CN114163506A

CN114163506A - 施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在介导同源重组上的应用

Info

Publication number: CN114163506A
Application number: CN202111318814.6A
Authority: CN
Inventors: 冯雁; 黄飞
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-11-09
Filing date: 2021-11-09
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2041-11-09
Also published as: CN114163506B

Abstract

本发明涉及施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI‑RE蛋白在介导同源重组上的应用。本发明研究发现所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI‑RE蛋白影响DNA复制以及DNA损伤修复途径；本发明公开了施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI‑RE蛋白介导的大肠杆菌基因敲除技术的构建和应用。本发明首先构建施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI‑RE蛋白表达质粒和带有待敲除把基因序列左右同源臂序列的重组质粒；随后用两个质粒转化大肠杆菌，诱导双交换重组，通过表型筛选或PCR鉴定获得敲除靶基因的菌株。该操作系统首次构建基于PsPIWI‑RE蛋白与同源序列的基因编辑系统。为大肠杆菌等微生物的基因编辑提供新的优良工具。

Description

施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在介导同源重组上的应用

技术领域

本发明涉及原核生物基因编辑技术领域，尤其是涉及施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在介导同源重组上的应用。

背景技术

基因编辑技术是对细胞的基因组DNA序列进行插入、删除、替换等修改的一种技术。该技术可以实现基因组DNA的可遗传修改，使得目标细胞产生特定基因的敲除或敲入。该技术对基因工程、农业发展、生物医学研究、基因治疗等领域具有重要意义。目前较为成熟的基因编辑技术包括：ZFN技术，TALEN技术，CRISPR技术等，其中CRISPR技术作为新兴基因编辑技术，因其操作简便、成本低、脱靶率低等优势而受到广泛关注。2020年，EmmanuelleCharpentier和Jennifer A.Doudna两位科学家因在CRISPR技术的研究与突出贡献被授予2020年诺贝尔化学奖。

尽管CRISPR/Cas9技术相对成熟，但是仍然存在一些技术缺陷需要完善。CRISPR/Cas9技术的主要不足包括：脱靶效应，也就是存在对非靶标基因的编辑。虽然基于CRISPR/Cas9的改良技术可以降低脱靶率，但仍然无法完全解决脱靶问题；效率问题，CRISPR/Cas9对靶标基因的编辑效率取决于sgRNA和Cas9的浓度，浓度低则效率低，浓度高效率会提高，但是脱靶率会提高，因此，高效率和低脱靶率之间不可兼得；递送问题，Cas9蛋白分子量约160kDa，编码CRISPR-Cas9系统的DNA片段约为8–10kb，如此大分子量的DNA片段或蛋白质递送到目标细胞内是一个难题；免疫排斥，CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白来源于原核生物，进入人体细胞会引起免疫排斥，存在安全性问题；副作用，运用CRISPR/Cas9进行基因治疗，存在一定副作用。

已有的基因编辑系统的不足，使得开发新型基因编辑系统的必要性和重要意义。近年来，有研究报道了基于Argonaute蛋白(Ago)的基因编辑系统。Argonaute蛋白编码基因广泛存在于真核、原核和古菌基因组中。研究表明，原核来源的Argonaute蛋白(pAgo)结合短链ssDNA(指导链，gDNA)特异性结合与gDNA互补配对的单链DNA底物。这种DNA引导的DNA剪切活性被认为具有开发为新型基因编辑工具的潜力。近期对NgAgo基因编辑能力的研究显示，NgAgo通过结合重组酶A(recA)参与微生物同源重组过程，提高同源重组效率和同源重组相关的基因编辑。NgAgo可以提高Pasteurella multocida和Escherichia coli中基因的插入或缺失效率到80-100％。NgAgo提高同源重组效率需要同源臂的存在，而gDNA的存在对同源重组效率的提高影响不大。分析认为，NgAgo通过结合recA，提高了recA介导的DNA链交换。以上结果表明，Ago蛋白参与了体内同源重组过程，设计Ago蛋白结合同源臂序列可以在微生物细胞内实现基因编辑或插入。这些结果为开发基于Ago蛋白的基因编辑工具提供了有力的理论依据。

Ago蛋白属于PIWI蛋白家族，对Ago蛋白同源序列进行同源性分析发现了几类PIWI家族远缘蛋白家族，其中一种远缘家族称为PIWI-RE家族。PIWI-RE家族的主要特点是，N端不具有典型的N端结构域和PAZ结构域。C端包含两个十分保守氨基酸残基：精氨酸(R)、谷氨酸(E)。作为不具有完整Ago结构域的PIWI家族蛋白，PIWI-RE蛋白的功能尚未见报道。

