JP7423520B2 - Cas9ベースノックイン方針の効力を改善するための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ASCIIコピーは2018年11月16日に作成され、0098-0002WO1_SL.txtと命名され、1,105,014バイトのサイズである。
(a)標的配列(TSV)を含むベクター(TSVは、領域2及び領域1並びにSoIを含む);
(b)TSC中の粘着末端を生成し得る第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体(第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第1の単量体は、TSCの領域1において開裂させ、第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第2の単量体は、領域2において開裂させる);及び
(c)TSV中の粘着末端を生成し得る第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体(第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第1の単量体は、TSVの領域2において開裂させ、第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第2の単量体は、領域1において開裂させる)
を導入することを含み;
(a)のベクター、(b)の第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体及び(c)の第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の導入は、細胞の染色体中へのSoIの挿入をもたらす方法を対象とする。
(a)標的配列(TSV)(TSVは、領域2及び領域1並びにSoIを含む)を含むベクター(ベクターは、粘着末端を含む);
(b)TSC中の粘着末端を生成し得る第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体(第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第1の単量体は、TSCの領域1において開裂させ、第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第2の単量体は、領域2において開裂させる)
導入することを含み;
(a)のベクター及び(b)の第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の導入は、細胞の染色体中へのSoIの挿入をもたらす方法を対象とする。
(a)細胞中に、挿入カセット(IC)を含むベクター(ICは、5’-3’方向で、
(i)標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第1の領域、
(ii)1つ以上のヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の突然変異を含む第2の領域、
(iii)第1のヌクレアーゼ結合部位、
(iv)マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、
(v)第2のヌクレアーゼ結合部位、
(vi)1つ以上のヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の突然変異を含む第3の領域、及び
(vii)標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第4の領域を含み、第1の領域及び第4の領域は、標的ポリヌクレオチド配列と95%~l00%同一である)を導入すること;
(b)相同組換えを介して標的ポリヌクレオチド配列中にICを挿入して第1の改変標的ポリヌクレオチドを生成すること;
(c)マーカー遺伝子を発現する細胞を選択すること;
(d)第1の改変標的ポリヌクレオチドを部位特異的ヌクレアーゼに供して粘着末端を有する第2の改変標的ポリヌクレオチドを生成すること;及び
(e)粘着末端を有する第2の改変標的ポリヌクレオチドをリガーゼ(リガーゼは、第2の領域及び第3の領域において粘着末端をライゲートする)に供して標的ポリヌクレオチド配列と比較して1つ以上の改変ヌクレオチドを含むライゲートされた改変標的核酸を作出すること
を含む方法を対象とする。
本明細書において使用される「a」又は「an」は、1つ以上を意味し得る。本明細書及び特許請求の範囲において本明細書において使用され、語「含む(comprising)」と同時に使用される場合、語「a」又は「an」は、1つ又は2つ以上を意味し得る。本明細書において使用される「別の」又は「さらなる」は、少なくとも第2のもの以上を意味し得る。
正荷電側鎖:Arg、His、Lys;
負荷電側鎖:Asp、Glu;
極性非荷電側鎖:Ser、Thr、Asn、Gln;
疎水性側鎖:Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp;
その他:Cys、Gly、Pro。
一部の実施形態において、本開示は、(a)粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(「付着末端Cas9」又は「stiCas9」);及び(b)stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列(ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない)を含むガイドポリヌクレオチドを含み;複合体は天然に存在しない非天然発生CRISPR-Cas系を提供する。
一部の実施形態において、本開示は、真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって、(1)細胞中に、(a)粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(stiCas9)、及び(b)stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列(ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない)を含むガイドポリヌクレオチド(複合体は天然に生じない)を導入すること;(2)Cas9エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドにより標的配列中の粘着末端を生成すること;並びに(3)(a)粘着末端を一緒に、又は(b)目的ポリヌクレオチド配列(SoI)を粘着末端にライゲートすることを含み、それにより標的配列を改変する方法を提示する。
