CN113710802A - 微生物中的汇集基因组编辑 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在一或多个转化轮次中编辑微生物宿主细胞的基因组的方法。所述方法允许以汇集和/或迭代方式将基因编辑引入到微生物宿主细胞的基因组中，所述汇集和/或迭代方式不需要在至少一个转化轮次之后使用功能性反选择。所述方法可以用于在微生物宿主细胞的基因组中快速堆叠基因编辑。还公开了用于执行所述方法的组合物和试剂盒。

Description

微生物中的汇集基因组编辑
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年3月8日提交的美国临时申请序列号62/816,035的优先权，所述美国临时申请出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开涉及通过使用定点基因组编辑技术(例如，CRISPR-Cas9)对微生物宿主细胞进行汇集编辑的组合物和方法。可以在连续编辑轮次的迭代过程中执行汇集编辑的方法，使得在不需要主动表达和利用可反选择标志物的情况下执行至少一个编辑轮次。所公开的方法和组合物可以用于产生多种基因编辑以及在所期望的宿主细胞或生物体的基因组中的多个基因座中堆叠多个基因编辑。
背景技术
代谢工程广泛应用于修饰微生物宿主细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)，以产生工业相关的生物燃料或生化制品，包含乙醇、高级醇、脂肪酸、氨基酸、莽草酸前体、萜类化合物、聚酮化合物和1,4-丁二醇的聚合物前体。通常，工业优化的菌株需要大量基因组修饰，包含插入、缺失和调节修饰，以产生此类工业相关产品。此类大量基因组编辑目标需要高效的工具来执行省时的顺序操纵或多重操纵。
虽然许多利用噬菌体重组酶介导的同源重组(重组工程)的方法使用Rac原噬菌体系统或三种噬菌体λRed蛋白——Exo、β和Gam来操纵大肠杆菌的染色体DNA，但考虑到这些方法可能是费力、耗时的和/或特征诱变效率通常低于1％，所述方法对高通量应用往往是不理想的。最近，姜威(Jiang W)等人介绍了一种利用噬菌体重组酶介导的同源重组和CRISPR/Cas9技术两者的方法(参见姜(Jiang)等人,使用CRISPR-Cas系统对细菌基因组进行RNA引导的编辑(RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cassystems),自然生物技术(Nat Biotechnol.)2013年3月；31(3):233-9)。简而言之，在姜和其同事的方法中，首先对待修饰的菌株进行基因操纵以表达Cas9核酸酶和λRed机制，并且随后将所述菌株与以下进行共转化：(i)对向导RNA进行编码的质粒(pCRISPR)，所述质粒与待修饰的染色体区域粘接并促进通过Cas9进行位点特异性DNA切割；以及(ii)与经切割的末端部分同源的供体DNA(PCR源性或化学合成的)，所述供体DNA促进通过λRed介导的重组修复双链断裂，由此引入期望的突变。虽然姜和同事的策略报告突变效率高达65％，但所述方法仍然很耗时，并且需要存在和使用可反选择标志物，以便有效消除在整个程序中引入的质粒的宿主细胞。
因此，本领域需要以有效、快速且有成本效益的方式在微生物宿主细胞中引入多个基因编辑并迭代地堆叠基因编辑的新方法，所述方法可以用于广泛的微生物宿主中。本文所提供的组合物和方法解决了用于对微生物宿主细胞进行代谢工程化的当前方法固有的上述缺点。
发明内容
一方面，本文提供了一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：a.)将微生物宿主细胞的基础群体与第一编辑质粒池组合，其中所述第一池中的每个编辑质粒包括至少一个修复片段，并且其中所述第一编辑质粒池包括至少两个不同的修复片段，其中所述第一池中的每个编辑质粒进一步包括选择标志基因，并且其中每个修复片段包括在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；b.)将来自所述第一编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(a)的单独微生物宿主细胞中；以及c.)使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述方法进一步包括步骤(d)，所述步骤(d)包括使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。在一些情况下，不同的编辑质粒被引入到单独微生物宿主细胞中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述至少两个不同的修复片段存在于同一质粒上。在一些情况下，所述至少两个不同的修复片段存在于不同的质粒上。在一些情况下，所述不同的编辑质粒包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的修复片段，由此产生至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有一个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的单独细胞、具有一个基因组编辑的单独细胞以及具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述方法进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：d.)使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；e.)将额外编辑质粒池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑质粒池包括至少一或两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；f.)将来自所述额外编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中；以及g.)使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。在一些情况下，不在至少一个编辑轮次之后、不在每个编辑轮次之后或不在任何编辑轮次之后执行反选择。在一些情况下，不在至少一个编辑轮次之后、不在每个编辑轮次之后或不在任何编辑轮次之后执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。在一些情况下，每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的多个基因编辑的序列。在一些情况下，每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。在一些情况下，所述方法进一步包括对在步骤(c)中选择的菌落进行基因分型。在一些情况下，所述方法进一步包括对在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长的微生物宿主细胞进行基因分型。在一些情况下，1)在每个编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择；或者2)在任何编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。在一些情况下，与先前与所述微生物宿主细胞组合的每个其它或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒相比，所述第一编辑质粒池和所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的复制起点或相同的复制起点类别。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述第一或额外编辑质粒池包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个不同的编辑质粒。在一些情况下，所述第一或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的选择标志基因。在一些情况下，所述选择标志基因包括抗生素或营养缺陷型选择标志基因。在一些情况下，所述基因编辑选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。在一些情况下，在一或多个额外编辑轮次中引入的所述修复片段包括一或多个基因编辑的不同序列并且与来自前一编辑轮次的不同选择标志基因相关联。在一些情况下，在一或多个额外编辑轮次中引入的所述gRNA靶向不同的一或多个基因座并且与来自前一编辑轮次的不同抗生素选择标志基因相关联。在一些情况下，所述方法进一步包括步骤(h)，其中步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒，其中所述最终修复片段包括所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终一或多个基因座中或邻近所述最终一或多个基因座的一或多个基因编辑的序列，其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列同源的序列，其中所述最终一或多个基因座包括与先前编辑的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座，并且其中所述最终质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列。在一些情况下，所述方法进一步包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补的向导序列的gRNA，以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。在一些情况下，所述微生物宿主细胞包括来自一或多个异源重组系统的一组蛋白质。在一些情况下，所述微生物宿主细胞包括来自λred重组系统、RecET重组系统的一组蛋白质、来自λred重组系统或RecET重组系统的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。在一些情况下，来自所述λred重组系统的所述一组蛋白质包括β蛋白、gam蛋白和exo蛋白。在一些情况下，在步骤(a)之前，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质在包括对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因的质粒上被引入到所述微生物宿主细胞中。在一些情况下，由于对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因整合到所述微生物宿主细胞的基因组中，因此来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质被所述微生物宿主细胞稳定地表达。在一些情况下，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质是组成型表达的。在一些情况下，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质可操作地连接到诱导型启动子上，任选地其中所述异源重组系统基因位于操纵子中。在一些情况下，所述诱导型启动子可通过添加试剂、耗竭代谢物或试剂或通过温度变化来诱导。在一些情况下，所述试剂选自由以下组成的组：阿拉伯糖、异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和四环素。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli/E.coli)菌株。在一些情况下，所述引入步骤包括转化所述微生物宿主细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是真核细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是酵母细胞。在一些情况下，所述酵母细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是丝状真菌。在一些情况下，所述丝状真菌是黑曲霉(Aspergillusniger)。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是原核细胞。在一些情况下，所述原核宿主细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
另一方面，本文提供了一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：a.)将微生物宿主细胞的基础群体与第一编辑质粒池组合，其中所述第一池中的每个编辑质粒包括至少一个修复片段，其中所述第一编辑质粒池包括至少两个不同的修复片段，其中所述第一编辑质粒池中的每个编辑质粒进一步包括选择标志基因，并且其中所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对一或多个位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与所述第一编辑质粒池一起引入到所述微生物宿主细胞中，其中所述一或多个位点特异性限制酶靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座，其中每个修复片段包括所述一或多个位点特异性限制酶所靶向的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；b.)将来自所述第一编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(a)的单独微生物宿主细胞中；以及c.)使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述方法进一步包括步骤(d)，所述步骤(d)包括使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。在一些情况下，不同的编辑质粒被引入到单独微生物宿主细胞中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，不同的编辑构建体被引入到所述单独微生物宿主细胞的亚群体中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述至少两个不同的修复片段存在于同一质粒上。在一些情况下，所述至少两个不同的修复片段存在于不同的质粒上。在一些情况下，所述不同的编辑质粒包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的修复片段，由此产生至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有一个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的单独细胞、具有一个基因组编辑的单独细胞以及具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述方法进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：d.)使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；e.)将额外编辑质粒池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑质粒池包括至少一或两个不同的修复片段，其中所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与所述额外编辑质粒池一起被引入到所述微生物宿主细胞中，所述额外编辑质粒池靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座，并且其中每个修复片段包括所述一或多个位点特异性限制酶所靶向的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；f.)将来自所述额外编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中；以及g.)使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。在一些情况下，不在至少一个编辑轮次之后、不在每个编辑轮次之后或不在任何编辑轮次之后执行反选择。在一些情况下，不在至少一个编辑轮次之后、不在每个编辑轮次之后或不在任何编辑轮次之后执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。在一些情况下，每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的多个基因编辑的序列。在一些情况下，每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。在一些情况下，所述方法进一步包括对在步骤(c)中选择的菌落进行基因分型。在一些情况下，所述方法进一步包括对在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长的微生物宿主细胞进行基因分型。在一些情况下，1)在每个编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择；或者2)在任何编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。在一些情况下，与先前与所述微生物宿主细胞组合的每个其它或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒相比，所述第一编辑质粒池和所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的复制起点或相同的复制起点类别。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述第一或额外编辑质粒池包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个不同的编辑质粒。在一些情况下，所述第一或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的选择标志基因。在一些情况下，所述选择标志基因包括抗生素或营养缺陷型选择标志基因。在一些情况下，所述一或多个位点特异性限制酶中的每个切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座处的序列。在一些情况下，所述一或多个位点特异性限制酶中的每个选自由以下组成的组：RNA引导的核酸内切酶、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)。在一些情况下，所述位点特异性限制酶中的每个编码在质粒上、编码在所述基因组中、从RNA翻译或引入到所述细胞中作为蛋白质。在一些情况下，所述基因编辑选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。在一些情况下，在一或多个额外编辑轮次中引入的所述修复片段包括一或多个基因编辑的不同序列并且与来自前一编辑轮次的不同选择标志基因相关联。在一些情况下，在一或多个额外编辑轮次中引入的所述gRNA靶向不同的一或多个基因座并且与来自前一编辑轮次的不同抗生素选择标志基因相关联。在一些情况下，所述方法进一步包括步骤(h)，其中步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒，其中所述最终修复片段包括所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终一或多个基因座中或邻近所述最终一或多个基因座的一或多个基因编辑的序列，其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列同源的序列，其中所述最终一或多个基因座包括与先前编辑的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座，其中所述最终质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列，其中所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的所述最终质粒一起被引入到所述微生物宿主细胞中。在一些情况下，所述方法进一步包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补的向导序列的gRNA，以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。在一些情况下，所述微生物宿主细胞包括来自一或多个异源重组系统的一组蛋白质。在一些情况下，所述微生物宿主细胞包括来自λred重组系统、RecET重组系统的一组蛋白质、来自λred重组系统或RecET重组系统的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。在一些情况下，来自所述λred重组系统的所述一组蛋白质包括β蛋白、gam蛋白和exo蛋白。在一些情况下，在步骤(a)之前，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质在包括对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因的质粒上被引入到所述微生物宿主细胞中。在一些情况下，由于对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因整合到所述微生物宿主细胞的基因组中，因此来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质被所述微生物宿主细胞稳定地表达。在一些情况下，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质是组成型表达的。在一些情况下，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质可操作地连接到诱导型启动子上，任选地其中所述异源重组系统基因位于操纵子中。在一些情况下，所述诱导型启动子可通过添加试剂、耗竭代谢物或试剂或通过温度变化来诱导。在一些情况下，所述试剂选自由以下组成的组：阿拉伯糖、异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和四环素。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是大肠杆菌菌株。在一些情况下，所述引入步骤包括转化所述微生物宿主细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是真核细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是酵母细胞。在一些情况下，所述酵母细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是丝状真菌。在一些情况下，所述丝状真菌是黑曲霉(Aspergillus niger)。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是原核细胞。在一些情况下，所述原核宿主细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
在仍额外的方面，本文提供了一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：a.将微生物宿主细胞的基础群体与包括一或多个编辑质粒的第一编辑构建体池组合，其中所述第一编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，其中所述微生物宿主细胞包括RNA引导的DNA核酸内切酶，或者RNA引导的DNA核酸内切酶与所述第一编辑构建体池一起被引入到所述微生物宿主细胞中，并且其中所述第一编辑构建体池包括：i.靶向相同的一或多个靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；ii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的相同的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；或者iii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；b.将包括所述一或多个编辑质粒的所述第一编辑构建体池引入到来自步骤(a)的单独微生物宿主细胞中，其中所述第一编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及c.使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述方法进一步包括步骤(d)，所述步骤(d)包括使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。在一些情况下，不同的编辑质粒被引入到单独微生物宿主细胞中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，不同的编辑构建体被引入到所述单独微生物宿主细胞的亚群体中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述至少两个不同的修复片段存在于同一质粒上。在一些情况下，所述至少两个不同的修复片段存在于不同的质粒上。在一些情况下，所述第一编辑构建体池进一步包括一或多个线性片段。在一些情况下，所述第一编辑构建体池进一步包括两个或两个以上不同的线性片段。在一些情况下，所述第一编辑构建体池包括两个或两个以上不同的编辑质粒。在一些情况下，所述gRNA存在于所述一或多个编辑质粒上。在一些情况下，所述修复片段存在于所述一或多个编辑质粒上。在一些情况下，所述gRNA和所述修复片段存在于所述一或多个编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述gRNA存在于同一编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述修复片段存在于同一编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑所述不同基因座的所述gRNA存在于所述两个或两个以上不同的编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑所述不同基因座的所述修复片段存在于所述两个或两个以上不同的编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述gRNA和所述修复片段存在于同一编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑所有基因座的所述gRNA和所述修复片段存在于同一编辑质粒上。在一些情况下，所述gRNA存在于所述一或多个线性片段上。在一些情况下，所述修复片段存在于所述一或多个线性片段上。在一些情况下，所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在所述一或多个线性片段上。在一些情况下，所述两个或两个以上不同的线性片段包括不同的修复片段。在一些情况下，所述两个或两个以上不同的线性片段包括不同的gRNA。在一些情况下，所述线性片段作为ssDNA或dsDNA提供。在一些情况下，所述线性片段含有末端修饰。在一些情况下，所述末端修饰应用于所述线性片段的5'和/或3'末端。在一些情况下，所述修饰选自由以下组成的组，但不限于：磷酸化末端、硫代磷酸酯连接碱基、发夹、倒置碱基、碱基修饰、2'O-甲基碱基、锁定核酸碱基、硫代磷酸化2'O-甲基碱基和硫代磷酸化锁定核酸碱基。在一些情况下，所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的修复片段或多个不同的修复片段。在一些情况下，所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的gRNA或多个不同的gRNA。在一些情况下，所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的修复片段和不同的gRNA或多个不同的修复片段和多个不同的gRNA。在一些情况下，所述不同的编辑构建体包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的gRNA和/或修复片段，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有一个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的单独细胞、具有一个基因组编辑的单独细胞以及具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述方法进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：d.使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；e.将包括一或多个编辑质粒的额外编辑构建体池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，并且其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；f.将包括所述一或多个编辑质粒的所述额外编辑构建体池引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中，其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及g.使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。在一些情况下，不在至少一个编辑轮次之后、不在每个编辑轮次之后或不在任何编辑轮次之后执行反选择。在一些情况下，不在至少一个编辑轮次之后、不在每个编辑轮次之后或不在任何编辑轮次之后执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。在一些情况下，每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的多个基因编辑的序列。在一些情况下，每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。在一些情况下，在步骤(b)或(f)中引入的所述gRNA包括与所述一或多个靶基因座互补的序列，并且每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。在一些情况下，在步骤(f)中引入的所述gRNA包括与在前一编辑轮次中靶向的任何一或多个基因座不同的一或多个基因座互补的序列，并且每个修复片段包括所述不同的一或多个基因座中或邻近所述不同的一或多个基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。在一些情况下，在步骤(f)中引入的所述gRNA包括与在前一编辑轮次中靶向的相同的一或多个基因座互补的序列，并且每个修复片段包括相比于在前一编辑轮次中引入的基因编辑在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个不同基因编辑的序列。在一些情况下，步骤(f)包括将一或多个不同的编辑构建体引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中，其中所述不同的编辑构建体包括与在前一编辑轮次中引入的所述gRNA和/或所述修复片段不同的gRNA和/或修复片段，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生一或多个不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述一或多个不同的编辑构建体包括不同的gRNA，所述不同的gRNA包括与至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个不同的一或多个基因座互补的序列，其中所述不同的一或多个基因座与任何先前靶向的一或多个基因座不同。在一些情况下，所述一或多个不同的编辑构建体包括不同的修复片段，所述不同的修复片段包括相比于在前一编辑轮次中引入的基因编辑在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个不同基因编辑的序列。在一些情况下，所述方法进一步包括对在步骤(c)中选择的菌落进行基因分型。在一些情况下，所述方法进一步包括对在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长的微生物宿主细胞进行基因分型。在一些情况下，1)在每个编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择；或者2)在任何编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。在一些情况下，与先前与所述微生物宿主细胞组合的每个其它或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒相比，所述第一编辑质粒池和所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的复制起点或相同的复制起点类别。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述第一或额外编辑质粒池包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个不同的编辑质粒。在一些情况下，所述第一或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的选择标志基因。在一些情况下，所述选择标志基因包括抗生素或营养缺陷型选择标志基因。在一些情况下，所述RNA引导的DNA核酸内切酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座处的序列。在一些情况下，所述RNA引导的DNA核酸内切酶选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1或其同源物、直系同源物或旁系同源物。在一些情况下，所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在质粒上、编码在所述基因组中、从RNA翻译或引入到所述细胞中作为蛋白质。在一些情况下，所述gRNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一些情况下，所述gRNA包含单gRNA(sgRNA)。在一些情况下，所述基因编辑选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。在一些情况下，在一或多个额外编辑轮次中引入的所述修复片段包括一或多个基因编辑的不同序列并且与来自前一编辑轮次的不同选择标志基因相关联。在一些情况下，在一或多个额外编辑轮次中引入的所述gRNA靶向不同的一或多个基因座并且与来自前一编辑轮次的不同抗生素选择标志基因相关联。在一些情况下，所述方法进一步包括步骤(h)，其中步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终gRNA和最终修复片段的最终质粒，其中所述最终gRNA包括与所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终一或多个基因座互补的序列，其中所述最终一或多个基因座包括与先前引入到所述微生物宿主细胞中的gRNA所靶向的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座，其中所述最终修复片段包括所述最终一或多个基因座中的一或多个基因编辑的序列，其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列同源的序列，并且其中所述最终质粒、所述最终gRNA和/或所述最终修复片段与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列相关联。在一些情况下，所述方法进一步包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补的向导序列的gRNA，以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。在一些情况下，所述微生物宿主细胞包括来自一或多个异源重组系统的一组蛋白质。在一些情况下，所述微生物宿主细胞包括来自λred重组系统、RecET重组系统的一组蛋白质、来自λred重组系统或RecET重组系统的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。在一些情况下，来自所述λred重组系统的所述一组蛋白质包括β蛋白、gam蛋白和exo蛋白。在一些情况下，在步骤(a)之前，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质在包括对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因的质粒上被引入到所述微生物宿主细胞中。在一些情况下，由于对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因整合到所述微生物宿主细胞的基因组中，因此来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质被所述微生物宿主细胞稳定地表达。在一些情况下，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质是组成型表达的。在一些情况下，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质可操作地连接到诱导型启动子上，任选地其中所述异源重组系统基因位于操纵子中。在一些情况下，所述诱导型启动子可通过添加试剂、耗竭代谢物或试剂或通过温度变化来诱导。在一些情况下，所述试剂选自由以下组成的组：阿拉伯糖、异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和四环素。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是大肠杆菌菌株。在一些情况下，所述引入步骤包括转化所述微生物宿主细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是真核细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是酵母细胞。在一些情况下，所述酵母细胞是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是丝状真菌。在一些情况下，所述丝状真菌是黑曲霉(Aspergillus niger)。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是原核细胞。在一些情况下，所述原核宿主细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