发明内容

基于现有技术的现状，本发明提供一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

进一步地，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白具体来源于施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)DSM4166菌株。

本发明还提供一种编码所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白的多核苷酸。

在本发明的一个实施方式中，编码所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白的多核苷酸的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白的应用，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在制备参与DNA复制以及DNA损伤修复途径的药物上的应用。

本发明还提供施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白的应用，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在制备参与DNA同源重组途径的药物上的应用。

本发明还提供施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白的应用，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在构建基于PIWI-RE蛋白的同源重组基因编辑系统上的应用。

本发明还提供一种包含编码所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白的多核苷酸的表达载体。

本发明还提供一种包含所述表达载体的病毒载体。

本发明还提供一种施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)的PsPIWI-RE蛋白缺失突变株的构建方法，包括以下步骤：

首先，克隆施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri DSM4166)的PIWI-RE蛋白(PsPIWI-RE,Accession number:WP_014597637.1)编码基因上游1000bp和下游1000bpDNA片段；

提取施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri DSM4166)基因组DNA为扩增模板，分别扩增上、下游同源臂各1000bp；上、下游同源臂序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示；

通过巢式PCR将上下游DNA片段连接成一条DNA片段，通过酶切-连接法克隆到pK18mobSacB同源双交换载体，构建pK18-PsPIWI-RE-HA载体，构建好的质粒转化大肠杆菌DH5α，挑取克隆，测序验证，对于测序正确的克隆，摇菌，抽取质粒，制备好的质粒转化施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri DSM4166)感受态细胞，培养，获得成功敲除PsPIWI-RE蛋白的菌株进行保存，标记为P.stutzeri△piwi-re。

在本发明的一个实施方式中，上游同源臂扩增引物：

dPSago-F1 ACGGTTGTTCATAGGGTTCTCTG

dpsAgo-R1 TCATCTCGCGTCCTTTCTTGATTC；

下游同源臂扩增引物：

dPsAgo-F2 GGAATGAATCACCCCGGGTTTC

dPsAgo-R2 TAGCGGATCGAGACGTACTGG。

本发明还提供基于上述方法得到的施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)的PsPIWI-RE蛋白缺失突变株。

本发明还提供一种可以实现同源重组敲除的基因编辑系统，包括所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白，以及目标基因同源臂。

在本发明的一个实施方式中，可以实现同源重组敲除的基因编辑系统为一种质粒，所述质粒携带目标基因同源臂，并表达所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白。

在本发明的一个实施方式中，所述目标基因为大肠杆菌(E.Coli)LacZ基因，大肠杆菌(E.Coli)LacZ基因上游同源臂序列如SEQ ID No.5所示，大肠杆菌(E.Coli)LacZ基因下游同源臂序列如SEQ ID No.6所示。

本申请公开构建了基于PsPIWI-RE蛋白为工具的基因编辑系统的方法与应用。

与现有技术相比，本发明公开了施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白介导的大肠杆菌基因敲除技术的构建和应用。

本发明首先构建施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白表达质粒和带有待敲除把基因序列左右同源臂序列的重组质粒；随后用两个质粒转化大肠杆菌，诱导双交换重组，通过表型筛选或PCR鉴定获得敲除靶基因的菌株。该操作系统首次构建基于PsPIWI-RE蛋白与同源序列的基因编辑系统。为大肠杆菌等微生物的基因编辑提供新的优良工具。

附图说明

图1为本发明实施例1中使用的质粒载体图谱。图1包括图1-1、1-2、1-3。

图2为PCR检测P.stutzeri及PIWI-RE缺失突变体基因组结果。其中使用引物为上述det-dPRE-F3和det-dPRE-R3。如右侧所示，该对引物扩增PIWI-RE基因两端DNA片段。在野生型P.stutzeri基因组中可扩增2.8Kb DNA片段，在P.stutzeri△piwi-re基因组中可扩增500bp DNA片段，说明敲除菌株为正确缺失PIWI-RE基因的菌株。

图3为P.stutzeri和P.stutzeri△piwi-re菌株生长曲线比对。

图4为P.stutzeri和P.stutzeri△piwi-re菌株对环丙沙星和丝裂霉素C耐受性分析结果。

图5为在大肠杆菌细胞内构建PsPIWI-RE介导的同源重组体系示意图。

图6为PIWI-RE引导的同源重组系统在大肠杆菌中的基因敲除效率统计结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

PsPIWI-RE突变体的构建

为说明PsPIWI-RE蛋白在体内作用机制，构建施氏假单胞杆菌(Pseudomonasstutzeri DSM4166)的PIWI-RE蛋白缺失突变株。

首先，克隆施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri DSM4166)的PIWI-RE蛋白(PsPIWI-RE,Accession number:WP_014597637.1)编码基因上游1000bp和下游1000bpDNA片段。