一部の実施形態において、本開示は、米国特許第9,567,608号明細書に記載のObLiGaRe法の派生法に基づき細胞中の染色体中に目的配列(SoI)を導入する方法を提供する。ObLiGaRe(偏性ライゲーションゲート型組換え)は、Latin verb obligare(直接ライゲートすること)の語源的意味を反映する。これは、様々な細胞系において広く適用可能であり、遺伝子操作のための追加のアプローチを提供する。米国特許第9,567,608号明細書はジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて標的配列を標的化し、開裂させる一方、本明細書の開示は、第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体、例えば、Cas9-FokI、及び第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の使用を提供する。本明細書に記載の部位特異的遺伝子挿入の方法は、米国特許第9,567,608号明細書に記載のObLiGaRe法とそれを区別するために略語として「ObLiGaRe 2.0」と情報的に称される。
一部の実施形態において、本開示は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列中の1つ以上のヌクレオチドをシームレスに改変する方法を提供する。「シームレス突然変異誘発」は、例えば、突然変異を導入するために使用される選択遺伝子の存在下でのいかなる他の隣接変化も伴わない部位特異的突然変異誘発(すなわち、1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入)を指す。タンパク質コード領域における突然変異誘発のためのシームレスDNA遺伝子操作は、有利である。それというのも、突然変異誘発ステップの間に導入される任意の外部配列がタンパク質発現を妨害し得るためである。本開示は、2ステップ選択/対抗選択方針を使用するシームレス突然変異誘発であって、選択カセット、例えば、抗生物質耐性遺伝子とそれに伴う対抗選択遺伝子の標的部位における挿入を最初に含むシームレス突然変異誘発を提供する。続いて、カセットは、通常、小分子、例えば、ストレプトマイシン又は糖の投与を含む対抗選択遺伝子に対する選択により所望の配列によりシームレスに置き換える。対抗選択マーカーの通例の任意選択としては、sacB、rpsL、並びに適切な宿主バックグラウンドにおいて選択し、及び対抗して選択することができるマーカー、例として、galK、thyA及びtolCが挙げられる。シームレス突然変異誘発の従来の方法は、例えば、Wang et al.,“Improved seamless mutagenesis by recombineering using ccdB for counterselection,”Nucleic Acids Research 42(5):e37(2014);Zhang et al.,“A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli,”Nature Genetics 20(2):123-128(1998);Westenberg et al.,“Counter-selection recombineering of the baculovirus genome:a strategy for seamless modification of repeat-containing BACs,”Nucleic Acids Research 38:e166(2010);Wong et al.,“Efficient and seamless DNA recombineering using a thymidylate synthase A selection system in Escherichia coli,”Nucleic Acids Research 33:e59(2005)に記載され、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
(i)標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第1の領域、
(ii)1つ以上のヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の突然変異を含む第2の領域、
(iii)第1のヌクレアーゼ結合部位、
(iv)マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、
(v)第2のヌクレアーゼ結合部位、
(vi)1つ以上のヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の突然変異を含む第3の領域、及び
(vii)標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第4の領域を含み、第1の領域及び第4の領域は、標的ポリヌクレオチド配列のそれらのそれぞれの一部と95%~l00%同一である。
一部の実施形態において、本開示は、stiCas9タンパク質との複合体を形成する遺伝子操作ガイドRNAであって、(a)真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列;及び(b)Cas9タンパク質に結合し得るtracrRNA配列を含み、tracrRNAは、天然発生tracrRNA配列と少なくとも10ヌクレオチドだけ異なり、Cas9タンパク質のヌクレアーゼ効率を改善する遺伝子操作ガイドRNAを提供する。
[1]
a)粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(stiCas9);及び
b)前記stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列(前記ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない)を含むガイドポリヌクレオチド
を含み;
前記複合体は天然に生じない
非天然発生CRISPR-Cas系。
[2]
a)粘着末端を生成し得、核局在化シグナル(NLS)を含むCas9エフェクタータンパク質(stiCas9);及び
b)前記stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチド
を含み;
前記複合体は天然に生じない
非天然発生CRISPR-Cas系。
[3]
a)粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(stiCas9)をコードする1つ以上のヌクレオチド配列;及び