在又另一方面，本文提供的一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：将微生物宿主细胞的基础群体与包括一或多个编辑质粒的第一编辑构建体池组合，其中所述第一编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，并且其中所述第一编辑构建体池包括：i.靶向至少两个不同靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；ii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；或者iii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；b.)将RNA引导的DNA核酸内切酶以及包括所述一或多个编辑质粒的所述第一编辑构建体池引入到来自步骤(a)的单独微生物宿主细胞中，其中所述第一编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及c.)使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述方法进一步包括步骤(d)，所述步骤(d)包括使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。在一些情况下，不同的编辑构建体被引入到所述单独微生物宿主细胞的亚群体中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述至少两个不同的修复片段存在于同一质粒上。在一些情况下，所述至少两个不同的修复片段存在于不同的质粒上。在一些情况下，所述第一编辑构建体池进一步包括一或多个线性片段。在一些情况下，所述第一编辑构建体池进一步包括两个或两个以上不同的线性片段。在一些情况下，所述第一编辑构建体池包括两个或两个以上不同的编辑质粒。在一些情况下，所述gRNA存在于所述一或多个编辑质粒上。在一些情况下，所述修复片段存在于所述一或多个编辑质粒上。在一些情况下，所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在所述一或多个编辑质粒上。在一些情况下，所述gRNA和所述修复片段存在于所述一或多个编辑质粒上。在一些情况下，所述RNA引导的DNA核酸内切酶、所述gRNA和产生每个编辑所需的所述修复片段的序列均存在于所述一或多个编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述gRNA存在于同一编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述修复片段存在于同一编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑所述不同基因座的所述gRNA存在于所述两个或两个以上不同的编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑所述不同基因座的所述修复片段存在于所述两个或两个以上不同的编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述gRNA和所述修复片段存在于同一编辑质粒上。在一些情况下，用于靶向和编辑所有基因座的所述gRNA和所述修复片段存在于同一编辑质粒上。在一些情况下，所述gRNA存在于所述一或多个线性片段上。在一些情况下，所述修复片段存在于所述一或多个线性片段上。在一些情况下，所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在所述一或多个线性片段上。在一些情况下，所述两个或两个以上不同的线性片段包括不同的修复片段。在一些情况下，所述两个或两个以上不同的线性片段包括不同的gRNA。在一些情况下，所述线性片段作为ssDNA或dsDNA提供。在一些情况下，所述线性片段含有末端修饰。在一些情况下，所述末端修饰应用于所述线性片段的5'和/或3'末端。在一些情况下，所述修饰选自由以下组成的组，但不限于：磷酸化末端、硫代磷酸酯连接碱基、发夹、倒置碱基、碱基修饰、2'O-甲基碱基、锁定核酸碱基、硫代磷酸化2'O-甲基碱基和硫代磷酸化锁定核酸碱基。在一些情况下，所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的修复片段或多个不同的修复片段。在一些情况下，所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的gRNA或多个不同的gRNA。在一些情况下，所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的修复片段和不同的gRNA或多个不同的修复片段和多个不同的gRNA。在一些情况下，所述不同的编辑构建体包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的gRNA和/或修复片段，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有一个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的单独细胞、具有一个基因组编辑的单独细胞以及具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述方法进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：d.使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；e.将包括一或多个编辑质粒的额外编辑构建体池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，并且其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；f.将RNA引导的DNA核酸内切酶以及包括所述一或多个编辑质粒的所述额外编辑构建体池引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中，其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及d.使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。在一些情况下，不在至少一个编辑轮次之后、不在每个编辑轮次之后或不在任何编辑轮次之后执行反选择。在一些情况下，不在至少一个编辑轮次之后、不在每个编辑轮次之后或不在任何编辑轮次之后执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。在一些情况下，每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的多个基因编辑的序列。在一些情况下，每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。在一些情况下，在步骤(b)或(f)中引入的所述gRNA包括与所述一或多个靶基因座互补的序列，并且每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。在一些情况下，在步骤(f)中引入的所述gRNA包括与在前一编辑轮次中靶向的任何一或多个基因座不同的一或多个基因座互补的序列，并且每个修复片段包括所述不同的一或多个基因座中或邻近所述不同的一或多个基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。在一些情况下，在步骤(f)中引入的所述gRNA包括与在前一编辑轮次中靶向的相同的一或多个基因座互补的序列，并且每个修复片段包括相比于在前一编辑轮次中引入的基因编辑在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个不同基因编辑的序列。在一些情况下，步骤(f)包括将一或多个不同的编辑构建体引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中，其中所述不同的编辑构建体包括与在前一编辑轮次中引入的所述gRNA和/或所述修复片段不同的gRNA和/或修复片段，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生一或多个不同的基因修饰的微生物菌株。在一些情况下，所述一或多个不同的编辑构建体包括不同的gRNA，所述不同的gRNA包括与至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个不同的一或多个基因座互补的序列，其中所述不同的一或多个基因座与任何先前靶向的一或多个基因座不同。在一些情况下，所述一或多个不同的编辑构建体包括不同的修复片段，所述不同的修复片段包括相比于在前一编辑轮次中引入的基因编辑在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个不同基因编辑的序列。在一些情况下，所述方法进一步包括对在步骤(c)中选择的菌落进行基因分型。在一些情况下，所述方法进一步包括对在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长的微生物宿主细胞进行基因分型。在一些情况下，1)在每个编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择；或者2)在任何编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。在一些情况下，与先前与所述微生物宿主细胞组合的每个其它或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒相比，所述第一编辑质粒池和所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的复制起点或相同的复制起点类别。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的单独细胞。在一些情况下，所述第一或额外编辑质粒池包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个不同的编辑质粒。在一些情况下，所述第一或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的选择标志基因。在一些情况下，所述选择标志基因包括抗生素或营养缺陷型选择标志基因。在一些情况下，所述RNA引导的DNA核酸内切酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座处的序列。在一些情况下，所述RNA引导的DNA核酸内切酶选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1或其同源物、直系同源物或旁系同源物。在一些情况下，所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在质粒上、编码在所述基因组中、从RNA翻译或引入到所述细胞中作为蛋白质。在一些情况下，所述gRNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一些情况下，所述gRNA包含单gRNA(sgRNA)。在一些情况下，所述基因编辑选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。在一些情况下，在一或多个额外编辑轮次中引入的所述修复片段包括一或多个基因编辑的不同序列并且与来自前一编辑轮次的不同选择标志基因相关联。在一些情况下，在一或多个额外编辑轮次中引入的所述gRNA靶向不同的一或多个基因座并且与来自前一编辑轮次的不同抗生素选择标志基因相关联。在一些情况下，所述方法进一步包括步骤(h)，其中步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终gRNA和最终修复片段的最终质粒，其中所述最终gRNA包括与所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终一或多个基因座互补的序列，其中所述最终一或多个基因座包括与先前引入到所述微生物宿主细胞中的gRNA所靶向的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座，其中所述最终修复片段包括所述最终一或多个基因座中的一或多个基因编辑的序列，其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列同源的序列，并且其中所述最终质粒、所述最终gRNA和/或所述最终修复片段与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列相关联。在一些情况下，所述方法进一步包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补的向导序列的gRNA，以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。在一些情况下，所述微生物宿主细胞包括来自一或多个异源重组系统的一组蛋白质。在一些情况下，所述微生物宿主细胞包括来自λred重组系统、RecET重组系统的一组蛋白质、来自λred重组系统或RecET重组系统的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。在一些情况下，来自所述λred重组系统的所述一组蛋白质包括β蛋白、gam蛋白和exo蛋白。在一些情况下，在步骤(a)之前，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质在包括对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因的质粒上被引入到所述微生物宿主细胞中。在一些情况下，由于对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因整合到所述微生物宿主细胞的基因组中，因此来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质被所述微生物宿主细胞稳定地表达。在一些情况下，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质是组成型表达的。在一些情况下，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质可操作地连接到诱导型启动子上，任选地其中所述异源重组系统基因位于操纵子中。在一些情况下，所述诱导型启动子可通过添加试剂、耗竭代谢物或试剂或通过温度变化来诱导。在一些情况下，所述试剂选自由以下组成的组：阿拉伯糖、异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和四环素。在一些情况下，所述引入步骤包括转化所述微生物宿主细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是真核细胞。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是酵母细胞。在一些情况下，所述酵母细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是丝状真菌。在一些情况下，所述丝状真菌是黑曲霉(Aspergillusniger)。在一些情况下，所述微生物宿主细胞是原核细胞。在一些情况下，所述原核宿主细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
附图说明
图1描绘了如本文所提供并在实例1中详述的迭代基因组编辑的实施例的工作流程示意图。
图2展示了可选标志物随转化的变化的损失。
图3展示了迭代编辑转化的编辑效率。转化1(即1_cadA)在W3110中产生了18％的编辑效率(筛选了46个复制品)。转化2(2_maeA)在W3110中产生了100％的编辑效率(筛选了6个复制品)。转化3(3_maeB)在W3110中产生了75％的编辑效率(筛选了16个复制品)。*cadA缺失被认为具有潜在毒性，从而产生较低编辑效率(这在不同条件下的多个实验中观察到)。
图4展示了在3个迭代堆积轮次之后筛选大肠杆菌菌落的菌落PCR反应。以灰色叠加的野生型条带大小用于转化编辑1和2。顶部小图-cadA：WT＝1826bp，cadA缺失＝933bp，中间小图-maeA：WT＝2256bp，maeA缺失＝881bp，底部小图-maeB：WT＝2590bp，maeB缺失＝1047bp。
图5A-5D展示了通过转化和选择第二质粒从菌株中清除先前存在的质粒的实例。图5A示出含有带有抗生素抗性标志物(abR1)的质粒的细胞被具有相同复制起点(圆圈)和不同抗生素选择标志物(abR2)的第二质粒。图5B示出含有第二质粒的转化体的选择通过在含有针对第二标志物的抗生素的培养基上铺板进行，从而产生含有两种质粒的细胞。图5C示出了在选择第二质粒下的生长导致第一质粒损失。图5D示出任选的最终步骤涉及通过主动反选择或通过解除抗生素选择而损失第二质粒以产生最终不含质粒的菌株。
图6描绘了对大肠杆菌转化体经受汇集的CRISPR编辑的菌落PCR筛选结果。
图7展示了引入到谷氨酸棒状杆菌中的sgRNA/修复质粒池的组成。
图8展示了用图7中展示的sgRNA/修复质粒池转化的谷氨酸棒状杆菌转化体的组成。
图9描绘了如本文所提供并在实例6中详述的迭代和汇集的迭代CRISPR基因组编辑的实施例的工作流程示意图。
图10A-10B展示了使用CRISPR/Cas9同源定向修复在酿酒酵母中的汇集的基因组编辑。图10A描绘了通过引入以下三(3)类线性DNA分子进行的CRISPR/Cas9介导的转化：对Cas9表达基因和抗生素(即诺尔丝菌素(Nourseothricin))抗性标志基因进行编码的质粒骨架、整合到Cas9表达质粒中的具有同源性的sgRNA表达盒以及sgRNA所靶向的基因组基因座的多个编辑有效载荷。图10B示出了来自六(6)个转化实验的基因分型数据，所述转化实验引入了3个有效载荷的池以插入到靶向酿酒酵母基因组中的六(6)个基因座之一的sgRNA所靶向的六(6)个可能的基因组基因座(即ARI1基因、TRP1基因、ADH6基因、ECM13基因、MCH5基因或PRB1基因)中的每一个中。在每个实验中，在汇集的基因组编辑后恢复多个基因型。
图11A-11C展示了使用CRISPR/Cas9同源定向修复在酿酒酵母中的迭代基因组编辑。图11A描绘了快速迭代转化过程：按照标准的转化过程，在抗生素培养基上选择转化体。菌落作为池培养，然后用含有抗生素标志物2的替代性质粒骨架进行第二次转化，并且在含有抗生素2的固体培养基上选择转化体。使用抗生素3重复此过程以产生具有3个编辑的菌株。图11B示出了通过用以下3个线性DNA分子转化进行的CRISPR/Cas9介导的转化：对Cas9表达基因和三个抗生素标志物之一进行编码的质粒骨架、整合到Cas9表达质粒中的具有同源性的sgRNA表达盒以及sgRNA所靶向的基因组基因座的修复模板。图11C示出了在传统转化之后通过快速迭代转化引入的两个基因组编辑的基因分型的结果。经基因分型的28个菌落中有17.8％包含两个迭代编辑。
图12A展示了执行汇集的质粒迭代堆叠(PPIS)的过程，而图12B-12C示出在PPIS方法中使用CRISPR介导的同源定向修复应用4个独特编辑/轮次持续4个轮次之后捕获大肠杆菌中125个可能基因型中的11个可能基因型或约9％的可能基因型(4个轮次中的1个轮次中未发生编辑并且被排除在#个可能基因型之外)。
图13A展示了执行汇集的亲本迭代堆叠(PPAIS)的过程，而图13B-13C示出在PPAIS方法中使用CRISPR介导的同源定向修复应用4个独特编辑/轮次持续4个轮次之后捕获大肠杆菌中125个可能基因型中的26个可能基因型或约21％的可能基因型(4个轮次中的1个轮次中未发生编辑并且被排除在#个可能基因型之外)。
图14A展示了使用被动反选择的单个迭代堆叠的过程。图14B示出了在第3轮次转化之后菌株对卡那霉素的敏感性。图14C-14D示出在使用CRISPR介导的同源定向修复在4个轮次中应用4个独特编辑之后捕获大肠杆菌中32个可能基因型中的7个可能基因型或约22％的可能基因型(4个轮次中的1个轮次中未发生编辑并且被排除在#个可能基因型之外)。
图15描绘了经受如实例7中所描述的同源重组(HR)介导的汇集的菌株构建的大肠杆菌的PCR筛选和下一代测序(NGS)的结果。
具体实施方式
定义
虽然认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，但是阐述以下定义是为了便于解释当前公开的主题。
如本文所使用的，术语“一个(a)”或“一种(an)”是指一或多个这种实体，即可以指复数指示物。如此，术语“一个”或“一种”、“一或多个”和“至少一个”在本文中可以可互换地使用。另外，通过不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”提及“一个元素”并不排除存在多于一个元素的可能性，除非上下文明确地要求存在一个且仅有一个元素。
除非上下文另有要求，否则贯穿本说明书和权利要求书，词语“包括(comprise)”和其变型(如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”)将以开放式的、包含性的意义进行解释，即解释为“包含但不限于”。
贯穿本说明书对“一个实施例(one embodiment)”或“一个实施例(anembodiment)”的引用意味着结合所述实施例所描述的特定特征、结构或特性可以包含在本公开的至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书中各个地方出现的短语“在一个实施例中(in one embodiment)”或“在一个实施例中(in an embodiment)”不一定都是指同一个实施例。应理解，为清楚起见，在单独的实施例的上下文中描述的本公开的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反地，为简便起见，在单个实施例的背景下描述的本公开的不同特征也可以单独地或以任何适合的子组合提供。
如本文所使用的，术语“细胞生物体”“微生物(microorganism)”或“微生物(microbe)”应被广义地理解。这些术语可互换地使用，并且包含但不限于两原核生物领域(即细菌和古菌)以及某些真核真菌和原生生物。在一些实施例中，本公开是指本公开中存在的列表/表格和附图的“微生物(microorganism)”或“细胞生物体”或“微生物(microbe)”。此表征不仅可以指本文所提供的经鉴定的分类属，而且还可以指经鉴定的分类种以及本文所提供的任何生物体的各种新型且新鉴定或设计的菌株。
如本文所使用的，术语“原核生物”是本领域公认的且指不含细胞核或其它细胞器的细胞。通常将原核生物分类到细菌和古细菌两个领域之一中。古细菌领域和细菌领域的生物体之间的确切差异是基于16S核糖体RNA中的核苷酸碱基序列的基本差异。
如本文所使用的，术语“古细菌”是指疵壁菌(Mendosicute)门生物体的分类、通常发现于不寻常的环境中并且通过若干个标准与其余原核生物区分开，所述若干个标准包含核糖体蛋白的数量和细胞壁中胞壁酸的缺乏。在ssrRNA分析的基础上，古细菌由以下两个系统发育上不同的组组成：泉古菌(Crenarchaeota)和广古菌(Euryarchaeota)。在其生理学的基础上，古细菌可以组织成三种类型：产甲烷菌(methanogens)(产生甲烷的原核生物)；极端嗜盐菌(halophiles)(生活在很高浓度的盐(NaCl)中的原核生物)；以及极端(超)嗜热菌(thermophilus)(生活在非常高的温度下的原核生物)。除了将原核生物与细菌(即，细胞壁中没有胞壁质、酯连接的膜脂质等)区分开的统一古细菌特征外，这些原核生物表现出使其适应自己的特定栖息地的独特结构或生化属性。泉古菌主要由超嗜热硫依赖性原核生物组成，并且广古菌含有产甲烷菌和极端嗜盐菌。
如本文所使用的，“细菌”或“真细菌”可以指原核生物体的领域。细菌包含如下至少11种不同的群组：(1)革兰氏阳性(gram+)细菌，其中主要有两个亚门：(1)高G+C菌群(放线菌属(Actinomycetes)、分枝杆菌(Mycobacteria)、微球菌属(Micrococcus)等)；(2)低G+C菌群(芽孢杆菌属(Bacillus)、梭状芽胞杆菌属(Clostridia)、乳酸菌属(Lactobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococci)、支原体属(Mycoplasmas))；(2)变形菌门(Proteobacteria)，例如紫色光合的+非光合的革兰氏阴性细菌(包含最“常见的”革兰氏阴性细菌)；(3)蓝细菌(Cyanobacteria)，例如含氧光能利用菌；(4)螺旋菌(Spirochetes)和相关种；(5)浮霉状菌属(Planctomyces)；(6)拟杆菌属(Bacteroides)、黄杆菌(Flavobacteria)；(7)衣原体属(Chlamydia)；(8)绿硫菌(Greensulfur bacteria)；(9)绿非硫菌(Green non-sulfur bacteria)(也为厌氧光能利用菌(anaerobic phototrophs))；(10)抗放射性微球菌(Radioresistant micrococci)和相关物；(11)热袍菌属(Thermotoga)和嗜热菌热袍菌属(Thermosipho thermophiles)。
如本文所使用的，“真核生物”是其细胞含有细胞核和封闭在膜内的其它细胞器的任何生物体。真核生物属于真核域(Eukarya)或真核生物域(Eukaryota)分类单元。将真核细胞与原核细胞(上述细菌和古细菌)区分开的定义性特征是真核细胞具有膜结合的细胞器，特别是细胞核，所述细胞核含有遗传物质并且由核膜封闭。
如本文所使用的，术语“经基因修饰的宿主细胞”、“重组宿主细胞”和“重组菌株”在本文中可互换地使用并且可以指已经通过本文所提供的迭代基因编辑方法进行基因修饰的宿主细胞。因此，术语包含与其所来源于的天然存在的生物体相比已经进行基因改变、修饰或工程化使得其表现出改变的、经修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当基因修饰影响微生物的编码核酸序列时)的宿主细胞(例如，细菌等)。应当理解，在一些实施例中，术语不仅指所讨论的特定重组宿主细胞，而且还指此类宿主细胞的后代或潜在后代。
如本文所使用的，术语“野生型微生物”或“野生型宿主细胞”可以描述自然界中出现的细胞，即未经基因修饰的细胞。
如本文所使用的，术语“基因工程化”可以指对宿主细胞的基因组的任何操纵(例如，通过核酸的插入、缺失、突变或替换)。
如本文所使用的，术语“对照”或“对照宿主细胞”可以指用于测定基因修饰或实验处理的效果的适当的比较宿主细胞。在一些实施例中，所述对照宿主细胞是野生型细胞。在其它实施例中，对照宿主细胞在基因上与经基因修饰的宿主细胞相同，除了区分处理宿主细胞的基因修饰之外。在一些实施例中，本公开教导了使用亲本菌株作为对照宿主细胞。在其它实施例中，宿主细胞可以是缺乏在处理宿主细胞中测试的特异性启动子或SNP的基因上相同的细胞。
如本文所使用的，术语“等位基因”可以意指基因的一或多种替代性形式中的任何一种，所有这些等位基因与至少一个性状或特性相关。在二倍体细胞中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的对应基因座。
如本文所使用的，术语“基因座(locus)”(基因座(loci)复数)可以意指期望对天然基因组序列进行编辑的任何位点。在一个实施例中，所述术语可以意指在染色体上发现例如基因或基因标志物的一或多个特定位置或位点。
如本文所使用的，术语“基因连接(genetically linked)”可以指在育种期间以高比率共同遗传使得其难以通过杂交分离的两个或两个以上性状。
如本文所使用的，“重组”或“重组事件”可以指染色体交换或独立分类。
如本文所使用的，术语“表型”可以指个体细胞、细胞培养物、生物体或生物体群组的可观察特性，所述可观察特性由所述个体的基因组成(即基因型)与环境之间的相互作用产生。
如本文所使用的，术语“嵌合”或“重组”在描述核酸序列或蛋白质序列时可以指将至少两个异源多核苷酸或两个异源多肽连接成单个大分子或者重排至少一种天然核酸或蛋白质序列的一或多个元素的核酸或蛋白质序列。例如，术语“重组”可以指两个以其它方式分离的序列片段的人工组合，例如通过化学合成或通过基因工程技术对分离的核酸片段进行操纵。
如本文所使用的，“合成核苷酸序列”或“合成多核苷酸序列”是自然界中未知的或非天然发生的核苷酸序列。通常，当与任何其它天然发生的核苷酸序列相比时，此类合成核苷酸序列可以包括至少一个核苷酸差异。
如本文所使用的，术语“核酸”可以指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其类似物。此术语可以指分子的一级结构并且因此包含双链和单链DNA以及双链和单链RNA。所述术语还包含经修饰的核酸，如甲基化和/或加帽的核酸、含有经修饰的碱基的核酸、主链修饰等。术语“核酸”和“核苷酸序列”可互换使用。
如本文所使用的，术语“基因”可以指与生物功能相关的DNA的任何片段。因此，基因可以包含但不限于其表达所需的编码序列和/或调节序列。基因还可以包含非表达的DNA片段，例如形成其它蛋白质的识别序列。基因可以从多种来源获得，包含从所关注的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可以包含被设计成具有期望的参数的序列。
如本文所使用的，术语“同源”或“同源物”或“直系同源物”或“直系同源序列”是本领域已知的并且可以指共享共同祖先或家族成员并且基于序列同一性程度确定的有关序列。
术语“同源性”、“同源”、“基本上类似”和“基本上对应”可以在本文中可互换地使用。所述术语可以指其中一或多个核苷酸碱基的改变不影响核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力的核酸片段。这些术语还指本公开的核酸片段的修饰，如相对于初始的未经修饰的片段基本上不改变所得核酸片段的功能性质的一或多个核苷酸的缺失或插入。因此，如本领域技术人员将理解的，应当理解，本公开不仅仅涵盖具体的示范性序列。这些术语描述在一种物种、亚种、变种、栽培品种或菌株中发现的基因与另一物种、亚种、变种、栽培品种或菌株中的对应或等效基因之间的关系。出于本公开的目的，对同源序列进行比较。
认为、相信或已知“同源序列”或“同源物”或“直系同源物”在功能上相关。可以通过多种方式中的任何一种方式指示功能关系，包含但不限于：(a)序列同一性程度和/或(b)相同或类似的生物功能。优选地，指示(a)和(b)两者。氨基酸或核酸序列之间的序列同源性可以根据共享祖先来定义。由于物种形成事件(直系同源物)或复制事件(旁系同源物)，两个核酸片段可以具有共享祖先。氨基酸或核酸序列之间的同源性可以从其序列相似性推断，使得如果所述氨基酸或核酸序列共享显著相似性，则所述氨基酸或核酸序列是同源的。显著相似性可以是两个序列通过来自共同祖先的趋异进化而相关的有力证据。多个序列的比对可以用于发现同源区域。同源性可以使用本领域中可容易获得的软件程序来测定，如在当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编,1987)增刊30,第7.718章,表7.71中论述的那些软件程序。一些比对程序是BLAST(NCBI)、MacVector(英国牛津的牛津分子有限公司(Oxford MolecularLtd))、ALIGN Plus(宾夕法尼亚州科学与教育软件公司(Scientific and EducationalSoftware))和AlignX(载体NTI(Vector NTI)，加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司(Invitrogen))。另一个比对程序是使用默认参数的Sequencher(密歇根州安阿伯市基因编码公司(Gene Codes))。
如本文所使用的，术语“内源性”或“内源基因”可以指在宿主细胞基因组内天然发现的位置中的天然发生的基因。在本公开的上下文中，将异源启动子可操作地连接到内源基因意指在现有基因之前、在所述基因天然存在的位置中在基因上插入异源启动子序列。如本文所描述的，内源基因可以包含根据本公开的任何方法已经突变的天然发生的基因的等位基因。
如本文所使用的，术语“外源”可以与术语“异源”可互换地使用，并且是指来自除其天然来源之外的某个来源的物质。例如，术语“外源蛋白”或“外源基因”是指来自非天然来源或定位并且已被人工供应给生物系统的蛋白质或基因。
如本文所使用的，如本领域所熟知的，术语“核苷酸变化”是指例如核苷酸取代、缺失和/或插入。例如，突变可以含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变编码蛋白质的性质或活性或蛋白质的制备方式的改变。可替代地，突变可以是可以改变编码蛋白质的氨基酸序列并且可以导致蛋白质性质或活性改变的非同义取代或改变。
如本文所使用的，如本领域所熟知的，术语“蛋白质修饰”可以指例如氨基酸取代、氨基酸修饰、缺失和/或插入。
如本文所使用的，术语核酸或多肽的“至少一部分”或“片段”可以意指具有此类序列的最小尺寸特性的部分或全长分子的至多并包含全长分子的任何较大片段。本公开的多核苷酸的片段可以对基因调节元件的生物活性部分进行编码。基因调节元件的生物活性部分可以通过分离本公开的多核苷酸之一的包括基因调节元件的部分并且如本文所描述的对活性进行评估来制备。类似地，多肽的一部分可以是1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸，依此类推，直至全长多肽。待使用的部分的长度将取决于特定的应用。核酸的可用作杂交探针的部分可以短至12个核苷酸；在一些实施例中，所述部分为20个核苷酸。多肽的可用作表位的部分可以短至4个氨基酸。多肽的执行全长多肽的功能的部分通常将长于4个氨基酸。
变体多核苷酸还可以涵盖源自诱变和重组程序(如DNA改组)的序列。用于此类DNA改组的策略是本领域已知的。例如，参见施特默尔(Stemmer)(1994)美国国家科学院院刊(PNAS)91:10747-10751；施特默尔(1994)自然(Nature)370:389-391；克拉梅里(Crameri)等人,(1997)自然生物科技(Nature Biotech.)15:436-438；摩尔(Moore)等人,1997,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)272:336-347；张(Zhang)等人,(1997)美国国家科学院院刊94:4504-4509；克拉梅里等人,(1998),自然391:288-291；以及美国专利第5,605,793号和第5,837,458号。
对于本文中公开的PCR扩增，可以将寡核苷酸引物设计成用于在PCR反应中使用以从提取自任何所关注生物体的cDNA或基因组DNA扩增对应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域中通常是已知的并且在萨姆布鲁克(Sambrook)等人(2001)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第3版,纽约普莱恩维尤冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))中公开。还参见英尼斯(Innis)等人编,(1990)PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications)(纽约学术出版社(Academic Press))；英尼斯和盖尔芬德(Gelfand)编,(1995)PCR策略(PCR Strategies)(纽约学术出版社)；以及英尼斯和盖尔芬德编,(1999)PCR方法手册(PCR Methods Manual)(纽约学术出版社(Academic Press))。PCR的已知方法包含但不限于使用配对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物的方法、使用多组成对引物同时扩增多于一个DNA片段的多重方法等。
如本文所使用的，术语“引物”可以指能够与允许DNA聚合酶连接的扩增靶标粘接的寡核苷酸，由此当被置于引物延伸产物的合成被诱导的条件下时即在核苷酸和如DNA聚合酶等聚合剂的存在下以及在适当的温度和pH下用作DNA合成的起始点。(扩增)引物可以是单链的以得到最大扩增效率。所述引物可以是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在聚合剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包含温度和引物的组成(A/T对G/C含量)。一对双向引物由一个正向引物和一个反向引物组成，如DNA扩增领域中如PCR扩增中常用的。
如本文所使用的，“启动子”可以指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。在一些实施例中，启动子序列可以由近侧和更远侧的上游元件组成，后一种元件通常被称为增强子。因此，“增强子”可以是可以刺激启动子活性的DNA序列并且可以是启动子的先天元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以全部来源于天然基因，或者由来源于在自然界中发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包括合成DNA片段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境条件的表达。例如，启动子可以用于以组成型或响应于内源或外源刺激的方式改变基因的表达水平。进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全限定，因此某些变异的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
如本文所使用的，短语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”可以在本文中可互换地使用。重组构建体可以包括核酸片段的人工组合，例如自然界中未一起发现的调节序列和编码序列。例如，嵌合构建体可以包括源自不同来源的调节序列和编码序列或源自相同来源但以与自然界中发现的方式不同的方式布置的调节序列和编码序列。此类构建体可以单独使用或者可以与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于如本领域技术人员所熟知的将用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分了解为了成功转化、选择和繁殖包括本公开的分离的核酸片段中的任何分离的核酸片段的宿主细胞而必须存在于载体上的遗传因子。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和模式(琼斯(Jones)等人,(1985)欧洲分子生物学学会会刊(EMBO J.)4:2411-2418；阿尔梅达(De Almeida)等人,(1989)分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genetics)218:78-86)，并且因此必须筛选多个事件以获得显示所期望的表达水平和模式的线。可以通过直接测序、DNA的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、蛋白表达的免疫印迹分析或表型分析等来完成此类筛选。载体可以是自主复制或可以整合到宿主细胞的染色体中的质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体也可以是不自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一链内的DNA和RNA两者构成的多核苷酸、聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀合的DNA等。如本文所使用的，术语“表达”是指功能性最终产物例如mRNA或蛋白质(前体或成熟)的产生。
“可操作地连接”或“功能性连接”可以意指根据本公开的任何功能性遗传因子(例如，启动子、终止子、降解决定子、溶解度标签等)与额外的寡核苷酸或多核苷酸的顺序布置。在一些情况下，顺序布置可以导致所述额外的多核苷酸的转录。在一些情况下，顺序布置可以导致所述额外的多核苷酸的翻译。功能性遗传因子可以存在于额外的寡核苷酸或多核苷酸的上游或下游。在一个实例中，“可操作地连接”或“功能性连接”可以意指启动子控制邻近所述启动子或位于所述启动子下游或3'的基因的转录。在另一个实例中，“可操作地连接”或“功能性连接”可以意指终止子控制邻近所述终止子或位于所述终止子上游或5'的基因转录的终止。
如本文所使用的，术语“所关注的产物”或“生物分子”可以指微生物从原种产生的任何产物。在一些情况下，所关注的产物可以是小分子、酶、肽、氨基酸、有机酸、合成化合物、燃料、酒精等。例如，所关注的产物或生物分子可以是任何初级或次级细胞外代谢物。初级代谢物可以尤其是乙醇、柠檬酸、乳酸、谷氨酸、谷氨酸盐、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸和其它氨基酸、维生素、多糖等。次级代谢物可以尤其是抗生素化合物(如青霉素)或免疫抑制剂(如环孢菌素A)、植物激素(如赤霉素)、他汀类药物(如洛伐他汀)、杀真菌剂(如灰黄霉素)等。所关注的产物或生物分子也可以是由微生物产生的任何细胞内组分，如：微生物酶，所述微生物酶包含：过氧化氢酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖异构酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、乳糖酶、链激酶等。细胞内组分还可以包含重组蛋白，如胰岛素、乙肝疫苗、干扰素、粒细胞集落刺激因子、链激酶等。
如本文所使用的，术语“HTP基因设计文库”或“文库”可以指根据本公开的遗传扰动集合。在一些实施例中，本发明的文库可以表现为：i)数据库或其它计算机文件中的序列信息的集合；ii)包括上述一系列遗传因子的基因构建体的集合；或iii)包括所述遗传因子的宿主细胞株。在一些实施例中，本公开的文库可以指单独因子的集合(例如，PRO交换文库的启动子集合、STOP交换文库的终止子集合、SOLUBILITY TAG交换文库的蛋白质溶解度标签集合、或DEGRADATION TAG交换文库的蛋白质降解标签集合)。在其它实施例中，本公开的文库还可以指遗传因子的组合，如启动子:基因、基因:终止子、或甚至启动子:基因:终止子的组合。在一些实施例中，本公开的文库还可以指启动子、终止子、蛋白质溶解度标签和/或蛋白质降解标签的组合。在一些实施例中，本公开的文库进一步包括与将文库的每个成员应用于宿主生物体中的效果相关联的元数据。例如，如本文所使用的，文库可以包含启动子::基因序列组合的集合以及那些组合对特定物种中的一或多种表型的所产生的影响，因此使用所述组合改进在未来启动子交换中的未来预测价值。
如本文所使用的，术语“SNP”指小核多态性。在一些实施例中，本公开的SNP应该被广义地解释，并且包含单核苷酸多态性、序列插入、缺失、倒位和其它序列替换。如本文所使用的，术语“非同义”或“非同义SNP”可以指导致宿主细胞蛋白质的编码改变的突变。
基因组工程化的“高通量(HTP)”方法可以涉及使用至少一个使得能够评估大量实验或条件的设备，例如自动化设备(例如，液体处理器或板处理器机器)来执行所述方法的至少一个步骤。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”可以涵盖寡核苷酸并指任何长度的核酸。多核苷酸可以是DNA或RNA。除非另有说明，多核苷酸可以是单链(ss)或双链(ds)。多核苷酸可以是合成的(例如，在DNA合成仪中合成的)或天然发生的(例如，从天然资源中提取的或源自经克隆或经扩增的材料)。本文所指代的多核苷酸可以含有经修饰的碱基或核苷酸。
如本文所使用的，术语“池”可以指至少2个多核苷酸的集合。多核苷酸池可以包括多个不同的多核苷酸。在一些实施例中，池中的一组多核苷酸可以包括至少5个、至少10个、至少12个或至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个或至少1000个或1000个以上多核苷酸。
如本文所使用的，术语“组装”可以指其中两个或两个以上、四个或四个以上、六个或六个以上、八个或八个以上、十个或十个以上、12个或12个以上、15个或15个以上多核苷酸的反应，例如四个或四个以上多核苷酸接合到另一个多核苷酸以形成更长的多核苷酸。
如本文所使用的，术语“在合适的反应条件下温育”可以指将反应维持在合适的温度和时间以实现期望的结果，即多核苷酸组装。适用于在本发明的方法中使用的酶和试剂的反应条件是已知的(例如，如本文中的实例中所描述的)，并且如此可以容易地确定用于本发明的方法的适合的反应条件。这些反应条件可以根据所使用的酶而变化(例如，取决于所述反应条件的最佳温度等)。
如本文所使用的，术语“接合”可以指两个序列之间共价连接的产生。
如本文所使用的，术语“组合物”可以指除所列试剂外还可以含有其它试剂(例如，甘油、盐、dNTP等)的试剂组合。组合物可以呈任何形式，例如水性或冻干的，并且可以处于任何状态(例如，冷冻或液体形式)。
如本文所使用的，“载体”是可以整合片段或DNA组装使得工程化载体可以在宿主细胞中复制的合适DNA。线性化载体可以通过限制性核酸内切酶消化环状载体或通过PCR产生。片段和/或线性化载体的浓度可以通过凝胶电泳或其它方式确定。
如本文所使用的，术语“整合子”可以指整合到核酸(例如，基因组、质粒等)中的可移动遗传因子或遗传因子，所述可移动遗传因子或遗传因子包括或含有包括外源基因、对整合子整合酶(Intl)进行编码的基因、整合子相关重组位点(attl)和整合子相关启动子(Pc)，如迈克尔R.吉林斯(Gillings,Michael R),“整合子：过去、现在和未来(Integrons:Past,Present,and Future)”微生物学与分子生物学综述(Microbiology and MolecularBiology Review),2014年6月第78:2卷,第257-277页中所描述的，其内容通过引用并入本文中。
概述
本文提供了用于产生一或多种基因修饰的微生物菌株的组合物和试剂盒。本文还提供了用于编辑微生物宿主细胞的基因组以产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法。所述方法可以用于以汇集方式在微生物宿主细胞的基因组中引入和/或堆叠多个基因编辑。为了促进所述多个基因编辑在其基因组内的引入和/或堆叠，所述微生物宿主细胞可以包括位点特异性限制酶和/或一或多个重组系统和来自多个基因编辑的每个基因编辑可以包括在其5'和3'末端两者上的序列，所述序列与所述微生物宿主细胞中的核酸(例如，基因组、质粒等)内存在的基因座同源。本文所提供的方法可能需要将修复或供体核酸，例如线性核酸片段(单链或双链)上的基因编辑引入到微生物宿主细胞中。本文所述的编辑方法本质上可以是汇集的，这意味着用于在微生物群体中产生多个不同编辑的组分在每个编辑轮次中被混合或汇集。可以在本文所述的编辑方法中利用一或多个编辑轮次(例如，转化和选择)，使得至少一个轮次不需要使用功能性反选择(例如，抗生素、化学或温度反选择)。在一个实施例中，修复或供体核酸存在于相同或单独的质粒上，所述质粒在每个编辑轮次中被引入并且包括与在前一和/或后一转化和选择轮次中引入的质粒上存在的可选择标志基因不同的可选择标志基因。进一步地，在每个转化和选择轮次中引入的质粒可以包括与贯穿所述方法引入的其它质粒彼此相同的复制起点。从在转化轮次中引入的微生物宿主细胞中消除或去除质粒可以通过在包括试剂的培养基上生长来促进，所述试剂对表达当前轮次的可反选择标志基因的微生物宿主细胞施加选择压力。本文还提供了在本文所提供的方法中使用的用于以迭代或非迭代的方式编辑微生物宿主细胞的基因组的组合物和试剂盒。基因编辑可以选自由以下组成的组：插入(例如，从一个或几个核苷酸的小插入到多个基因的通路插入)、缺失(例如，从一个或几个核苷酸的小缺失到多个基因的通路缺失)、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑、或其任何组合。本文所提供的方法中的每个转化轮次可以将单个基因编辑引入到微生物宿主细胞中的遗传因子(例如，基因组或质粒)内的单个基因座中或将多个基因编辑引入到微生物宿主细胞中的遗传因子(例如，基因组或质粒)内的多个基因座中。用于本文所提供的方法、组合物和试剂盒中的所述微生物宿主细胞可以是原核或真核细胞。
在一个实施例中，本文提供了一种用于编辑微生物宿主细胞基因组的方法，所述方法包括：(a)将包括第一修复片段和选择标志基因的第一质粒引入到所述微生物宿主细胞中，其中所述第一修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的第一基因座中或邻近所述第一基因座的基因编辑的序列分离的同源臂，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述第一基因座的序列互补或同源的序列；(b)使来自步骤(a)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；以及(c)使在步骤(b)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。在一个实施例中，所述编辑方法包括将基因编辑引入到所述微生物宿主细胞的单个轮次。在一个实施例中，所述方法是迭代的并且进一步包括步骤(d)，所述步骤(d)包括在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞中在一或多个额外轮次中重复步骤(a)-(c)，其中所述一或多个额外轮次中的每个轮次包括引入包括额外修复片段的额外质粒，其中所述额外修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的基因座中或邻近所述基因座的基因编辑的序列分离的同源臂，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述基因座的序列互补或同源的序列，并且其中所述额外质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因，由此迭代地编辑所述微生物宿主细胞基因组。一或多个额外轮次可以是至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个将基因编辑引入到所述微生物宿主细胞的轮次。在一个实施例中，在至少一个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在每个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在任何编辑轮次之后不执行反选择。在又另一个实施例中，仅在交替编辑轮次之后执行反选择。在仍另一个实施例中，仅在最后编辑轮次之后执行反选择。所述反选择可以通过所述微生物宿主细胞表达抗生素、化学品或温度敏感性可反选择标志基因进行。所述选择标志基因可以是抗生素或营养缺陷型选择标志基因，例如本文所提供的抗生素或营养缺陷型选择标志基因。在一或多个额外轮次中的每个轮次中靶向的基因座可以是第一基因座或来自第一基因座的另一或不同基因座。在一或多个额外轮次中的每个轮次中靶向的基因座可以是与来自另一迭代方法轮次的基因座相同的基因座。在一或多个额外轮次中的每个轮次中靶向的基因座可以是作为来自另一迭代方法轮次的基因座的另一或不同基因座。
在一个实施例中，每个修复片段(即第一修复片段和/或额外修复片段)可以包括与来自先前修复片段的所述基因编辑中的一或多个基因编辑相同的基因编辑的序列。因此，可以在所述方法的每个轮次(第一轮次和/或额外轮次)中在每个基因座处引入相同基因编辑的序列。在一个实施例中，每个修复片段(即第一修复片段和/或额外修复片段)可以包括与来自先前修复片段的所述基因编辑中的一或多个基因编辑不同的基因编辑的序列。因此，可以在所述方法的每个轮次(第一轮次和/或额外轮次)中在每个基因座处引入不同基因编辑的序列。在一个实施例中，引入多个不同的第一修复片段。所述多个不同的第一修复片段可以包括在不同基因座中或邻近所述不同基因座的基因编辑的序列。在一个实施例中，引入多个不同的额外修复片段。所述多个额外修复片段中的每个修复片段可以包括在不同基因座中或邻近不同基因座的基因编辑的序列。在一个实施例中，在所述方法的每个轮次中在每个不同基因座处引入的基因编辑是相同的基因编辑。在一个实施例中，在所述方法的每个轮次中在每个不同基因座处引入的基因编辑是不同的基因编辑。所述基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。
在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(e)，所述步骤(e)包括在重复步骤(a)-(c)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒。所述最终修复片段可以包括同源臂，所述同源臂被所述微生物宿主细胞的基因组中的最终基因座中或邻近所述最终基因座的基因编辑的序列分离，使得所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的基因组中的所述最终基因座的序列互补或同源的序列。所述最终基因座可以是与先前编辑的任何基因座不同的基因座。所述最终质粒可以包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列。在一个实施例中，在终末轮次之后执行反选择。在一个实施例中，所述方法进一步包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补或同源的向导序列的向导RNA(gRNA)，以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何此类核酸内切酶。所述gRNA可以包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，所述gRNA包括单gRNA(sgRNA)。