其中，PIWI-RE蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，上游同源臂扩增引物：

dPSago-F1 ACGGTTGTTCATAGGGTTCTCTG

dpsAgo-R1 TCATCTCGCGTCCTTTCTTGATTC；

下游同源臂扩增引物：

dPsAgo-F2 GGAATGAATCACCCCGGGTTTC

dPsAgo-R2 TAGCGGATCGAGACGTACTGG

提取施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri DSM4166)基因组DNA为扩增模板。以上述引物分别扩增上、下游同源臂各1000bp。

上、下游同源臂序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。

进行扩增的PCR体系如下：

PCR程序如下：

通过巢式PCR将上下游DNA片段连接成一条DNA片段，通过酶切-连接法克隆到pK18mobSacB同源双交换载体，构建pK18-PsPIWI-RE-HA载体，构建好的质粒转化大肠杆菌DH5α，挑取克隆，测序验证。

使用的质粒载体图谱参考图1。

对于测序正确的克隆，摇菌，抽取质粒。制备好的质粒转化施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri DSM4166)感受态细胞，涂布Kan抗性平板。挑取克隆，接种到含蔗糖的LB液体培养基，培养过夜后，稀释涂布到含蔗糖的LB固体培养基平皿上。以菌落PCR的方法检测双交换菌株。

用于检测突变株的引物：

det-dPRE-F3 TGAACATCCTGGTGAGCCTCAC

det-dPRE-R3 CGCTCTTCACTGGTCTGACCG

用上述引物进行菌落PCR，如果是成功敲除的菌株，扩增产物为500bp。如果是野生型菌株，扩增产物为2.8Kb。通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断哪些克隆是敲除菌株。对成功敲除的菌株进行保存，标记为P.stutzeri△piwi-re。

图2为PCR检测施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri DSM4166)及PIWI-RE缺失突变体基因组结果。其中使用引物为上述det-dPRE-F3和det-dPRE-R3。如右侧所示，该对引物扩增PIWI-RE基因两端DNA片段。在施氏假单胞杆菌piwi-re基因上下游设计的一对引物可以在以野生型施氏假单胞杆菌基因组DNA为模板的PCR体系中获得2.8Kb的DNA片段，而在以piwi-re缺失突变菌株基因组DNA为模板的PCR体系中获得500bp的DNA片段。说明敲除菌株为正确缺失PIWI-RE基因的菌株。该结果表明施氏假单胞杆菌PIWI-RE蛋白缺失突变株构建成功。

实施例2

PIWI-RE缺失突变对P.stutzeri菌株生长状态的影响，测定生长曲线

施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri DSM4166)记为P.stutzeri菌株。

实施例1中所得成功敲除的菌株记为P.stutzeri△piei-re。

为说明PIWI-RE缺失突变对P.stutzeri生长状态的影响，测定P.stutzeri和P.stutzeri△piei-re菌株的生长曲线。对P.stutzeri和P.stutzeri△piwi-re菌株进行划线活化，挑取菌斑接种到5mL LB培养基，30℃过夜培养，按照1/100转接到100mL LB培养基。30℃，220RPM摇床培养，每隔1h测定一次OD₆₀₀，绘制生长曲线，分析P.stutzeri和P.stutzeri△piwi-re的生长状态是否存在显著差异。

图3为P.stutzeri和P.stutzeri△piwi-re菌株生长曲线比对，生长曲线测定结果，野生型菌株和piwi-re缺失突变菌株在0-16h的生长状态没有明显差别，表明PsPIWI-RE蛋白不会影响施氏假单胞杆菌的生长状态。

实施例3

PIWI-RE参与DNA损伤修复和同源重组试验

已经报道，TtAgo参与DNA复制，帮助复制后的环装DNA分离。NgAgo参与DNA同源重组，提高同源重组效率。探究PIWI-RE参与DNA复制或DNA同源重组途径，揭示PIWI-RE蛋白体内作用机制，为构建基于PIWI-RE蛋白的基因编辑系统提供理论基础。

为确定PIWI-RE蛋白是否参与DNA复制或DNA同源重组途径，本检测P.stutzeri和P.stutzeri△piei-re菌株对DNA复制抑制剂(环丙沙星)和DNA损伤诱导剂(丝裂霉素C，MMC)的耐受性差异。对P.stutzeri和P.stutzeri△piwi-re菌株划线活化，接种到5mL LB培养基，30℃过夜培养，测定OD₆₀₀，将OD₆₀₀一致的两种菌液分成三组，其中一组加入终浓度为50μM的环丙沙星，一组加入终浓度为50μM的丝裂霉素C(MMC)，第三组作为对照组。室温混匀30min，以5×稀释法，制备菌液系列梯度稀释菌液。每组稀释5个梯度，分别取少许菌液，按网格顺序点到LB平板上，使得每种菌液形成均匀大小的菌斑。30℃过夜培养，观察菌斑生长情况。