b)前記stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列(前記ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない)を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列
を含み;
前記複合体は天然に生じない
非天然発生CRISPR-Cas系。
[4]
a)粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(stiCas9)をコードする1つ以上のヌクレオチド配列;及び
b)前記stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列
を含み;
(a)及び(b)の前記ヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターの制御下であり、前記複合体は天然に生じない
非天然発生CRISPR-Cas系。
[5]
前記ガイドポリヌクレオチドが、tracrRNA配列を含む、第1項~第4項のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas系。
[6]
tracrRNA配列を含む別個のポリヌクレオチドをさらに含む、第1項~第4項のいずれか一項に記載のCRISPR-Cas系。
[7]
前記ガイドポリヌクレオチド、tracrRNA配列、及び前記stiCas9が、複合体を形成し得、前記複合体は天然に生じない、第6項に記載のCRISPR-Cas系。
[8]
a)粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(stiCas9)をコードする1つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に結合している調節エレメント;及び
b)前記stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列(前記ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない)を含むガイドポリヌクレオチド
を含み;
前記複合体は天然に生じない
1つ以上のベクターを含む非天然発生CRISPR-Cas系。
[9]
a)粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(stiCas9)をコードする1つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に結合している調節エレメント(前記調節エレメントは、真核生物調節エレメントである);及び
b)前記stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチド
を含み;
前記複合体は天然に生じない
1つ以上のベクターを含む非天然発生CRISPR-Cas系。
[10]
前記ガイドポリヌクレオチドが、tracrRNA配列をさらに含む、第8項又は第9項に記載の非天然発生ベクター。
[11]
tracrRNA配列を含むヌクレオチド配列をさらに含む、第9項又は第10項に記載の非天然発生ベクター。
[12]
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の10ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、第1項~第11項のいずれか一項に記載の系。
[13]
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、第1項~第12項のいずれか一項に記載の系。
[14]
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の3ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、第1項~第13項のいずれか一項に記載の系。
[15]
前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’に存在し、前記PAMは、3’Gリッチモチーフを含む、第1項~第14項のいずれか一項に記載の系。
[16]
前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’に存在し、前記PAM配列は、NGG(Nは、A、C、G、又はTである)である、第1項~第15項のいずれか一項に記載の系。
[17]
前記粘着末端が、3~40ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、第1項~第16項のいずれか一項に記載の系。
[18]
前記粘着末端が、4~20ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、第1項~第17項のいずれか一項に記載の系。
[19]
前記粘着末端が、5~15ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、第1項~第18項のいずれか一項に記載の系。
[20]
前記stiCas9が、II-B型CRISPR系を有する細菌種に由来する、第1項~第19項のいずれか一項に記載の系。
[21]
前記stiCas9が、配列番号10~97又は192~195のいずれか1つと少なくとも95%の同一性を有するドメインを含む、第1項~第20項のいずれか一項に記載の系。
[22]
前記stiCas9が、1E-5のE値カットオフを用いてTIGR03031タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む、第1項~第21項のいずれか一項に記載の系。
[23]
前記stiCas9が、1E-10のE値カットオフを用いて前記TIGR03031タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む、第1項~第22項のいずれか一項に記載の系。
[24]