在一个实施例中，本文提供了一种用于编辑微生物宿主细胞基因组的方法，所述方法包括或需要：(a)将包括第一修复片段和选择标志基因的第一质粒引入到所述微生物宿主细胞中，其中所述微生物宿主细胞包括位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的序列与所述第一质粒一起被引入到所述微生物宿主细胞中，其中所述位点特异性限制酶靶向(例如，结合)所述微生物宿主细胞的所述基因组中的第一基因座，并且其中所述第一修复片段包括被所述第一基因座中或邻近所述第一基因座的基因编辑的序列分离的同源臂，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述第一基因座的序列互补或同源的序列；(b)使来自步骤(a)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；以及(c)使在步骤(b)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。在一个实施例中，所述编辑方法包括将基因编辑的序列引入到所述微生物宿主细胞的单个轮次。在一个实施例中，所述方法是迭代的并且进一步包括步骤(d)，所述步骤(d)包括或需要在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞中在一或多个额外轮次中重复步骤(a)-(c)，其中所述一或多个额外轮次中的每个轮次包括引入包括额外修复片段的额外质粒，其中所述额外修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的基因座中或邻近所述基因座的基因编辑的序列分离的同源臂，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述基因座的序列互补或同源的序列，并且其中所述额外质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因，并且其中所述微生物宿主细胞包括位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的序列与所述额外质粒一起被引入到所述微生物宿主细胞中，所述额外质粒靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述第一基因座或另一基因座，由此迭代地编辑所述微生物宿主细胞基因组。一或多个额外轮次可以是至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个将基因编辑引入到所述微生物宿主细胞的轮次。在一个实施例中，在至少一个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在每个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在任何编辑轮次之后不执行反选择。在又另一个实施例中，仅在交替编辑轮次之后执行反选择。在仍另一个实施例中，仅在最后编辑轮次之后执行反选择。所述反选择可以通过所述微生物宿主细胞表达抗生素、化学品或温度敏感性可反选择标志基因进行。所述选择标志基因可以是抗生素或营养缺陷型选择标志基因，例如本文所提供的任何抗生素或营养缺陷型选择标志基因。在一个实施例中，步骤(a)中的所述位点特异性酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述第一基因座处的序列。在一个实施例中，步骤(d)中的所述位点特异性限制酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中在所述一或多个额外轮次中的每个轮次中靶向的所述基因座处的序列。在一或多个额外轮次中的每个轮次中靶向的基因座可以是第一基因座或来自第一基因座的另一或不同基因座。在一或多个额外轮次中的每个轮次中靶向的基因座可以是与来自另一迭代方法轮次的基因座相同的基因座。在一或多个额外轮次中的每个轮次中靶向的基因座可以是作为来自另一迭代方法轮次的基因座的另一或不同基因座。在本文所提供的编辑方法的每个轮次(例如，第一轮次和/或额外轮次)中引入的包括基因编辑序列的修复片段中的每个修复片段可以包括与所述微生物宿主细胞中的位点特异性限制酶所靶向的基因座互补或同源的序列。在所述编辑方法的每个轮次(例如，第一轮次和/或额外轮次)中引入的存在于修复片段上的基因编辑中的每个基因编辑可以侧接有与所述微生物宿主细胞中的位点特异性限制酶所靶向的基因座同源的序列。与所述微生物宿主细胞中的位点特异性限制酶所靶向的基因座互补或同源的序列可以存在于修复片段或基因编辑中的每个修复片段或每个基因编辑的5'和3'端两者上，并且可以被称为同源臂。在一个实施例中，每个修复片段(即第一修复片段和/或额外修复片段)可以包括与存在于先前修复片段上的所述基因编辑中的一或多个基因编辑相同的基因编辑的序列。因此，可以在所述方法的每个轮次(第一轮次和/或额外轮次)中在每个基因座处引入相同基因编辑的序列。在一个实施例中，每个修复片段(即第一修复片段和/或额外修复片段)可以包括与存在于先前修复片段上的所述基因编辑中的一或多个基因编辑不同的基因编辑的序列。因此，可以在所述方法的每个轮次(第一轮次和/或额外轮次)中在每个基因座处引入不同基因编辑的序列。在一个实施例中，引入多个不同的第一修复片段。所述多个不同的第一修复片段可以包括在不同基因座中或邻近所述不同基因座的基因编辑的序列。在一个实施例中，引入多个不同的额外修复片段。所述多个额外修复片段可以包括在不同基因座中或邻近所述不同基因座的基因编辑的序列。在一个实施例中，在所述方法的每个轮次中在每个不同基因座处引入的基因编辑是相同的基因编辑。在一个实施例中，在所述方法的每个轮次中在每个不同基因座处引入的基因编辑是不同的基因编辑。进一步到此实施例，所述微生物宿主细胞中的位点特异性限制酶可以切割在一或多个重复轮次中在每个不同基因座处的序列。所述基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。
在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(e)，所述步骤(e)包括在重复步骤(a)-(c)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒。所述最终修复片段可以包括所述微生物宿主细胞的基因组中的最终基因座中或邻近所述最终基因座的基因编辑的序列。所述最终基因座可以是与先前编辑的任何基因座不同的基因座。所述最终质粒可以包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列。所述微生物宿主细胞可以包括位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的序列可以与靶向所述微生物宿主细胞的基因组中的最终基因座的最终质粒一起被引入到所述微生物宿主细胞中。所述最终修复片段可以包括同源臂，所述同源臂包括与最终基因座或由所述位点特异性限制酶切割的基因座互补或同源的序列。在一个实施例中，所述方法进一步包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补或同源的向导序列的向导RNA(gRNA)，以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何此类核酸内切酶。所述gRNA可以包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，所述gRNA包括单gRNA(sgRNA)。
在一个实施例中，上述迭代编辑方法本质上是汇集的，这意味着用于在微生物群体中产生多个编辑的组分在每个编辑轮次中被混合或汇集。进一步到此实施例，每个轮次或转化可以包括添加包括2个或2个以上修复片段的池。每个修复片段可以靶向与2个或2个以上修复片段的每个其它修复片段不同的基因座。每个修复片段可以包括与2个或2个以上修复片段的每个其它修复片段不同的基因编辑的序列。上述迭代编辑方法的每个轮次或转化可以每个轮次或转化添加包括至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个修复片段的池。如本文所提供的，2个或2个以上修复片段中的每个修复片段可以存在于质粒上，所述质粒可以被称为编辑质粒。2个或2个以上修复片段中的每个修复片段都可以存在于同一质粒上。2个或2个以上修复片段中的每个修复片段都可以存在于不同的质粒上。在一个实施例中，在每个轮次或转化中添加的2个或2个以上修复片段中的每个修复片段可以包括用于如本文所提供的2个或2个以上基因编辑的序列。不同的gRNA/修复片段对可以包括至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个或10000个不同的gRNA和/或修复片段，并且可以由此在经编辑的微生物宿主细胞群体中产生至少、至多或正好2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、12种、14种、16种、18种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种或10000种不同的基因修饰的微生物菌株。如本文所提供的，修复片段上的基因编辑中的每个基因编辑的序列可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑或多重编辑。
在一个实施例中，本文提供了一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法专门利用同源重组。所述同源重组可以与用于产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株的微生物宿主细胞天然或异源。所述方法可以包括：(a)将微生物宿主细胞的基础群体与第一编辑质粒池组合，其中所述池中的每个编辑质粒包括至少一个修复片段，并且其中所述编辑质粒池包括至少两个不同的修复片段，其中所述池中的每个编辑质粒进一步包括选择标志基因，并且其中每个修复片段包括在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列互补或同源的序列；(b)将来自所述编辑质粒池的质粒引入到来自步骤(a)的单独微生物宿主细胞中；以及(c)使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。在一个实施例中，步骤(b)需要将不同的编辑质粒引入到所述单独微生物宿主细胞的亚群体中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。所述不同的编辑质粒可以包括至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个不同的修复片段，并且由此可以产生至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个不同的基因修饰的微生物菌株。所述至少两个不同的修复片段可以存在于同一编辑质粒上。所述至少两个不同的修复片段可以存在于不同的编辑质粒上。所述一或多个基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。所述选择标志基因可以是抗生素或营养缺陷型选择标志基因。
在一个实施例中，上述专门使用同源重组产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法进一步包括步骤(d)，所述步骤(d)包括使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。步骤(d)可以促进从在步骤(b)中引入的编辑质粒池中清除质粒。
在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(e)，所述步骤(e)包括将额外编辑质粒池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑质粒池包括至少一或两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括包含与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座的序列互补或同源的序列的同源臂，并且其中每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于所述同源臂之间。在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(f)，所述步骤(f)包括将来自所述额外编辑质粒池的质粒引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中。在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(g)使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。
上述用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法可以是迭代过程，所述迭代过程包括在一或多个额外编辑轮次中重复步骤(d)-(g)，使得所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与第一或先前组合的编辑质粒池中存在的选择标志基因不同的选择标志基因。所述一或多个额外轮次可以是至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个轮次。在一个实施例中，在至少一个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在每个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在任何编辑轮次之后不执行反选择。在又另一个实施例中，仅在交替编辑轮次之后执行反选择。在仍另一个实施例中，仅在最后编辑轮次之后执行反选择。所述反选择可以通过所述微生物宿主细胞表达抗生素、化学品或温度敏感性可反选择标志基因进行。在所述一或多个额外编辑轮次中引入的所述修复片段可以包括一或多个基因编辑的不同序列并且与来自前一编辑轮次的不同选择标志基因相关联。所述一或多个基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。
在一个实施例中，用于产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株的方法进一步包括步骤(h)，所述步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒。所述最终修复片段可以包括在所述微生物宿主细胞的核酸(例如，基因组或质粒)中的最终一或多个基因座中或邻近所述最终一或多个基因座的一或多个基因编辑的序列。所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列互补或同源的序列。所述最终一或多个基因座可以包括与先前编辑的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座。所述最终质粒可以包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列。在一个实施例中，所述方法进一步包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补或同源的向导序列的向导RNA(gRNA)，以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何此类核酸内切酶。
在一个实施例中，本文提供了一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：(a)将微生物宿主细胞的基础群体与第一编辑质粒池组合，其中所述池中的每个编辑质粒包括至少一个修复片段，其中所述编辑质粒池包括至少两个不同的修复片段，其中所述编辑质粒池中的每个编辑质粒进一步包括选择标志基因，并且其中所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与所述第一编辑质粒池一起引入到所述微生物宿主细胞中，其中所述一或多个位点特异性限制酶各自靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座，其中每个修复片段包括来自所述一或多个位点特异性限制酶所靶向的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列；(b)将来自所述编辑质粒池的质粒引入到来自步骤(a)的单独微生物宿主细胞中；以及(c)使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。在一个实施例中，步骤(b)需要将不同的编辑质粒引入到所述单独微生物宿主细胞的亚群体中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。所述不同的编辑质粒可以包括至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个不同的修复片段，并且由此可以产生至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个不同的基因修饰的微生物菌株。所述至少两个不同的修复片段可以存在于同一质粒或不同的质粒上。在一个实施例中，所述修复片段中的每个修复片段包括与所述位点特异性限制酶所靶向的基因座互补或同源的序列。在一个实施例中，所述一或多个基因编辑或所述修复片段中的每个修复片段的每个序列包括与所述微生物宿主细胞中存在的或引入到所述微生物宿主细胞中的位点特异性限制酶所靶向的基因座互补或同源的序列。与所述微生物宿主细胞中存在的或引入到所述微生物宿主细胞中的位点特异性限制酶所靶向的基因座互补或同源的序列可以存在于所述修复片段中的每个修复片段或所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的5'和3'端两者上，并且可以被称为同源臂，使得5'端上的所述同源臂可以被称为左同源臂，而3'端上的所述同源臂可以被称为右同源臂。在一个实施例中，存在于或引入到所述微生物宿主细胞中的位点特异性限制酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座处的序列。所述一或多个基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。所述选择标志基因可以是本领域已知的和/或本文所提供的抗生素或营养缺陷型选择标志基因。
在一个实施例中，用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法进一步包括步骤(d)，所述步骤(d)包括使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。步骤(d)可以促进从在步骤(b)中引入的编辑质粒池中清除质粒。在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(e)，所述步骤(e)包括将额外编辑质粒池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑质粒池包括至少一或两个不同的修复片段，其中所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与所述额外编辑质粒池一起被引入到所述微生物宿主细胞中，所述额外编辑质粒池靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座，并且其中每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列。在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(f)，所述步骤(f)包括将来自所述额外编辑质粒池的质粒引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中。在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(g)，所述步骤(g)包括使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。
上述用于利用位点特异性限制酶产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法可以是迭代过程，所述迭代过程包括在一或多个额外编辑轮次中重复步骤(d)-(g)，使得所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与第一或先前组合的编辑质粒池上存在的选择标志基因不同的选择标志基因。所述一或多个额外轮次可以是至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个轮次。在一个实施例中，在至少一个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在每个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在任何编辑轮次之后不执行反选择。在又另一个实施例中，仅在交替编辑轮次之后执行反选择。在仍另一个实施例中，仅在最后编辑轮次之后执行反选择。所述反选择可以通过所述微生物宿主细胞表达抗生素、化学品或温度敏感性可反选择标志基因进行。在一个实施例中，存在于或引入到所述微生物宿主细胞中的位点特异性限制酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座处的序列。在所述一或多个额外编辑轮次中引入的所述修复片段可以包括一或多个基因编辑的不同序列并且与来自前一编辑轮次的不同选择标志基因相关联。所述一或多个基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。
在一个实施例中，用于产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株的方法进一步包括步骤(h)，所述步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒。所述最终修复片段可以包括在所述微生物宿主细胞的核酸(例如，基因组或质粒)中的最终一或多个基因座中或邻近所述最终一或多个基因座的一或多个基因编辑的序列。所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列可以位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列互补或同源的序列。最终一或多个基因座可以包括与先前编辑的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座。所述最终质粒可以与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列相关联。所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的所述最终质粒一起被引入到所述微生物宿主细胞中。在一个实施例中，所述方法进一步包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补或同源的向导序列的向导RNA(gRNA)，以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何此类核酸内切酶。
用于本文所提供的方法中的任何方法的任何步骤的所述位点特异性限制酶可以是本领域已知的任何位点特异性限制酶。所述位点特异性限制酶可以选自由以下组成的群组：RNA引导的DNA核酸内切酶、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)。在一个实施例中，所述位点特异性限制酶在质粒上编码。在一个实施例中，所述位点特异性限制酶在整合子上编码。在一个实施例中，所述位点特异性限制酶在所述基因组中编码。在一个实施例中，所述位点特异性限制酶从RNA翻译。在一个实施例中，所述位点特异性限制酶作为蛋白质被引入到细胞中。在一个实施例中，所述位点特异性限制酶是RNA引导的DNA核酸内切酶。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以是2类CRISPR-Cas系统RNA引导的核酸内切酶。所述2类CRISPR-Cas系统RNA引导的DNA核酸内切酶是II型、V型或VI型RNA引导的核酸内切酶。在一个实施例中，CRISPR-Cas系统RNA引导的DNA核酸内切酶选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1和MAD7或其同源物、直系同源物、突变体、变体或其修饰版本。
在一个实施例中，上述方法本质上是多路的，这意味着每个轮次可以将多个基因编辑引入单个微生物的核酸(例如，基因组、质粒等)中。进一步对此实施例，每个修复片段包括所述微生物宿主细胞中的核酸(例如，基因组或质粒)中的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的多个基因编辑的序列。每个修复片段可以包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个基因编辑的序列。修复片段上的每个基因编辑的序列可以选自由以下组成的群组：如本文所提供的插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑或多重编辑。如本文所提供的，修复片段中的每个修复片段可以存在于质粒上。包括一或多个修复片段的质粒可以称为编辑质粒。
在另一个实施例中，本文提供了一种用于编辑微生物宿主细胞基因组的方法，所述方法包括：(a)将第一质粒、第一向导RNA(gRNA)和第一修复片段引入到所述微生物宿主细胞中，其中所述gRNA包括与所述微生物宿主细胞的所述基因组中的第一基因座互补或同源的序列，其中所述第一修复片段包括被所述第一基因座中或邻近所述第一基因座的基因编辑的序列分离的同源臂，并且其中所述第一质粒包括选择标志基因以及所述gRNA和所述修复片段中的至少一者或两者，并且其中所述微生物宿主细胞包括RNA引导的DNA核酸内切酶，或者RNA引导的DNA核酸内切酶与所述第一质粒一起被引入到所述宿主细胞中；(b)使来自步骤(a)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；(c)使在步骤(b)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。在一个实施例中，所述编辑方法包括将基因编辑引入到所述微生物宿主细胞的单个轮次。在一个实施例中，所述方法是迭代的并且进一步包括步骤(d)，所述步骤(d)包括或需要在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞中在一或多个额外轮次中重复步骤(a)-(c)，其中所述一或多个额外轮次中的每个轮次包括引入额外质粒、额外gRNA和额外修复片段，其中所述额外gRNA包括与所述微生物宿主细胞的所述基因组中的基因座互补或同源的序列，其中所述额外修复片段包括被所述微生物宿主细胞的所述基因组中的基因座中或邻近所述基因座的基因编辑的序列分离的同源臂，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述基因座的序列互补或同源的序列，并且其中所述额外质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因，并且其中所述额外质粒包括所述额外gRNA和所述额外修复片段中的至少一者或两者，由此迭代地编辑所述微生物宿主细胞基因组。一或多个额外轮次可以是至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个将基因编辑引入到所述微生物宿主细胞的轮次。在一个实施例中，在至少一个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在每个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在任何编辑轮次之后不执行反选择。在又另一个实施例中，仅在交替编辑轮次之后执行反选择。在仍另一个实施例中，仅在最后编辑轮次之后执行反选择。所述反选择可以通过所述微生物宿主细胞表达抗生素、化学品或温度敏感性可反选择标志基因进行。所述选择标志基因可以是抗生素或营养缺陷型选择标志基因。在一个实施例中，步骤(a)中的所述RNA引导的DNA核酸内切酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述第一基因座处的序列。步骤(d)中的所述RNA引导的DNA核酸内切酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中在所述一或多个额外轮次中的每个轮次中靶向的所述基因座处的序列。在一或多个额外轮次中的每个轮次中靶向的基因座可以是第一基因座或来自第一基因座的另一或不同基因座。在一或多个额外轮次中的每个轮次中靶向的基因座可以是与来自另一迭代方法轮次的基因座相同的基因座。在一或多个额外轮次中的每个轮次中靶向的基因座可以是作为来自另一迭代方法轮次的基因座的另一或不同基因座。
在一个实施例中，所述第一质粒包括所述第一gRNA和所述第一修复片段，并且所述额外质粒中的每个额外质粒包括额外gRNA和额外修复片段。在一个实施例中，所述第一gRNA作为线性片段提供。在一个实施例中，每个额外gRNA作为线性片段提供。在一个实施例中，所述第一gRNA和每个额外gRNA作为线性片段提供。在一个实施例中，所述第一gRNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，每个额外gRNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，所述第一gRNA和每个额外gRNA两者包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，所述第一gRNA是单gRNA(sgRNA)。在一个实施例中，每个额外gRNA是单gRNA(sgRNA)。在一个实施例中，所述第一gRNA和每个额外gRNA两者是单gRNA(sgRNA)。在额外一个编辑轮次中引入的gRNA可以靶向与前一编辑轮次不同的一或多个基因座。在上述编辑方法的每个轮次中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以切割在gRNA所靶向的每个基因座处的所述微生物宿主细胞的基因组中的序列。
在本文所提供的方法的连续轮次中引入的其中存在的修复片段或基因编辑中的每个修复片段或基因编辑可以包括与由RNA引导的DNA核酸内切酶切割的靶向基因座中、靶向基因座处或邻近靶向基因座的序列互补或同源的序列。与靶向基因座互补或同源的序列可以存在于其中存在的修复片段或基因编辑序列中的每一个的5'和3'端两者上，并且可以被称为同源臂。在一个实施例中，所述第一修复片段作为线性片段提供。在一个实施例中，每个额外修复片段作为线性片段提供。在一个实施例中，所述第一修复片段和每个额外修复片段两者均作为线性片段提供。在一个实施例中，所述第一修复片段作为ssDNA或dsDNA提供。在一个实施例中，每个额外修复片段作为ssDNA或dsDNA提供。在一个实施例中，所述第一修复片段和每个额外修复片段两者作为ssDNA或dsDNA提供。所述线性片段可以包含一或多个末端修饰。所述末端修饰可以应用于线性片段的5'和/或3'末端。所述末端修饰可以选自由以下组成的组，但不限于：磷酸化末端、硫代磷酸酯连接碱基、发夹、倒置碱基、碱基修饰、2'O-甲基碱基、锁定核酸碱基、硫代磷酸化2'O-甲基碱基和硫代磷酸化锁定核酸碱基。每个修复片段(即第一修复片段和/或额外修复片段)可以包括与存在于先前修复片段上的所述基因编辑中的一或多个基因编辑相同的基因编辑的序列。每个修复片段(即第一修复片段和/或额外修复片段)可以包括与存在于先前修复片段上的所述基因编辑中的一或多个基因编辑不同的基因编辑的序列。在一个实施例中，引入多个不同的第一修复片段。所述多个不同的第一修复片段中的每个不同的第一修复片段可以包括在不同基因座中或邻近所述不同基因座的基因编辑的序列。在一个实施例中，引入多个不同的额外修复片段。所述多个额外修复片段中的每个修复片段可以包括在不同基因座中或邻近不同基因座的基因编辑的序列。在一个实施例中，在所述方法的每个轮次中在每个不同基因座处引入的基因编辑是相同的基因编辑。在一个实施例中，在所述方法的每个轮次中在每个不同基因座处引入的基因编辑是不同的基因编辑。所述基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。
在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(e)，所述步骤(e)包括在重复步骤(a)-(c)的终末轮次中引入最终质粒、最终gRNA和最终修复片段。所述最终gRNA可以包括与所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终基因座互补或同源的序列。所述最终基因座可以是与先前引入到所述微生物宿主细胞中的gRNA所靶向的任何基因座不同的基因座。所述最终修复片段可以包括被所述最终基因座中的基因编辑的序列分离的同源臂。所述同源臂可以包括与侧接最终基因座的序列互补或同源的序列。所述最终gRNA和/或所述最终修复片段可以与和在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列相关联。所述最终质粒可以包括所述最终gRNA和所述最终修复片段中的至少一者或两者。在一个实施例中，所述最终gRNA作为线性片段提供。在一个实施例中，所述最终gRNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，所述最终gRNA是单gRNA(sgRNA)。在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(f)，步骤(f)包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补或同源的向导序列的gRNA，以促进通过CRISPR在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。在一个实施例中，包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补或同源的向导序列的gRNA作为线性片段提供。在一个实施例中，包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补或同源的向导序列的gRNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补或同源的向导序列的gRNA是单gRNA(sgRNA)。
在一个实施例中，上述迭代编辑方法本质上是汇集的，这意味着用于在微生物群体中产生多个编辑的组分在每个编辑轮次中被混合或汇集。进一步到此实施例，上述迭代编辑方法的每个轮次或转化可以包括添加2个或2个以上gRNA/修复片段对。在一些情况下，每个gRNA/修复片段对可以靶向与2个或2个以上gRNA/修复片段对的每个其它gRNA/修复片段对不同的基因座。在其它情况下，每个gRNA/修复片段对可以产生与2个或2个以上gRNA/修复片段对的每个其它gRNA/修复片段对不同的编辑。上述迭代编辑方法的每个轮次或转化可以每个轮次添加至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个gRNA/修复片段对或转化。如本文所提供的，2个或2个以上gRNA/修复片段对中的每一个都可以存在于质粒上。在每个gRNA/修复片段对中，gRNA或修复片段中的一或两个可以是线性片段。所述线性片段可以包含一或多个末端修饰。所述末端修饰可以应用于线性片段的5'和/或3'末端。所述末端修饰可以选自由以下组成的组，但不限于：磷酸化末端、硫代磷酸酯连接碱基、发夹、倒置碱基、碱基修饰、2'O-甲基碱基、锁定核酸碱基、硫代磷酸化2'O-甲基碱基和硫代磷酸化锁定核酸碱基。在每个gRNA/修复片段对中，gRNA或修复片段中的一或两个都可以存在于质粒上。在一个实施例中，在每个轮次或转化中添加的2个或2个以上gRNA/修复片段对中的每个修复片段可以包括2个或2个以上基因编辑的序列，使得2个或2个以上基因编辑中的每个基因编辑与本文所提供的gRNA配对。不同的gRNA/修复片段对可以包括至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个或10000个不同的gRNA和/或修复片段，并且可以由此在经编辑的微生物宿主细胞群体中产生至少、至多或正好2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、12种、14种、16种、18种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种或10000种不同的基因修饰的微生物菌株。存在于修复片段上的基因编辑中的每个基因编辑的序列可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑或多重编辑。gRNA中的每个gRNA可以包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，gRNA中的每个gRNA包含单gRNA(sgRNA)。
在一个实施例中，本文提供了一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：(a)将微生物宿主细胞的基础群体与包括一或多个编辑质粒的第一编辑构建体池组合，其中所述编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，并且其中所述第一编辑构建体池包括：(i)靶向相同的一或多个靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列；(ii)靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的相同的一或多个基因编辑的序列；或者(iii)靶向至少两个不同的靶基因座的的gRNA以及至少两个不同修复片段，其中每个修复片段包括在靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列；(b)将包括所述一或多个编辑质粒的一或多个编辑构建体引入到来自步骤(a)的单独微生物宿主细胞中，其中所述编辑构建体包括根据(a)(i)-(iii)中的任一项的gRNA和修复片段；以及(c)使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。在一个实施例中，不同的编辑构建体被引入到步骤(b)中的所述单独微生物宿主细胞的亚群体中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。不同的编辑构建体可以包括至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个或10000个不同的gRNA和/或修复片段，并且可以由此在第一经编辑的微生物宿主细胞群体中产生至少、至多或正好1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、12种、14种、16种、18种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9000种或10000种不同的基因修饰的微生物菌株。在一个实施例中，微生物宿主细胞的所述基础群体包括RNA引导的DNA核酸内切酶。在一个实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶被引入到微生物宿主细胞的所述基础群体中。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以编码在一或多个编辑质粒上，并且由此在引入所述一或多个编辑质粒后被引入到所述微生物宿主细胞中。在一个实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶、所述gRNA和产生每个编辑所需的所述修复片段的序列均存在于所述一或多个编辑质粒上。存在于或引入到微生物宿主细胞的基础群体中的RNA引导的DNA核酸内切酶可以切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座处的序列。所述至少两个不同的修复片段可以存在于同一质粒或不同的质粒上。在一个实施例中，所述修复片段中的每个修复片段包括与存在于或引入到微生物宿主细胞的所述基础群体中的RNA引导的DNA核酸内切酶所靶向的基因座互补或同源的序列。在一个实施例中，所述修复片段中的每个修复片段的所述一或多个基因编辑的每个序列包括与存在于或引入到微生物宿主细胞的所述基础群体中的RNA引导的DNA核酸内切酶所靶向的基因座的互补或同源的序列。与存在于或引入到所述微生物宿主细胞的基础群体中的RNA引导的DNA核酸内切酶所靶向的基因座互补或同源的序列可以存在于所述修复片段中的每个修复片段或所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的5'和3'端两者上，并且可以被称为同源臂，使得5'端上的所述同源臂可以被称为左同源臂，而3'端上的所述同源臂可以被称为右同源臂。所述选择标志基因可以是抗生素或营养缺陷型选择标志基因。在一个实施例中，存在于或引入到微生物宿主细胞的基础群体中的RNA引导的DNA核酸内切酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座处的序列。所述一或多个基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。
在一个实施例中，所述第一编辑构建体池进一步包括一或多个线性片段。向导RNA(gRNA)可以存在于所述一或多个线性片段中的每个线性片段上。向导RNA(gRNA)可以存在于所述一或多个线性片段中的至少一个上。所述修复片段可以存在于所述一或多个线性片段中的每一个上。所述修复片段可以存在于所述一或多个线性片段中的至少一个上。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以编码在所述一或多个线性片段中的每一个上。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以编码在所述一或多个线性片段中的至少一个上。所述线性片段可以是不同的线性构建体。在一个实施例中，所述第一编辑构建体池进一步包括两个或两个以上不同的线性片段。所述两个或两个以上不同的线性片段中的每一个可以包括不同的修复片段。所述两个或两个以上不同的线性片段中的至少一个可以包括不同的修复片段。在一个实施例中，所述两个或两个以上不同的线性片段包括不同的gRNA。所述两个或两个以上不同的线性片段中的每一个可以包括不同的gRNA。所述两个或两个以上不同的线性片段中的至少一个可以包括不同的gRNA。所述线性片段可以是单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)。用于本文所提供的方法中的线性片段可以含有一或多个末端修饰。所述末端修饰可以应用于线性片段的5'和/或3'末端。所述末端修饰可以选自由以下组成的组，但不限于：磷酸化末端、硫代磷酸酯连接碱基、发夹、倒置碱基、碱基修饰、2'O-甲基碱基、锁定核酸碱基、硫代磷酸化2'O-甲基碱基和硫代磷酸化锁定核酸碱基。gRNA中的每个gRNA可以包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，gRNA中的每个gRNA包含单gRNA(sgRNA)。
在一个实施例中，所述gRNA存在于所述一或多个编辑质粒上。在一个实施例中，所述修复片段存在于所述一或多个编辑质粒上。在一个实施例中，所述gRNA和所述修复片段存在于所述一或多个编辑质粒上。用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述gRNA可以存在于同一编辑质粒上。用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述修复片段可以存在于同一编辑质粒上。用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述gRNA和所述修复片段可以存在于同一编辑质粒上。用于靶向和编辑所有基因座的所述gRNA和所述修复片段可以存在于同一编辑质粒上。gRNA中的每个gRNA可以包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，gRNA中的每个gRNA包含单gRNA(sgRNA)。
在一个实施例中，所述第一编辑构建体池包括两个或两个以上不同的编辑质粒。在一个实施例中，用于靶向和编辑不同基因座的gRNA存在于所述两个或两个以上不同的编辑质粒上。所述两个或两个以上不同的编辑质粒可以包括不同的gRNA或多个不同的gRNA。在一个实施例中，用于靶向和编辑不同基因座的修复片段存在于所述两个或两个以上不同的编辑质粒上。所述两个或两个以上不同的编辑质粒可以包括不同的修复片段或多个不同的修复片段。gRNA中的每个gRNA可以包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，gRNA中的每个gRNA包含单gRNA(sgRNA)。在一个实施例中，所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的修复片段和不同的gRNA或多个不同的修复片段和多个不同的gRNA。