P.stutzeri和P.stutzeri△piwi-re菌株对环丙沙星和丝裂霉素C耐受性分析结果如图4所示，MMC和环丙沙星耐受性试验表明，PIWI-RE蛋白的缺失突变导致施氏假单胞杆菌对环丙沙星和MMC的耐受性明显减弱。该结果表明，PIWI-RE蛋白在施氏假单胞杆菌细胞内参与DNA复制以及DNA损伤修复途径。

实施例4

PIWI-RE介导的同源重组系统构建

为构建基于PIWI-RE蛋白的同源重组基因编辑系统，选择大肠杆菌(E.Coli)β-半乳糖苷酶基因(lacZ)为编辑对象，以蓝白斑筛选作为筛选手段。同源重组系统由两个质粒构成，一个质粒表达PsPIWI-RE蛋白(pET28a-PIWI-RE)，是将PsPIWI-RE蛋白编码基因经过密码子优化后克隆到表达载体pET28a载体上，用以在大肠杆菌中表达PsPIWI-RE蛋白；另一个质粒提供同源重组所需目标基因序列上下游同源臂(pUC19-LaczHA)，是将大肠杆菌LacZ基因内待敲除300bp片段上下游各500bp序列通过通过化学合成为一条1Kb的DNA片段，再将该1Kb DNA片段克隆到pUC19载体上。

其中，大肠杆菌(E.Coli)LacZ基因上游同源臂序列如SEQ ID No.5所示。大肠杆菌(E.Coli)LacZ基因下游同源臂序列如SEQ ID No.6所示。

将上述pET28a-PIWI-RE载体和pUC19-LaczHA载体同时转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。通过含有卡那霉素和氨苄霉素抗性平板筛选携带双质粒的菌株，挑取克隆，测序验证，保存测序正确的菌株。将该菌株接种到含有Kan和IPTG的培养基中，37℃摇床培养。取菌液，稀释涂布于含有X-Gal和IPTG的LB固体平皿，37℃过夜培养。观察并统计平皿的蓝色和白色菌斑数。以白色菌斑数/全部菌斑数为敲除效率。

在大肠杆菌细胞内构建PsPIWI-RE介导的同源重组体系示意图如图5所示，PIWI-RE引导的同源重组系统在大肠杆菌中的基因敲除效率统计结果如图6所示。

可以看出，在大肠杆菌细胞内构建PsPIWI-RE介导的同源重组体系，选取大肠杆菌LacZ基因为目标基因位点。分别选取上下游500bp DNA片段为同源臂，同源重组的结果是LacZ基因内部确实300bp DNA片段，LacZ基因失活，导致大肠杆菌在蓝白斑筛选平板上显示白色。结果显示，只有同时包含携带LacZ基因同源臂的质粒与PsPIWI-RE表达质粒同的实验组，才会出现白斑，而只携带LacZ基因同源臂的质粒的对照组，未检测到白斑的存在。表明PsPIWI-RE参与并提高了大肠杆菌的同源重组效率。PIWI-RE与同源臂共同组成了一个可以实现同源重组敲除的基因编辑系统。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在介导同源重组上的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 783

<212> PRT

<213> 施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)