前記細菌種が、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、フランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)、ガンマプロテオバクテリア(gamma proteobacterium)HTCC5015、パラサテレラ・エキスクレメンティホミニス(Parasutterella excrementihominis)、サテレラ・ワズワーセンシス(Sutterella wadsworthensis)、スルフロスピリラム属種(Sulfurospirillum sp.)SCADC、ルミノバクター属種(Ruminobacter sp.)RM87、バークホルデリア・バクテリウム(Burkholderiales bacterium)1_1_47、バクテロイデス・オーラル・タクソン(Bacteroidetes oral taxon)274株F0058、ウォリネラ・スクシノゲネス(Wolinella succinogenes)、バークホルデリア・バクテリウム(Burkholderiales bacterium)YL45、ルミノバクター・アミロフィラス(Ruminobacter amylophilus)、カンピロバクター属種(Campylobacter sp.)P0111、カンピロバクター属種(Campylobacter sp.)RM9261、カンピロバクター・ラニエナエ(Campylobacter lanienae)株RM8001、カンプリロバクター・ラニエナエ(Camplylobacter lanienae)株P0121、ツリシモナス・ムリス(Turicimonas muris)、レジオネラ・ロンジニエンシス(Legionella londiniensis)、サリニビブリオ・シャルメンシス(Salinivibrio sharmensis)、レプトスピラ属種(Leptospira sp.)単離株FW.030、モリテラ属種(Moritella sp.)単離株NORP46、エンドゾイコモナス属種(Endozoicomonassp.)S-B4-1U、タミルナドゥイバクター・サリナス(Tamilnaduibacter salinus)、ビブリオ・ナトリエゲンス(Vibrio natriegens)、アルコバクター・スキロウイイ(Arcobacter skirrowii)、フランシセラ・フィロミラギア(Francisella philomiragia)、フランシセラ・ヒスパニエンシス(Francisella hispaniensis)、又はパレンドゾイコモナス・ハリクロナエ(Parendozoicomonas haliclonae)である、第23項に記載の系。
[25]
前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’に存在し、前記PAM配列は、YG(Yは、ピリミジンである)であり、前記stiCas9が、細菌種F.ノビシダ(F.novicida)に由来する、第24項に記載の系。
[26]
前記stiCas9が、1つ以上の核局在化シグナルを含む、第1項~第25項のいずれか一項に記載の系。
[27]
前記真核細胞が、動物又はヒト細胞である、第1項~第26項のいずれか一項に記載の系。
[28]
前記真核細胞が、ヒト細胞である、第1項~第27項のいずれか一項に記載の系。
[29]
前記真核細胞が、植物細胞である、第1項~第26項のいずれか一項に記載の系。
[30]
前記ガイド配列が、ダイレクトリピート配列に結合している、第1項~第29項のいずれか一項に記載の系。
[31]
第1項~第30項のいずれか一項に記載の系を含む送達粒子。
[32]
前記stiCas9及び前記ガイドポリヌクレオチドが、複合体中に存在する、第31項に記載の送達粒子。
[33]
前記複合体が、tracrRNA配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、第32項に記載の送達粒子。
[34]
脂質、糖、金属、又はタンパク質をさらに含む、第32項又は第22項に記載の送達粒子。
[35]
第1項~第30項のいずれか一項に記載の系を含むベシクル。
[36]
前記stiCas9及び前記ガイドポリヌクレオチドが、複合体中に存在する、第35項に記載のベシクル。
[37]
tracrRNA配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、第36項に記載のベシクル。
[38]
前記ベシクルが、エキソソーム又はリポソームである、第35項~第37項のいずれか一項に記載のベシクル。
[39]
前記stiCas9をコードする前記1つ以上のヌクレオチド配列が、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている、第5項~第9項のいずれか一項に記載の系。
[40]
Cas9エフェクタータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記ガイドポリヌクレオチドが、単一ベクター上に存在する、第5項~第30項又は第39項のいずれか一項に記載の系。
[41]
Cas9エフェクタータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記ガイドポリヌクレオチドが、単一核酸分子上に存在する、第5項~第30項又は第39項のいずれか一項に記載の系。
[42]
第5項~第30項又は第39項~第41項のいずれか一項に記載の系を含むウイルスベクター。
[43]
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのものである、第42項に記載のウイルスベクター。
[44]
a)粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(stiCas9)、及び
b)前記stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列(前記ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得る)を含むガイドポリヌクレオチド
を含み;
前記複合体は天然に生じない
CRISPR-Cas系を含む真核細胞。
[45]
粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(stiCas9)(前記Cas9エフェクタータンパク質は、II-B型CRISPR系を有する細菌種に由来する)を含むCRISPR-Cas系を含む真核細胞。
[46]
真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって、
a)前記細胞中に、
i.粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(stiCas9);及び
ii.前記stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列(前記ガイド配列は、前記真核細胞中の前記標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない)を含むガイドポリヌクレオチド(前記複合体は天然に生じない)
を導入すること;並びに
b)前記Cas9エフェクタータンパク質及び前記ガイドポリヌクレオチドにより前記標的配列中の粘着末端を生成すること;並びに
c)
i.前記粘着末端を一緒に、又は