在一个实施例中，上述使用gRNA产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法进一步包括步骤(d)，所述步骤(d)包括使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。步骤(d)可以促进清除在步骤(b)中引入的编辑质粒。在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(e)，所述步骤(e)包括将包括一或多个编辑质粒的额外编辑构建体池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合。所述额外编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，并且其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段。在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(f)，所述步骤(f)包括将包括所述一或多个编辑质粒的一或多个编辑构建体引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中，其中所述编辑构建体包括根据(a)(i)-(iii)中的任一项的gRNA和修复片段。在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(g)，所述步骤(g)包括使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。在一个实施例中，所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与存在于所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。在步骤(f)中的引入的gRNA可以包括与一或多个靶基因座互补或同源的序列，并且每个修复片段可以包括在一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个基因编辑的序列。
上述用于利用gRNA产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法可以是迭代过程，所述迭代过程包括在一或多个额外编辑轮次中重复步骤(d)-(g)，使得所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与第一或先前组合的编辑质粒池上存在的选择标志基因不同的选择标志基因。所述一或多个额外轮次可以是至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、，10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个轮次。在一个实施例中，在至少一个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在每个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在任何编辑轮次之后不执行反选择。在又另一个实施例中，仅在交替编辑轮次之后执行反选择。在仍另一个实施例中，仅在最后编辑轮次之后执行反选择。所述反选择可以通过所述微生物宿主细胞表达抗生素、化学品或温度敏感性可反选择标志基因进行。在一个实施例中，存在于或引入到微生物宿主细胞中的RNA依赖性DNA核酸内切酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座处的序列。在所述一或多个额外编辑轮次中引入的所述修复片段可以包括一或多个基因编辑的不同序列并且与来自前一编辑轮次的不同选择标志基因相关联。所述一或多个基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。在步骤(f)中引入的所述gRNA包括与在前一编辑轮次中靶向的任何一或多个基因座不同的一或多个基因座互补或同源的序列，并且每个修复片段包括所述不同的一或多个基因座中或邻近所述不同的一或多个基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个基因编辑的序列。在步骤(f)中引入的所述gRNA可以包括与在前一编辑轮次中靶向的相同的一或多个基因座互补或同源的序列，并且每个修复片段可以包括相比于在前一编辑轮次中引入的基因编辑在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、或20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个不同基因编辑的序列。在一个实施例中，步骤(f)包括将一或多个不同的编辑构建体引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中，其中所述不同的编辑构建体包括与在前一编辑轮次中引入的所述gRNA和/或所述修复片段不同的gRNA和/或修复片段，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生一或多个不同的基因修饰的微生物菌株。在一个实施例中，在一或多个额外编辑轮次中引入的所述gRNA靶向不同的一或多个基因座并且与来自前一编辑轮次的不同抗生素选择标志基因相关联。所述一或多个不同的编辑构建体可以包括不同的gRNA，所述不同的gRNA包括与至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个不同的一或多个基因座互补或同源的序列，其中所述不同的一或多个基因座与任何先前靶向的一或多个基因座不同。所述一或多个不同的编辑构建体可以包括不同的修复片段，所述不同的修复片段包括相比于在前一编辑轮次中引入的基因编辑在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个不同基因编辑的序列。与先前与所述微生物宿主细胞组合的每个其它或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒相比，所述第一编辑质粒池和所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒可以包括相同的复制起点或相同的复制起点类别。所述第一或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒可以包括相同的选择标志基因。所述选择标志基因可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何选择标志基因。在一个实施例中，所述选择标志基因包括抗生素或营养缺陷型选择标志基因。gRNA中的每个gRNA可以包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，gRNA中的每个gRNA包含单gRNA(sgRNA)。所述基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。
在一或多个额外编辑轮次中引入的所述修复片段可以包括一或多个基因编辑的不同序列并且与来自前一编辑轮次的不同选择标志基因相关联。在一或多个额外编辑轮次中引入的所述gRNA可以靶向不同的一或多个基因座并且与来自前一编辑轮次的不同抗生素选择标志基因相关联。
在一个实施例中，用于产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株的方法进一步包括步骤(h)，所述步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入最终质粒、最终gRNA和最终修复片段。所述最终gRNA可以包括与所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终一或多个基因座互补或同源的序列。所述最终一或多个基因座可以包括与先前引入到所述微生物宿主细胞中的gRNA所靶向的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座。所述最终修复片段可以包括所述最终一或多个基因座中的一或多个基因编辑的序列。所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列可以位于同源臂之间，其中所述同源臂可以包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列互补或同源的序列。最终质粒、最终gRNA和/或最终修复片段可以与和在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列相关联。在一个实施例中，所述方法进一步包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补或同源的向导序列的向导RNA(gRNA)，以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何此类核酸内切酶。所述最终gRNA可以包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，所述最终gRNA包含单gRNA(sgRNA)。
在一个实施例中，上述利用gRNA的方法本质上是多重的，这意味着每个编辑轮次可以将多个基因编辑引入到单个微生物的基因组中。进一步到此实施例，在每个轮次或转化中引入的修复片段包括多个基因编辑的序列，并且所述多个基因编辑中的每个基因编辑与gRNA配对。在另一个实施例中，引入靶向至少2个或2个以上不同基因座的gRNA，使得每个gRNA与相同或不同的修复片段配对。在一个实施例中，用于多重编辑的所述修复片段和/或成对gRNA作为线性片段存在。所述线性片段可以包含一或多个末端修饰。所述末端修饰可以应用于线性片段的5'和/或3'末端。所述末端修饰可以选自由以下组成的组，但不限于：磷酸化末端、硫代磷酸酯连接碱基、发夹、倒置碱基、碱基修饰、2'O-甲基碱基、锁定核酸碱基、硫代磷酸化2'O-甲基碱基和硫代磷酸化锁定核酸碱基。在一个实施例中，用于多重编辑的所述修复片段和/或成对gRNA存在于质粒上。在一个实施例中，用于多重编辑的所述修复片段和成对gRNA各自存在于同一质粒上。在一个实施例中，用于多重编辑的所述修复片段和成对gRNA各自存在于不同的质粒上，使得成对gRNA的每个成对gRNA存在于与成对gRNA的每个其它成对gRNA相同或不同的质粒上。在每个轮次或转化中引入的所述修复片段可以包括至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个基因编辑的序列，并且每个基因编辑都可以与gRNA配对。在上述迭代编辑方法的每个轮次或转化中引入的gRNA可以靶向至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个不同的基因座，并且每个gRNA都可以与修复片段配对。在一个实施例中，在本文所提供的任何方法中引入的所述gRNA包括与一或多个靶基因座互补或同源的序列，并且每个修复片段包括在一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个基因编辑的序列。在一个实施例中，在本文所提供的任何方法中引入的所述gRNA包括与和在前一编辑轮次中靶向的任何一或多个基因座不同的一或多个基因座互补或同源的序列，并且每个修复片段包括在不同的一或多个基因座中或邻近所述一或多个基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个基因编辑的序列。在一个实施例中，在本文所提供的任何方法中引入的所述gRNA包括与在前一编辑轮次中靶向的相同的一或多个基因座互补或同源的序列，并且每个修复片段包括相比于在前一编辑轮次中引入的基因编辑在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个不同基因编辑的序列。在上述迭代编辑方法的每个轮次或转化中引入的不同gRNA可以靶向至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个不同的基因座，并且每个gRNA都可以与修复片段配对。存在于修复片段上的基因编辑中的每个基因编辑的序列可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑或多重编辑。gRNA中的每个gRNA可以包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，gRNA中的每个gRNA包含单gRNA(sgRNA)。
在一个实施例中，用于本文所提供的用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法中的任何方法中的第一或额外编辑质粒池可以包括多个不同的编辑质粒。所述多个不同的编辑质粒可以是至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个不同的编辑质粒。所述第一或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒可以包括相同的选择标志基因。
如本文所提供的用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法可以产生微生物宿主细胞的第一、第二或额外编辑群体，所述群体包括具有零个、一个或多个基因组编辑的单独细胞。所述多个基因组编辑可以是至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑。在一个实施例中，所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。在一个实施例中，所述微生物宿主细胞的所述第二编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。在一个实施例中，所述微生物宿主细胞的每个额外编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。
在一个实施例中，用于本文所提供的任何方法中的RNA引导的DNA核酸内切酶编码在质粒上。所述质粒可以是用于本文所提供的任何方法中的编辑质粒。在一个实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在整合子上。在一个实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在所述基因组中。在一个实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶从RNA翻译。在一个实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶作为蛋白质被引入到细胞中。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以是2类CRISPR-Cas系统RNA引导的核酸内切酶。所述2类CRISPR-Cas系统RNA引导的DNA核酸内切酶是II型、V型或VI型RNA引导的核酸内切酶。在一个实施例中，CRISPR-Cas系统RNA引导的DNA核酸内切酶选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1和MAD7或其同源物、直系同源物、突变体或其修饰版本。
在一个实施例中，用于本文所提供的方法中的任何方法中的所述微生物宿主细胞可以进一步包括来自一或多个重组系统的一组蛋白质。所述重组系统可以选自λred重组系统、RecET重组系统、Red/ET重组系统、来自λred重组系统或RecET重组系统的蛋白质的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。在一个实施例中，所述一组蛋白质来自λred重组系统并且包括β蛋白、gam蛋白和exo蛋白。在一个实施例中，在本文所提供的任何方法中的步骤(a)之前，来自重组系统的所述一组蛋白质作为核酸被引入到所述微生物宿主细胞中，例如通过一或多个质粒或整合子，包括对来自所述重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因。在另一个实施例中，由于对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因整合到所述微生物宿主细胞的基因组中，因此来自所述重组系统的所述一组蛋白质被所述微生物宿主细胞稳定地表达。在另一个实施例中，由于对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因整合到所述微生物宿主细胞的基因组中，因此来自所述重组系统的所述一组蛋白质被所述微生物宿主细胞组成型地表达。在一个实施例中，来自所述重组系统的所述一组蛋白质存在于与诱导型启动子可操作地连接的操纵子中。所述诱导型启动子可以是本领域已知的可通过添加或耗竭试剂或代谢物或通过温度变化诱导的任何启动子。所述试剂可以选自由以下组成的组：阿拉伯糖、异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和四环素。用于本文所提供的所述方法和组合物中的诱导型启动子的实例可以包含IPTG诱导型lac启动子和阿拉伯糖诱导型pBAD启动子。在一个实施例中，来自所述重组系统的所述一组蛋白质存在于与阻抑型启动子可操作地连接的操纵子中。所述阻抑型启动子可以是本领域已知的可通过去除试剂诱导的任何启动子。用于本文所提供的所述方法和组合物中的阻抑型启动子的实例可以包含trp启动子，并且所述试剂可以是色氨酸。所述一或多个重组系统可以与所述微生物宿主细胞异源。
在一个实施例中，本文所提供的用于编辑微生物宿主细胞基因组的任何方法(例如，以单重、多重或汇集方式)进一步包括在使微生物宿主细胞在对表达特异性选择标志基因的所述微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长之后对所述微生物宿主细胞进行基因分型。本文所提供的用于编辑微生物宿主细胞基因组的方法(例如，以单重、多重或汇集方式)可以进一步包括在采用多个选择步骤的方法中在选择步骤之间对所述微生物宿主细胞进行基因分型。在一个实施例中，本文所提供的用于迭代地编辑微生物宿主细胞基因组的方法可以进一步包括在每个编辑轮次之间对所述微生物宿主细胞进行基因分型。在一个实施例中，本文所提供的任何方法可以进一步包括在使所述微生物宿主细胞在对引入到所述微生物宿主细胞中的特异性选择标志基因不具有选择性的培养基中生长之后对所述微生物宿主细胞进行基因分型。在一个实施例中，本文所提供的方法可以进一步包括在最终步骤(例如，编辑的最后步骤)之后对所述微生物宿主细胞进行基因分型。在一个实施例中，本文所提供的用于迭代地编辑微生物宿主细胞基因组的方法可以进一步包括仅在最终编辑轮次之后，在至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个编辑轮次之后对所述微生物宿主细胞进行基因分型。可以进行所述基因分型以确认期望修饰的存在。基因分型可以通过菌落PCR、限制酶切消化、Sanger测序、下一代测序(NGS)、检测报告基因或抗生素的存在/不存在或所属领域的其它标准方法进行。基因编辑也可以通过测序来确认，如使用本领域已知的任何下一代测序方法。
在另一个实施例中，本文提供了一种用于从微生物宿主细胞中清除先前存在的质粒的方法，所述方法包括：(a)将包括第一选择标志基因的第一质粒引入到所述微生物宿主细胞中；以及(b)使来自步骤(a)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，其中所述先前存在的质粒和引入的第一质粒包括相同的复制起点，由此从微生物宿主细胞中清除所述先前存在的质粒，其中不执行反选择以促进先前存在的质粒的清除。所述反选择可以通过所述微生物宿主细胞表达抗生素、化学品或温度敏感性可反选择标志基因进行。在一个实施例中，所述方法进一步包括步骤(c)，所述步骤(c)包括使在步骤(b)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。在仍额外的实施例中，所述方法进一步包括在一或多个轮次中重复步骤(a)-(c)。所述一或多个轮次中的每个轮次可以包括引入包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的额外质粒，其中所述先前存在的质粒和额外引入的质粒包括相同的复制起点。所述先前存在的质粒可以是天然质粒或异源质粒。在一个实施例中，在至少一个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在每个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在任何编辑轮次之后不执行反选择。在又另一个实施例中，仅在交替编辑轮次之后执行反选择。在仍另一个实施例中，仅在最后编辑轮次之后执行反选择。所述选择标志基因可以是抗生素或营养缺陷型选择标志基因，如本文所提供的抗生素或营养缺陷型选择标志基因。
在仍另一个实施例中，本文提供了一种用于从微生物宿主细胞中迭代地清除先前引入的质粒的方法，所述方法包括：(a)将包括第一选择标志基因的第一质粒引入到所述微生物宿主细胞中；(b)使来自步骤(a)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；(c)使在步骤(b)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；以及(d)在一或多个轮次中重复步骤(a)-(c)，其中所述一或多个轮次中的每个轮次包括引入包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的额外质粒，并且其中所述第一质粒和所述额外质粒包括与先前引入到所述微生物宿主细胞中的任何其它第一质粒或额外质粒相同的复制起点，由此从微生物宿主细胞中迭代地清除所述先前引入的第一质粒或额外质粒，其中不执行反选择以促进先前存在的质粒的清除；所述反选择可以通过所述微生物宿主细胞表达抗生素、化学品或温度敏感性可反选择标志基因进行。在一个实施例中，在至少一个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在每个编辑轮次之后不执行反选择。在另一个实施例中，在任何编辑轮次之后不执行反选择。在又另一个实施例中，仅在交替编辑轮次之后执行反选择。在仍另一个实施例中，仅在最后编辑轮次之后执行反选择。所述选择标志基因可以是抗生素或营养缺陷型选择标志基因，如本文所提供的抗生素或营养缺陷型选择标志基因。
在一个实施例中，本文所提供的用于从微生物宿主细胞中清除质粒的方法进一步包括在每个步骤之间对所述微生物宿主细胞进行基因分型。在一个实施例中，本文所提供的用于从微生物宿主细胞基因组中清除质粒的方法可以进一步包括在选择步骤之间对所述微生物宿主细胞进行基因分型。在一个实施例中，本文所提供的用于从微生物宿主细胞基因组中清除质粒的方法可以进一步包括在最终步骤之后对所述微生物宿主细胞进行基因分型。可以进行所述基因分型以确认期望修饰的存在。基因分型可以通过菌落PCR、限制酶切消化、Sanger测序、下一代测序(NGS)、检测报告基因或抗生素的存在/不存在或所属领域的其它标准方法进行。基因编辑也可以通过测序来确认，如使用本领域已知的任何下一代测序方法。
在一个实施例中，本文所提供的任何方法的引入步骤包括转化微生物宿主。所述微生物宿主细胞的转化可以使用本领域已知的和/或本文所提供的用于将核酸(例如，质粒)转化或引入到微生物宿主细胞中的任何方法执行。在一些情况下，引入到微生物宿主细胞中的核酸中的一些或全部可以作为一或多个质粒的一部分引入。在其它情况下，引入到微生物宿主细胞中的核酸中的一些或全部可以作为线性片段引入，所述线性片段例如包括单链或双链DNA和/或RNA。作为线性片段存在的任何核酸(无论所述线性片段是单链还是双链以用于本文所提供的任何方法、组合物或试剂盒中)都可以含有一或多个末端修饰。所述末端修饰可以应用于线性片段的5'和/或3'末端。所述末端修饰可以选自由以下组成的组，但不限于：磷酸化末端、硫代磷酸酯连接碱基、发夹、倒置碱基、碱基修饰、2'O-甲基碱基、锁定核酸碱基、硫代磷酸化2'O-甲基碱基和硫代磷酸化锁定核酸碱基。
在一个实施例中，在本文所提供的任何方法中使用的所述微生物宿主细胞是真核细胞。真核微生物宿主细胞可以是本文所提供的任何真核微生物宿主细胞。在一个实施例中，所述真核微生物宿主细胞是酵母细胞或丝状真菌细胞。所述酵母细胞可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何酵母细胞。所述丝状真菌细胞可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何丝状真菌细胞。
在另一个实施例中，在本文所提供的任何方法中使用的所述微生物宿主细胞是原核细胞。原核微生物宿主细胞可以是本文所提供的任何原核微生物宿主细胞。在一个实施例中，所述原核微生物宿主细胞是大肠杆菌菌株。所述大肠杆菌菌株可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何菌株。例如，大肠杆菌菌株可以选自产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、致肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、尿路致病性大肠杆菌(UPEC)、产维罗毒素大肠杆菌、大肠杆菌O157：H7、大肠杆菌O104：H4、大肠杆菌O121、大肠杆菌O104：H21、大肠杆菌K1、大肠杆菌NC101。在一个实施例中，所述原核微生物宿主细胞是芽孢杆菌(a species of Bacillus)或其菌株。所述芽孢杆菌可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何物种。所述芽孢杆菌菌株可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何菌株。在一个实施例中，所述原核微生物宿主细胞是棒状杆菌(a species ofCorynebacterium)或其菌株。所述棒状杆菌可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何物种。所述棒状杆菌菌株可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何菌株。
如本公开通篇所述，本文所提供的方法中使用的质粒可以包括可选择或选择标志基因。用于本文中的可选择标志基因可以是营养缺陷型标志物、原养型标志物、显性标志物、隐性标志物、抗生素抗性标志物、分解代谢标志物、酶标志物、荧光标志物、发光标志物或其组合。在一个实施例中，所述可选择或选择标志基因是抗生素或营养缺陷型选择标志基因。所述抗生素选择标志基因可以是本领域已知的任何抗生素选择标志基因。可以基于所述微生物宿主细胞选择在本文所提供的方法中使用的任何质粒中使用的抗生素选择标志基因。例如，对于原核宿主细胞，所述抗生素选择标志基因可以是本领域已知的赋予对氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、吉欧霉素、壮观霉素/链霉素的抗性的任何基因。对于真核宿主细胞，所述抗生素选择标志基因可以是本领域已知的赋予对博莱霉素、腐草霉素遗传霉素、新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟素、吉欧霉素的抗性的任何基因。所述营养缺陷型选择标志基因可以是本领域已知的用于特定微生物宿主细胞的任何营养缺陷型选择标志基因。在本文所提供的用于原核细胞的方法中使用的任何质粒中使用的营养缺陷型选择标志基因可以选自已知的氨基酸营养缺陷型标志物。在本文所提供的用于真核细胞的方法中使用的任何质粒中使用的营养缺陷型选择标志基因可以选自酵母URA3、LYS2、LEU2、TRI1、HIS3、MET15和ADE2或其同源物或直系同源物。
如本公开通篇所述，本文所提供的方法中使用的质粒可以进一步包括可反选择或反选择标志基因。所述可反选择标志基因可以是通常也称为“死亡基因”的基因，所述死亡基因表达杀死生产细胞的有毒基因产物。用于本文所提供的所述方法和组合物中的可反选择标志基因可以是本领域已知的任何“死亡基因”。在一个实施例中，所述可反选择或反选择标志基因是抗生素、化学品或温度敏感性标志基因。可以基于所述微生物宿主细胞选择在本文所提供的方法中使用的任何质粒中使用的可反选择标志基因。例如，对于原核宿主细胞(例如，大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum))，所述可反选择标志基因可以选自sacB、rpsL(strA)、tetAR、pheS、thyA、gata-1或ccdB，其功能在(雷拉特(Reyrat)等人,1998“可反选择标志物：细菌遗传学和发病机制的尚未开发的工具(CounterselectableMarkers:Untapped Tools for Bacterial Genetics and Pathogenesis).”传染与免疫(Infect Immun).66(9):4011-4017)中描述。对于真核宿主细胞，所述可反选择标志基因可以选自酵母LYS2、TRP1、MET15、URA3、URA4+和胸苷激酶或其同源物或直系同源物。
如本公开通篇所述，在本文所提供的方法中的任何转化和选择轮次中使用的质粒可以各自包括相同的复制起点。由在本文所提供的方法中引入基因编辑的任何轮次中使用的质粒中的每个质粒共享的复制起点可以是本领域已知的任何复制起点。可以基于所述微生物宿主细胞选择在本文所提供的方法中使用的任何质粒中使用的复制起点。在一个实施例中，所述微生物宿主细胞是原核宿主细胞，并且在任何编辑轮次期间引入的质粒之间共享的复制起点是本领域已知的用于特定原核宿主细胞生物体的任何复制起点。在一个实施例中，所述微生物宿主细胞是大肠杆菌菌株，并且在任何编辑轮次期间引入的质粒之间共享的复制起点是oriR、colE1、p15A、pUC、pSC101或R6K。在一个实施例中，所述微生物宿主细胞是芽孢杆菌属菌株，并且在连续编辑轮次期间引入的质粒之间共享的复制起点是pE194、pBAA1或pUB110。在一些实施例中，R6K复制起点以pir蛋白的存在为条件。也就是说，在一些实施例中，当前公开的包括R6K复制起点的载体将仅在包括pir基因的宿主细胞中扩增。在一个实施例中，所述微生物宿主细胞是棒状杆菌属菌株，并且在任何编辑轮次期间引入的质粒之间共享的复制起点是oriR、CASE1或CG1。
本文还提供了用于本文所提供的方法中的组合物。在一个实施例中，用于本文所提供的方法中的组合物包括修复片段池。在一个实施例中，所述池包括多个单修复片段。在一个实施例中，所述池包括多个修复片段，使得所述池中的至少一个修复片段包括基因编辑，所述基因编辑与存在于所述多个修复片段的每个其它修复片段中的每个其它基因编辑不同。存在于池中的多个修复片段可以是至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个不同的修复片段。在一个实施例中，所述多个修复片段中的至少一个修复片段可以靶向微生物宿主细胞内的核酸(例如，基因组或质粒)中的基因座，所述基因座与池中的每个其它修复片段所靶向的基因座不同。在一个实施例中，所述多个修复片段中的每个修复片段可以靶向微生物宿主细胞内的核酸(例如，基因组或质粒)中的基因座，所述基因座与池中的每个其它修复片段所靶向的基因座不同。在一个实施例中，本文所提供的组合物中存在的池中的每个修复片段包括用于一个基因编辑的序列。在一个实施例中，本文所提供的组合物中存在的池中的每个修复片段包括用于多个基因编辑的序列。每个修复片段可以包括至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个基因编辑的序列。存在于修复片段上的每个基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑或多重编辑。所述基因编辑可以是启动子、降解决定子、终止子、蛋白质溶解度标签或降解性标签。
本文所提供的组合物中存在的池中的每个修复片段可以作为核酸的线性片段存在。所述核酸的线性片段可以是单链或双链的。所述线性片段可以包含一或多个末端修饰。所述末端修饰可以应用于线性片段的5'和/或3'末端。所述末端修饰可以选自由以下组成的组，但不限于：磷酸化末端、硫代磷酸酯连接碱基、发夹、倒置碱基、碱基修饰、2'O-甲基碱基、锁定核酸碱基、硫代磷酸化2'O-甲基碱基和硫代磷酸化锁定核酸碱基。
在一个实施例中，本文所提供的组合物中存在的池中的每个修复片段可以存在于质粒或整合子内。在一个实施例中，本文所提供的组合物中存在的池中的每个修复片段可以存在于与池中的每个其它修复片段不同的质粒或整合子内。在一个实施例中，所述修复片段提供在质粒中。在一个实施例中，每个包括修复片段的质粒进一步包括一或多个复制起点。每个质粒中的一或多个复制起点可以是相同的。在一个实施例中，所述质粒包括促进将质粒维持在质粒克隆期间使用的微生物宿主细胞(例如，大肠杆菌)中的第一复制起点以及促进将质粒维持在本文所提供的基因编辑方法之一中使用的微生物宿主细胞(例如，谷氨酸棒状杆菌)中的第二复制起点。
在一个实施例中，每个修复片段或包括修复片段的核酸(例如，质粒)可以进一步包括对选择标志物和/或反选择标志物进行编码的序列。用于本文中的选择标志基因和/或反选择标志基因可以是原养型标志物、显性标志物、隐性标志物、抗生素抗性标志物、分解代谢标志物、酶标志物、荧光标志物、发光标志物或其组合。在一个实施例中，所述选择标志基因和/或反选择标志基因是抗生素、化学品或温度敏感性标志基因。所述抗生素选择标志基因可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何抗生素选择标志基因。可以基于所述微生物宿主细胞选择在本文所提供的方法中使用的任何质粒中使用的抗生素选择标志基因。在一个实施例中，如本文所提供的组合物中的每个修复片段或包括修复片段的核酸(例如，质粒)包括与每个其它修复片段或包括修复片段的每个其它核酸(例如，质粒)相同的选择标志基因。
修复片段中的每个修复片段或存在于修复片段内的一或多个基因编辑可以包括与微生物宿主细胞内的核酸(例如，基因组和/或质粒)中存在的基因座同源的序列。与核酸(例如，基因组和/或质粒)中存在的基因座同源的序列可以位于修复片段或基因编辑的上游或5'和/或修复片段或基因编辑的下游或3'。与位于修复片段或基因编辑上游或5'的核酸(例如，基因组和/或质粒)中存在的基因座同源的序列可以被称为左同源臂，而与位于修复片段或基因编辑下游或3'的核酸(例如，基因组和/或质粒)中存在的基因座互补或同源的序列可以被称为右同源臂。
在一个实施例中，用于本文所提供的方法中的组合物包括编辑质粒池。所述编辑质粒池可以包括至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个不同的编辑质粒。所述池中的编辑质粒中的每个编辑质粒可以包括一或多个修复片段。存在于每个编辑质粒中的所述一或多个修复片段可以包括至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个基因编辑的序列。存在于修复片段上的每个基因编辑可以选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑或多重编辑。所述基因编辑可以是启动子、降解决定子、终止子、蛋白质溶解度标签或降解性标签。
在一个实施例中，如本文所提供的组合物中的编辑质粒池中的每个编辑质粒包括选择标志基因。在一个实施例中，如本文所提供的组合物中的编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的选择标志基因。在一个实施例中，如本文所提供的组合物中的编辑质粒池中的每个编辑质粒包括反选择标志基因。编辑质粒内的选择标志基因和/或反选择标志基因可以是原养型标志物、显性标志物、隐性标志物、抗生素抗性标志物、分解代谢标志物、酶标志物、荧光标志物、发光标志物或其组合。在一个实施例中，所述选择标志基因和/或反选择标志基因是抗生素、化学品或温度敏感性标志基因。所述抗生素选择标志基因可以是本领域已知的和/或本文所提供的任何抗生素选择标志基因。可以基于所述微生物宿主细胞选择在本文所提供的方法中使用的任何质粒中使用的抗生素选择标志基因。
在一个实施例中，池中的每个编辑质粒进一步包括一或多个复制起点。每个编辑质粒中的一或多个复制起点可以是相同的。在一个实施例中，所述质粒包括促进将质粒维持在质粒克隆期间使用的微生物宿主细胞(例如，大肠杆菌)中的第一复制起点以及促进将质粒维持在本文所提供的基因编辑方法之一中使用的微生物宿主细胞(例如，谷氨酸棒状杆菌)中的第二复制起点。
在一个实施例中，编辑质粒中的每个修复片段或存在于每个修复片段内的一或多个基因编辑可以包括与微生物宿主细胞内的核酸(例如，基因组和/或质粒)中存在的基因座互补或同源的序列。与核酸(例如，基因组和/或质粒)中存在的基因座互补或同源的序列可以位于修复片段上存在的基因编辑的上游或5'和/或基因编辑的下游或3'。与位于基因编辑上游或5'的核酸(例如，基因组和/或质粒)中存在的基因座互补或同源的序列可以被称为左同源臂，而与位于基因编辑下游或3'的核酸(例如，基因组和/或质粒)中存在的基因座互补或同源的序列可以被称为右同源臂。
在一个实施例中，每个修复片段或编辑质粒中的每个修复片段内存在的一或多个基因编辑可以包括左同源臂和右同源臂，所述左同源臂和右同源臂靶向微生物宿主细胞内的遗传因子(例如，基因组和/或质粒)中的基因座，所述基因座与池中的每个其它修复片段或存在于每个其它编辑质粒中的每个修复片段内的一或多个基因编辑所靶向的基因座不同。在一个实施例中，每个修复片段或编辑质粒中的每个修复片段内存在的一或多个基因编辑可以包括左同源臂和右同源臂，所述左同源臂和右同源臂靶向微生物宿主细胞内的核酸(例如，基因组、质粒等)中的基因座，所述基因座与池中的每个其它或至少一个修复片段或存在于每个其它编辑质粒中的每个其它修复片段内的一或多个基因编辑所靶向的基因座相同。
本文所提供的任何组合物可以进一步包括与存在于修复片段中的每个基因编辑配对的向导RNA(gRNA)。本文所提供的任何组合物中存在的每个gRNA可以包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。在一个实施例中，本文所提供的任何组合物中存在的每个gRNA包含单gRNA(sgRNA)。与如本文所提供的修复片段中存在的基因编辑配对的gRNA可以靶向核酸(例如，基因组或质粒)中的基因座，对于所述基因座，基因编辑或包括所述基因编辑的修复片段包括与其互补或同源的序列并且可以促进所述基因座的切割。与如本文所提供的修复片段上存在的基因编辑配对的gRNA可以存在于与所述基因编辑相同的质粒(例如，编辑质粒)或不同的质粒(例如，编辑质粒)上。当存在于不同或单独质粒上时，包括所述gRNA的质粒可以进一步包括与包括配对基因编辑的质粒或包括配对基因编辑的修复片段相同的选择标志基因和/或反选择标志基因。当存在于不同或单独质粒上时，包括所述gRNA的质粒可以进一步包括与包括配对基因编辑的质粒或包括配对基因编辑的修复片段相同的复制起点。与如本文所提供的修复片段上存在的基因编辑配对的gRNA可以存在于与所述基因编辑相同的线性片段(单链或双链)或不同的线性片段(单链或双链)上。在一个实施例中，本文所提供的组合物中的质粒(例如，编辑质粒)或编辑构建体包括一个gRNA或多个不同的gRNA，使得每个gRNA与也存在于组合物中的修复片段上存在的基因编辑配对。所述多个不同的gRNA可以是至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000 100个不同的gRNA。与所述质粒(例如，编辑质粒)或编辑构建体上的每个gRNA配对的基因编辑也可以存在于所述质粒(例如，编辑质粒)或编辑构建体上。在一个实施例中，存在于本文所提供的组合物中的线性片段(单链或双链)包括一个gRNA或多个不同的gRNA，使得每个gRNA与也存在于所述组合物中的修复片段上存在的基因编辑配对。所述多个不同的gRNA可以是至少、至多或正好2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个不同的gRNA。与所述线性片段(单链或双链)上的每个gRNA配对的基因编辑也可以存在于所述线性片段(单链或双链)上。
在一个实施例中，如本文所提供的组合物可以进一步包括微生物宿主细胞，所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性核酸内切酶。所述一或多个位点特异性限制酶中的每一个可以是本领域已知的任何位点特异性限制酶。所述一或多个位点特异性限制酶中的每一个可以选自由以下组成的组：RNA引导的DNA核酸内切酶、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)。在一个实施例中，所述一或多个位点特异性限制酶中的每一个被引入到微生物宿主细胞中或核酸(例如，质粒或整合子)上的其基础菌株中。在一个实施例中，所述一或多个位点特异性限制酶中的每一个编码在质粒上并被引入到所述微生物宿主细胞中或其基础菌株中。所述一或多个位点特异性限制酶中的每一个可以编码在如本文所提供的一或多个编辑质粒上。在一个实施例中，所述一或多个位点特异性限制酶、一或多个gRNA和一或多个修复片段中的每一个的序列可以存在于如本文所提供的一或多个编辑质粒上。在一个实施例中，所述一或多个位点特异性限制酶中的每一个编码在整合子上并被引入到所述微生物宿主细胞中或其基础菌株中。在一个实施例中，所述一或多个位点特异性限制酶中的每一个编码在基因组中。在一个实施例中，所述一或多个位点特异性限制酶中的每一个从RNA翻译。在一个实施例中，所述一或多个位点特异性限制酶中的每一个被引入到所述细胞中作为蛋白质。
在一个实施例中，所述一或多个位点特异性限制酶中的每一个是RNA引导的DNA核酸内切酶。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以是2类CRISPR-Cas系统RNA引导的核酸内切酶。所述2类CRISPR-Cas系统RNA引导的DNA核酸内切酶是II型、V型或VI型RNA引导的核酸内切酶。在一个实施例，CRISPR-Cas系统RNA引导的DNA核酸内切酶选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1和MAD7或其同源物、直系同源物、突变体或其修饰版本。在一个实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶被引入到微生物宿主细胞中或核酸(例如，质粒或整合子)上的其基础菌株中。在一个实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在整合子上并被引入到所述微生物宿主细胞或其基础菌株中。在一个实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在质粒上并被引入到所述微生物宿主细胞或其基础菌株中。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以编码在如本文所提供的一或多个编辑质粒上。在一个实施例中，所述RNA引导的DNA核酸内切酶、一或多个gRNA和一或多个修复片段的序列可以存在于如本文所提供的一或多个编辑质粒上。
在一个实施例中，用于所提供的组合物中的任何组合物中的所述微生物宿主细胞可以进一步包括来自一或多个重组系统的一组蛋白质。所述重组系统可以选自λred重组系统、RecET重组系统、Red/ET重组系统、来自λred重组系统或RecET重组系统的蛋白质的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。在一个实施例中，所述一组蛋白质来自λred重组系统并且包括β蛋白、gam蛋白和exo蛋白。在一个实施例中，在本文所提供的任何方法中的步骤(a)之前，来自重组系统的所述一组蛋白质作为核酸被引入到所述微生物宿主细胞中，例如通过一或多个质粒或整合子，包括对来自所述重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因。在另一个实施例中，由于对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因整合到所述微生物宿主细胞的基因组中，因此来自所述重组系统的所述一组蛋白质被所述微生物宿主细胞稳定地和/或组成型地表达。在一个实施例中，来自所述重组系统的所述一组蛋白质存在于与诱导型启动子可操作地连接的操纵子中。所述诱导型启动子可以是本领域已知的可通过添加试剂或通过温度变化诱导的任何启动子。所述试剂可以选自由以下组成的组：阿拉伯糖、异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和四环素。用于本文所提供的所述方法和组合物中的诱导型启动子的实例可以包含IPTG诱导型lac启动子和阿拉伯糖诱导型pBAD启动子。在一个实施例中，来自所述重组系统的所述一组蛋白质存在于与阻抑型启动子可操作地连接的操纵子中。所述阻抑型启动子可以是本领域已知的可通过去除试剂诱导的任何启动子。用于本文所提供的所述方法和组合物中的阻抑型启动子的实例可以包含trp启动子，并且所述试剂可以是色氨酸。所述一或多个重组系统可以与所述微生物宿主细胞异源。
应用
本文所提供的组合物和方法可以具有广泛的应用，例如允许在微生物宿主细胞内设计用于合成所关注的期望产物的路径或优化所述微生物宿主细胞的基因产物在期望产物的合成或表达中起作用的一个或多个序列。本文所提供的组合物和编辑方法还可以用于产生基因的优化序列或其表达，或组合由基因编码的蛋白质的一或多个功能结构域或基序。所述基因可以是生化或代谢途径的一部分。所述生化或代谢途径可以产生所关注的期望产物。
所关注的期望产物可以是可以在细胞培养物、真核或原核表达系统或转基因动物或植物中组装的任何分子。本文所提供的方法和其中使用的组合物可以用于产生已经改变基因和/或代谢途径的微生物宿主细胞或其文库。本文所提供的方法和其中使用的组合物可以用于生成产生所关注的产物和/或具有关于所关注的产物的期望特性的微生物宿主细胞或其文库。所述期望特性可以是所关注的期望产物的高生产水平、所关注的产物的增强的功能或降低的功能(如果这是有利的话)。本文所提供的方法中的任何方法中的额外步骤可能需要筛选所得微生物宿主细胞或其文库以确定期望特性或所关注的产物的存在。此类筛选可以通过高通量方法进行，如本文所提供的，所述高通量方法可以是机器人/自动化方法。
因此，本文所提供的编辑方法可以在多种情况下用于产生或工程化微生物宿主细胞以产生所关注的期望产物。在一些情况下，所关注的产物可以是小分子、酶、肽、氨基酸、有机酸、合成化合物、燃料、酒精等。例如，所关注的产物或生物分子可以是任何初级或次级细胞外代谢物。初级代谢物可以尤其是乙醇、柠檬酸、乳酸、谷氨酸、谷氨酸盐、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸和其它氨基酸、维生素、多糖等。次级代谢物可以尤其是抗生素化合物(如青霉素)或免疫抑制剂(如环孢菌素A)、植物激素(如赤霉素)、他汀类药物(如洛伐他汀)、杀真菌剂(如灰黄霉素)等。所关注的产物或生物分子也可以是由宿主细胞产生的任何细胞内组分，如微生物酶，包含过氧化氢酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖异构酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、乳糖酶、链激酶等。细胞内组分还可以包含重组蛋白，如胰岛素、乙肝疫苗、干扰素、粒细胞集落刺激因子、链激酶等。所关注的产物也可以指所关注的蛋白质。