<400> 1

Met Lys Ala Leu Glu Leu Arg Thr Ser Leu Phe Lys Phe Asp Ala Thr

1 5 10 15

Gln Leu Gly Gln Ala Tyr Arg Val Val Ile Gly Pro Gln Tyr Leu Asp

20 25 30

Ala Trp Gln Ala Leu Gln Gly Leu Val Lys Lys Pro His Pro Gly Leu

35 40 45

Pro Thr Thr Gly Leu Glu Glu Met Leu Ala Val Leu Ser Arg Gly Pro

50 55 60

Val Lys Val Asp Leu Phe Pro Gln Lys Lys Gly Gly Val Ser Ala Ile

65 70 75 80

Leu Met Leu Tyr Pro Leu Ser Val Asp Thr Ile Asn Glu Val Leu His

85 90 95

Leu Trp Ser Met Asp Val Leu Arg Ile Trp Asn Glu Gln Leu Val Gly

100 105 110

Ile Glu Gly Lys Leu Ile Val Thr Asp Val Val Pro Leu Asp Thr Ser

115 120 125

Arg Leu Val Thr Pro Gly Asp Ile Ser Ser Leu Ala Tyr Thr Val Ile

130 135 140

Pro Trp Leu Val Gly Gln Ala Leu Ile Gln Thr Pro Met Gln Ala Ala

145 150 155 160

Arg Pro Ile Lys Leu Tyr Gln Ala Ala Asp Ser Ser Leu Leu Ala Trp

165 170 175

Asp Asp Pro Ile Val Ser Glu Asn Asp Val Arg Tyr Ala Ser Ala Leu

180 185 190

His Ala Ile Glu Pro Thr Leu Val Leu Leu His Gly Arg Pro Gln Pro

195 200 205

Tyr Ile Gln Leu Arg Val Lys Leu Thr Gln Val Met Pro Asn Leu Val

210 215 220

Gly Lys Lys Lys His Ala Trp Val Lys Thr Gly Asp Leu Ile Val Lys

225 230 235 240

Ala Lys Leu Lys Thr Lys Lys Thr Asp Glu Gly Trp Glu Thr Thr Tyr

245 250 255

Glu His Pro Val Glu Lys Leu Leu Thr Phe Met Gly Val Gln Ser Phe

260 265 270

Pro Pro Met Val Asp Gly Asp Ile Pro Val Asp Ser Asp Val Arg Pro

275 280 285

Ile Tyr Ala Ile Pro Pro Ser Asn Pro Met Ile Ala Ser Gly Pro Gly

290 295 300

Pro Leu Phe Leu Asp Gln Ala Gly Phe His Leu Leu Ala Ser Leu Pro

305 310 315 320

Gly Thr Ala Pro Leu Leu Val Lys Lys Ala Val Ala Ser Leu Arg Glu

325 330 335

Glu Lys Val Val Asn Thr Gly Glu Ala Ala Asn Leu Asn Ala Met Val

340 345 350

Leu Ala Ala His Ala Asp Val Met Leu Arg Leu His Ala Ala Ser Thr

355 360 365

Thr Leu Ala Gln Asp Ser Lys Phe Phe Asp Lys Val Met Pro Pro Leu

370 375 380

Val Ala Leu Thr Arg Leu Asp Val Pro Asp Ala Gln Arg Met Leu Glu

385 390 395 400

Gly Lys His Asp Ser Asn Ser Leu Asn Asp Trp Leu Met Asn His Val

405 410 415

Val Pro Ala Ser Lys Gln Ala Ser Glu Asn Gly Ala Lys Val Met Ile

420 425 430

Val Glu Thr Ser Thr Ser Ala Ala Ser Gln Glu Ala Gly Leu Asp Pro

435 440 445

Lys His Val Ile Arg Arg Val Leu Ala Lys His Gly Ile Ala Thr Gln

450 455 460

Phe Ile Met His Ile Asp Pro Asp Ala Gln Ala Lys Arg Arg Lys Thr

465 470 475 480

Lys Ala Asp Asp Arg Asp Phe Lys Ala Thr Asn Ser Ile Ile Glu Ala

485 490 495

Ile Arg Leu Ser Gly His Leu Pro Val Pro Thr Pro Lys Val Lys Ser

500 505 510

Met Pro Ala Ser Thr Thr Val Leu Ser Ile Leu Leu Asp Arg Ile Gln

515 520 525

Asp Lys Gly Pro Ala Ile Tyr Leu Pro Val Ile Thr Arg Thr Val Leu

530 535 540

Gly Gly Asn Lys Pro Glu Val Phe Trp Phe Glu Ser Cys Leu Asp Ser

545 550 555 560

Asn Gly Lys Trp Phe Ser Tyr Gly Glu Gly Leu Ala Ala Ile His Gly

565 570 575

Thr Asp Thr Leu Leu Lys Pro Asp Gln Leu Lys Thr Leu Val Thr Gln

580 585 590

Ser Leu Leu Asp Cys Lys Ile Asn Ser Asn Asp Ser Leu Ile Val Cys

595 600 605

Leu Asp Ala Asn Leu Arg Thr Phe Tyr Gly Ala Leu Lys Asp Gly Pro

610 615 620

Gly Glu Gly Leu Pro Pro Val Pro Ser Asp Ala Ala Val Val Arg Ile

625 630 635 640

Arg Ala Asp His Gln Val Ala Gln Ile Ser Gly Asn His Thr Leu Ser

645 650 655

Pro Asn Ser Ala His Tyr Ile Gly Thr Lys Val Gly Ala Phe Gln Ser

660 665 670

Cys Glu Ser Ala Ser Val Phe Tyr Phe Val Ser Pro Ser Lys Gln Tyr

675 680 685

Gly Ser Val Arg Ser Gln Arg Glu Asn Thr Arg Tyr Asp Val Ser Glu

690 695 700

Arg Asp Leu Arg Asp Pro Trp Gln Gln Leu Gly Val Thr Glu Ile Thr

705 710 715 720

Ile Ile Thr Pro Gly Ala Phe Ser Thr Ala Thr Val Ile Ala Glu Gln

725 730 735

Val Ala Leu Leu Cys Arg Asn Pro Ser Leu Trp Asp Gly Tyr Leu Arg

740 745 750

Leu Pro Gly Pro Met His Leu Gly Lys Gln Val Ala Ala Asp His Pro

755 760 765

Ile Leu Glu Met Arg Arg Lys Ser Glu Ala Asn Arg Tyr Gly Asn

770 775 780

<210> 2

<211> 2352

<212> DNA

<213> 施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)