ii.目的ポリヌクレオチド配列(SoI)を前記粘着末端に
ライゲートすること
を含み;
それにより前記標的配列を改変する方法。
[47]
真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって、
a)前記細胞中に、
i.粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(stiCas9)をコードするヌクレオチド配列;及び
ii.前記stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列(前記ガイド配列は、前記真核細胞中の前記標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない)を含むガイドポリヌクレオチド(前記複合体は天然に生じない)
を導入すること;並びに
b)前記Cas9エフェクタータンパク質及び前記ガイドポリヌクレオチドにより前記標的配列中の粘着末端を生成すること;並びに
c)
i.前記粘着末端を一緒に、又は
ii.目的ポリヌクレオチド配列(SoI)を前記粘着末端に
ライゲートすること
を含み;
それにより前記標的配列を改変する方法。
[48]
前記ガイドポリヌクレオチドが、tracrRNA配列をさらに含む、第46項又は第47項に記載の方法。
[49]
前記細胞中に、tracrRNA配列を含むポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、第46項又は第47項に記載の方法。
[50]
前記ガイドポリヌクレオチド、tracrRNA配列、及び前記stiCas9が、複合体を形成し得、前記複合体は天然に生じない、第49項に記載の方法。
[51]
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の10ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、第46項~第50項のいずれか一項に記載の方法。
[52]
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、第46項~第51項のいずれか一項に記載の方法。
[53]
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の3ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、第46項~第52項のいずれか一項に記載の方法。
[54]
前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’に存在し、前記PAMは、3’Gリッチモチーフを含む、第46項~第53項のいずれか一項に記載の方法。
[55]
前記標的配列が、PAMの5’に存在し、前記PAM配列は、NGG(Nは、A、C、G、又はTである)である、第46項~第54項のいずれか一項に記載の方法。
[56]
前記粘着末端が、3~40ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、第46項~第55項のいずれか一項に記載の方法。
[57]
前記粘着末端が、4~20ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、第46項~第56項のいずれか一項に記載の方法。
[58]
前記粘着末端が、5~15ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、第46項~第57項のいずれか一項に記載の方法。
[59]
前記stiCas9が、II-B型CRISPR系を有する細菌種に由来する、第46項~第58項のいずれか一項に記載の方法。
[60]
前記真核細胞が、動物又はヒト細胞である、第46項~第59項のいずれか一項に記載の方法。
[61]
前記真核細胞が、ヒト細胞である、第46項~第60項のいずれか一項に記載の方法。
[62]
前記真核細胞が、植物細胞である、第46項~第59項のいずれか一項に記載の方法。
[63]
前記改変が、前記標的配列の少なくとも一部の欠失である、第46項~第62項のいずれか一項に記載の方法。
[64]
前記改変が、前記標的配列の突然変異である、第46項~第62項のいずれか一項に記載の方法。
[65]
前記改変が、前記標的配列中への目的配列の挿入である、第46項~第62項のいずれか一項に記載の方法。
[66]
エキソヌクレアーゼを導入して前記stiCas9により生成されたオーバーハングを除去することをさらに含む、第46項~第65項のいずれか一項に記載の方法。
[67]
前記エキソヌクレアーゼが、Cas4、Artemis、又はTREX2である、第66項に記載の方法。
[68]
前記Cas4が、II-B型CRISPR系を有する細菌種に由来する、第67項に記載の方法。
[69]
前記複合体の構成成分をコードするポリヌクレオチドを、1つ以上のベクター上に導入する、第46項~第68項のいずれか一項に記載の方法。
[70]
細胞中の染色体中に目的配列(SoI)を導入する方法であって、
前記染色体は、領域1及び領域2を含む標的配列(TSC)を含み、前記細胞中に、
a)標的配列(TSV)を含むベクター(前記TSVは、領域2及び領域1並びにSoIを含む);
b)前記TSC中の粘着末端を生成し得る第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体(前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第1の単量体は、前記TSCの領域1において開裂させ、前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第2の単量体は、領域2において開裂させる);及び
c)前記TSV中の粘着末端を生成し得る第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体(前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第1の単量体は、前記TSVの領域2において開裂させ、前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第2の二量体は、領域1において開裂させる)
を導入することを含み;
前記細胞中への(a)の前記ベクター、(b)の前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体及び(c)の前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の導入は、前記細胞の前記染色体中への前記SoIの挿入をもたらす方法。
[71]