重组系统
在本文所提供的一方面，本文所提供的用于编辑微生物宿主细胞的核酸(例如，基因组、粘粒或质粒)或从其产生菌株的方法可能需要在微生物宿主细胞中使用同源重组系统。所述同源重组系统可以是宿主细胞固有的或引入到细胞宿主的。所述同源重组系统的基因可以引入在质粒上，引入在线性DNA片段上，作为RNA或一组RNA引入并从其翻译，或作为蛋白质或一组蛋白质引入。
在一个实施例中，在本文所提供的方法中使用同源重组(例如，天然同源重组)可以在多个轮次方法中的每个轮次中利用质粒池。池中的每个质粒可以包括与核酸(例如，基因组、质粒等)中的区域同源的序列(例如，左同源臂和右同源臂)，使得所述左同源臂和右同源臂被设计的基因编辑(例如，启动子或其它序列插入、取代、SNP、终止子、降解决定子、标签序列、降解信号或缺失的序列)分离。池中的质粒中的每个质粒的其它特征可以包含可选择标志基因(例如，如本文所提供的营养缺陷型或抗生素选择标志基因)、一或多个可反选择标志基因(例如SacB或PheS，分别在存在蔗糖和4-氯苯丙氨酸的情况下赋予毒性)和复制起点(例如，R6K)。来自在迭代编辑方法的每个轮次中使用的质粒池的每个质粒可以具有相同的复制起点。来自在编辑方法的一个轮次中使用的质粒池的每个质粒可以具有与来自在迭代编辑方法的每个其它轮次中使用的质粒池的每个质粒相同的复制起点。
一旦产生了包括同源臂和基因编辑的序列的每个质粒，所述每个质粒就可以按限定的比率(例如，等摩尔)混合或汇集，并使用本文所提供的方法中的任何方法(例如，通过电穿孔转化、缀合等)引入到所述微生物宿主细胞中。在一个实施例中，本文所提供的方法的每个轮次包括两个或两个以上质粒池。在每个轮次包括两个或两个以上质粒池的实施例中，所述池可以按限定的(例如，等摩尔)比率混合。
转化后，可以允许所得转化体恢复。可以选择恢复条件(例如，时间和温度)以最小化或减少在汇集文库中产生偏差的概率(例如，一些可能使用所述编辑方法的经编辑的菌株可能比其它经编辑或未经编辑的菌株更频繁或更不频繁和/或生长更快或更慢)。
在恢复之后，本文所提供的方法的每个轮次中的所得转化体可以被平板接种在培养基上以选择表达在特定轮次中使用的可选择标志基因的转化体。包括同源臂的质粒与核酸(例如，基因组、质粒等)中的靶向基因座的重组可以发生在质粒上存在的同源臂所靶向的两个同源位点之一处并且侧接设计的基因编辑。
然后，可以从选择性培养基上刮取在选择性培养基上生长为菌落的所得转化体、稀释并平板接种于第二类选择性培养基(例如，可反选择培养基)上。这一步骤可以允许诱导和选择细胞(并且然后是菌落)，这些细胞中的具有靶向基因座的核酸(例如，基因组、质粒等)在左同源臂或右同源臂处经历第二重组事件。如果第二重组事件发生在与第一重组事件相同的同源臂处，则可以重新产生出发菌株。如果第二重组事件发生在第二重组位点处，则所得转化体可以包括期望的基因编辑。因此，在反选择培养基上生长的菌落群体包括未经编辑的菌株和经编辑的菌株的混合物两者，每个菌株都含有在特定编辑轮次中引入的质粒池中包含的编辑之一。
如本文所提供的，通过使转化体在对在特定轮次中由转化体表达的选择标志基因不具有选择性的培养基中生长来促进去除在多轮迭代编辑方法的特定轮中引入的质粒池。
如本文所提供的，通过利用如本文所提供的同源重组的方法产生的转化体或菌株中的期望的基因编辑的确认和/或鉴定可以通过在选择和/或反选择之后对所述转化体或菌株进行基因分型来实现。可以使用如本文所提供的PCR和/或下一代测序进行基因分型。
环入/环出
在一些实施例中，本公开教导了从宿主生物体中环出所选DNA区域的方法。所述环出方法可以如中岛(Nakashima)等人,2014“通过基因组编辑和基因沉默进行细菌细胞工程(Bacterial Cellular Engineering by Genome Editing and Gene Silencing)”.国际分子医学杂志(Int.J.Mol.Sci.)15(2),2773-2793中所描述的。环出缺失技术是本领域已知的，并在(蒂尔(Tear)等人,2014“不稳定的人工基因特异性反向重复序列切除在大肠杆菌中介导无疤痕基因缺失(Excision of Unstable Artificial Gene-Specific InvertedRepeats Mediates Scar-Free Gene Deletions in Escherichia coli)”应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotech)175:1858-1867)中进行描述。本文所提供的方法中使用的环出方法可以使用单交叉同源重组执行。在一个实施例中，所选区域的环出可能需要使用单交叉同源重组。
在一个实施例中，本文所提供的组合物、方法或试剂盒包括或利用包括同源臂(例如，左/右同源臂)和位于其间的基因编辑序列的修复片段，使得所述修复片段各自位于可以用作环出载体的质粒上。在一个实施例中，在包括修复片段的环出载体与宿主细胞基因组之间使用单交叉同源重组，所述修复片段包括同源臂和位于其间的基因编辑序列，以便环入所述载体。所述环出载体内的基因编辑的序列可以被设计为具有序列，所述序列为现有或引入的邻近宿主序列的同向重复序列，使得同向重复序列侧接预定用于环化和缺失的DNA的区域。一旦插入，含有环出质粒或载体的细胞就可以被反选择以缺失选择区域。
在本文所提供的一方面，本文所提供的用于编辑微生物宿主细胞的核酸(例如，基因组、粘粒或质粒)的方法可能需要使用来自一或多个重组系统的所述一组蛋白质。所述重组系统可以是所述微生物宿主细胞内源性的，也可以是异源引入的。所述一或多个异源重组系统的所述一组蛋白质可以作为核酸(例如，作为质粒、线性DNA或RNA或整合子)引入并整合到宿主细胞的基因组中或从染色体外因子稳定地表达。所述一或多个异源重组系统的所述一组蛋白质可以作为RNA引入并由所述宿主细胞翻译。所述一或多个异源重组系统的所述一组蛋白质可以作为蛋白质引入到所述宿主细胞中。所述一或多个重组系统的所述一组蛋白质可以来自λred重组系统、RecET重组系统、Red/ET重组系统、来自λred重组系统、RecET重组系统或Red/ET重组系统的蛋白质的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。重组方法和/或来自RecET重组系统的所述一组蛋白质可以是如张(Zhang)Y.、布赫霍尔茨(Buchholz)F.、穆耶尔斯(Muyrers)J.P.P.和斯图尔特(Stewart)A.F.“利用大肠杆菌重组进行DNA工程的新逻辑(A new logic for DNA engineering usingrecombination in E.coli.)”自然遗传学(Nature Genetics)20(1998)123-128；穆耶尔斯,J.P.P.、张,Y.、泰斯塔(Testa),G.、斯图尔特,A.F.“通过ET重组快速修饰细菌人工染色体(Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination.)”核酸研究(Nucleic Acids Res)27(1999)1555-1557；张Y.、穆耶尔斯J.P.P.、泰斯塔G和斯图尔特A.F.“通过大肠杆菌的同源重组进行DNA克隆(DNA cloning byhomologous recombination in E.coli)”自然生物技术18(2000)1314-1317以及穆耶尔斯JP等人,“技术：重组工程——克隆和操纵DNA的新选择(Techniques:Recombinogenicengineering--new options for cloning and manipulating DNA)”生物化学趋势(Trends Biochem Sci.)2001年5月；26(5):325-31中所描述的重组方法和/或来自RecET重组系统的所述一组蛋白质中的任何一种，所述文献通过引用并入本文中。来自Red/ET重组系统的所述一组蛋白质可以是如里韦罗-穆勒(Rivero-Müller)、阿道夫(Adolfo)等人,“通过Red/ET重组进行辅助大片段插入(ALFIRE)——大片段重组工程的替代性和增强方法(Assisted large fragment insertion by Red/ET-recombination(ALFIRE)--analternative and enhanced method for large fragment recombineering)”核酸研究第35卷,10(2007):e78中所描述的所述一组蛋白质中的任何一种，所述文献通过引用并入本文中。
如本文所提供的，可以使用本文所提供的方法单独或汇集引入的基因编辑可以包括控制因子(例如，启动子、终止子、溶解度标签、降解性标签或降解决定子)、经修饰的基因形式(例如，具有期望SNP的基因)、反义核酸和/或作为代谢或生化途径的一部分的一或多个基因。在一个实施例中，所述修饰需要一或多个缺失，例如以使单个基因或多个基因失活。在一个实施例中，所述修饰需要对宿主细胞进行基因编辑。所述基因编辑可能需要编辑所述宿主细胞的基因组和/或所述宿主细胞中存在的单独遗传因子，例如质粒或粘粒。
λRED介导的重组
在本文所提供的一方面，本文所提供的用于编辑微生物宿主细胞的核酸(例如，基因组、粘粒或质粒)的方法可能需要使用来自λred介导的重组系统的一组蛋白质。λred介导的同源重组在本文所提供的任何方法中的使用可以如达琴科卡(Datsenko)和万纳(Wanner),美国国家科学院院刊97:6640-6645(2000)中所描述的，其内容特此以全文引用的方式并入。来自λred重组系统的所述一组蛋白质可以包括exo蛋白、β蛋白或gam蛋白或其任何组合。Gam可以阻止内源性RecBCD和SbcCD核酸酶两者消化引入到微生物宿主细胞中的线性DNA，而exo是一种5'→3'dsDNA依赖性核酸外切酶，所述核酸外切酶可以从5'端开始降解线性dsDNA并产生2种可能的产物(即，具有单链3'突出端的部分dsDNA双链体或整个互补链被降解的ssDNA)，并且β可以保护由Exo产生的ssDNA并促进其粘接到细胞中的互补ssDNA靶标。如blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering所述，基于λred的重组与ssDNA寡核苷酸底物可能需要β表达，其内容通过引用并入本文中。
在一个实施例中，本文所提供的编辑方法在已经稳定表达λred重组基因的微生物宿主细胞，如blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering中描述的DY380菌株中实施，其内容通过引用并入本文中。可以在托马森(Thomason)等人(重组工程：使用同源重组的细菌中的基因工程(Recombineering:Genetic Engineering in Bacteria Using HomologousRecombination.)当代分子生物学实验指南(Current Protocols in MolecularBiology.)106:V:1.16:1.16.1-1.16.39)和沙兰(Sharan)等人(重组工程：基于同源重组的基因工程方法(Recombineering:A Homologous Recombination-Based Method ofGenetic Engineering.)自然实验手册(Nature protocols.)2009；4(2):206-223)中发现包括λred重组系统的组分并且可以用于本文所提供的任何方法的其它菌株，这些文献中的每个文献的内容通过引用并入本文中。
如本文所提供的，可以在实施本文所提供的任何编辑方法之前将λred重组系统的所述一组蛋白质引入到所述微生物宿主细胞中。λred重组系统的蛋白质中的每种蛋白质的基因可以引入在核酸(例如，作为质粒、线性DNA或RNA、迷你λ、λred原噬菌体或整合子)上并整合到所述宿主细胞的基因组中或从染色体外因子稳定地表达。在一些情况下，λred重组系统的组分中的每个组分(即，exo、β、gam或其组合)可以作为RNA引入并由所述宿主细胞翻译。在一些情况下，λred重组系统的组分中的每个组分(即，exo、β、gam或其组合)可以作为蛋白质引入到所述宿主细胞中。
在一个实施例中，用于λred重组系统的所述一组蛋白质的基因被引入在质粒上。所述质粒上的λred重组系统的所述一组蛋白质可以在启动子(例如，内源性噬菌体pL启动子)的控制下。在一个实施例中，所述质粒上的λred重组系统的所述一组蛋白质在诱导型启动子的控制下。所述诱导型启动子可以通过添加或耗竭试剂或通过温度变化来诱导。在一个实施例中，所述质粒上的λred重组系统的所述一组蛋白质在诱导型启动子(如IPTG诱导型lac启动子或阿拉伯糖诱导型pBAD启动子)的控制下。表达λred重组系统的所述一组蛋白质的基因的质粒也可以表达与特异性启动子相关的阻遏物，例如分别与IPTG诱导型lac启动子、阿拉伯糖诱导型pBAD启动子和内源性噬菌体pL启动子相关的lacI、araC或cI857阻遏物。
在一个实施例中，将λred重组系统的所述一组蛋白质的基因引入在迷你λ上，所述迷你λ是一种缺陷型非复制、环形噬菌体DNA，所述迷你λ在被引入到微生物宿主细胞时整合到如blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering所描述的基因组中，其内容通过引用并入本文中。
在一个实施例中，将λred重组系统的所述一组蛋白质的基因引入在λred原噬菌体上，所述λred原噬菌体可以允许λred重组系统稳定地整合到如blog.addgene.org/lambda-red-a-homologous-recombination-based-technique-for-genetic-engineering所描述的微生物宿主细胞中，其内容通过引用并入本文中。
在一个实施例中，本文所提供的用于编辑包括来自λred重组系统的一组蛋白质的微生物宿主基因组的任何方法单独使用修复片段或与gRNA成对使用，使得每个修复片段和/或成对gRNA作为DNA的线性片段存在。DNA的线性片段可以是ssDNA或dsDNA。包括修复片段和/或gRNA的线性片段可以进一步包括可选择标志基因和/或可反选择标志基因。dsDNA或ssDNA线性片段的使用可能取决于修复片段或gRNA的大小或长度。例如，当修复片段包括大于约20个核苷酸的基因编辑(例如，插入或缺失)时，可以使用dsDNA线性片段，而当修复片段包括小于约20个核苷酸的基因编辑(例如，插入或缺失)时，可以使用ssDNA线性片段。
如本文所提供的，修复片段或存在于修复片段上的基因编辑可以包括同源臂，所述同源臂包括与存在于微生物宿主细胞内的核酸(例如，基因组、质粒等)中的基因座互补或同源的序列。存在于修复片段上或侧接基因编辑的同源臂各自的长度可以分别介于1与5之间、介于5与10之间、介于10与20之间、介于20与30之间、介于30与40之间、介于40与50之间、介于50与60之间、介于60与70之间、介于70与80之间、介于80与90之间、介于90与100之间、介于100与125之间、介于125与150之间、介于150与175之间或介于175与200之间的核苷酸，包括端点。存在于修复片段上或侧接基因编辑的同源臂的长度可以是至少、至多或正好1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个核苷酸。
CRISPR介导的基因编辑
在本文所提供的一方面，本文所提供的用于迭代地编辑微生物宿主细胞的核酸(例如，基因组、粘粒或质粒)的方法可能需要使用CRISPR。如本文所提供的，可以在实施所述方法之前将CRISPR/Cas系统的RNA引导的DNA核酸内切酶引入到所述微生物宿主细胞中。所述CRISPR/Cas系统的RNA引导的DNA核酸内切酶可以被引入作为核酸(例如，作为质粒、线性DNA或RNA或整合子)并整合到宿主细胞的基因组中或从染色体外因子表达。所述CRISPR/Cas系统的RNA引导的DNA核酸内切酶可以作为RNA引入并由所述宿主细胞翻译。所述CRISPR/Cas系统的RNA引导的DNA核酸内切酶可以作为蛋白质引入到所述宿主细胞中。
所述CRISPR/Cas系统是一种原核免疫系统，所述原核免疫系统赋予对外来遗传因子(如存在于质粒和噬菌体内的那些遗传因子)的抗性并提供获得性免疫形式。CRISPR代表成簇规律间隔短回文重复序列，并且cas代表CRISPR相关系统并且是指与CRISPR复合体相关的小cas基因。
CRISPR-Cas系统被最广泛地表征为1类或2类系统。这两个系统之间的主要区别特征是Cas效应模块的性质。1类系统需要将多个Cas蛋白组装成复合体(称为“级联复合体”)以介导干扰，而2类系统使用较大的单一Cas酶来介导干扰。基于特异性Cas蛋白的存在，1类或2类系统中的每一个进一步分为多个CRISPR Cas类型。例如，1类系统分为以下三种类型：I型系统，其含有Cas3蛋白；III型系统，其含有Cas10蛋白；以及假定的IV型系统，其含有Csf1蛋白，即一种Cas8样蛋白。2类系统通常不如1类系统常见，并且进一步分为以下三种类型：II型系统，其含有Cas9蛋白；V型系统，其含有Cas12a蛋白(以前称为Cpf1，并且在本文中称为Cpf1)、Cas12b(以前称为C2c1)、Cas12c(以前称为C2c3)、Cas12d(以前称为CasY)和Cas12e(以前称为CasX)；以及VI型系统，其含有Cas13a(以前称为C2c2)、Cas13b和Cas13c。派索查(Pyzocha)等人,ACS化学生物学(ACS Chemical Biology),第13卷(2),第347-356页。在一个实施例中，用于本文所提供的方法中的CRISPR-Cas系统是2类系统。在一个实施例中，用于本文所提供的方法中的CRISPR-Cas系统是II型、V型或VI型2类系统。在一个实施例中，用于本文所提供的方法中的CRISPR-Cas系统包括选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c和MAD7或其同源物、直系同源物或旁系同源物的组分。在一个实施例中，用于本文所提供的方法中的CRISPR-Cas系统包括Cpf1、或其同源物、直系同源物或旁系同源物。在一个实施例中，用于本文所提供的方法中的CRISPR-Cas系统包括MAD7、或其同源物、直系同源物或旁系同源物。
本文所公开的方法中使用的CRISPR系统包括Cas效应模块，所述Cas效应模块包括一或多个核酸(例如，RNA)引导的CRISPR相关(Cas)核酸酶，所述Cas核酸酶在本文中称为Cas效应蛋白。在一些实施例中，所述Cas蛋白可以包括一或多个核酸酶结构域。Cas效应蛋白可以靶向单链或双链核酸分子(例如，DNA或RNA核酸)并且可以产生双链或单链断裂。在一些实施例中，所述Cas效应蛋白是野生型或天然发生的Cas蛋白。在一些实施例中，所述Cas效应蛋白是突变Cas蛋白，其中在WT或天然发生的Cas蛋白(例如，亲本Cas蛋白)中进行一或多个突变、插入或缺失以产生与亲本Cas蛋白相比具有一或多个改变特性的Cas蛋白。
在一些情况下，所述Cas蛋白是野生型(WT)核酸酶。用于本公开的合适的Cas蛋白的非限制性实例包含C2cl、C2c2、C2c3、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Cpfl、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx100、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、MAD1-20、SmCsm1、其同源物、其直系同源物、其变体、其突变体或其修饰版本。合适的核酸引导的核酸酶(例如，Cas9)可以来自属的生物体，所述属包含但不限于：硫微螺菌属(Thiomicrospira)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、韧皮部杆菌属(Candidatus)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、氨基酸球菌属(Acidomonococcus)、普氏菌属(Prevotella)、史密氏菌(Smithella)、摩拉氏菌属(Moraxella)、互养菌属(Synergistes)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、链状杆菌属(Catenibacterium)、坎塔布里亚属(Kandleria)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、多尔氏菌属(Dorea)、粪球菌属(Coprococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、果聚糖菌属(Fructobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、棒杆菌属(Corynebacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、军团菌属(Legionella)、密螺旋体属(Treponema)、氏菌属(Roseburia)、产线菌属(Filifactor)、优杆菌属(Eubacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、枝原体属(Mycoplasma)、拟杆菌属(Bacteroides)、弗拉瓦属(Flaviivola)、黄杆菌属(Flavobacterium)、鳞球菌属(Sphaerochaeta)、固氮螺菌属(Azospirillum)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、奈瑟菌属(Neisseria)、氏菌属(Roseburia)、帕维杆菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、尼塔法理特属(Nitratifractor)、支原体属(Mycoplasma)、脂环酸芽胞杆菌属(Alicyclobacillus)、比利杆菌属(Brevibacilus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroidetes)、比利杆菌属、肉食杆菌属(Carnobacterium)、达安梭菌属(Clostridiaridium)、梭菌属(Clostridium)、脱硫盐菌属(Desulfonatronum)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、创伤球菌属(Helcococcus)、纤毛菌属(Leptotrichia)、李斯特菌属(Listeria)、嗜甲烷菌属(Methanomethyophilus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、丰佑菌科(Opitutaceae)、帕卢迪杆菌属(Paludibacter)、红杆菌属(Rhodobacter)、斯帕罗查塔属(Sphaerochaeta)、肿块芽胞杆菌属(Tuberibacillus)和弯曲菌属(Campylobacter)。此类属的生物体的物种可以如本文中以其它方式讨论的那样。
合适的核酸引导的核酸酶(例如，Cas9)可以来自门的生物体，所述门包含但不限于厚壁菌门(Firmicute)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochates)和软壁菌门(Tenericutes)。合适的核酸引导的核酸酶可以来自纲的生物体，所述纲包含但不限于丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)、梭菌纲(Clostridia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、放线菌纲(Actinobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidetes)、黄杆菌纲(Flavobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、螺旋体(Spirochaetes)和柔膜菌纲(Mollicutes)。合适的核酸引导的核酸酶可以来自目的生物体，所述目包含但不限于梭菌目(Clostridiales)、乳杆菌目(Lactobacillales)、放线菌目(Actinomycetales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、奈瑟菌目(Neisseriales)、军团菌目(Legionellales)、鹦鹉螺菌目(Nautiliales)、弯曲菌目(Campylobacterales)、螺旋体目(Spirochaetales)、支原体目(Mycoplasmatales)和硫发菌目(Thiotrichales)。合适的核酸引导的核酸酶可以来自科的生物体，所述科包含但不限于：毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、优杆菌科(Eubacteriaceae)、棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、黄杆菌科(Flavobacterium)、枝原体科(Cryomoorphaceae)、红菌科(Rhodobiaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、醋杆菌科(Acetobacteraceae)、金丝桃科(Sutterellaceae)、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)、军团菌科(Legionellaceae)、无节菌科(Nautiliaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、螺旋体科(Spirochaetaceae)、支原体科(Mycoplasmataceae)和弗郎西斯氏菌科(Francisellaceae)。
适于在本公开的方法、系统和组合物中使用的其它核酸引导的核酸酶(例如，Cas9)包含源自生物体的那些核酸酶，所述生物体如但不限于：硫微螺菌XS5(Thiomicrospira sp.XS5)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolvens)、甲烷浆菌白蚁假丝酵母菌(CandidatusMethanoplasma termitum)、嗜甲烷假丝酵母菌(Candidatus Methanomethylophilusalvus)、纤毛卟啉酮(Porphyromonas crevioricanis)、细菌性鳃病(Flavobacteriumbranchiophilum)、克氏卟啉球菌属(Acidomonococcus sp.)、毛螺旋菌细菌COE1(Lachnospiraceae bacterium COE1)、普氏菌短ATCC 19188(Prevotella brevis ATCC19188)、史密氏菌SCADC(Smithella sp.SCADC)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、琼斯氏共生菌(Synergistes jonesii)、拟杆菌口腔分类群274(Bacteroidetes oral taxon274)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、稻田氏钩端螺旋体莱姆血清变型10(Leptospira inadai serovar Lyme str 10)、克氏卟啉球菌属、晶体结构(5B43)变形链球菌(S.mutans)、牛无乳链球菌(S.agalactiae)、相似型链球菌(S.equisimilis)、血液链球菌(S.sanguinis)、肺炎链球菌(S.pneumonia)；空肠变曲菌(C.jejuni)、结肠弯曲菌(C.coli)；尼塔法理特水海杆菌(N.salsuginis)、尼塔法理特特加库斯菌(N.tergarcus)；耳葡萄球菌(S.auricularis)、肉葡萄球菌(S.carnosus)；脑膜炎奈瑟菌(N.meningitides)、淋球菌(N.gonorrhoeae)；李斯特菌(L.monocytogenes)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)；肉毒梭菌(C.Botulinum)、艰难梭菌(C.difficile)、破伤风梭菌(C.tetani)、索氏梭菌(C.sordellii)；土拉热弗朗西丝氏菌l(Francisella tularensisl)、普氏阿尔伯弧菌(Prevotella albensis)、乳酸杆菌MC2017 1(Lachnospiraceaebacterium MC2017 1)、白碎屑丁酸菌(Butyrivibrio proteoclasticus)、异域菌门菌GW2011_GWA2_33_10(Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10)、微囊菌GW2011_GWC2_44_17(Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17)、史密瑟拉菌SCADC(Smithella sp.SCADC)、小基因组菌总门(Microgenomates)、氨基酸球菌BV3L6(Acidaminococcus sp.BV3L6)、毛螺科菌MA2020(Lachnospiraceae bacterium MA2020)、候选白蚁甲烷支原体(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)、牛眼莫拉氏菌237(Moraxella bovoculi 237)、纳代钩端螺旋体(Leptospirainadai)、毛螺旋菌ND2006、纤毛卟啉酮3、解糖胨普雷沃菌(Prevotella disiens)、猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)、链状杆菌CAG(Catenibacterium sp.CAG)：290、坎塔布里亚海豹属(Kandleria vitulina)、梭菌目菌属KA00274(Clostridiales bacteriumKA00274)、毛螺科菌3-2(Lachnospiraceae bacterium3-2)、长链多丽叶(Dorealongicatena)、灵巧粪球菌GD/7(Coprococcus catus GD/7)、哥伦比亚肠球菌DSM 7374(Enterococcus columbae DSM 7374)、果聚糖杆菌EFB-N1(Fructobacillus sp.EFB-N1)、耐盐乳杆菌(Weissella halotolerans)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、植物乳杆菌(Lactobacillus versmoldensis)和龈沟产线菌ATCC 35896(Filifactor alocis ATCC35896)。参见美国专利第8,697,359号；第8,771,945号；第8,795,965号；第8,865,406号；第8,871,445号；第8,889,356号；第8,895,308号；第8,906,616号；第8,932,814号；第8,945,839号；第8,993,233号；第8,999,641号；第9,822,372号；第9,840,713号；美国专利申请第13/842,859号(US 2014/0068797 A1)；第9,260,723号；第9,023,649号；第9,834,791号；第9,637,739号；美国专利申请第14/683,443号(US 2015/0240261A1)；美国专利申请第14/743,764号(US 2015/0291961 A1)；第9,790,490号；第9,688,972号；第9,580,701号；第9,745,562号；第9,816,081号；第9,677,090号；第9,738,687号；美国申请第15/632,222号(US2017/0369879 A1)；美国申请第15/631,989号；美国申请第15/632,001号；以及美国专利第9,896,696号，上述文献各自通过引用并入本文中。
在一些实施例中，Cas效应蛋白包括以下活性中的一或多种：
切口酶活性，即切割核酸分子的单链的能力；
双链核酸酶活性，即切割双链核酸的两条链并产生双链断裂的能力；
核酸内切酶活性；
核酸外切酶活性；和/或
解旋酶活性，即解开双链核酸的螺旋结构的能力。
在本公开的方面，术语“向导核酸”是指多核苷酸，所述多核苷酸包括：1)能够与靶序列(本文中称为“靶向片段”)杂交的向导序列；以及2)能够与如本文所述的核酸引导的核酸酶相互作用(单独或与tracrRNA分子组合)的支架序列(本文称为“支架片段”)。向导核酸可以是DNA。向导核酸可以是RNA。向导核酸可以包括DNA和RNA两者。向导核酸可以包括经修饰的非天然发生的核苷酸。在向导核酸包括RNA的情况下，所述RNA向导核酸可以由多核苷酸分子(如使用本文所提供的方法和组合物生成的质粒、线性构建体)上的DNA序列编码。
在一些实施例中，本文所述的向导核酸是RNA向导核酸(“向导RNA”或“gRNA”)并且包括靶向片段和支架片段。在一些实施例中，gRNA的支架片段包括在一个RNA分子中，并且靶向片段包括在另一个单独的RNA分子中。此类实施例在本文中被称为“双分子gRNA”或“两分子gRNA”或“双gRNA”在一些实施例中，gRNA是单个RNA分子，并且在本文中称为“单向导RNA”或“sgRNA”。术语“向导RNA”或“gRNA”是包含性的，其是指两分子向导RNA和sgRNA两者。
gRNA的DNA靶向片段包括与靶核酸序列中的序列互补或同源的核苷酸序列。所述靶核酸序列可以是如基因组或质粒等遗传因子中的基因座。如此，gRNA的靶向片段通过杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用，并且靶向片段的核苷酸序列决定gRNA将结合的靶DNA内的位置。当使用合适的比对算法进行最佳比对时，向导序列与其对应的靶序列之间的互补性程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可以通过使用任何合适的用于比对序列的算法来确定。在一些实施例中，向导序列的长度为约或多于约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、45个、50个、75个或更多个核苷酸。在一些实施例中，向导序列的长度少于约75个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个核苷酸。在一些方面，向导序列的长度为10到30个核苷酸。所述向导序列的长度可以为15到20个核苷酸。所述向导序列的长度可以为15个核苷酸。所述向导序列的长度可以为16个核苷酸。所述向导序列的长度可以为17个核苷酸。所述向导序列的长度可以为18个核苷酸。所述向导序列的长度可以为19个核苷酸。所述向导序列的长度可以为20个核苷酸。
向导RNA的支架片段与一或多个Cas效应蛋白相互作用以形成核糖核蛋白复合体(本文称为CRISPR-RNP或RNP复合体)。向导RNA通过上述靶向片段将结合的多肽引导到靶核酸序列内的特异性核苷酸序列。向导RNA的支架片段包括两个核苷酸延伸段，所述核苷酸延伸段彼此互补并形成双链RNA双链体。支架序列内的促进可靶向核酸酶复合物形成的足够序列可以包含沿支架序列内的两个序列区域的长度的互补性程度，如涉及形成二级结构的一或两个序列区域。在一些情况下，所述一或两个序列区域包括或存在于相同的多核苷酸上。在一些情况下，所述一或两个序列区域包括或存在于单独的多核苷酸上。最佳比对可以通过任何合适的比对算法确定，并且可以进一步说明二级结构，如一或两个序列区域内的自我互补性。在一些实施例中，当最佳比对时，所述一或两个序列区域之间沿两者中较短者的长度的互补性程度为约或大于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更高。在一些实施例中，两个序列区域中的至少一个的长度为约或多于约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、40个、50个或更多个核苷酸。
主题gRNA的支架序列可以包括二级结构。二级结构可以包括假结区域或茎环结构。在一些实例中，向导核酸和核酸引导的核酸酶的兼容性至少部分地由向导RNA的二级结构区域内或邻近所述二级结构区域的序列确定。在一些情况下，向导核酸与核酸引导的核酸酶的结合动力学部分地由支架序列内的二级结构确定。在一些情况下，向导核酸与核酸引导的核酸酶的结合动力学部分由具有支架序列的核酸序列确定。
gRNA-Cas效应蛋白组合的兼容支架序列可以通过扫描邻近天然Cas核酸酶基因座的序列找到。换句话说，天然Cas核酸酶可以编码在邻近对应的兼容向导核酸或支架序列的基因组上。
核酸引导的核酸酶可以与在核酸酶内源性宿主内未发现的向导核酸兼容。此类正交向导核酸可以通过经验测试确定。正交向导核酸可以来自不同的细菌物种，或者也可以是合成的或以其它方式工程化为非自然发生的。与普通核酸引导的核酸酶兼容的正交向导核酸可以包括一或多个共同特征。共同特征可以包含假结区域外的序列。共同特征可以包含假结区域。共同特征可以包含一级序列或二级结构。
向导核酸可以被工程化为通过改变向导序列靶向所期望的靶序列，使得向导序列与靶序列互补或同源，由此允许所述向导序列与所述靶序列之间的杂交。具有工程化向导序列的向导核酸可以被称为工程化向导核酸。工程化向导核酸通常是非自然发生的并且在自然界中找不到。
在一个实施例中，包括在本文所提供的任何方法的每个轮次中引入的如本文所提供的一或多个基因编辑的修复片段充当供体DNA，并且每个修复片段上的每个基因编辑与gRNA配对。每个gRNA可以包括靶向宿主细胞内的遗传因子(例如，染色体或质粒)中的基因座处的特异性序列的序列。在使用同源定向修复(HDR)的CRISPR基因编辑方法中，供体DNA序列可以与其成对的向导RNA(gRNA)组合使用。所述CRISPR复合物可能导致靶基因内的链断裂，所述链断裂可以通过使用同源定向修复(HDR)进行修复。HDR介导的修复可以通过用使用本文所提供的方法和组合物生成的供体DNA序列共转化宿主细胞来促进。供体DNA序列可以包括期望的基因扰动(例如，缺失、插入(例如，启动子、终止子、溶解度或降解性标签)和/或单核苷酸多态性)以及包括与gRNA所靶向的序列或基因座互补或同源的序列的靶向序列或同源臂。在此实施例中，所述CRISPR复合物切割由一或多个gRNA指定的靶基因。然后，所述供体DNA序列可以用作同源重组机制的模板，以将期望的基因扰动并入到宿主细胞中。供体DNA可以是单链、双链或双链质粒。所述供体DNA可能缺少PAM序列或包括杂乱的、改变的或无功能的PAM，以防止重新切割。在一些情况下，所述供体DNA可以含有功能性或未改变的PAM位点。所述供体DNA中的突变或编辑序列(也侧接有同源区域)防止在突变已经并入到基因组中之后被CRISPR复合物重新切割。在一些实施例中，通过使用或表达来自一或多个重组系统的所述一组蛋白质来促进同源重组，所述一或多个重组系统是宿主细胞内源性的或是异源地引入的。
宿主细胞
本文所提供的用于编辑宿主细胞的核酸(例如，基因组或质粒)以在所述宿主细胞中生成或产生期望的特征或表型(例如，产生如本文所提供的所关注的产物)的试剂盒、组合物和方法可以适用于任何可以在基因突变体群体中鉴定期望的特征或表型的生物体。所述生物体可以是微生物或高等真核生物体。
因此，如本文所使用的，术语“微生物”应被广义地理解。其包含但不限于两个原核领域(即细菌和古菌)以及某些真核真菌和原生生物。然而，在某些方面，如昆虫、植物和动物等“高等”真核生物体可以用于本文所教导的方法中。
合适的宿主细胞包含但不限于：细菌细胞、藻类细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在一个说明性实施例中，合适的宿主细胞包含大肠杆菌菌株或芽孢杆菌属菌株。
本公开的其它合适的宿主生物体包含棒状杆菌属的微生物。在一些实施例中，优选的棒状杆菌菌株/物种包含：有效棒状杆菌(C.efficiens)，其中沉积型菌株为DSM44549；谷氨酸棒状杆菌，其中沉积型菌株为ATCC13032；以及产氨棒状杆菌(C.ammoniagenes)，其中沉积型菌株为ATCC6871。在一些实施例中，本公开的优选宿主是谷氨酸棒状杆菌。
棒状杆菌属的合适宿主菌株，具体地是谷氨酸棒状杆菌，具体地是已知的野生型菌株：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、醋谷棒状杆菌ATCC15806(Corynebacteriumacetoglutamicum ATCC15806)、嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870(Corynebacteriumacetoacidophilum ATCC13870)、以栖糖蜜棒状杆菌ATCC17965(Corynebacteriummelassecola ATCC17965)、热产氨棒状杆菌FERM BP-1539(Corynebacteriumthermoaminogenes FERM BP-1539)、黄色短杆菌ATCC14067(Brevibacterium flavumATCC14067)、乳糖发酵短杆菌ATCC13869(Brevibacterium lactofermentum ATCC13869)和短杆菌ATCC14020(Brevibacterium divaricatum ATCC14020)；以及由其制备的产生L-氨基酸的突变体或菌株，例如产生L-赖氨酸的菌株：谷氨酸棒状杆菌FERM-P 1709、黄色短杆菌FERM-P 1708、乳糖发酵短杆菌FERM-P 1712、谷氨酸棒状杆菌FERM-P 6463、谷氨酸棒状杆菌FERM-P 6464、谷氨酸棒状杆菌DM58-1、谷氨酸棒状杆菌DG52-5、谷氨酸棒状杆菌DSM5714和谷氨酸棒状杆菌DSM12866。
术语“谷氨酸微球菌(Micrococcus glutamicus)”也用于谷氨酸棒状杆菌。例如，在现有技术中，有效棒状杆菌的一些代表也被称为热产氨棒状杆菌，如菌株FERM BP-1539。
在一些实施例中，本公开的微生物宿主细胞是真核细胞。合适的真核宿主细胞包含但不限于：真菌细胞、藻类细胞、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞。合适的真菌宿主细胞包含但不限于：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、不完全菌门(Deuteromycota)、接合菌门(Zygomycota)、半知菌门(Fungi imperfecti)。某些优选的真菌宿主细胞包含酵母细胞和丝状真菌细胞。合适的丝状真菌宿主细胞包含例如真菌亚门(Eumycotina)和卵菌门(Oomycota)细分的任何丝状形式(参见例如霍克斯沃思(Hawksworth)等人,安斯沃思和比斯比的真菌词典(In Ainsworth and Bisby'sDictionary of The Fungi),第8版,1995,CAB国际(CAB International),英国剑桥大学出版社(University Press,Cambridge,UK)，所述文献通过引用并入本文中)。丝状真菌的特征是具有由几丁质、纤维素和其它复杂多糖构成的细胞壁的营养菌丝体。丝状真菌宿主细胞在形态上不同于酵母。
在某些说明性但非限制性实施例中，所述丝状真菌宿主细胞可以是以下物种的细胞：绵霉属(Achlya)、枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、头孢霉属(Cephalosporium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、棒囊壳属(Corynascus)、丛赤壳属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、色二孢属(Diplodia)、栗疫壳属(Endothis)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、胶枝霉属(Gliocladium)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、毁丝霉属(Myceliophthora)(例如，嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila))、毛霉属(Mucor)、脉孢霉属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、柄孢壳菌属(Podospora)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、梨孢属(Pyricularia)、毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢霉(Scytalidium)、侧孢霉属(Sporotrichum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、栓菌属(Tramates)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、轮枝菌属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或有性世代(teleomorphs)或无性世代(anamorphs)以及其同义词或分类学当量。在一个实施例中，丝状真菌选自由以下组成的组：构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)、酱油曲霉(A.sojae)和黑曲霉组的曲霉(Aspergilli)。在优选的实施例中，所述丝状真菌是黑曲霉。
在一个实施例中，所述丝状真菌是选自臭曲霉ACM 3996(Aspergillus foetidusACM3996)(＝FRR 3558)、稻瘟病菌Guy-11(Magnaporthe grisea Guy-11)、黄孢原毛平革菌RP78(Phanerochaete chrysosporium RP78)的生产菌株。在单独实施例中，所述丝状真菌是本领域已知的黑曲霉生产菌株。用于本文所提供的方法中的黑曲霉生产菌株的实例可以包含黑曲霉ATCC 11414、ATCC 1015、ACM 4992(＝ATCC 9142)、ACM 4993(＝ATCC10577)、ACM 4994(＝ATCC 12846)、ATCC26550、ATCC 11414、N402、CBS 513.88或NRRL3(ATCC 9029、CBS 120.49)。
