3’进行等摩尔浓度比例混合，以0.1℃/s的速度从98℃缓慢降温到16℃，得到的产物与BsaI酶切后的pRPS-C质粒利用DNA连接，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，记为pRPS-CkT质粒；

c.用于目的基因编辑的sgRNA框架引入：以pTarget质粒为模板，扩增得到用于编辑目的基因的sgRNA表达模块；插入到所述pRPS-CkT质粒中，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，即为pPaper系列母质粒；

(4)pScissors系列母质粒构建

a.抗性替换：以步骤(1)获得的pRPS质粒为模板，扩增获得除壮观霉素抗性基因之外的序列；以pMDIAI质粒为模板，扩增获得阿普拉霉素抗性基因表达模块；上述两个扩增片段连接后转化大肠杆菌，筛选后提取获得具有阿普拉霉素抗性的质粒，记为pRPS-G质粒；

b.靶向序列引入：将寡核苷酸BsaI-C.S15F，序列为5’cgcctcgcaagatgtggcgtgtta3’与BsaI-C.S15R，序列为5’aaactaacacgccacatcttgcga3’进行等摩尔浓度比例混合，以0.1℃/s的速度从98℃缓慢降温到16℃，得到的产物与BsaI酶切后的pRPS-G质粒连接，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，记为pRPS-GkC质粒；

c.用于目的基因编辑的sgRNA框架引入：以pTarget质粒为模板，扩增得到用于编辑目的基因的sgRNA表达模块，插入到所述pRPS-GkC质粒中，转化大肠杆菌，筛选后提取质粒，即为pScissors系列的母质粒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述用于消除质粒的引导RNA框架表达模块的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；扩增所用的引物为H-KX-F：5’cttattaatcagataaaatattccactggtaacagg3’和引物KX-R：5’ccagtcgattggctgagc3’；

所述复制起始序列p15A，是以pBAD30质粒为模板，以引物H-P15AF：5’ctcgagatatcaagcttcgctagcggagtgtatac3’和引物P15AR：5’aatattttatctgattaataagatgatcttcttg3’扩增获得的；

所述壮观霉素抗性基因表达模块以pTarget质粒为模板，以引物SpecR：5’gagctcagccaatcgactgg3’和引物H-Spec-F：5’gcgaagcttgatatctcgagttcatgtgcagc3’扩增获得的。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中a所述的扩增获得四环素抗性基因表达模块所用的引物为：

H-V2T-F：5’gaagcttgatatctcgagtcaacccagtcagctccttcaggctcgagattctcatgtttgacagc3’和H-V2T-R：

5’cgactggcgagcggcatctcaacccagtcagctccttctggttaggtcgaggtggcccg3’；

步骤(2)中c所述的pRPS-TkG质粒，经引物VE-F：5’cgctagcggagtgtatac3’和VE-R：5’gaagcttgatatctcgag3’扩增，扩增产物经DpnI酶切，酶切产物与所述用于编辑目的基因的sgRNA表达模块经体外重组方法进行连接；

步骤(3)中a所述扩增获得氯霉素抗性基因表达模块所用的引物为H-V2C-F：5’gaagcttgatatctcgagtcgcaagatgtggcgtgttaaggctcgtgatacgcctatttttatagg3’和H-V2C-R：5’cgactggcgagcggcatctcgcaagatgtggcgtgttatggttacgccccgccctgcc3’；

步骤(3)中c所述pRPS-CkT质粒，经引物VE-F：5’cgctagcggagtgtatac3’和VE-R：5’gaagcttgatatctcgag3’扩增，扩增产物经DpnI酶切，酶切产物与所述用于编辑目的基因的sgRNA表达模块经体外重组方法进行连接；

步骤(4)中a所述扩增获得阿普拉霉素抗性基因表达模块所用的引物为H-V2G-F：5’gaagcttgatatctcgaggatgggcaggtacttctcctaggggatggatataccgaaaaaatcgc3’和H-V2G-R：5’cgactggcgagcggcatcgatgggcaggtacttctccttggttagccaatcgactggcg3’；

步骤(4)中c所述pRPS-GkC质粒、经引物VE-F：5’cgctagcggagtgtatac3’和VE-R：5’gaagcttgatatctcgag3’扩增，扩增产物经DpnI酶切，酶切产物与所述用于编辑目的基因的sgRNA表达模块经体外重组方法进行连接；

步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中所述以步骤(1)获得的质粒pRPS为模板，扩增获得除壮观霉素抗性基因表达模块之外的序列所用的引物为：

H-P15AF：5’ctcgagatatcaagcttcgctagcggagtgtatac3’和B0014-R：5’gatgccgctcgccagtcgattg3’；所述以pTarget质粒为模板，得到用于编辑目的基因的sgRNA表达模块所用的引物为：

H-J119F：5’ctcgagatatcaagcttcgttgacagctagctcagtcc3’和

H-gRNAR4：5’gtatacactccgctagcgctcgagtagggataacagg3’。

9.权利要求1-5任意一项所述的基因编辑工具在基因编辑中的应用。

10.一种多轮基因编辑的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)起始步骤：准备含有pCas质粒的菌株，制备感受态；

(2)循环步骤：

a.根据待编辑的基因序列设计sgRNA，利用权利要求1-5任意一项所述的基因编辑工具，获得用于编辑目的基因的pRock系列质粒、pPaper系列质粒或pScissors系列质粒，完成第一次基因编辑，获得重组菌；

b.鉴定阳性菌落，经培养后制备感受态细胞；

c.重复步骤a及b，制备下一个目的基因的基因编辑质粒，按照pRock系列质粒、pPaper系列质粒、pScissors系列质粒的三种质粒循环顺序向步骤b制备的感受态细胞中转入另外一种质粒，完成所述的下一个目的基因的编辑；

(3)结束步骤：完成所有基因编辑步骤后，IPTG诱导去除最后一个sgRNA表达质粒。

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