細胞中の染色体中に目的配列(SoI)を導入する方法であって、
前記染色体は、領域1及び領域2を含む標的配列(TSC)を含み;前記細胞中に、
a)標的配列(TSV)(前記TSVは、領域2及び領域1並びに前記SoIを含む)を含むベクター(前記ベクターは、粘着末端を含む);
b)前記TSC中の粘着末端を生成し得る第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体(前記Cas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第1の単量体は、前記TSCの領域1において開裂させ、前記Cas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第2の単量体は、領域2において開裂させる)
を導入することを含み;
前記細胞中への(a)の前記ベクター及び(b)の前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の導入は、前記細胞の前記染色体中への前記SoIの挿入をもたらす方法。
[72]
前記第1及び第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体が同一である、第70項又は第71項に記載の方法。
[73]
前記第1及び第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体が異なる、第70項又は第71項に記載の方法。
[74]
前記細胞中に、前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第1の単量体との複合体を形成し、第1のガイド配列(前記第1のガイド配列は、領域1を含む前記TSCにハイブリダイズするが、前記ベクターにハイブリダイズしない)を含む第1のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、第70項~第73項のいずれか一項に記載の方法。
[75]
前記細胞中に、前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第1の単量体との複合体を形成し、第1のガイド配列(前記第1のガイド配列は、前記TSC及び前記TSVにハイブリダイズする)を含む第1のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、第70項~第73項のいずれか一項に記載の方法。
[76]
前記細胞中に、前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第2の単量体との複合体を形成し、第2のガイド配列(前記第2のガイド配列は、領域2を含む前記TSCにハイブリダイズするが、前記ベクターにハイブリダイズしない)を含む第2のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、第70項~第75項のいずれか一項に記載の方法。
[77]
前記細胞中に、前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第2の単量体との複合体を形成し、第2のガイド配列(前記第2のガイド配列は、前記TSC及び前記TSVにハイブリダイズする)を含む第2のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、第70項~第75項のいずれか一項に記載の方法。
[78]
前記細胞中に、前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の第1の単量体との複合体を形成し、第3のガイド配列(前記第3のガイド配列は、領域2を含む前記TSVにハイブリダイズするが、前記染色体にハイブリダイズしない)を含む第3のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、第70項~第77項のいずれか一項に記載の方法。
[79]
前記細胞中に、前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第1の単量体との複合体を形成し、第3のガイド配列(前記第3のガイド配列は、前記TSC及び前記TSVにハイブリダイズする)を含む第3のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、第70項~第78項のいずれか一項に記載の方法。
[80]
前記細胞中に、前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第2の単量体との複合体を形成し、第4のガイド配列(前記第4のガイド配列は、領域1を含む前記TSVにハイブリダイズするが、前記染色体にハイブリダイズしない)を含む第4のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、第70項~第79項のいずれか一項に記載の方法。
[81]
前記細胞中に、前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第2の単量体との複合体を形成し、第4のガイド配列(前記第4のガイド配列は、前記TSC及び前記TSVにハイブリダイズする)を含む第4のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、第70項~第80項のいずれか一項に記載の方法。
[82]
前記細胞中に、前記第1、第2、第3、及び第4のガイドポリヌクレオチドを導入することを含む、第70項~第81項のいずれか一項に記載の方法。
[83]
前記細胞中に、tracrRNA配列を含むポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、第70項~第82項のいずれか一項に記載の方法。
[84]
前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第1の単量体及び前記第2の単量体中の前記エンドヌクレアーゼが、IIS型エンドヌクレアーゼである、第70項~第83項のいずれか一項に記載の方法。
[85]
前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第1の単量体及び前記第2の単量体中の前記エンドヌクレアーゼが、IIS型エンドヌクレアーゼである、第70項~第83項のいずれか一項に記載の方法。
[86]
前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体及び前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、IIS型エンドヌクレアーゼである、第70項~第85項のいずれか一項に記載の方法。