<400> 2

atgaaggccc ttgagctacg caccagccta ttcaaatttg atgcgaccca attggggcaa 60

gcctaccgtg tggtaatcgg cccccagtat ctcgacgcgt ggcaagcgct tcaggggctg 120

gttaaaaagc cacatccggg cctgcctacg acaggattgg aggagatgct tgccgttctt 180

tcccggggcc ccgtaaaggt ggacctattc ccccaaaaaa agggcggtgt ctcggcaatt 240

ctcatgctct atccgctgtc ggtcgacact atcaacgagg tgctccacct atggtcgatg 300

gacgtcctta ggatttggaa cgagcaactg gtcggcattg aaggaaagtt gatcgtcacc 360

gacgtggtgc cgctggatac aagtcgtcta gtcacgcctg gagacatttc atcgctcgcg 420

tatacggtca ttccttggct ggtgggacaa gccctcatac aaacgcccat gcaggcagcg 480

aggcccatca agctgtacca ggcagctgat tccagcttgc ttgcatggga tgaccctatc 540

gtttccgaaa atgatgtccg atatgccagt gcactgcatg ctatcgaacc gactcttgtc 600

ttgctgcacg gtcggccgca gccctacatc cagctacgtg tgaaactgac ccaggtgatg 660

cccaaccttg taggcaagaa aaaacatgcc tgggtcaaaa ccggcgacct gatcgtcaaa 720

gcgaagctca aaaccaagaa gacggacgaa ggctgggaaa ctacgtacga gcaccctgtc 780

gagaagctgc tgaccttcat gggcgtacag tcgtttcctc caatggtcga cggcgacatc 840

cccgtcgaca gcgacgtgag acccatctac gccatcccac cgtcaaatcc aatgattgcg 900

tcaggccctg gcccgctgtt cctcgaccaa gccggctttc acctccttgc aagtctgcct 960

ggaacggctc cgcttctggt caagaaggcg gtggctagct tacgagagga gaaggttgtc 1020

aacacgggag aggccgccaa tctgaacgcg atggtactcg cagcacacgc tgacgtgatg 1080

ctgcggctac atgcagccag taccaccctg gcccaggaca gcaagttctt cgataaggtg 1140

atgcctcctc tcgtggcact gacacgcctg gatgtaccgg acgcgcagcg aatgcttgaa 1200

ggaaaacatg acagcaacag cctaaacgac tggctaatga accatgtggt gcccgctagc 1260

aagcaggctt ctgaaaatgg cgcaaaggta atgatcgttg agaccagtac gtccgctgcc 1320

tctcaggaag cagggctaga ccccaagcac gtcattcgaa gggtactggc aaagcacggc 1380

atcgcgaccc agttcatcat gcatatcgac cctgatgcac aagctaagag gcggaagacc 1440

aaagcggatg atcgtgattt caaagctacc aactcgatca tcgaagcgat tcgactaagc 1500

gggcacctcc ccgttccgac gcccaaagta aaatcgatgc cggcgagcac aacggtgctg 1560

tcgattttgc tggatagaat tcaggataaa ggcccggcca tctatctgcc ggttatcacc 1620

cggacggtgt tgggcgggaa taaaccagag gttttctggt tcgaatcttg cttggactcc 1680

aatggcaaat ggttcagcta cggcgagggc ttggccgcca tccacgggac ggacactctg 1740

ctcaagcctg accaattgaa gacattggtc acccaatcct tgctggactg caagatcaat 1800

tcgaacgact cgttgatcgt ctgcctcgat gccaatctaa gaaccttcta tggagcattg 1860

aaagatggcc ccggggaggg tcttcctccc gtcccatcag atgccgctgt cgtccgcatt 1920

cgagccgatc accaggtagc acagatcagc ggcaaccaca ccttgtctcc caactcggct 1980

cactacatcg ggacgaaggt gggagctttt caatcttgcg agagcgcctc ggtattttat 2040

ttcgtgtcac cgtctaagca gtacggcagc gttcgctcac agcgcgagaa cacaagatac 2100

gacgtatcag aacgagacct gcgagatcca tggcagcagt tgggcgtaac agaaatcacg 2160

atcataacgc ccggggcatt tagcactgcg acagtgatcg ctgaacaggt cgccttgctg 2220

tgcaggaacc cttcactgtg ggacggctac ctgcgtctgc ctgggcccat gcacttgggc 2280

aaacaagtag cggcagacca tccaattttg gaaatgcgac gcaagtctga agcgaaccgg 2340

tatggaaatt ag 2352

<210> 3

<211> 1099

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caatgactcg accctgaacg tcgtcgccat gcgcggtgat ccgcacagca ctctactttc 60