合适的酵母宿主细胞可以包含但不限于：假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤醇母属(Pichia)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)和亚罗酵母属(Yarrowia)。在一些实施例中，所述酵母细胞是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、诺本氏酵母(Saccharomyces norbensis)、克鲁维酵母(Saccharomyceskluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、嗜海盐毕赤酵母(Pichiatrehalophila)、卡达姆毕赤酵母(Pichia kodamae)、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、奥普特毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichiathermotolerans)、水杨毕赤酵母(Pichia salictaria)、(Pichia quercuum)、栎毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、白假丝酵母(Candida albicans)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
在某些实施例中，所述微生物宿主细胞是藻类，如衣藻(例如，诱变莱茵衣藻(C.Reinhardtii))和席藻属(Phormidium)(席藻ATCC29409)。
在一个实施例中，所述微生物宿主细胞是原核细胞。合适的原核细胞包含革兰氏阳性、革兰氏阴性和革兰氏变异细菌细胞。所述微生物宿主细胞可以是以下物种或菌株，但不限于：农杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、倒囊藻属(Anacystis)、不动杆菌属(Acinetobacter)、嗜酸栖热菌属(Acidothermus)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、布赫纳氏菌属(Buchnera)、芸苔种(Campestris)、弯曲菌属(Camplyobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、着色菌属(Chromatium)、粪球菌属(Coprococcus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、肠球菌属(Enterococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、梭菌属(Fusobacterium)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Geobacillus)、嗜血杆菌(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、泥杆菌属(Ilyobacter)、微球菌属(Micrococcus)、细杆菌属(Microbacterium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基杆菌属、分支杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、泛生菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红假单胞菌属、氏菌属(Roseburia)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、栅列藻属(Scenedesmus)、链霉菌属(Streptomyces)、链球菌属(Streptococcus)、聚球藻属(Synecoccus)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)、透夫利玛属(Tropheryma)、土拉弗氏菌属(Tularensis)、特梅库拉属(Temecula)、热粘球菌属(Thermosynechococcus)、高温球菌属(Thermococcus)、脲原体(Ureaplasma)、黄杆菌属(Xanthomonas)、木杆菌属(Xylella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和发酵单胞菌属(Zymomonas)。
在一些实施例中，所述微生物宿主菌株是细菌工业菌株。许多细菌工业菌株是已知的并且适用于本文所描述的方法和组合物。
在一些实施例中，所述细菌工业菌株属于农杆菌(例如，放射形农杆菌(A.radiobacter)、毛根农杆菌(A.rhizogenes)、悬钩子农杆菌(A.rubi))、节杆菌(例如，金黄节杆菌(A.aurescens)、柠檬节杆菌(A.citreus)、球形节杆菌(A.globformis)、谷氨酸氢节杆菌(A.hydrocarboglutamicus)、迈索尔节杆菌(A.mysorens)、烟草节杆菌(A.nicotianae)、石蜡节杆菌(A.paraffineus)、原型丰尼节杆菌(A.protophonniae)、玫瑰精节杆菌(A.roseoparaffinus)、硫磺节杆菌(A.sulfureus)、产脲节杆菌(A.ureafaciens))、芽胞杆菌(例如，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、炭疽杆菌(B.anthracis)、巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、环状芽孢杆菌(B.circulars)、短小芽胞杆菌(B.pumilus)、灿烂芽胞杆菌(B.lautus)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、短芽孢杆菌(B.brevis)、坚固芽胞杆菌(B.firmus)、阿尔科菲厄斯芽孢杆菌(B.alkaophius)、地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜盐芽胞杆菌(B.halodurans)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens))。在特定实施例中，所述宿主细胞将是工业芽孢杆菌菌株，包含但不限于枯草芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。在一些实施例中，所述宿主细胞将是工业梭菌(例如，丙酮丁醇梭杆菌(C.acetobutylicum)、破伤风梭菌E88(C.tetani E88)、象牙海岸梭菌(C.lituseburense)、糖基丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、拜氏梭菌(C.beijerinckii))。在一些实施例中，所述宿主细胞将是工业棒状杆菌(例如，谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒状杆菌(C.acetoacidophilum))。在一些实施例中，所述宿主细胞将是工业埃希氏杆菌(例如，大肠杆菌)。在一些实施例中，所述宿主细胞将是欧文氏菌(例如，噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、菠萝欧文氏菌(E.ananas)、草生欧文菌(E.herbicola)、点斑欧文氏菌(E.punctata)、泰勒斯欧文氏菌(E.terreus))。在一些实施例中，所述宿主细胞将是工业泛菌(例如，柠檬泛菌(P.citrea)、成团泛菌(P.agglomerans))。在一些实施例中，所述宿主细胞将是工业假单胞菌(例如，恶臭假单胞菌(P.putida)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、梅瓦隆假单胞菌(P.mevalonii))。在一些实施例中，所述宿主细胞将是工业链球菌(例如，相似型链球菌(S.equisimiles)、化脓链球菌(S.pyogenes)、乳房链球菌(S.uberis))。在一些实施例中，所述宿主细胞将是工业链霉菌(例如，产二素链霉菌(S.ambofaciens)、不产色链霉菌(S.achromogenes)、阿维链霉菌(S.avermitilis)、天蓝链霉菌(S.coelicolor)、金霉素链霉菌(S.aureofaciens)、金色链霉菌(S.aureus)、由链霉菌(S.fungicidicus)、灰色链霉菌(S.griseus)、变铅青链霉菌(S.lividans))。在一些实施例中，所述宿主细胞将是工业发酵单胞菌(例如，运动发酵单胞菌(Z.mobilis)、解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica))等。
在一些实施例中，所述细菌宿主细胞是大肠杆菌并且可以包括：产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、致病性大肠杆菌(EPEC)、侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、泌尿致病性大肠杆菌(UPEC)、产维罗毒素大肠杆菌、大肠杆菌O157：H7、大肠杆菌O104：H4、大肠杆菌O121、大肠杆菌O104：H21、大肠杆菌K1和大肠杆菌NC101。在一些实施例中，用于本文所提供的基因组工程方法的微生物宿主细胞选自大肠杆菌K12、大肠杆菌B和大肠杆菌C。
在一些实施例中，用于本文所提供的基因组工程方法的微生物宿主细胞选自大肠杆菌菌株NCTC 12757、NCTC 12779、NCTC 12790、NCTC 12796、NCTC 12811、ATCC 11229、ATCC 25922、ATCC 8739、DSM 30083、BC 5849、BC 8265、BC 8267、BC 8268、BC 8270、BC8271、BC 8272、BC 8273、BC 8276、BC 8277、BC 8278、BC 8279、BC 8312、BC 8317、BC 8319、BC 8320、BC 8321、BC 8322、BC 8326、BC 8327、BC 8331、BC 8335、BC 8338、BC 8341、BC8344、BC 8345、BC 8346、BC 8347、BC 8348、BC 8863和BC 8864。
在一些实施例中、用于本文所提供的基因组工程方法的微生物宿主细胞是嗜绿细胞毒性大肠杆菌(VTEC)、如菌株BC 4734(O26:H11)、BC 4735(O157:H-)、BC 4736、BC 4737(n.d.)、BC 4738(O157:H7)、BC 4945(O26:H-)、BC 4946(O157:H7)、BC 4947(O111:H-)、BC4948(O157:H)、BC 4949(O5)、BC 5579(O157:H7)、BC 5580(O157:H7)、BC 5582(O3:H)、BC5643(O2:H5)、BC 5644(O128)、BC 5645(O55:H-)、BC 5646(O69:H-)、BC 5647(O101:H9)、BC5648(O103:H2)、BC 5850(O22:H8)、BC 5851(O55:H-)、BC 5852(O48:H21)、BC 5853(O26:H11)、BC 5854(O157:H7)、BC 5855(O157:H-)、BC 5856(O26:H-)、BC 5857(O103:H2)、BC5858(O26:H11)、BC 7832、BC 7833(O原始形式:H-)、BC 7834(ONT:H-)、BC 7835(O103:H2)、BC 7836(O57:H-)、BC 7837(ONT:H-)、BC 7838、BC 7839(O128:H2)、BC 7840(O157:H-)、BC7841(O23:H-)、BC 7842(O157:H-)、BC 7843、BC 7844(O157:H-)、BC 7845(O103:H2)、BC7846(O26:H11)、BC 7847(O145:H-)、BC 7848(O157:H-)、BC 7849(O156:H47)、BC 7850、BC7851(O157:H-)、BC 7852(O157:H-)、BC 7853(O5:H-)、BC 7854(O157:H7)、BC 7855(O157:H7)、BC 7856(O26:H-)、BC 7857、BC 7858、BC 7859(ONT:H-)、BC 7860(O129:H-)、BC 7861、BC 7862(O103:H2)、BC 7863、BC 7864(O原始形式:H-)、BC 7865、BC 7866(O26:H-)、BC7867(O原始形式:H-)、BC 7868、BC 7869(ONT:H-)、BC 7870(O113:H-)、BC 7871(ONT:H-)、BC 7872(ONT:H-)、BC 7873、BC 7874(O原始形式:H-)、BC 7875(O157:H-)、BC 7876(O111:H-)、BC 7877(O146:H21)、BC 7878(O145:H-)、BC 7879(O22:H8)、BC 7880(O原始形式:H-)、BC 7881(O145:H-)、BC 8275(O157:H7)、BC 8318(O55:K-:H-)、BC 8325(O157:H7)和BC8332(ONT)、BC 8333。
在一些实施例中，用于本文所提供的基因组工程方法的微生物宿主细胞是侵袭性大肠杆菌(EIEC)，如菌株BC 8246(O152:K-:H-)、BC 8247(O124:K(72):H3),BC 8248(O124)、BC 8249(O112)、BC 8250(O136:K(78):H-)、BC 8251(O124:H-)、BC 8252(O144:K-:H-)、BC 8253(O143:K:H-)、BC 8254(O143)、BC 8255(O112)、BC 8256(O28a.e)、BC 8257(O124:H-)、BC 8258(O143)、BC 8259(O167:K-:H5)、BC 8260(O128a.c.:H35)、BC 8261(O164)、BC 8262(O164:K-:H-)、BC 8263(O164)和BC 8264(O124)。
在一些实施例中，用于本文所提供的基因组工程方法的微生物宿主细胞是产肠毒素大肠杆菌(ETEC)，如菌株BC 5581(O78:H11)、BC 5583(O2:K1)、BC 8221(O118)、BC 8222(O148:H-)、BC 8223(O111)、BC 8224(O110:H-)、BC 8225(O148)、BC 8226(O118)、BC 8227(O25:H42)、BC 8229(O6)、BC 8231(O153:H45)、BC 8232(O9)、BC 8233(O148)、BC 8234(O128)、BC 8235(O118)、BC 8237(O111)、BC 8238(O110:H17)、BC 8240(O148)、BC 8241(O6H16)、BC 8243(O153)、BC 8244(O15:H-)、BC 8245(O20)、BC 8269(O125a.c:H-)、BC8313(O6:H6)、BC 8315(O153:H-)、BC 8329、BC 8334(O118:H12)和BC 8339。
在一些实施例中，用于本文所提供的基因组工程方法的微生物宿主细胞是致病性大肠杆菌(EPEC)，如菌株BC 7567(O86)、BC 7568(O128)、BC 7571(O114)、BC 7572(O119)、BC 7573(O125)、BC 7574(O124)、BC 7576(O127a)、BC 7577(O126)、BC 7578(O142)、BC7579(O26)、BC 7580(OK26)、BC 7581(O142)、BC 7582(O55)、BC 7583(O158)、BC 7584(O-)、BC 7585(O-)、BC 7586(O-)、BC 8330、BC 8550(O26)、BC 8551(O55)、BC 8552(O158)、BC8553(O26)、BC 8554(O158)、BC 8555(O86)、BC 8556(O128)、BC 8557(OK26)、BC 8558(O55)、BC 8560(O158)、BC 8561(O158)、BC 8562(O114)、BC 8563(O86)、BC 8564(O128)、BC8565(O158)、BC 8566(O158)、BC 8567(O158)、BC 8568(O111)、BC 8569(O128)、BC 8570(O114)、BC 8571(O128)、BC 8572(O128)、BC 8573(O158)、BC 8574(O158)、BC 8575(O158)、BC 8576(O158)、BC 8577(O158)、BC 8578(O158)、BC 8581(O158)、BC 8583(O128)、BC 8584(O158)、BC 8585(O128)、BC 8586(O158)、BC 8588(O26)、BC 8589(O86)、BC 8590(O127)、BC8591(O128)、BC 8592(O114)、BC 8593(O114)、BC 8594(O114)、BC 8595(O125)、BC 8596(O158)、BC 8597(O26)、BC 8598(O26)、BC 8599(O158)、BC 8605(O158)、BC 8606(O158)、BC8607(O158)、BC 8608(O128)、BC 8609(O55)、BC 8610(O114)、BC 8615(O158)、BC 8616(O128)、BC 8617(O26)、BC 8618(O86)、BC 8619、BC 8620、BC 8621、BC 8622、BC 8623、BC8624(O158)和BC 8625(O158)。
在一些实施例中，用于本文所提供的基因组工程方法的微生物宿主细胞是志贺氏菌(Shigella)生物体，包含福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)和宋内志贺菌(Shigella sonnei)。
在一些实施例中，用于本文所提供的方法中的细菌宿主细胞是本领域已知的芽孢杆菌和/或选自枯草芽孢杆菌和光芽胞杆菌(B.wakoensis)、溶淀粉芽胞杆菌(B.amylolyticus)、解半纤维素芽胞杆菌(B.hemicellulosilyticus)、解纤维芽胞杆菌(B.cellulosilyticus)、香鱼海槽芽胞杆菌(B.akibai)、解甘露醇糖芽胞杆菌(B.mannanilyticus)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、蕈状芽胞杆菌(B.mycoides)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、巨大芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、环状芽胞杆菌(B.circulans)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、蜂房芽胞杆菌(B.alvei)、短芽孢杆菌、浸麻芽孢杆菌(B.macerans)、解淀粉芽孢杆菌和球形芽胞杆菌(B.sphaericus)。
在一些实施例中，用于本文所提供的基因组工程方法的微生物宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌菌株，如菌株O-4(＝JCM 9137＝DSM 2514)、N-1(＝JCM 9140＝DSM 2521)、17-1(＝JCM 9142＝DSM 2524)、27-1(＝JCM 9144＝DSM 2520)、13(＝JCM 9145＝DSM 2523)、K-12-5(＝JCM 9149)、202-1(＝JCM 9151)、C-11(＝JCM 9152＝DSM 16731)、D-6(＝JCM 9154)、2b-2(＝JCM 9155)、N-4T(＝JCM 9156＝DSM 2522)、1139T(＝JCM 9157＝ATCC 43226)、IC(＝JCM 9158)、KX-6(＝JCM 9159)、H-167(＝JCM 9160)、199(＝JCM 9163)、C-3(＝JCM9164)、S-2(＝JCM 9166)、AM-001(＝JCM 10596＝DSM 16130)和8-1(＝JCM 10598)。
在各种实施例中，可以用于本公开的实践的包含原核和真核菌株两者的菌株可公开从许多培养物保藏中心轻易获得，如美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenand Zellkulturen GmbH，DSM)、哥伦比亚广播公司(Centraalbureau VoorSchimmelcultures，CBS)和农业研究服务专利菌种保藏中心(Agricultural ResearchService Patent Culture Collection)、北部地区研究中心(Northern RegionalResearch Center，NRRL)。
宿主细胞的转化
在一些实施例中，本公开的方法中使用的构建体可以使用多种技术中的任何一种引入到微生物宿主细胞中，包含转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti介导的基因转移。特定方法包含磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染或电穿孔(戴维斯(Davis),L.、狄伯纳(Dibner),M.、巴蒂(Battey),I.,1986“分子生物学基本方法(Basic Methods inMolecular Biology)”)。其它转化方法包含例如乙酸锂转化和电穿孔(参见例如吉茨(Gietz)等人,核酸研究27:69-74(1992)；伊藤(Ito)等人,细菌学杂志(J.Bacterol.)153:163-168(1983)；以及贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente),酶学方法(Methods inEnzymology)194:182-187(1991))。在一些实施例中，转化的宿主细胞被称为重组宿主菌株。
自动化
在一个实施例中，本文所提供的试剂盒、组合物和方法被并入到用于微生物宿主细胞的基因工程的高通量(HTP)方法中。在另一个实施例中，本文所提供的方法可以使用分子工具中的一或多个分子工具来实施，所述分子工具作为PCT/US18/36360、PCT/US18/36333或WO 2017/100377(所述文献中的每个文献出于所有目的通过引用并入本文中)中描述的HTP分子工具组的套件的一部分，以产生具有期望特征或表型的基因工程微生物宿主细胞。可以使用本文所提供的方法生成以迭代地编辑微生物宿主细胞的基因组的文库的实例可以包含但不限于启动子序列梯、终止子序列梯、溶解度标签序列梯或降解性标签序列梯。如PCT/US18/36360、PCT/US18/36333或WO 2017/100377中所描述的，本文所提供的方法可适用的高通量基因组工程方法的实例可以包含但不限于启动子交换、终止子(终止)交换、溶解度标签交换、降解性标签交换或SNP交换。所述高通量方法可以是自动化的和/或利用机器人和液体处置平台(例如，本领域已知的平板机器人平台和液体处置机器)。高通量方法可以利用多孔板，例如微量滴定板。
在一些实施例中，本公开的自动化方法包括机器人系统。本文所概述的系统通常涉及使用96孔或384孔微量滴定板，但如本领域技术人员将理解的，可以使用任何数量的不同板或配置。此外，本文所概述的任何或所有步骤都可以是自动化的；因此，例如，所述系统可以完全或部分自动化。与本文所提供的方法和组合物相容的机器人系统可以是PCT/US18/36360、PCT/US18/36333或WO 2017/100377中描述的那些机器人系统。
试剂盒
本公开还提供了用于实践如上所述的从微生物宿主细胞编辑或清除质粒或产生源自所述微生物宿主细胞的文库的方法的试剂盒。所述试剂盒可以包括含有执行所述方法所需的所有试剂(例如，包括修复片段和/或gRNA的质粒；基础微生物宿主细胞)的混合物。在一个实施例中，标的试剂盒可以包含：(i)包括第一修复片段的第一质粒池，所述第一修复片段包括一或多个基因编辑和选择标志基因；(ii)一或多个额外质粒池，使得每个额外质粒池包括额外修复片段，所述额外修复片段包括一或多个额外基因编辑的序列和与在先前质粒中引入的选择标志基因不同的选择标志基因；以及(iii)任选地，微生物宿主细胞。所述第一修复片段和/或每个额外片段可以进一步包括侧接所述一或多个基因编辑的同源臂。每个修复片段(第一和/或每个额外修复片段)上的所述同源臂可以包括与所述微生物宿主细胞内的核酸(例如，基因组、质粒等)中的基因座互补或同源的序列。存在于每个修复片段(第一和/或额外修复片段)上的所述同源臂可以与每个其它修复片段上的所述同源臂靶向相同的基因座。存在于每个修复片段(第一和/或额外修复片段)上的所述同源臂可以与每个其它修复片段上的所述同源臂靶向不同的基因座。存在于每个修复片段(第一和/或额外修复片段)上的所述同源臂可以与额外修复片段上的所述同源臂中的一或多个同源臂靶向相同的基因座。
在一个实施例中，标的试剂盒可以包含：(i)第一修复片段池，所述第一修复片段包括一或多个基因编辑序列和选择标志基因；(ii)与存在于所述第一修复片段上的一或多个基因编辑中的每个基因编辑配对的向导RNA(gRNA)；(iii)一或多个额外修复片段，使得每个额外修复片段包括一或多个基因编辑序列和与在先前修复片段中引入的选择标志基因不同的选择标志基因；(iv)在每个额外修复片段上发现的每个额外基因编辑的额外gRNA；以及(v)任选地，微生物宿主细胞。在一个实施例中，每个修复片段和其配对的gRNA存在于相同质粒上。在一个实施例中，每个修复片段和其配对的gRNA存在于单独质粒上。在一个实施例中，每个修复片段和其配对的gRNA存在于核酸的相同线性片段上。在一个实施例中，每个修复片段和其配对的gRNA存在于核酸的单独线性片段上。每个第一修复片段和/或每个额外片段可以进一步包括侧接所述一或多个基因编辑的同源臂。每个修复片段(第一和/或每个额外修复片段)上的所述同源臂可以包括与所述微生物宿主细胞内的核酸(例如，基因组、质粒等)中的基因座互补或同源的序列。存在于每个修复片段(第一和/或额外修复片段)上的所述同源臂可以靶向与每个其它修复片段上的所述同源臂相同的基因座。存在于每个修复片段(第一和/或额外修复片段)上的所述同源臂可以靶向与每个其它修复片段上的所述同源臂不同的基因座。存在于每个修复片段(第一和/或额外修复片段)上的所述同源臂可以靶向与额外修复片段上的所述同源臂中的一或多个同源臂相同的基因座。
在一些情况下，所述试剂盒进一步包含用于对编辑的微生物宿主细胞进行基因分型的试剂(例如，用于菌落PCR和/或限制性片段分析的试剂)和/或对编辑的微生物宿主细胞进行表型测试的试剂。
在一个实施例中，本文所提供的试剂盒进一步包括核酸(例如，作为质粒、线性DNA或RNA或整合子)，所述核酸对异源重组系统的一组蛋白质进行编码以将异源重组系统引入到微生物宿主细胞中。在一个实施例中，本文所提供的试剂盒进一步包括用于将异源重组系统引入到微生物宿主细胞中的异源重组系统的一组蛋白质。所述异源重组系统可以选自λred重组系统、RecET重组系统、Red/ET重组系统、来自λred重组系统、Red/ET重组系统或RecET重组的蛋白质的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。
在单独实施例中，本文所提供的试剂盒进一步包括核酸(例如，作为质粒、线性DNA或RNA或整合子)，所述核酸对一或多个位点特异性限制酶进行编码以将所述位点特异性限制酶引入到微生物宿主细胞中。在一个实施例中，本文所提供的试剂盒进一步包括一或多个位点特异性限制酶以将所述一或多个位点特异性限制酶引入到微生物宿主细胞中。所述一或多个位点特异性限制酶可以选自由以下组成的组：RNA引导的DNA核酸内切酶、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)。在一个实施例中，一或多个位点特异性限制核酸内切酶是RNA引导的DNA核酸内切酶，所述RNA引导的DNA核酸内切酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的第一基因座和/或另一基因座处的序列。所述RNA引导的DNA核酸内切酶可以选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1和MAD7或其同源物、直系同源物或旁系同源物。
所述试剂盒的组分可以组合在一个容器中，或者每种组分可以在其自己的容器中。例如，所述试剂盒的组分可以组合在单个反应管或一或多个不同的反应管中。
除了以上提及的组分之外，标的试剂盒进一步包含使用所述试剂盒的组分以实践主题方法的说明。用于实践主题方法的说明通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在如纸或塑料等基材上。如此，说明书可以作为包装插页存在于所述试剂盒中、存在于所述试剂盒的容器或其组分的标记中(即与包装或分包装相关联)等。在其它实施例中，所述试剂盒中不存在实际说明书，但是提供了用于例如通过因特网从远端源获得说明书的手段。此实施例的实例是包含网址的试剂盒，可以在所述网址中查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。
实例
通过参考以下实例进一步展示了本发明。然而，应当注意，这些实例与上述实施例一样是说明性的并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实例1-用于通过不需要对每个编辑轮次使用反选择标志物的CRISPR迭代编辑微生物宿主细胞基因组的方法的原理验证。
目的
本实例描述了使用CRISPR介导的方法在微生物宿主细胞的基因组中堆叠多个基因组编辑，而无需在每个编辑轮次中使用反选择标志物。图1中示出了在此实例中采用的方法的一般工作流程并且需要在包括CRISPR/Cas9和λred重组机制的微生物宿主菌株(即大肠杆菌菌株)的3个连续基因组编辑轮次中的每个轮次中在3个单独基因组位点之一处引入基因编辑。3个单独基因组位点中的每个单独基因组位点的基因编辑均存在于单独的构建体上，所述构建体还包括可选择标志基因(即新霉素磷酸转移酶II(KanR)、氯霉素乙酰转移酶(ChlorR)或四环素外排转运蛋白(TetR))，并且所述构建体中的每个构建体单独引入到微生物宿主菌株中。在第一轮次中，将KanR质粒转化到所述微生物宿主细胞中，并通过在含卡那霉素的培养基(Kan)上生长来选择转化体。然后从所述板中单独挑取抗生素抗性转化体(对子集进行基因分型)，在不选择KanR质粒的培养基中培养过夜，并为第二转化轮次做准备。在第二转化轮次中，将ChlorR质粒转化到从第一轮次中选择的转化体中，并通过在含氯霉素的培养基(CMP)上生长进行选择。在从第二轮次中选择的转化体中，第三TetR质粒轮次也发生了相同的循环。在转化TetR质粒后，可以任选地应用反选择轮次以主动清除细胞群体中的任何剩余质粒(例如，图1和9中的“2”)。如图1和9所示，反选择要么是被动的，要么是主动的。第1轮次和第2轮次与第2轮次和第3轮次之间的被动反选择(图1和9中的“1”)是通过从抗生素选择(即在非选择性培养基上生长)释放转化体来介导的。在不存在抗生素选择压力的情况下，质粒竞争复制机制(即蛋白质)，从而导致细胞损失。第3轮次后的主动反选择(图1和9中的‘2’)可以通过使用标志物介导，如存在于sgRNA/修复片段质粒中的sacB或pheS。
材料和方法
使用本领域已知的克隆方法构建了Cas9/λ-red质粒，所述Cas9/λ-red质粒包括可操作地连接到天然Cas9启动子的Cas9基因和可操作地连接到阿拉伯糖诱导型启动子的操纵子中的来自λred重组系统的一组蛋白质(即β、gam和exo)。然后将Cas9/λ-red质粒转化到大肠杆菌W3110菌株中。
为了执行和测试图1所示的迭代CRISPR编辑工作流程的功效，构建了3组sgRNA/修复片段质粒。第一组sgRNA/修复片段质粒(即KanR质粒)具有在靶向大肠杆菌菌株中的cadA基因的pR启动子的控制下的sgRNA盒、用于在cadA基因中引入893bp缺失的缺失盒、用于对成功转化的大肠杆菌宿主细胞赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因以及用于在大肠杆菌宿主细胞中维持的复制起点。第二组sgRNA/修复片段质粒(即ChlorR质粒)具有在靶向大肠杆菌菌株中的maeA基因的pR启动子的控制下的sgRNA盒、用于在maeA基因中引入1375bp缺失的缺失盒、用于对成功转化的大肠杆菌宿主细胞赋予氯霉素抗性的氯霉素乙酰转移酶基因以及与所述第一组sgRNA/修复片段质粒相同的用于在大肠杆菌宿主细胞中维持的复制起点。第三组sgRNA/修复片段质粒(即tetR质粒)具有在靶向大肠杆菌菌株中的maeB基因的pR启动子的控制下的sgRNA盒、用于在maeB基因中引入1543bp缺失的缺失盒、用于对成功转化的大肠杆菌宿主细胞赋予四环素抗性的四环素外排转运蛋白基因以及与所述第一组和所述第二组sgRNA/修复片段质粒相同的用于在大肠杆菌宿主细胞中维持的复制起点。所有组sgRNA/修复片段质粒还具有sacB基因以在含有蔗糖的生长培养基上进行反选择。
在制备3组sgRNA/修复片段质粒中的每组后，将KanR质粒转化到含有Cas9/λred质粒的基础大肠杆菌W3110菌株中，所述Cas9/λred质粒具有用于对羧苄青霉素赋予抗性的β-内酰胺酶基因，并且通过在含有卡那霉素和羧苄青霉素的生长板上生长来选择所得第1轮次转化体。在选择性培养基板中的每一个上生长一段时间，直到单独菌落变得可挑取，这通常过夜进行。然后挑取若干个Kan和Clin抗性菌落以对期望编辑进行基因分型，在选择性培养基上打补丁以确定KanR、ClinR或TetR质粒的存在，并且在含有羧苄青霉素的培养基上生长过夜以仅选择Cas9/λred质粒(参见图2)。感受态细胞由源自第1轮次转化体的过夜培养物制备，并且用ChlorR质粒转化含有Cas9/λred质粒和KanR质粒的所得感受态第1轮次转化体，并且通过在含有氯霉素和羧苄青霉素的板上生长来选择第2轮次转化体。然后挑取若干个Chlor和Clin抗性菌落以对期望编辑进行基因分型，在选择性培养基上打补丁以确定KanR、ClinR或TetR质粒的存在，并在含有羧苄青霉素的培养基上生长过夜以仅选择Cas9/λred质粒(参见图2)。感受态细胞由源自第2轮次转化体的过夜培养物制备，并且用TetR质粒转化含有Cas9/λred质粒和ChlorR质粒(子集也可能含有KanR质粒)的所得感受态第2轮次转化体。通过在含有四环素和羧苄青霉素的板上生长来选择第3轮次转化体。从第1、2和3编辑轮次中挑取若干个TetR和Clin抗性菌落并进行基因分型(参见图4)，并在选择性培养基上打补丁以确定KanR、ClinR或TetR质粒的存在(参见图2)。应注意，如果经修饰的大肠杆菌菌株包括在方案期间引入的基因编辑中的每个基因编辑并且缺少所有先前引入的sgRNA/修复片段质粒，那么所述菌落可以在含有适量反选择剂(例如5％蔗糖；参见图1和9)的培养基中生长过夜。
结果
此实例的目标之一是通过引入和选择含有第二可选择标志物的质粒测试是否将从携带含有所述第一可选择标志物的质粒的微生物宿主细胞中清除或去除含有第一可选择标志物的质粒。假设在这种所谓的“被动”反选择过程中，通过引入和选择含有第二可选择标志物的质粒而损失含有第一可选择标志物的质粒是由于缺乏对含有第一可选择标志物的质粒的选择以及DNA复制机制的竞争而发生的。如图2所示，确实发生了先前从宿主细胞中引入的含有可选择标志物的质粒的损失。具体地，图2示出了通过用含有具有相同的复制起点的不同抗生素选择标志物的新质粒进行转化来清除质粒的实例。这特别示出在图2的右手边的底端行的培养皿照片中，其中细胞强烈表达了tetR质粒，但明显损失了在早期转化中引入的ChlorR质粒和KanR质粒两者。
虽然引入到微生物宿主菌株中的质粒随着每次新的转化和选择而逐渐损失(参见图2)，但如通过从图4中的3个转化轮次后大肠杆菌菌落的PCR反应的凝胶运行图像看出的，在每个质粒上引入到宿主细胞中的基因编辑(cadA、maeA和maeB基因的缺失)显然是有效的。具体地，图4示出了在用本文所述的各组sgRNA修复片段质粒进行3个连续转化轮次后，单独菌落中存在cadA、maeA和maeB缺失。应注意，如图3所示，编辑效率在连续转化轮次之间确实有所不同；然而，可变编辑效率可能是所靶向的基因座和/或引入的基因编辑的函数。例如，cadA缺失可能是有毒的，这可能是这一转化轮次的编辑效率较低的原因。
总体而言，本文中呈现的结果清楚地证明，可以在微生物宿主细胞中进行基因编辑的迭代堆叠，而无需在每个编辑轮次中主动表达和利用反选择标志物，如本公开全文所提供的。
实例2-用于清除先前引入到微生物宿主菌株中的质粒的方法的原理验证。
目的
本实例描述了去除存在于微生物菌株内的第一质粒，目的是获得其中不再存在所述第一质粒的最终菌株，由此有效消除所述第一质粒的所述微生物菌株。
材料和方法
如图5A-5D所示，为了获得所述微生物菌株中不再存在第一质粒的最终菌株，将含有与所述第一质粒相同的复制起点、抗生素选择标志物以及任选的可反选择标志物的第二质粒转化到所述菌株中(图5A)。通过在选择性培养基上平板接种来选择已经吸收所述第二质粒的转化体(图5B)。在维持第二质粒的选择下，所得菌株的生长会导致先前存在的第一质粒的损失(图5C)。然后可以通过解除抗生素选择和/或质粒上的任选可反选择标志物的主动反选择而损失此第二质粒，从而产生不含第一、第二或任何额外质粒的最终菌株(图5D)。应注意，所述第一质粒可以是先前引入到微生物菌株中的质粒，例如在如本文所提供的和/或本领域已知的基因编辑方法期间，或者可以是所述微生物菌株的天然质粒。
实例3-用于以多重方式进行迭代编辑的方法的原理验证
目的
此实例描述了使用CRISPR介导的方法来扩展实例1中描述的迭代编辑方法，使得在一系列连续基因编辑轮次中的每个轮次中对微生物宿主细胞或源自其的转化体进行1个以上编辑，目的是在微生物宿主细胞的基因组中堆叠多个基因组编辑，而不需要在每一基因编辑轮次中使用反选择标志物。在此实例中，所述方法与实例1和本公开的其它地方所描述的相似，除了每个引入的质粒含有>1个向导RNA(gRNA)/修复片段对的情况。
材料和方法
在此实例中使用的微生物细胞与在实例1中生成和使用的大肠杆菌W3110菌株相同。
准备了三组不同的编辑质粒以在大肠杆菌中进行迭代多重编辑。每组使用相同的质粒骨架。编辑通过三个轮次进行，目的是每个编辑轮次将两种不同的编辑引入到宿主细胞的基因组中，其中每个轮次引入的编辑不同于在前一个编辑轮次中引入的编辑。每个编辑质粒含有两个不同的sgRNA/修复片段对。所有编辑质粒都含有相同的复制ori，并且每组不同的编辑质粒含有不同的抗生素标志物(在此实例中，质粒组1＝KanR，质粒；组2＝ChlorR，质粒；组3＝TetR)。因此，KanR、ChlorR和TetR质粒中的每一个都含有不同的多个sgRNA/修复片段对。
对于第一编辑轮次，如上文实例1所述，将KanR质粒(第1组)转化到含有ClinRCas9/λred质粒的大肠杆菌W3110基础菌株中。通过在对卡那霉素和羧苄青霉素具有选择性的培养基上平板接种来选择转化体。挑取若干个Kan和Clin抗性菌落进行基因分型并在含有羧苄青霉素的培养基上生长过夜以仅选择Cas9/λred质粒。感受态细胞由源自第1轮次转化体的过夜培养物制备，并且用ChlorR质粒转化含有Cas9/λred质粒和KanR质粒的所得感受态第1轮次转化体(第2组)。通过在含有氯霉素和羧苄青霉素的板上生长来选择第2轮次转化体。挑取若干个ChlorR和Clin抗性菌落进行基因分型(ChloR编辑和KanR编辑两者的基因分型)并在含有羧苄青霉素的培养基上生长过夜以仅选择Cas9/λred质粒。感受态细胞由源自第2轮次转化体的过夜培养物制备，并且用TetR质粒转化含有Cas9/λred质粒和ChlorR质粒(子集也可能含有KanR质粒)的所得感受态第2轮次转化体(第3组)。通过在含有四环素和羧苄青霉素的板上生长来选择第3轮次转化体。挑取若干个四环素抗性菌落进行基因分型(TetR、ChloR和KanR编辑的基因分型)并在含有羧苄青霉素的培养基上生长过夜以仅选择Cas9/λred质粒。可以任选地应用反选择轮次以主动清除细胞群体中的任何剩余质粒(例如，图1和9中的“2”)。例如，在一些情况下，在最后一个编辑轮次之后，细胞不只在含有羧苄青霉素的培养基中生长，而是也在含有适量反选择剂(例如，5％蔗糖)的培养基中生长过夜以生成缺少所有含有sgRNA/修复片段对的引入质粒的菌株。所得细胞群体包括具有多个不同基因编辑的单独细胞，典型地在此实例中，每个细胞有6个不同的编辑；每个编辑轮次中，所述不同的编辑对应于每个质粒组中存在的一些或全部不同的sgRNA/修复片段对。
实例4-大肠杆菌中汇集的CRISPR介导的编辑的原理验证。
目的
此实例描述了使用汇集的CRISPR介导的方法编辑大肠杆菌宿主菌株的基因组，以产生包括编辑组合(即生物多样性)的大肠杆菌混合群体。在此实例中，将含有各自包括在多个基因组基因座中的每个基因组基因座处的多个可能基因编辑中的一个可能基因编辑的修复片段的混合物的池引入到大肠杆菌基础菌株中，以确定CRISPR介导的编辑是否可以用于产生含有跨多个基因组基因座的各种基因编辑组合的大肠杆菌细胞群体。
材料和方法
在此实例中使用的微生物细胞与在实例1中生成和使用的大肠杆菌W3110菌株相同。
此外，还制备了sgRNA/修复片段质粒的集合作为池引入到上文产生的大肠杆菌基础菌株中。每个质粒包括：(1)sgRNA盒，所述sgRNA盒包括靶向可操作地连接到促进在所述盒中编码的sgRNA的组成型表达的pR启动子的三个基因组基因座(即，cadA、maeA或maeB)之一的sgRNA；(2)修复片段，所述修复片段包括对应于所述基因座的适当sgRNA的3个基因座之一的期望基因编辑(9个修复片段之一(即，cadA处的3个不同缺失：500bp缺失、890bp缺失和1500bp缺失；maeA处的3个不同缺失：1000bp缺失、1300bp缺失和1500bp缺失))；(3)赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因，所述基因用于在任何需要的克隆步骤期间使用并且在将sgRNA/修复片段质粒引入到上文产生的基础菌株中后用于选择大肠杆菌转化体；(4)在大肠杆菌中用于质粒维持的colE1复制起点；以及(5)大肠杆菌的sacB反选择标志物。在制备之后，将9个sgRNA/修复片段质粒以等比例混合在一起以产生池，以便引入到上文产生的大肠杆菌基础菌株中。
在制备上述试剂之后，用9个sgRNA/修复质粒池各自以彼此相等的比例转化含有CRISPR/Cas9和λred重组机制的大肠杆菌基础菌株。如上所述，9个sgRNA/修复质粒中的每一个都含有三个sgRNA之一(即在此实验中靶向的三个基因座：cadA、maeA或maeB)和9个修复片段之一(即，cadA处的3个不同缺失：500bp缺失、890bp缺失和1500bp缺失；maeA处的3个不同缺失：1000bp缺失、1300bp缺失和1500bp缺失)。转化反应在18℃或30℃下温育并在1小时(在18℃和30℃两者下培养)或3小时(在30℃下培养)之后回收，并且平板接种于含有卡那霉素的培养基上。挑取菌落并通过菌落PCR筛选或基因分型以进行成功编辑。
结果
图6描绘了在测试的3个不同条件(生长温度/恢复时间)下在挑取的菌落中观察到的编辑。在所述条件中的2个条件(30℃-1小时恢复和30℃-3小时恢复)下，鉴定了9个预期编辑中的4个。在最后一个条件(18℃-1小时恢复)下，鉴定了9个预期编辑中的5个。总的来说，图6中描绘的结果表明，可以使用汇集的CRISPR介导的编辑产生含有跨多个基因组基因座的特定基因编辑组合的大肠杆菌宿主细胞群体。
实例5-谷氨酸棒状杆菌中汇集的CRISPR介导的编辑的原理验证。
目的
此实例描述了使用汇集的CRISPR介导的方法编辑谷氨酸棒状杆菌宿主菌株的基因组，以产生包括编辑组合(即生物多样性)的谷氨酸棒状杆菌混合群体。在此实例中，将含有各自包括在多个基因组基因座中的每个基因组基因座处的多个可能基因编辑中的一个可能基因编辑的修复片段和gRNA的混合物的池引入到谷氨酸棒状杆菌基础菌株中，以确定CRISPR介导的编辑是否可以用于产生含有跨多个基因组基因座的各种基因编辑组合的谷氨酸棒状杆菌细胞群体。
材料和方法
为了执行此实例中的实验，通过整合对可操作地连接到促进在谷氨酸棒状杆菌宿主细胞的基因组内的组成型表达的启动子(例如，Ptrc)的Cas9多肽进行编码的基因来产生含有CRISPR/Cas9的谷氨酸棒状杆菌基础菌株。一组蛋白质或对异源重组系统进行编码的基因也可以被引入到谷氨酸棒状杆菌基础菌株中。对所述一组异源重组蛋白进行编码的基因可以在操纵子中表达并由诱导型启动子诱导，所述诱导型启动子可以包含在质粒内或整合在基因组中。
此外，还制备了sgRNA/修复片段质粒的集合作为池引入到上文产生的谷氨酸棒状杆菌基础菌株中。每个质粒包括：(1)sgRNA盒，所述sgRNA盒包括靶向可操作地连接到促进在所述盒中编码的sgRNA的组成型表达的启动子(例如，Pcg2613)的若干个基因组基因座之一的sgRNA；(2)修复片段，所述修复片段包括若干个基因座之一的期望基因编辑(PROSWAPS或降解决定子的启动子)；(3)合适的选择标志基因(例如，新霉素磷酸转移酶II或氯霉素乙酰转移酶)，所述选择标志基因用于在制备sgRNA/修复片段质粒期间在大肠杆菌中的克隆步骤以及在引入sgRNA/修复片段质粒之后选择谷氨酸棒状杆菌转化体；(4)用于在大肠杆菌中维持质粒的适当复制起点(例如，colE1或p15A)；以及(5)用于在谷氨酸棒状杆菌中维持质粒的适当复制起点(例如，CASE1或CG1)。在sgRNA/修复片段质粒中还可以包含谷氨酸棒状杆菌的适当反选择标志物(例如，sacB、pheS等)。在制备之后，将sgRNA/修复片段质粒以等比例混合在一起以产生池，以便引入到上文产生的谷氨酸棒状杆菌基础菌株中。如图7所示，制备了17个不同的sgRNA/修复质粒池。每个池含有3到17个质粒；给定池内的所有质粒都含有相同类型的编辑，PROSWAP或降解决定子的启动子。给定池内的所有质粒都靶向不同的基因座。如图7所示，17个池包含300ng(图右侧)和900ng(图左侧)。在转化到谷氨酸棒状杆菌中之前，从所有质粒池中制备下一代测序(NGS)文库，并且使用所得序列读段来鉴定每个池中存在的编辑质粒的比例，如图7所示。应注意的是，在图7中，每个饼图表示池，每种颜色表示给定池内唯一的sgRNA/修复质粒，并且“饼切片”的大小与给定池内的读段(即质粒)的数量成比例。
在制备上述试剂之后，用图7所示的17个池中的一个池的300ng(图右侧)或900ng(图左侧)转化含有CRISPR/Cas9的谷氨酸棒状杆菌基础菌株。在30℃下3小时后恢复转化并在含有卡那霉素的培养基上平板接种。挑取转化体的菌落，并且通过下一代测序(NGS)评估编辑。NGS筛选程序需要PCR扩增，并且随后对所挑取的菌落内含有的sgRNA/修复质粒进行NGS测序以鉴定预期的靶基因座。接下来，此鉴定信息用于将靶基因座引物与每个所挑取的菌落进行匹配。靶基因座引物被设计为粘接在sgRNA/修复质粒中存在的同源臂之外。接下来，扩增来自每个菌落的靶基因座，构建每个扩增子的标志文库，并且对每个扩增子的标志文库进行测序，以确定是否在每个基因座处成功并入预期的编辑。