[87]
前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体及び前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、BbvI、BgcI、BfuAI、BmpI、BspMI、CspCI、FokI、MboII、MmeI、NmeAIII、及びPleIからなる群から独立して選択される、第70項~第86項のいずれか一項に記載の方法。
[88]
前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体及び前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、FokIである、第70項~第87項のいずれか一項に記載の方法。
[89]
前記第1及び第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体を、前記細胞中に、前記第1及び第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチドとして導入する、第70項~第88項のいずれか一項に記載の方法。
[90]
前記第1及び第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体をコードする前記ポリヌクレオチドが、1つのベクター上に存在する、第89項に記載の方法。
[91]
前記第1及び第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体をコードする前記ポリヌクレオチドが、2つ以上のベクター上に存在する、第89項に記載の方法。
[92]
前記第1、第2又は両方のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体が、改変Cas9を含む、第70項~第91項のいずれか一項に記載の方法。
[93]
前記第1、第2又は両方のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体が、触媒的に不活性なCas9を含む、第92項に記載の方法。
[94]
前記第1、第2又は両方のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、FokIである、第93項に記載の方法。
[95]
前記第1、第2又は両方のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体が、ニッカーゼ活性を有するCas9を含む、第92項に記載の方法。
[96]
前記第1、第2又は両方のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、FokIである、第95項に記載の方法。
[97]
前記Cas9-エンドヌクレアーゼ二量体が、野生型Cas9に対してCas9中の単一アミノ酸置換を含む、第92項に記載の方法。
[98]
前記第1、第2又は両方のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、FokIである、第97項に記載の方法。
[99]
前記単一アミノ酸置換が、D10A又はH840Aである、第97項又は第98項に記載の方法。
[100]
前記単一アミノ酸置換が、D10Aである、第97項又は第98項に記載の方法。
[101]
前記単一アミノ酸置換が、H840Aである、第97項又は第98項に記載の方法。
[102]
前記Cas9-エンドヌクレアーゼ二量体が、野生型Cas9に対して二重アミノ酸置換を含む、第92項に記載の方法。
[103]
前記二重アミノ酸置換が、D10A及びH840Aである、第102項に記載の方法。
[104]
前記野生型Cas9が、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス(Staphylococcus pseudintermedius)、プラノコッカス・アンタルクティカス(Planococcus antarcticus)、ストレプトコッカス・サングイニス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、コリバクテリウム・グロメランス(Coribacterium glomerans)、ラクトバシラス・ファーシミニス(Lactobacillus farciminis)、カテニバクテリウム・ミツオカイ(Catenibacterium mitsuokai)、ラクトバシラス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、オエノコッカス・キタハラ(Oenococcus kitahara)、フルクトバシラス・フルクトサス(Fructobacillus fructosus)、フィネゴルディア・マグナ(Finegoldia magna)、ベイロネラ・アチピカ(Veillonella atyipca)、ソロバクテリウム・モオレイ(Solobacterium moorei)、アシドアミノコッカス属種(Acidaminococcus sp.)D21、ユーバクテリウム・ユリ(Eubacterium yurri)、コプロコッカス・カタス(Coprococcus catus)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、フィリファクター・アロシス(Filifactor alocis)、ペプトニフィラス・ドゥエルデニイ(Peptoniphilus duerdenii)、又はトレポネマ・デンティコラ(Treponema denticola)に由来する、第97項に記載の方法。
[105]
前記粘着末端が、5’オーバーハングを含む、第70項~第104項のいずれか一項に記載の方法。
[106]
前記粘着末端が、3’オーバーハングを含む、第70項~第104項のいずれか一項に記載の方法。
[107]
前記第1、第2又は両方のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体が、3~40ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する、第70項~第106項のいずれか一項に記載の方法。
[108]
前記第1、第2又は両方のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体が、4~30ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する、第70項~第106項のいずれか一項に記載の方法。
[109]