acttccggat gtcagtgctc tgggctatgc cggtgtgaaa cggttgttca tagggttctc 120

tgccactgca tattttcccg gagccagtgc ttacgacctt cgagccaaag acttcatcga 180

cgttccggat gcagctggcc agatcacctt cgagaacgtc aaccaaacga ccgccatctc 240

tggtgccacc tttgcggagc gcaagttcct ggtatcgaaa tttgccaaag aaatatggcc 300

ctgggcgaaa gcccgtctcc agagcctggc aaacgaccca aagacccaag agcgcgctcg 360

cctgctcttg gtcaccaaca gcgatacgga tgctgaagtg ctggccatga ccctcgcgaa 420

aatgcagggc ggccctggcc aattggtagg ctgggtgcga ggacgacaga gcgagtacaa 480

gccatcctca ctcgaagcac agcaaacact tgtctacgac gacctggcgg aattcaccag 540

cggccggcat aaggacaaga cgttgctggt cagtgcgctt ggccctatgg cgcgcggcca 600

taacatcgta aacgccgatg gtctttcggc gattggcgcc gtagtgatct gcgtccgtcc 660

actgccctct tcggacagcc caaacaacaa ccttgcccat atctgctacg agacggggaa 720

agcggttgcc ttctacagca gccctggctt gctgatgatg caggagcgaa agcattccaa 780

tgctctccta caaagtattc gtaccgcacg cccggcgttt agccagcaac cggataacat 840

ccgtcattac accatcatga acatcctggt gagcctcact caactcatcg gacgggggcg 900

tcgaggaggt actccggtaa cttgttactt cgctgatgcc gcgtttctga atggcctcaa 960

gccttggcac gagatgctca acgagagcgt ccatcaactc aagaaggatg gagattggga 1020

tcagttcgaa cgtcaccatg ccggcgtcgc atcagcactt ctgaaataca tcaatgaatc 1080

aagaaaggac gcgagatga 1099

<210> 4

<211> 1033

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaatgaatc accccgggtt tcgtggaggc ctcaactctt gagaagatga ggccatgaga 60

aagactacta cctactcccc tgaagtccgt gagcgtgctg tgcgcatggt tctggaacac 120

ctgaacgact atccgtccga gtgggcagcc attgaggcca tcgctccgaa gattggctgt 180

gccgcgcaaa ccctgcatgg ctggattcgt cgccagcaga ccgatgcggg gcagcgcccc 240

ggtcagacca gtgaagagcg cgagcgcatc agagccctag agcgcgaaaa ccgcgaactg 300

cgtaaggcaa acgagatatt gcgcctggcc agtgcgtatt ttgcccaggc ggagctcgac 360

cgccgcacca agtcctgagg gcgtttgtcg atcagcatcg tgaccgtctc ggggtcgagt 420

cgatctgccg cgtgttgcag atcgccccgt ccggttaccg caggcacgtg gctcaacagc 480

gcaacccggc actgcgctgt tgtcgtgctc agcgcgatga cgcattgacc ctggaaatcc 540

agcgagtgtg ggatgccaat atgcagtgct atggcgcggt gaaggtctgg aagcagctgc 600

ggcgagaagg catcgaggtc gccagatgca cggtggagcg gttaatgcgt cgggccggat 660

tgcagggcat tagacgtggc cagatcgtgc agacaacggt ggccggcgac aaggcccttt 720

gcccgctgga tcgtgtccaa cgccagttcc atgccgaccg cccgaaccag ttgtgggtgt 780

cggacttcac ctatgtatcg acctggcagg gctggctgta cgtggcgttc gtgatcgacg 840

tctttgcacg gcggatcgtc ggctggcgag tcagtaccag catgaagaca gacttcgtac 900

tggatgccct ggagcaggcc ctgtacgccc gccagccaca ccgtaccggt ggtctgatcc 960

atcacagcga ccgtggaagc cagtacgtct cgatccgcta taccgaacgg ctggcagagg 1020

ccggcattga gcc 1033

<210> 5

<211> 500

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(E. Coli)