结果
如图8所示，从单独池中恢复的单独编辑的最大数量为8。在图8中，每种颜色表示不同的成功编辑，黑白条纹表示不确定的测序数据，白色表示野生型，黑色表示过程失败。总的来说，图8中描绘的结果表明，可以使用汇集的CRISPR介导的编辑产生含有跨多个基因组基因座的特定基因编辑组合的谷氨酸棒状杆菌宿主细胞群体。此外，实例4和5的组合结果表明，汇集的CRISPR编辑通常可以用于原核生物。
实例6-用于以汇集方式进行迭代编辑的方法的原理验证
目的
此实例描述了使用CRISPR介导的方法来扩展实例1和3中描述的迭代编辑方法，以创建编辑组合的集合(即生物多样性)。为了实现这一点，实例1和3中描述的迭代编辑方法和实例4-5中描述的汇集的编辑方法可以以此方式扩展，其中每个转化或转化轮次包含引入1个以上或大于1个编辑质粒。
材料和方法
在此实例中描述的汇集的迭代编辑方法也可以在实例1中生成和使用的相同大肠杆菌W3110菌株中进行。
为了实施此实例的汇集的迭代编辑方法，如上文实例1和3中所述的迭代编辑以这样的方式进行，即在编辑轮次期间将编辑质粒池用于每组，使得每组的每个编辑质粒包括一个靶向相同基因座的sgRNA/修复片段对(如实例1中所述的基础迭代编辑)或两个或两个以上靶向多个基因座的不同的sgRNA/修复片段对(如实例3中所述的多重迭代编辑)。图9中示出了此实例的实施例(“组合突变堆叠”)与本文所述的非汇集的实施例(“单突变堆叠”)的比较。每次转化后，从板中收集菌落并组合——然后从此菌落集合中制备感受态细胞。在第二编辑轮次中，单独的编辑质粒池被转化(含有不同于第1轮次的选择标志物)，并且转化体被选择。从板中收集第2轮次的转化体并组合，然后制备感受态细胞并将其用于转化第3编辑池。在完成n个轮次的汇集转化后，可以对单独菌落进行基因分型并测试所关注的表型。在完成转化后，可以任选地应用反选择轮次以主动清除细胞群体中的任何剩余质粒(例如，图1和9中的“2”)。每个任何编辑轮次中，所得细胞群体将包括每个细胞都具有不同的单个或多个不同基因编辑的亚群体，所述不同的编辑对应于每个质粒组中存在的一些不同的sgRNA/修复片段对。
实例7-用于大肠杆菌中的同源重组(HR)介导的汇集菌株版本的方法的原理验证
目的
此实例详述了使用天然同源重组来创建编辑微生物的集合。在此实例中，每个质粒都含有与基因组中的某个区域的序列同源性(例如，左同源臂和右同源臂)。左同源臂和右同源臂由所设计的编辑(例如，启动子或其它序列插入、取代或缺失)分离。质粒的其它特征包含阳性可选择标志物(例如，卡那霉素抗性盒)、一或多种可反选择标志物(例如，SacB或PheS，其分别在存在蔗糖和4-氯苯丙氨酸的情况下赋予毒性)和R6K复制起点。
材料和方法
使用汇集的菌株版本的菌株构建通常由两部分组成。首先，通过制备能够进行多种可能编辑之一的质粒池并一次性将其转化到受体微生物中来生成经编辑的菌株文库。其次，鉴定哪些基因座(如果有的话)被编辑。
生成经编辑的菌株文库
制备10个质粒/池的6个不同的池，使得每个质粒以等摩尔量存在。每个质粒都含有要添加的启动子序列，所述启动子序列侧接有1-kb同源臂。将这些质粒池电穿孔到大肠杆菌菌株中，在37℃下在丰富生长培养基中恢复1-3小时，并且使用标准的大肠杆菌培养方法选择含有单个重组事件的单菌落。应注意，转化后的恢复时间(即37℃下1-3小时)用于确保转化体从电穿孔中恢复，同时最大限度地减少在汇集文库中产生偏差的概率(例如，一些经编辑的菌株可能比其它经编辑或未经编辑的菌株更频繁或更不频繁和/或生长更快或更慢)。此外，将所得转化体平板接种于培养基上以选择其中质粒与染色体的重组发生在质粒中存在的2个同源位点之一的转化体，所述转化体侧接所设计的编辑。
通过刮取琼脂培养基并将组合的菌落生物量重新悬浮在液体培养基中，将含有单个重组事件的菌落汇集在一起。在刮取期间将大约100个菌落汇集在一起以维持由10个质粒的每个池产生的菌落的多样性。将这些菌落重新悬浮在含有25％甘油和50ug/mL卡那霉素的溶原性肉汤培养基中，在-80℃下冷冻60分钟，在室温下解冻并在37℃下在搅拌下温育30分钟。然后稀释细胞悬浮液并将多个稀释液平板接种于含有蔗糖和4-氯苯丙氨酸的培养基上(可反选择培养基)，以诱导和选择由反选择基因sacB和pheS介导的第二重组事件的发生。将所述板在30℃下温育24-36小时。这允许诱导和选择细胞(并且然后是菌落)，所述细胞的染色体在左同源臂或右同源臂处经历第二重组事件。如果第二重组事件发生在与第一重组事件相同的同源臂处，则重新创建出发菌株。如果第二重组事件位于第二重组位点处，则所得菌株含有预期的编辑。因此，在反选择培养基上生长的菌落群体包括未经编辑的菌株和经编辑的菌株的混合物两者，每个菌株都含有初始质粒池中包含的编辑之一。
鉴定经编辑的基因座
由第二重组事件产生的含有基因组中的所设计的编辑或原始亲本基因型的菌落被挑取并在37℃下在液体培养基中生长过夜。经编辑的基因座通过本领域已知的PCR和/或下一代测序(NGS)技术鉴定。
在引入到所述细胞中的最初10个质粒中，在筛选96个生长在蔗糖和4-氯苯丙氨酸培养基上的菌落后，每个汇集的质粒转化可以恢复通过10个质粒构建的平均40％-50％的独特编辑(参见图15)。
实例8-使用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复在酿酒酵母中使用汇集的基因组编辑
目的
此实例详述了使用天然同源重组创建经编辑的酿酒酵母菌株的集合。在此实例中，要插入到酿酒酵母宿主细胞中的每个有效载荷都含有与基因组中的某个区域同源的序列(例如，左同源臂和右同源臂)。左同源臂和右同源臂通过所设计的编辑(例如，缺失)分离。
材料和方法
使用汇集的酿酒酵母菌株版本的菌株构建通常由两部分组成。首先，通过制备能够在基因组基因座处进行三(3)种可能编辑之一的质粒池并一次性将其转化到受体酿酒酵母宿主细胞中来生成经编辑的菌株文库。其次，鉴定哪些编辑发生在特异性基因座处。总体而言，所述过程需要在过程中使用Cas9介导的同源重组来转化宿主酿酒酵母菌株，在所述过程中，将三(3)个不同的有效载荷之一插入到每个靶向基因座中(参见图10A)。
Cas9由抗生素可选择CEN.ARS质粒表达，所述质粒对存在于宿主酿酒酵母菌株中的抗生素(即，诺尔丝菌素(Nourseothricin))抗性标志基因进行编码。在六(6)个单独转化中的每个转化中都提供了含有靶向六(6)个基因组基因座之一(即ARI1基因、TRP1基因、ADH6基因、ECM13基因、MCH5基因或PRB1基因)的间隔区(即，每个基因座一次转化)的sgRNA表达构建体作为具有同源臂的线性DNA分子，以通过同源重组整合到宿主细胞中存在的Cas9表达质粒中。三(3)个编辑有效载荷被生成为每个基因座的DNA线性片段，所述基因座使用PCR将靶向所述有效载荷的45bp同源臂添加到期望基因座上，并缺失对应sgRNA所靶向的序列并替换为特异性编辑有效载荷。三(3)个编辑有效载荷是：(1)以5'到3'朝向可操作地连接到组成型启动子的红色荧光蛋白(RFP)(指定为RFP_F)；(2)以3'到5'朝向可操作地连接到组成型启动子的RFP(指定为RFP_R)；或(3)以5'到3'朝向可操作地连接到组成型启动子的RFP以及以5'到3'朝向可操作地连接到不同组成型启动子的绿色荧光蛋白(GFP)(指定为RFP_GFP)。对于六(6)个靶向基因组基因座中的每一个，线性化Cas9表达质粒、线性sgRNA表达盒和三(3)个有效载荷扩增子的等摩尔池通过化学转化过程转化到酿酒酵母中，并且在含有诺尔丝菌素的培养基上选择转化体。所述化学转化过程需要使用乙酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇方法，如吉刺(Gietz)等人,通过乙酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇方法转化酵母(Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrierDNA/polyethylene glycol method),酶学方法(Methods in Enzymology),350(2001),87-96中所描述的。
在每次转化后，使用本领域已知的PCR和/或下一代测序(NGS)技术对菌落进行培养和基因分型。
结果和结论
如图10B所示，在每次转化后测试的菌落中，所有三种有效载荷都被检测到。此过程表明，有效载荷池可以用于酿酒酵母中的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，以高效且廉价地生成新的酿酒酵母菌株。
实例9-使用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复在酿酒酵母中使用迭代基因组编辑
目的
此实例详述了使用天然同源重组对酿酒酵母宿主细胞的基因组进行迭代地编辑以创建经编辑的酿酒酵母菌株的集合。在此实例中，在引入新的编辑有效载荷的每个连续转化轮次中，要插入到酿酒酵母宿主细胞中的每个编辑有效载荷都含有与基因组中的某个区域同源的序列(例如，左同源臂和右同源臂)。左同源臂和右同源臂通过所设计的编辑(例如，缺失)分离。
材料和方法
使用汇集的酿酒酵母菌株版本的菌株构建通常由两部分组成。首先，通过制备能够在基因组基因座处进行三(3)种可能编辑之一的质粒池并一次性将其转化到受体酿酒酵母宿主细胞中，并且然后重复此过程进行两个额外编辑轮次来生成经编辑的菌株文库，其中每个额外轮次靶向不同的基因座与在特定额外轮次中靶向的基因组基因座的三(3)种可能的基因编辑之一。其次，鉴定哪些编辑发生在特异性基因座处。总体而言，所述过程需要在过程中使用Cas9介导的同源重组来转化宿主酿酒酵母菌株，在所述过程中，将三(3)个不同的有效载荷之一插入到如图10A所示的每个靶向基因座中，但如图11A所示，重复所述过程进行两个额外轮次。
对于三(3)个转化轮次中的每一轮次，Cas9从存在于宿主酿酒酵母菌株中的三(3)个抗生素可选择CEN.ARS质粒之一表达。每个转化轮次使用对三种不同抗生素可选择标志基因之一进行编码的CEN.ARS质粒，使得每个轮次使用CEN.ARS质粒与来自每个其它转化轮次的不同抗生素选择标志物(即，图11A中的诺尔丝菌素(抗生素1)、遗传霉素(G418)(抗生素2)或潮霉素(抗生素3))。在每个转化轮次中，含有靶向基因组基因座的间隔区的sgRNA表达构建体(所述基因组基因座与在每个其它转化轮次中靶向的基因组基因座不同)作为具有同源臂的线性DNA分子提供，以便通过同源重组整合到宿主细胞中存在的Cas9表达质粒中。三(3)种可能编辑中的一(1)种编辑有效载荷被生成为在特定转化轮次中靶向的基因座的线性片段，所述转化使用PCR将靶向所述有效载荷的45bp同源臂添加到特定转化轮次的期望基因座上，并缺失对应sgRNA所靶向的序列并替换为特异性编辑有效载荷。每个转化轮次都会引入三(3)个可能有效载荷中的单独一(1)个。三(3)个可能编辑有效载荷是：(1)以5'到3'朝向可操作地连接到组成型启动子的红色荧光蛋白(RFP)(指定为RFP_F)；(2)以3'到5'朝向可操作地连接到组成型启动子的RFP(指定为RFP_R)；或(3)以5'到3'朝向可操作地连接到组成型启动子的RFP以及以5'到3'朝向可操作地连接到不同组成型启动子的绿色荧光蛋白(GFP)(指定为RFP_GFP)。
如图11B所示，对于每个转化轮次，线性化Cas9表达质粒、线性sgRNA表达盒和特异性编辑有效载荷通过实例8中使用的化学转化过程转化到酿酒酵母中，并且在含有相关抗生素的培养基上选择转化体进行特定转化轮次(即抗生素1、2或3)。第一转化使用硫酸诺尔丝菌素(抗生素1)选择执行，第二转化使用遗传霉素G418(抗生素2)选择执行，并且第三转化使用潮霉素(抗生素3)选择执行。在使用第一抗生素(抗生素1)进行初始转化和选择轮次后，将所述菌落在液体中培养2小时，使其具有感受态，然后通过使用第二组sgRNA盒/编辑有效载荷进行第二编辑轮次来转化。使用第二抗生素(抗生素2)在固体培养基上选择来自第二编辑轮次的转化体，然后在液体中培养，使其具有感受态并使用第三组sgRNA/编辑有效载荷进行第三次转化，并且使用第三抗生素(抗生素3)进行选择。在第三编辑轮次之后，使用本领域已知的PCR和/或下一代测序(NGS)技术对菌落进行培养和基因分型。
结果和结论
如图11C所示，在传统转化之后通过快速迭代转化引入的两个基因组编辑的基因分型示出，在28个基因分型的菌落中有17.8％含有两个迭代的编辑。此过程表明，在迭代过程中引入的有效载荷可以用于酿酒酵母中的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，以高效且廉价地生成新的酿酒酵母菌株。
实例10-汇集的质粒迭代堆叠(PPIS)的原理验证
目的
此实例详述了使用汇集的质粒迭代堆叠(PPIS)从每个编辑轮次的单个汇集转化中生成许多基因型。在此实例中，不是单独转化质粒，而是将4个质粒的池转化到宿主细胞中，清除所述质粒，并且然后汇集并用于接种主要培养物。然后使用4个质粒的池对主要培养物重复所述过程(参见图12A)。
材料和方法
总体而言，对于汇集的质粒迭代堆叠(PPIS)，将含有编辑有效载荷的多个质粒(pEDIT质粒)混合并用于在多个编辑轮次中转化包括大肠杆菌宿主细胞的培养物(参见图12A)。在转化所述大肠杆菌宿主细胞之前，将pCUT2.2质粒引入到所述宿主细胞中。所述pCUT2.2质粒是一种含有Cas9、重组工程机制、羧苄青霉素抗性盒和温度敏感性复制起点的复制质粒。在将pCUT 2.2质粒引入到大肠杆菌宿主细胞中后，在四(4)个单独、连续转化轮次中的每个轮次中，将各自含有编辑有效载荷的4个质粒的池混合并引入到含有pCUT2.2质粒的大肠杆菌宿主细胞中。在每一连续转化轮次中引入的4个质粒的池含有四(4)个pEDIT质粒，其中每个pEDIT质粒包括具有同源臂的编辑有效载荷和靶向大肠杆菌宿主细胞中的特异性基因座的对应sgRNA。在每个转化轮次之后，从所述轮次的转化体中清除在特定转化轮次中引入的pEDIT质粒(即，使用主动反选择或可替代地被动反选择(即在非选择性培养基上生长)，然后将清除的转化体汇集并随后用作主要培养物的接种体，然后使所述接种体经受下一连续编辑轮次。在最终编辑轮次之后，pCUT2.2使用其温度敏感性ori被清除。
更具体地说，所述PPIS过程是使用以下方法进行的：
(1)感受态细胞制备的培养物：
种子：在5mL LBClin100中接种基础编辑菌株。在30℃、160rpm下摇晃过夜。
主要部分：测量种子培养物的OD600，并以约0.04的起始OD600接种100mLLBClin100(取决于基础编辑菌株倍增时间)。在18℃、160rpm下摇晃约16小时。(目标是第二天早上在诱导重组工程机制之前培养物的OD600为约0.3)。
第二天早上，当OD600为约0.3时，用0.2％阿拉伯糖诱导主要培养物(重组工程机制的表达由pBAD驱动)。在30℃、160rpm下摇晃培养物，直到OD600达到0.4-0.6(1-2小时)。
(2)感受态细胞制备：
在冰上冷却培养物持续15分钟。在整个复合细胞制备过程中，将细胞保持在冰上(或在4℃下)。
在4℃、4000xg下离心10分钟。将细胞重新悬浮在50mL冷的10％甘油中，转移到50mL锥形瓶中，并在4℃、3500xg下旋转10分钟。倾析并洗涤2次以上，总共洗涤3次。最后一次洗涤后，倾析液体，并且将所述细胞沉淀物重新悬浮在50mL锥形瓶底部剩余的少量10％甘油中。
按1:50稀释复合细胞(980uL 10％甘油+20uL细胞)并测量OD600。用10％的冷甘油将复合细胞的OD600调整到约50-75的最终OD600。
(3)转化
混合50uL复合细胞和100ng质粒(对于汇集质粒-总共添加100ng，即100ng/质粒数＝ng每个质粒)，转移到1mM比色皿中，并使用大肠杆菌设置进行电穿孔。在此实例中，使用了4个独特的基因编辑，使得4个基因编辑中的一个存在于单独质粒上，并且因此在每个编辑轮次中混合和转化4个质粒。
立即重新悬浮在NEB恢复培养基(750uL)中。
通过在30℃、1000rpm下摇晃3小时恢复。
将900uL(1:500稀释)平板接种于未分离的LBClin100Kan50 Qtray上。在WhisperFlow柜中干燥持续1小时。在30℃下温育Qtray持续1-2天(直到菌落可挑取)。
(4)pEDIT清除
将n个菌落(n＝4x可能的基因型)挑取到300uL LBClin100Kan50 96MWP或120uLLBClin100Kan50 384DWP中。在30℃、160rpm下摇晃过夜。
当LBClin100Kan50培养物饱和时，储存(混合等体积的培养物和50％甘油)并将3uL冲压到300uL LBClin100+10％蔗糖96MWP中或将2uL冲压到120uL LBClin100384DWP中以清除pEDIT(用sacB进行主动反选择)。在30℃、160rpm下摇晃过夜。
当LBClin100Suc10培养物饱和时，将具有相同编辑池的培养物汇集并稀释到10-5。
将900uL经稀释的培养物平板接种于未分离的LBClin100 Qtray上。在WhisperFlow柜中干燥持续1小时。在30℃下温育Qtray持续1-2天(直到菌落可挑取)。
将每个Qtray孔中的1个菌落挑取到30uL无菌水中。重新悬浮菌落并将3uL冲压到300uL LBClin100和300uL LBClin100Kan50 96MWP中，或者将2uL冲压到120uL LBClin100和120uL LBClin100Kan50 384DWP中。在30℃、160rpm下摇晃过夜。
当LBClin100培养物饱和时，测量LBClin100和LBClin100Kan50板两者的OD600以检查未清除pEDIT的培养物。在LBClin100Kan50中生长的培养物没有清除pEDIT，并且也没有进行后续编辑轮次。
储存清除pEDIT(即在LBClin100中生长，但在LBClin100Kan50中不生长)的培养物(混合等体积的培养物和50％甘油)。
汇集清除pEDIT(种子)的培养物。测量汇集种子培养物的OD600，并以约0.04的起始OD600接种100mL LBClin100(取决于基础编辑菌株倍增时间)。
(5)菌株QC
通过重复步骤1-4执行n个编辑轮次。在此实例中，执行了4个编辑轮次。
在最后一个编辑轮次(即，第4轮次)之后，通过将5uL培养物冲压到20uL TE中并在98℃下温育10分钟，对pEDIT清除的培养物(未汇集孔)进行煮沸制备。
将7uL无菌水冲压到384孔PCR Framestar板中并添加扩增子NGS引物(含有i5/i7衔接子)。
将3uL煮沸制剂和10uL NEB OneTaq热启动主混合物与GC缓冲液冲压到含有引物的384孔PCR Framestar板中。总反应体积为20uL。
在标准NEB OneTaq热启动主混合物和GC缓冲液条件下运行PCR。
将映射的扩增子板移交给基因组学和测序核心以进行扩增子NGS。
对样本执行kmer搜索以评估是否发生编辑。
(6)pCUT2.2清除
将3uL LBClin培养物(pEDIT清除后)冲压到1mL LB 96DWP中。在42℃、1000rpm下摇晃17-20小时。
测量OD600，在LB中进行10-4到10-7稀释，并将150uL平板接种于LB和LBClin分开的Qtray上。
将LB和LBClin Qtrays在30℃下温育20-22小时。
筛选pCUT2.2清除(固体培养基)：在LB上生长但不在LBClin上生长的Qtray孔表明pCUT2.2清除。
从Qtray孔中挑取出n个在LB上生长但不在LBClin上生长的菌落到300uL水中。重新悬浮菌落并将5uL冲压到300uL LB和LBClin 96MWP中。
确认的pCUT2.2清除(液体培养基)：在LB上生长但不在LBClin上生长的孔表明pCUT2.2的成功清除。
储存清除pCUT2.2的培养物(将75uL培养物混合到75uL的50％甘油中)。
结果和结论
理论上，使用CRISPR进行四(4)个PPIS轮次的四(4)个独特编辑/轮次可以在大肠杆菌中产生625种可能的基因型。如图12B-12C所示，大肠杆菌中的125个中的11个或约9％的可能基因型被捕获(在4个轮次中的1个轮次中没有发生编辑，并被排除在可能的基因型数量之外)，这表明使用CRISPR的PPIS可以是在多个基因组基因座上引入多个基因编辑的有效方法。
实例11-汇集的亲本迭代堆叠(PPAIS)的原理验证
目的
此实例详述了使用汇集的亲本迭代堆叠(PPAIS)生成许多基因型并通过将质粒单独转化到单独的大肠杆菌宿主细胞培养物中来最小化转化/编辑偏差。
材料和方法
总体而言，对于汇集的亲本迭代堆叠(PPAIS)，不是将质粒池(如汇集的质粒迭代堆叠(PPIS))转化到宿主细胞培养物中，而是将4个pEDIT质粒池单独转化到宿主细胞的单独培养物中，从每个单独培养物中清除所述pEDIT质粒，汇集所有清除的菌株(种子)并将其用于接种主要培养物，然后将所述主要培养物分为单独的培养物。在下一个编辑轮次中，通过将四(4)个质粒池单独转化到通过从上一个编辑轮次分离主要培养物产生的单独培养物中来重复所述过程(参见图13A)。类似于实例8中使用的大肠杆菌宿主细胞，所述大肠杆菌宿主细胞包括pCUT2.2质粒，所述pCUT2.2质粒在开始多个编辑轮次之前被引入到所述宿主细胞中。与实例8中的pEDIT质粒一样，每个pEDIT质粒包括具有同源臂的编辑有效载荷和靶向大肠杆菌宿主细胞中的特异性基因座的对应sgRNA。也类似于实例8，在每个转化轮次之后，从所述轮次的转化体中清除在特定转化轮次中引入的pEDIT质粒(即，使用主动反选择或可替代地被动反选择(即，在非选择性培养基上生长)，并且在最终编辑轮次后，pCUT2.2使用其温度敏感ori被清除。
更具体地说，所述PPAIS过程以下列方式进行：
(1)感受态细胞制备的培养物：
种子：在5mL LBClin100中接种基础编辑菌株。在30℃、160rpm下摇晃过夜。
主要部分：测量种子培养物的OD600，并以约0.04的起始OD600接种100mLLBClin100(取决于基础编辑菌株倍增时间)。在18℃、160rpm下摇晃约16小时。(目标是第二天早上在诱导重组工程机制之前培养物的OD600为约0.3)。
第二天早上，当OD600为约0.3时，用0.2％阿拉伯糖诱导主要培养物(重组工程机制的表达由pBAD驱动)。在30℃、160rpm下摇晃培养物，直到OD600达到0.4-0.6(1-2小时)。
(2)感受态细胞制备：
在冰上冷却培养物持续15分钟。在整个复合细胞制备过程中，将细胞保持在冰上(或在4℃下)。
在4℃、4000xg下离心10分钟。将细胞重新悬浮在50mL冷的10％甘油中，转移到50mL锥形瓶中，并在4℃、3500xg下旋转10分钟。倾析并洗涤2次以上，总共洗涤3次。最后一次洗涤后，倾析液体，并且将所述细胞沉淀物重新悬浮在50mL锥形瓶底部剩余的少量10％甘油中。
按1:50稀释复合细胞(980uL 10％甘油+20uL细胞)并测量OD600。用10％的冷甘油将复合细胞的OD600调整到约50-75的最终OD600。
(3)转化
混合50uL复合细胞和100ng质粒，转移到1mM比色皿中，并且使用大肠杆菌设置进行电穿孔。在此实例中，使用了4个独特的基因编辑，使得4个基因编辑中的一个存在于单独质粒上，并且将四(4)个质粒中的每一个单独转化到大肠杆菌宿主细胞中。
立即重新悬浮在NEB恢复培养基(750uL)中。
通过在30℃、1000rpm下摇晃3小时恢复。
将900uL(1:500稀释)平板接种于未分离的LBClin100Kan50 Qtray上。在WhisperFlow柜中干燥持续1小时。在30℃下温育Qtray持续1-2天(直到菌落可挑取)。
(4)pEDIT清除
将n个菌落(n＝4x可能的基因型)挑取到300uL LBClin100Kan50 96MWP或120uLLBClin100Kan50 384DWP中。在30℃、160rpm下摇晃过夜。
当LBClin100Kan50培养物饱和时，储存(混合等体积的培养物和50％甘油)并将3uL冲压到300uL LBClin100+10％蔗糖96MWP中或将2uL冲压到120uL LBClin100384DWP中以清除pEDIT(用sacB进行主动反选择)。在30℃、160rpm下摇晃过夜。
当LBClin100Suc10培养物饱和时，将具有相同编辑的培养物汇集并稀释到10-5。
将900uL经稀释的培养物平板接种于未分离的LBClin100 Qtray上。在WhisperFlow柜中干燥持续1小时。在30℃下温育Qtray持续1-2天(直到菌落可挑取)。
将每个Qtray孔中的1个菌落挑取到30uL无菌水中。重新悬浮菌落并将3uL冲压到300uL LBClin100和300uL LBClin100Kan50 96MWP中，或者将2uL冲压到120uL LBClin100和120uL LBClin100Kan50 384DWP中。在30℃、160rpm下摇晃过夜。
当LBClin100培养物饱和时，测量LBClin100和LBClin100Kan50板两者的OD600以检查未清除pEDIT的培养物。在LBClin100Kan50中生长的培养物没有清除pEDIT，并且也没有进行后续编辑轮次。
储存清除pEDIT(即在LBClin100中生长，但在LBClin100Kan50中不生长)的培养物(混合等体积的培养物和50％甘油)。
汇集清除pEDIT(种子)的培养物。测量汇集种子培养物的OD600，并以约0.04的起始OD600接种100mL LBClin100(取决于基础编辑菌株倍增时间)。
(5)菌株QC
通过重复步骤1-4执行n个编辑轮次。在此实例中，执行了4个编辑轮次。
在最后一个编辑轮次(即，第4轮次)之后，通过将5uL培养物冲压到20uL TE中并在98℃下温育10分钟，对pEDIT清除的培养物(未汇集孔)进行煮沸制备。
将7uL无菌水冲压到384孔PCR Framestar板中并精选(hitpick)扩增子NGS引物(含有i5/i7衔接子)。
将3uL煮沸制剂和10uL NEB OneTaq热启动主混合物与GC缓冲液冲压到含有精选的引物的384孔PCR Framestar板中。总反应体积为20uL。
在标准NEB OneTaq热启动主混合物和GC缓冲液条件下运行PCR。
将映射的扩增子板移交给基因组学和测序核心以进行扩增子NGS。
对样本执行kmer搜索以评估是否发生编辑。
(6)pCUT2.2清除
将3uL LBClin培养物(pEDIT清除后)冲压到1mL LB 96DWP中。在42℃、1000rpm下摇晃17-20小时。
测量OD600，在LB中进行10-4到10-7稀释，并将150uL平板接种于LB和LBClin分开的Qtray上。
将LB和LBClin Qtrays在30℃下温育20-22小时。
筛选pCUT2.2清除(固体培养基)：在LB上生长但不在LBClin上生长的Qtray孔表明pCUT2.2清除。
从Qtray孔中挑取出n个在LB上生长但不在LBClin上生长的菌落到300uL水中。重新悬浮菌落并将5uL冲压到300uL LB和LBClin 96MWP中。
确认的pCUT2.2清除(液体培养基)：在LB上生长但不在LBClin上生长的孔表明pCUT2.2的成功清除。
储存清除pCUT2.2的培养物(将75uL培养物混合到75uL的50％甘油中)。
结果和结论
理论上，使用CRISPR进行四(4)个PPAIS轮次的四(4)个独特编辑/轮次可以在大肠杆菌中产生625种可能的基因型。如图13B-13C所示，大肠杆菌中的125个中的26个或约21％的可能基因型被捕获(在4个轮次中的1个轮次中没有发生编辑，并被排除在可能的基因型数量之外)，这表明使用CRISPR的PPAIS可以是在多个基因组基因座上引入多个基因编辑的有效方法。
实例12-用于使用被动反选择进行单次迭代编辑的方法的原理验证
目的
此实例描述了使用CRISPR介导的方法来使用实例1中描述的迭代编辑方法，但包括4个转化轮次，其中第4转化轮次使用具有与第一转化轮次中使用的可选择标志物相同的可选择标志物的编辑质粒。目的是确认被动反选择可有效地清除先前引入的编辑质粒，使得相同的可选择标志物可以在以后的基因组编辑轮次中循环使用。总的来说，与主动反选择相比，使用被动反选择可以减少编辑周期时间。
材料和方法
此实例中描述的迭代编辑方法基本上如图2和14A所示在大肠杆菌宿主细胞中进行，其中在第一转化轮次中将一组4个编辑质粒单独转化到大肠杆菌宿主细胞中，所述编辑质粒包括靶向相同基因座的一个sgRNA/修复片段对和卡那霉素(kan)可选择标志基因。所述转化体在含卡那霉素的培养基上生长；挑取单独菌落并在非选择性培养基中生长过夜，汇集(种子)并用于接种主要培养物，基本上如实例9中所述(每个培养物池源自单个pEDIT质粒)。在第2轮次中，用一组4个编辑质粒转化所述主要培养物，所述编辑质粒包括靶向相同基因座(与第一转化轮次的编辑质粒不同的基因座)的一个sgRNA/修复片段对和氯霉素(chlor)可选择标志基因。所述转化体在含Chlor的培养基上生长；挑取单独菌落并在非选择性培养基中生长过夜，汇集(种子)并用于接种新的主要培养物以进行第三转化轮次。在第3轮次中，用一组4个编辑质粒转化来自第2轮次的主要培养物，所述编辑质粒包括靶向相同基因座(与第一转化轮次和第二转化轮次的编辑质粒不同的基因座)的一个sgRNA/修复片段对和四环素(tet)可选择标志基因。所述转化体在含Tet的培养基上生长；挑取单独菌落并在非选择性培养基中生长过夜，汇集(种子)并用于接种新的主要培养物以进行第四转化轮次。在第4轮次中，用一组4个编辑质粒转化来自第3轮次的主要培养物，所述编辑质粒包括靶向相同基因座(与第一转化轮次、第二转化轮次和第三转化轮次的编辑质粒不同的基因座)的一个sgRNA/修复片段对和Kan可选择标志基因。所述转化体在含Kan的培养基上生长；单独菌落在非选择性培养基中生长过夜，转移到含蔗糖培养基以清除pEDIT，并且使用本领域已知的下一代测序(NGS)技术对清除pEDIT的菌株进行基因分型。
结果和结论
如图14B所示，第3转化轮次后产生的菌株对卡那霉素敏感，表明含有来自第1轮次的质粒的卡那霉素抗性基因已被清除。此外，图14C-14D示出了通过此实例的迭代编辑方法产生的菌株确实具有一些或全部期望的基因编辑。图14C-14D示出了在此实例所述的4个转化轮次中，通过引入4个独特编辑/轮次，可以使引入到大肠杆菌中的32个中的7个或约22％的可能基因型(在4个轮次中的1个轮次中没有发生编辑，并被排除在可能的基因型数量之外)被捕获。因此，2个被动反选择轮次足以应用至少2个轮次之前使用的选择标志基因的使用。此过程表明，在迭代过程中引入的有效载荷可以用于大肠杆菌中的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，以高效且廉价地生成新的大肠杆菌菌株。
本公开的编号实施例
在以下编号的实施例中阐述了本公开设想的其它主题：
1)一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：
a.将微生物宿主细胞的基础群体与第一编辑质粒池组合，其中所述第一池中的每个编辑质粒包括至少一个修复片段，并且其中所述第一编辑质粒池包括至少两个不同的修复片段，其中所述第一池中的每个编辑质粒进一步包括选择标志基因，并且其中每个修复片段包括在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；
b.将来自所述第一编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(a)的单独微生物宿主细胞中；以及
c.使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。
2)一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：
a.将微生物宿主细胞的基础群体与第一编辑质粒池组合，其中所述第一池中的每个编辑质粒包括至少一个修复片段，其中所述第一编辑质粒池包括至少两个不同的修复片段，其中所述第一编辑质粒池中的每个编辑质粒进一步包括选择标志基因，并且其中所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对一或多个位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与所述第一编辑质粒池一起引入到所述微生物宿主细胞中，其中所述一或多个位点特异性限制酶靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座，其中每个修复片段包括所述一或多个位点特异性限制酶所靶向的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；
b.将来自所述第一编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(a)的单独微生物宿主细胞中；以及
c.使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。
3)一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：
a.将微生物宿主细胞的基础群体与包括一或多个编辑质粒的第一编辑构建体池组合，其中所述第一编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，其中所述微生物宿主细胞包括RNA引导的DNA核酸内切酶，或者RNA引导的DNA核酸内切酶与所述第一编辑构建体池一起被引入到所述微生物宿主细胞中，并且其中所述第一编辑构建体池包括：
i.靶向相同的一或多个靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；
ii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的相同的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；或者
iii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；
b.将包括所述一或多个编辑质粒的所述第一编辑构建体池引入到来自步骤(a)的单独微生物宿主细胞中，其中所述第一编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及
c.使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。
4)一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：
a.将微生物宿主细胞的基础群体与包括一或多个编辑质粒的第一编辑构建体池组合，其中所述第一编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，并且其中所述第一编辑构建体池包括：
i.靶向相同的一或多个靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；
ii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的相同的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；或者
iii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；
b.将RNA引导的DNA核酸内切酶以及包括所述一或多个编辑质粒的所述第一编辑构建体池引入到来自步骤(a)的单独微生物宿主细胞中，其中所述第一编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及
c.使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。
5)根据实施例1到4中任一实施例所述的方法，其进一步包括步骤(d)，所述步骤(d)包括使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。
6)根据实施例1(b)或实施例2(b)所述的方法，其中不同的编辑质粒被引入到单独微生物宿主细胞中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。
7)根据实施例3(b)或实施例4(b)所述的方法，其中不同的编辑构建体被引入到所述单独微生物宿主细胞的亚群体中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。
8)根据实施例1到4中任一实施例所述的方法，其中所述至少两个不同的修复片段存在于同一质粒上。
9)根据实施例1到4中任一实施例所述的方法，其中所述至少两个不同的修复片段存在于不同质粒上。
10)根据实施例3或实施例4所述的方法，其中所述第一编辑构建体池进一步包括一或多个线性片段。
11)根据实施例3或实施例4所述的方法，其中所述第一编辑构建体池进一步包括两个或两个以上不同的线性片段。
12)根据实施例3或实施例4所述的方法，其中所述第一编辑构建体池包括两个或两个以上不同的编辑质粒。
13)根据实施例3或实施例4所述的方法，其中所述gRNA存在于所述一或多个编辑质粒上。
14)根据实施例3或实施例4所述的方法，其中所述修复片段存在于所述一或多个编辑质粒上。
15)根据实施例4所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在所述一或多个编辑质粒上。
16)根据实施例3或实施例4所述的方法，其中所述gRNA和所述修复片段存在于所述一或多个编辑质粒上。
17)根据实施例4所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶、所述gRNA和产生每个编辑所需的所述修复片段的序列均存在于所述一或多个编辑质粒上。
18)根据实施例3或实施例4所述的方法，其中用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述gRNA存在于同一编辑质粒上。
19)根据实施例3或实施例4所述的方法，其中用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述修复片段存在于同一编辑质粒上。
20)根据实施例12所述的方法，其中用于靶向和编辑所述不同基因座的所述gRNA存在于所述两个或两个以上不同的编辑质粒上。
21)根据实施例12所述的方法，其中用于靶向和编辑所述不同基因座的所述修复片段存在于所述两个或两个以上不同的编辑质粒上。
22)根据实施例3或实施例4所述的方法，其中用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述gRNA和所述修复片段存在于同一编辑质粒上。
23)根据实施例3或实施例4所述的方法，其中用于靶向和编辑所有基因座的所述gRNA和所述修复片段存在于同一编辑质粒上。
24)根据实施例10所述的方法，其中所述gRNA存在于所述一或多个线性片段上。
25)根据实施例10所述的方法，其中所述修复片段存在于所述一或多个线性片段上。
26)根据实施例10所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在所述一或多个线性片段上。
27)根据实施例11所述的方法，其中所述两个或两个以上不同的线性片段包括不同的修复片段。
28)根据实施例11所述的方法，其中所述两个或两个以上不同的线性片段包括不同的gRNA。
29)根据实施例10、11或24到28中任一实施例所述的方法，其中所述线性片段作为ssDNA或dsDNA提供。
30)根据实施例29所述的方法，其中所述线性片段含有末端修饰。
31)根据实施例30所述的方法，其中所述末端修饰应用于所述线性片段的5'和/或3'末端。
32)根据实施例31所述的方法，其中所述修饰选自由以下组成的组，但不限于：磷酸化末端、硫代磷酸酯连接碱基、发夹、倒置碱基、碱基修饰、2'O-甲基碱基、锁定核酸碱基、硫代磷酸化2'O-甲基碱基和硫代磷酸化锁定核酸碱基。
33)根据实施例12所述的方法，其中所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的修复片段或多个不同的修复片段。
34)根据实施例12所述的方法，其中所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的gRNA或多个不同的gRNA。
35)根据实施例12所述的方法，其中所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的修复片段和不同的gRNA或多个不同的修复片段和多个不同的gRNA。
36)根据实施例6所述的方法，其中所述不同的编辑质粒包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的修复片段，由此产生至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的基因修饰的微生物菌株。
37)根据实施例7所述的方法，其中所述不同的编辑构建体包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的gRNA和/或修复片段，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的基因修饰的微生物菌株。
38)根据实施例1到4、6到7或36到37中任一实施例所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的单独细胞。
39)根据实施例1到4、6到7或36到37中任一实施例所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有一个基因组编辑的单独细胞。
40)根据实施例1到4、6到7或36到37中任一实施例所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。
41)根据实施例1到4、6到7或36到37中任一实施例所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的单独细胞、具有一个基因组编辑的单独细胞以及具有多个基因组编辑的单独细胞。
42)根据实施例1到4、6到7或36到37中任一实施例所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的单独细胞。
43)根据实施例1所述的方法，其进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：
d.使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；
e.将额外编辑质粒池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑质粒池包括至少一或两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；
f.将来自所述额外编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中；以及
g.使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。
44)根据实施例2所述的方法，其进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：
d.使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；
e.将额外编辑质粒池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑质粒池包括至少一或两个不同的修复片段，其中所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与所述额外编辑质粒池一起被引入到所述微生物宿主细胞中，所述额外编辑质粒池靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座，并且其中每个修复片段包括所述一或多个位点特异性限制酶所靶向的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；
f.将来自所述额外编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中；以及
g.使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。
45)根据实施例3所述的方法，其进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：
d.使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；
e.将包括一或多个编辑质粒的额外编辑构建体池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，并且其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；
f.将包括所述一或多个编辑质粒的所述额外编辑构建体池引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中，其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及
g.使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。
46)根据实施例4所述的方法，其进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：
d.使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；
e.将包括一或多个编辑质粒的额外编辑构建体池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，并且其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；
f.将RNA引导的DNA核酸内切酶以及包括所述一或多个编辑质粒的所述额外编辑构建体池引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中，其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及
g.使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。
47)根据实施例43到46中任一实施例所述的方法，其中不在至少一个编辑轮次之后、不在每个编辑轮次之后或不在任何编辑轮次之后执行反选择。
48)根据实施例43到46中任一实施例所述的方法，其中不在至少一个编辑轮次之后、不在每个编辑轮次之后或不在任何编辑轮次之后执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。
49)根据前述实施例中任一实施例所述的方法，其中每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的多个基因编辑的序列。
50)根据前述实施例中任一实施例所述的方法，其中每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。
51)根据实施例3到4和45到46中任一实施例所述的方法，其中在步骤(b)或(f)中引入的所述gRNA包括与所述一或多个靶基因座互补的序列，并且每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。
52)根据实施例45或实施例46所述的方法，其中在步骤(f)中引入的所述gRNA包括与在前一编辑轮次中靶向的任何一或多个基因座不同的一或多个基因座互补的序列，并且每个修复片段包括所述不同的一或多个基因座中或邻近所述不同的一或多个基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。
53)根据实施例45或实施例46所述的方法，其中在步骤(f)中引入的所述gRNA包括与在前一编辑轮次中靶向的相同的一或多个基因座互补的序列，并且每个修复片段包括相比于在前一编辑轮次中引入的基因编辑在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个不同基因编辑的序列。
54)根据实施例45或实施例46所述的方法，其中步骤(f)包括将一或多个不同的编辑构建体引入到来自步骤(e)的单独微生物宿主细胞中，其中所述不同的编辑构建体包括与在前一编辑轮次中引入的所述gRNA和/或所述修复片段不同的gRNA和/或修复片段，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生一或多个不同的基因修饰的微生物菌株。
55)根据实施例54所述的方法，其中所述一或多个不同的编辑构建体包括不同的gRNA，所述不同的gRNA包括与至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个不同的一或多个基因座互补的序列，其中所述不同的一或多个基因座与任何先前靶向的一或多个基因座不同。
56)根据实施例54所述的方法，其中所述一或多个不同的编辑构建体包括不同的修复片段，所述不同的修复片段包括相比于在前一编辑轮次中引入的基因编辑在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个不同基因编辑的序列。
57)根据前述实施例中任一实施例所述的方法，其进一步包括对在步骤(c)中选择的菌落进行基因分型。
58)根据实施例43到46中任一实施例所述的方法，其进一步包括在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长的微生物宿主细胞进行基因分型。
59)根据实施例43到46中任一实施例所述的方法，其中：1)在每个编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择；或者2)在任何编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。
60)根据实施例43到46中任一实施例所述的方法，其中与先前与所述微生物宿主细胞组合的每个其它或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒相比，所述第一编辑质粒池和所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的复制起点或相同的复制起点类别。
61)根据实施例43到46中任一实施例所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括具有多个基因组编辑的单独细胞。
62)根据实施例43到46中任一实施例所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的单独细胞。
63)根据实施例1到4或43到46中任一实施例所述的方法，其中所述第一或额外编辑质粒池包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个不同的编辑质粒。
64)根据实施例1到4或43到46中任一实施例所述的方法，其中所述第一或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的选择标志基因。
65)根据实施例1到4或43到46中任一实施例所述的方法，其中所述选择标志基因包括抗生素或营养缺陷型选择标志基因。
66)根据实施例2或实施例44所述的方法，其中所述一或多个位点特异性限制酶中的每个切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座处的序列。
67)根据实施例2或实施例44所述的方法，其中所述一或多个位点特异性限制酶中的每个选自由以下组成的组：RNA引导的核酸内切酶、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)。
68)根据实施例2或实施例44所述的方法，其中所述位点特异性限制酶中的每个编码在质粒上、编码在所述基因组中、从RNA翻译或引入到所述细胞中作为蛋白质。
69)根据实施例3到4或45到46中任一实施例所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座处的序列。
70)根据实施例3到4或45到46中任一实施例所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1或其同源物、直系同源物或旁系同源物。
71)根据实施例3到4或45到46中任一实施例所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶编码在质粒上、编码在所述基因组中、从RNA翻译或引入到所述细胞中作为蛋白质。
72)根据实施例3到5、7到42或45到46中任一实施例所述的方法，其中所述gRNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。
73)根据实施例3到5、7到42或45到46中任一实施例所述的方法，其中所述gRNA包含单gRNA(sgRNA)。
74)根据前述实施例中任一实施例所述的方法，其中所述基因编辑选自由以下组成的组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。
75)根据实施例43到46中任一实施例所述的方法，其中在一或多个额外编辑轮次中引入的所述修复片段包括一或多个基因编辑的不同序列并且与来自前一编辑轮次的不同选择标志基因相关联。
76)根据实施例43到46中任一实施例所述的方法，其中在一或多个额外编辑轮次中引入的所述gRNA靶向不同的一或多个基因座并且与来自前一编辑轮次的不同抗生素选择标志基因相关联。
77)根据实施例43所述的方法，其进一步包括步骤(h)，其中步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒，其中所述最终修复片段包括所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终一或多个基因座中或邻近所述最终一或多个基因座的一或多个基因编辑的序列，其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列同源的序列，其中所述最终一或多个基因座包括与先前编辑的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座，并且其中所述最终质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列。
78)根据实施例44所述的方法，其进一步包括步骤(h)，其中步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒，其中所述最终修复片段包括所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终一或多个基因座中或邻近所述最终一或多个基因座的一或多个基因编辑的序列，其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列同源的序列，其中所述最终一或多个基因座包括与先前编辑的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座，其中所述最终质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列，其中所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的所述最终质粒一起被引入到所述微生物宿主细胞中。
79)根据实施例45或实施例46所述的方法，其进一步包括步骤(h)，其中步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终gRNA和最终修复片段的最终质粒，其中所述最终gRNA包括与所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终一或多个基因座互补的序列，其中所述最终一或多个基因座包括与先前引入到所述微生物宿主细胞中的gRNA所靶向的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座，其中所述最终修复片段包括所述最终一或多个基因座中的一或多个基因编辑的序列，其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列同源的序列，并且其中所述最终质粒、所述最终gRNA和/或所述最终修复片段与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列相关联。
80)根据实施例77到79中任一实施例所述的方法，其进一步包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补的向导序列的gRNA，以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。
81)根据前述实施例中任一实施例所述的方法，其中所述微生物宿主细胞包括来自一或多个异源重组系统的一组蛋白质。
82)根据前述实施例中任一实施例所述的方法，其中所述微生物宿主细胞包括来自λred重组系统、RecET重组系统的一组蛋白质、来自λred重组系统或RecET重组系统的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。
83)根据实施例82所述的方法，其中来自所述λred重组系统的所述一组蛋白质包括β蛋白、gam蛋白和exo蛋白。
84)根据实施例81到83中任一实施例所述的方法，其中在步骤(a)之前，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质在包括对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因的质粒上被引入到所述微生物宿主细胞中。
85)根据实施例81到84中任一实施例所述的方法，其中由于对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因整合到所述微生物宿主细胞的基因组中，因此来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质被所述微生物宿主细胞稳定地表达。
86)根据实施例81到85中任一实施例所述的方法，其中来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质是组成型表达的。
87)根据实施例81到86中任一实施例所述的方法，其中来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质可操作地连接到诱导型启动子上，任选地其中所述异源重组系统基因位于操纵子中。
88)根据实施例87所述的方法，其中所述诱导型启动子可通过添加试剂、耗竭代谢物或试剂或通过温度变化来诱导。
89)根据实施例88所述的方法，其中所述试剂选自由以下组成的组：阿拉伯糖、异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和四环素。
90)根据前述实施例中任一实施例所述的方法，其中所述引入步骤包括转化所述微生物宿主细胞。
91)根据前述实施例中任一实施例所述的方法，其中所述微生物宿主细胞是真核细胞。
92)根据实施例91所述的方法，其中所述微生物宿主细胞是酵母细胞。
93)根据实施例92所述的方法，其中所述酵母细胞是酿酒酵母。
94)根据实施例91所述的方法，其中所述微生物宿主细胞是丝状真菌。
95)根据权利要求94所述的方法，其中所述丝状真菌是黑曲霉。
96)根据实施例1到90中任一实施例所述的方法，其中所述微生物宿主细胞是原核细胞。
97)根据实施例96所述的方法，其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌。
98)根据实施例96所述的方法，其中所述原核宿主细胞是谷氨酸棒状杆菌。
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上述不同的实施例可以组合以提供额外的实施例。在本说明书中引用的和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物以全文引用的方式并入本文中。如果需要，则可以修改实施例的方面以采用各个专利、申请和出版物的概念来提供又额外的实施例。
鉴于以上详细描述，可以对实施例作出这些和其它改变。总之，在以下权利要求中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求限制于本说明书和权利要求中所公开的具体实施例，而是应当被解释为包含所有可能的实施例连同这种权利要求有权获得的等同物的整个范围。相应地，权利要求书并不受本公开的限制。
通过引用的方式并入
出于所有目的，本文中引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请均通过全文引用的方式并入本文。然而，对本文所引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不被视为并且不应当被视为对其构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。

Claims (98)

1.一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：
a.将微生物宿主细胞的基础群体与第一编辑质粒池组合，其中所述第一池中的每个编辑质粒包括至少一个修复片段，并且其中所述第一编辑质粒池包括至少两个不同的修复片段，其中所述第一池中的每个编辑质粒进一步包括选择标志基因，并且其中每个修复片段包括在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；
b.将来自所述第一编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(a)的个别微生物宿主细胞中；以及
c.使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。
2.一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：
a.将微生物宿主细胞的基础群体与第一编辑质粒池组合，其中所述第一池中的每个编辑质粒包括至少一个修复片段，其中所述第一编辑质粒池包括至少两个不同的修复片段，其中所述第一编辑质粒池中的每个编辑质粒进一步包括选择标志基因，并且其中所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对一或多个位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与所述第一编辑质粒池一起引入到所述微生物宿主细胞中，其中所述一或多个位点特异性限制酶靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座，其中每个修复片段包括所述一或多个位点特异性限制酶所靶向的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；
b.将来自所述第一编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(a)的个别微生物宿主细胞中；以及
c.使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。
3.一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：
a.将微生物宿主细胞的基础群体与包括一或多个编辑质粒的第一编辑构建体池组合，其中所述第一编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，其中所述微生物宿主细胞包括RNA引导的DNA核酸内切酶，或者RNA引导的DNA核酸内切酶与所述第一编辑构建体池一起被引入到所述微生物宿主细胞中，并且其中所述第一编辑构建体池包括：
i.靶向相同的一或多个靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；
ii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的相同的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；或者
iii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；
b.将包括所述一或多个编辑质粒的所述第一编辑构建体池引入到来自步骤(a)的个别微生物宿主细胞中，其中所述第一编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及
c.使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。
4.一种用于产生一或多个基因修饰的微生物菌株的方法，所述方法包括：
a.将微生物宿主细胞的基础群体与包括一或多个编辑质粒的第一编辑构建体池组合，其中所述第一编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，并且其中所述第一编辑构建体池包括：
i.靶向相同的一或多个靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；
ii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的相同的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；或者
iii.靶向至少两个不同的靶基因座的gRNA以及至少两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在所述靶基因座中或邻近所述靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接所述微生物宿主的所述基因组中的所述靶基因座的序列同源的序列；
b.将RNA引导的DNA核酸内切酶以及包括所述一或多个编辑质粒的所述第一编辑构建体池引入到来自步骤(a)的个别微生物宿主细胞中，其中所述第一编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及
c.使来自步骤(b)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第一编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其进一步包括：步骤(d)，所述步骤(d)包括使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞。
6.根据权利要求1(b)或权利要求2(b)所述的方法，其中不同的编辑质粒被引入到个别微生物宿主细胞中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。
7.根据权利要求3(b)或权利要求4(b)所述的方法，其中不同的编辑构建体被引入到所述个别微生物宿主细胞的亚群体中，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生两个或两个以上不同的基因修饰的微生物菌株。
8.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述至少两个不同的修复片段存在于同一质粒上。
9.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述至少两个不同的修复片段存在于不同的质粒上。
10.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述第一编辑构建体池进一步包括一或多个线性片段。
11.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述第一编辑构建体池进一步包括两个或两个以上不同的线性片段。
12.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述第一编辑构建体池包括两个或两个以上不同的编辑质粒。
13.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述gRNA存在于所述一或多个编辑质粒上。
14.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述修复片段存在于所述一或多个编辑质粒上。
15.根据权利要求4所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶在所述一或多个编辑质粒上编码。
16.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述gRNA和所述修复片段存在于所述一或多个编辑质粒上。
17.根据权利要求4所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶的序列、所述gRNA和产生每个编辑所需的所述修复片段均存在于所述一或多个编辑质粒上。
18.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述gRNA存在于同一编辑质粒上。
19.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述修复片段存在于同一编辑质粒上。
20.根据权利要求12所述的方法，其中用于靶向和编辑所述不同基因座的所述gRNA存在于所述两个或两个以上不同的编辑质粒上。
21.根据权利要求12所述的方法，其中用于靶向和编辑所述不同基因座的所述修复片段存在于所述两个或两个以上不同的编辑质粒上。
22.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中用于靶向和编辑相同的一或多个基因座的所述gRNA和所述修复片段存在于同一编辑质粒上。
23.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中用于靶向和编辑所有基因座的所述gRNA和所述修复片段存在于同一编辑质粒上。
24.根据权利要求10所述的方法，其中所述gRNA存在于所述一或多个线性片段上。
25.根据权利要求10所述的方法，其中所述修复片段存在于所述一或多个线性片段上。
26.根据权利要求10所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶在所述一或多个线性片段上编码。
27.根据权利要求11所述的方法，其中所述两个或两个以上不同的线性片段包括不同的修复片段。
28.根据权利要求11所述的方法，其中所述两个或两个以上不同的线性片段包括不同的gRNA。
29.根据权利要求10、11或24到28中任一权利要求所述的方法，其中所述线性片段作为ssDNA或dsDNA提供。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述线性片段含有末端修饰。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述末端修饰应用于所述线性片段的5'和/或3'末端。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述修饰选自由以下组成的群组，但不限于：磷酸化末端、硫代磷酸酯连接碱基、发夹、倒置碱基、碱基修饰、2'O-甲基碱基、锁定核酸碱基、硫代磷酸化2'O-甲基碱基和硫代磷酸化锁定核酸碱基。
33.根据权利要求12所述的方法，其中所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的修复片段或多个不同的修复片段。
34.根据权利要求12所述的方法，其中所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的gRNA或多个不同的gRNA。
35.根据权利要求12所述的方法，其中所述两个或两个以上不同的编辑质粒包括不同的修复片段和不同的gRNA或多个不同的修复片段和多个不同的gRNA。
36.根据权利要求6所述的方法，其中所述不同的编辑质粒包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的修复片段，由此产生至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的基因修饰的微生物菌株。
37.根据权利要求7所述的方法，其中所述不同的编辑构建体包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的gRNA和/或修复片段，由此在所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体中产生至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个不同的基因修饰的微生物菌株。
38.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的个别细胞。
39.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有一个基因组编辑的个别细胞。
40.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括具有多个基因组编辑的个别细胞。
41.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括不具有基因组编辑的个别细胞、具有一个基因组编辑的个别细胞以及具有多个基因组编辑的个别细胞。
42.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第一编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的个别细胞。
43.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：
d.使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；
e.将额外编辑质粒池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑质粒池包括至少一或两个不同的修复片段，其中每个修复片段包括在一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；
f.将来自所述额外编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(e)的个别微生物宿主细胞中；以及
g.使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；
其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。
44.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：
d.使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；
e.将额外编辑质粒池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑质粒池包括至少一或两个不同的修复片段，其中所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与所述额外编辑质粒池一起被引入到所述微生物宿主细胞中，所述额外编辑质粒池靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的一或多个靶基因座，并且其中每个修复片段包括所述一或多个位点特异性限制酶所靶向的一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的一或多个基因编辑的序列，并且其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主的所述基因组中的所述一或多个靶基因座的靶基因座的序列同源的序列；
f.将来自所述额外编辑质粒池的一或多个质粒引入到来自步骤(e)的个别微生物宿主细胞中；以及
g.使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；
其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。
45.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：
d.使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；
e.将包括一或多个编辑质粒的额外编辑构建体池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，并且其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；
f.将包括所述一或多个编辑质粒的所述额外编辑构建体池引入到来自步骤(e)的个别微生物宿主细胞中，其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及
g.使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；
其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。
46.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括一或多个额外编辑轮次，每个额外轮次包括：
d.使在步骤(c)中分离的所述微生物宿主细胞在对所述抗生素选择标志基因不具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞；
e.将包括一或多个编辑质粒的额外编辑构建体池与在步骤(d)中分离的微生物宿主细胞组合，其中所述额外编辑构建体池中的每个编辑质粒包括选择标志基因以及向导RNA(gRNA)和修复片段中的一或两者，并且其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；
f.将RNA引导的DNA核酸内切酶以及包括所述一或多个编辑质粒的所述额外编辑构建体池引入到来自步骤(e)的个别微生物宿主细胞中，其中所述额外编辑构建体池包括根据步骤(a)(i)-(iii)中的任一步骤的gRNA和修复片段；以及
g.使来自步骤(f)的所述微生物宿主细胞在对表达所述选择标志基因的微生物宿主细胞具有选择性的培养基中生长并从源自其的培养物中分离微生物宿主细胞，由此在所述微生物宿主细胞的第二或额外编辑群体中产生所述一或多个基因修饰的微生物菌株；
其中在所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括与来自所述第一或先前组合的编辑质粒池的所述选择标志基因不同的选择标志基因。
47.根据权利要求43到46中任一权利要求所述的方法，其中不在至少一个编辑轮次之后、每个编辑轮次之后或任何编辑轮次之后执行反选择。
48.根据权利要求43到46中任一权利要求所述的方法，其中不在至少一个编辑轮次之后、每个编辑轮次之后或任何编辑轮次之后执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。
49.根据权利要求1到4或43到46中任一权利要求所述的方法，其中每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的多个基因编辑的序列。
50.根据权利要求1到4或43到46中任一权利要求所述的方法，其中每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。
51.根据权利要求3到4或45到46中任一权利要求所述的方法，其中在步骤(b)或(f)中引入的所述gRNA包括与所述一或多个靶基因座互补的序列，并且每个修复片段包括所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。
52.根据权利要求45或权利要求46所述的方法，其中在步骤(f)中引入的所述gRNA包括与在前一编辑轮次中靶向的任何一或多个基因座不同的一或多个基因座互补的序列，并且每个修复片段包括所述不同的一或多个基因座中或邻近所述不同的一或多个基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个基因编辑的序列。
53.根据权利要求45或权利要求46所述的方法，其中在步骤(f)中引入的所述gRNA包括与在前一编辑轮次中靶向的相同的一或多个基因座互补的序列，并且每个修复片段包括相比于在前一编辑轮次中引入的基因编辑在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个不同基因编辑的序列。
54.根据权利要求45或权利要求46所述的方法，其中步骤(f)包括将一或多个不同的编辑构建体引入到来自步骤(e)的个别微生物宿主细胞中，其中所述不同的编辑构建体包括与在前一编辑轮次中引入的所述gRNA和/或所述修复片段不同的gRNA和/或修复片段，由此在所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体中产生一或多个不同的基因修饰的微生物菌株。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述一或多个不同的编辑构建体包括不同的gRNA，所述不同的gRNA包括与至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个不同的基因座互补的序列，其中所述不同的一或多个基因座与任何先前靶向的一或多个基因座不同。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述一或多个不同的编辑构建体包括不同的修复片段，所述不同的修复片段包括相比于在前一编辑轮次中引入的基因编辑在所述一或多个靶基因座中或邻近所述一或多个靶基因座的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个或20个不同基因编辑的序列。
57.根据权利要求1到4或43到46中任一权利要求所述的方法，其进一步包括对在步骤(c)中选择的菌落进行基因分型。
58.根据权利要求43到46中任一权利要求所述的方法，其进一步包括对在对所述选择标志基因不具有选择性的培养基中生长的微生物宿主细胞进行基因分型。
59.根据权利要求43到46中任一权利要求所述的方法，其中：1)在每个编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择；或者2)在任何编辑轮次之后不执行基于抗生素、化学品或温度的反选择。
60.根据权利要求43到46中任一权利要求所述的方法，其中与先前与所述微生物宿主细胞组合的每个其它或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒相比，所述第一编辑质粒池和所述额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的复制起点或相同的复制起点类别。
61.根据权利要求43到46中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括具有多个基因组编辑的个别细胞。
62.根据权利要求43到46中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的所述第二或额外编辑群体包括包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个基因组编辑的个别细胞。
63.根据权利要求1到4或43到46中任一权利要求所述的方法，其中所述第一或额外编辑质粒池包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个不同的编辑质粒。
64.根据权利要求1到4或43到46中任一权利要求所述的方法，其中所述第一或额外编辑质粒池中的每个编辑质粒包括相同的选择标志基因。
65.根据权利要求1到4或43到46中任一权利要求所述的方法，其中所述选择标志基因包括抗生素或营养缺陷型选择标志基因。
66.根据权利要求2或权利要求44所述的方法，其中所述一或多个位点特异性限制酶中的每个切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座处的序列。
67.根据权利要求2或权利要求44所述的方法，其中所述一或多个位点特异性限制酶中的每个选自由以下组成的群组：RNA引导的核酸内切酶、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)。
68.根据权利要求2或权利要求44所述的方法，其中所述位点特异性限制酶中的每个在质粒上编码，在所述基因组中编码，从RNA翻译或作为蛋白质引入到所述细胞中。
69.根据权利要求3到4或45到46中任一权利要求所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶切割在所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述一或多个靶基因座处的序列。
70.根据权利要求3到4或45到46中任一权利要求所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cpf1或其同源物、直系同源物或旁系同源物。
71.根据权利要求3到4或45到46中任一权利要求所述的方法，其中所述RNA引导的DNA核酸内切酶在质粒上编码，在所述基因组中编码，从RNA翻译或作为蛋白质引入到所述细胞中。
72.根据权利要求3到4或45到46中任一权利要求所述的方法，其中所述gRNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。
73.根据权利要求3到4或45到46中任一权利要求所述的方法，其中所述gRNA包含单gRNA(sgRNA)。
74.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述基因编辑选自由以下组成的群组：插入、缺失、单核苷酸多态性、基因组改组、大规模缺失、基因组编辑、质粒编辑和多重编辑或其任何组合。
75.根据权利要求43到46中任一权利要求所述的方法，其中在一或多个额外编辑轮次中引入的所述修复片段包括一或多个基因编辑的不同序列并且与来自前一编辑轮次的不同选择标志基因相关联。
76.根据权利要求43到46中任一权利要求所述的方法，其中在一或多个额外编辑轮次中引入的所述gRNA靶向不同的一或多个基因座并且与来自前一编辑轮次的不同抗生素选择标志基因相关联。
77.根据权利要求43所述的方法，其进一步包括步骤(h)，其中步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒，其中所述最终修复片段包括所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终一或多个基因座中或邻近所述最终一或多个基因座的一或多个基因编辑的序列，其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列同源的序列，其中所述最终一或多个基因座包括与先前编辑的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座，并且其中所述最终质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列。
78.根据权利要求44所述的方法，其进一步包括步骤(h)，其中步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终修复片段的最终质粒，其中所述最终修复片段包括所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终一或多个基因座中或邻近所述最终一或多个基因座的一或多个基因编辑的序列，其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列同源的序列，其中所述最终一或多个基因座包括与先前编辑的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座，其中所述最终质粒包括与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列，其中所述微生物宿主细胞包括一或多个位点特异性限制酶，或者对位点特异性限制酶进行编码的一或多个序列与靶向所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的所述最终质粒一起被引入到所述微生物宿主细胞中。
79.根据权利要求45或权利要求46所述的方法，其进一步包括步骤(h)，其中步骤(h)包括在重复步骤(d)-(g)的终末轮次中引入包括最终gRNA和最终修复片段的最终质粒，其中所述最终gRNA包括与所述微生物宿主细胞的所述基因组中的最终一或多个基因座互补的序列，其中所述最终一或多个基因座包括与先前引入到所述微生物宿主细胞中的gRNA所靶向的任何一或多个基因座相同或不同的一或多个基因座，其中所述最终修复片段包括所述最终一或多个基因座中的一或多个基因编辑的序列，其中所述一或多个基因编辑中的每个基因编辑的序列位于同源臂之间，其中所述同源臂包括与侧接来自所述微生物宿主细胞的所述基因组中的所述最终一或多个基因座的基因座的序列同源的序列，并且其中所述最终质粒、所述最终gRNA和/或所述最终修复片段与在前一选择轮次中引入的所述选择标志基因不同的选择标志基因的序列相关联。
80.根据权利要求79所述的方法，其进一步包括引入包括与存在于所述最终修复片段上或与所述最终修复片段相关联的序列互补的向导序列的gRNA，以促进通过RNA引导的DNA核酸内切酶在所述终末轮次之后去除所述最终修复片段。
81.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物宿主细胞包括来自一或多个异源重组系统的一组蛋白质。
82.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物宿主细胞包括来自λred重组系统、RecET重组系统的一组蛋白质、来自λred重组系统或RecET重组系统的蛋白质的任何同源物、直系同源物或旁系同源物或其任何组合。
83.根据权利要求82所述的方法，其中来自所述λred重组系统的所述一组蛋白质包括β蛋白、gam蛋白和exo蛋白。
84.根据权利要求81所述的方法，其中在步骤(a)之前，来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质在包括对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因的质粒上被引入到所述微生物宿主细胞中。
85.根据权利要求81所述的方法，其中由于对来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质进行编码的基因整合到所述微生物宿主细胞的基因组中，因此来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质被所述微生物宿主细胞稳定地表达。
86.根据权利要求81所述的方法，其中来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质是组成型表达的。
87.根据权利要求81所述的方法，其中来自所述异源重组系统的所述一组蛋白质可操作地连接到诱导型启动子上，任选地其中所述异源重组系统基因位于操纵子中。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述诱导型启动子可通过添加试剂、耗竭代谢物或试剂或通过温度变化来诱导。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述试剂选自由以下组成的群组：阿拉伯糖、异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和四环素。
90.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述引入步骤包括转化所述微生物宿主细胞。
91.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物宿主细胞是真核细胞。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述微生物宿主细胞是酵母细胞。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述酵母细胞是酿酒酵母。
94.根据权利要求91所述的方法，其中所述微生物宿主细胞是丝状真菌。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述丝状真菌是黑曲霉。
96.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的方法，其中所述微生物宿主细胞是原核细胞。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli/E.coli)。
98.根据权利要求96所述的方法，其中所述原核宿主细胞是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum/C.glutamicum)。
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