<400> 5

gtaacagttt ctttatggca gggtgaaacg caggtcgcca gcggcaccgc gcctttcggc 60

ggtgaaatta tcgatgagcg tggtggttat gccgatcgcg tcacactacg tctgaacgtc 120

gaaaacccga aactgtggag cgccgaaatc ccgaatctct atcgtgcggt ggttgaactg 180

cacaccgccg acggcacgct gattgaagca gaagcctgcg atgtcggttt ccgcgaggtg 240

cggattgaaa atggtctgct gctgctgaac ggcaagccgt tgctgattcg aggcgttaac 300

cgtcacgagc atcatcctct gcatggtcag gtcatggatg agcagacgat ggtgcaggat 360

atcctgctga tgaagcagaa caactttaac gccgtgcgct gttcgcatta tccgaaccat 420

ccgctgtggt acacgctgtg cgaccgctac ggcctgtatg tggtggatga agccaatatt 480

gaaacccacg gcatggtgcc 500

<210> 6

<211> 500

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(E. Coli)

<400> 6

tggctttcgc tacctggaga gacgcgcccg ctgatccttt gcgaatacgc ccacgcgatg 60

ggtaacagtc ttggcggttt cgctaaatac tggcaggcgt ttcgtcagta tccccgttta 120

cagggcggct tcgtctggga ctgggtggat cagtcgctga ttaaatatga tgaaaacggc 180

aacccgtggt cggcttacgg cggtgatttt ggcgatacgc cgaacgatcg ccagttctgt 240

atgaacggtc tggtctttgc cgaccgcacg ccgcatccag cgctgacgga agcaaaacac 300

cagcagcagt ttttccagtt ccgtttatcc gggcaaacca tcgaagtgac cagcgaatac 360

ctgttccgtc atagcgataa cgagctcctg cactggatgg tggcgctgga tggtaagccg 420

ctggcaagcg gtgaagtgcc tctggatgtc gctccacaag gtaaacagtt gattgaactg 480

cctgaactac cgcagccgga 500

Claims

1.一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白的应用，其特征在于，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在制备参与DNA复制以及DNA损伤修复途径的药物上的应用；

施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白的应用，其特征在于，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在制备参与DNA同源重组途径的药物上的应用；

3.一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白的应用，其特征在于，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在构建基于PIWI-RE蛋白的同源重组基因编辑系统上的应用；

4.根据权利要求1或2或3所述的一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白的应用，其特征在于，所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白具体来源于施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)DSM4166菌株。

5.一种施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)的PsPIWI-RE蛋白缺失突变株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

首先，克隆施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)的PIWI-RE蛋白编码基因上游1000bp和下游1000bpDNA片段，施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；

提取施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)基因组DNA为扩增模板，分别扩增上、下游同源臂各1000bp；

通过巢式PCR将上下游DNA片段连接成一条DNA片段，通过酶切-连接法克隆到pK18mobSacB同源双交换载体，构建pK18-PsPIWI-RE-HA载体，构建好的质粒转化大肠杆菌DH5α，挑取克隆，测序验证，对于测序正确的克隆，摇菌，抽取质粒，制备好的质粒转化施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri DSM4166)感受态细胞，培养，获得成功敲除PsPIWI-RE蛋白的菌株进行保存，标记为P.stutzeriΔpiei-re。

6.根据权利要求5所述的一种施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)的PsPIWI-RE蛋白缺失突变株的构建方法，其特征在于，上游同源臂序列如SEQ ID No.3所示，下游同源臂序列如SEQ ID No.4所示。

7.根据权利要求5所述的一种施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)的PsPIWI-RE蛋白缺失突变株的构建方法，其特征在于，上游同源臂扩增引物：

dPSago-F1 ACGGTTGTTCATAGGGTTCTCTG

dpsAgo-R1 TCATCTCGCGTCCTTTCTTGATTC；

下游同源臂扩增引物：

dPsAgo-F2 GGAATGAATCACCCCGGGTTTC

dPsAgo-R2 TAGCGGATCGAGACGTACTGG。

8.基于权利要求5所述方法得到的施氏假单胞杆菌(Pseudomonas stutzeri)的PsPIWI-RE蛋白缺失突变株。

9.一种可以实现同源重组敲除的基因编辑系统，其特征在于，包括施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白，以及目标基因同源臂；施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

10.根据权利要求9所述一种可以实现同源重组敲除的基因编辑系统，其特征在于，所述目标基因为大肠杆菌(E.Coli)LacZ基因，大肠杆菌(E.Coli)LacZ基因上游同源臂序列如SEQ ID No.5所示，大肠杆菌(E.Coli)LacZ基因下游同源臂序列如SEQ ID No.6所示。