前記第1、第2又は両方のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体が、5~20ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する、第70項~第106項のいずれか一項に記載の方法。
[110]
前記挿入時、前記染色体中の前記標的配列及び前記プラスミド中の前記標的配列を再構成させない、第70項~第109項のいずれか一項に記載の方法。
[111]
前記細胞が、真核細胞である、第70項~第110項のいずれか一項に記載の方法。
[112]
前記細胞が、動物又はヒト細胞である、第70項~第111項のいずれか一項に記載の方法。
[113]
前記細胞が、植物細胞である、第70項~第112項のいずれか一項に記載の方法。
[114]
(a)の前記ベクター、(b)の前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体、(c)の前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体又はそれらの組合せを、前記細胞中に、送達粒子、ベシクル、又はウイルスベクターを介して導入する、第70項~第113項のいずれか一項に記載の方法。
[115]
(a)の前記ベクター、(b)の前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体、(c)の前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体又はそれらの組合せを、前記細胞中に、送達粒子を介して導入する、第70項~第114項のいずれか一項に記載の方法。
[116]
前記送達粒子が、脂質、糖、金属、又はタンパク質を含む、第115項に記載の方法。
[117]
(a)の前記ベクター、(b)の前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体、(c)の前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体又はそれらの組合せを、前記細胞中に、ベシクルを介して導入する、第70項~第114項のいずれか一項に記載の方法。
[118]
前記ベシクルが、エキソソーム又はリポソームである、第117項に記載の方法。
[119]
(b)、(c)又はそれらの組合せを発現し得るポリヌクレオチドを、前記細胞中に、ウイルスベクターを介して導入する、第70項~第113項のいずれか一項に記載の方法。
[120]
(a)の前記ベクターが、ウイルスベクターである、第70項~第113項のいずれか一項に記載の方法。
[121]
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスである、第119項又は第120項に記載の方法。
[122]
前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第1の単量体が、前記第1のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成し、前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第2の単量体が、前記第2のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成する、第70項~第121項のいずれか一項に記載の方法。
[123]
前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第1の単量体が、前記第3のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成し、前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第2の単量体が、前記第4のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成する、第70項~第122項のいずれか一項に記載の方法。
[124]
前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第1の単量体が、前記第1のガイドポリヌクレオチド配列及びtracrRNA配列との複合体を形成し、前記第1のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第2の単量体が、前記第2のガイドポリヌクレオチド配列及びtracrRNA配列との複合体を形成する、第70項~第121項のいずれか一項に記載の方法。
[125]
前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第1の単量体が、前記第3のガイドポリヌクレオチド配列及びtracrRNA配列との複合体を形成し、前記第2のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体の前記第2の単量体が、前記第4のガイドポリヌクレオチド配列及びtracrRNA配列との複合体を形成する、第70項~第122項のいずれか一項に記載の方法。
[126]
前記第1、第2又は両方のCas9-エンドヌクレアーゼ二量体が、核局在化シグナルを含む、第70項~第125項のいずれか一項に記載の方法。
[127]
前記細胞が、幹細胞又は幹細胞系を含む、第70項~第126項のいずれか一項に記載の方法。
[128]
細胞中の標的ポリヌクレオチド配列中の1つ以上のヌクレオチドを改変する方法であって、
a)前記細胞中に、挿入カセット(IC)を含むベクター(ICは、5’~3’方向で、
i.前記標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第1の領域、
ii.前記標的ポリヌクレオチド配列中の1つ以上のヌクレオチドの突然変異を含む第2の領域、
iii.第1のヌクレアーゼ結合部位、
iv.マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、
v.第2のヌクレアーゼ結合部位、
vi.前記標的ポリヌクレオチド配列中の1つ以上のヌクレオチドの突然変異を含む第3の領域、及び
vii.前記標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第4の領域を含み、前記第1の領域及び前記第4の領域は、前記標的ポリヌクレオチド配列のそれらのそれぞれの一部と95%~l00%同一である)を導入すること;
b)相同組換えを介して前記標的ポリヌクレオチド配列中に前記ICを挿入して第1の改変標的ポリヌクレオチドを生成すること;
c)前記マーカー遺伝子を発現する細胞を選択すること;
d)前記第1の改変標的ポリヌクレオチドを部位特異的ヌクレアーゼに供して粘着末端を有する第2の改変標的ポリヌクレオチドを生成すること;及び
e)粘着末端を有する前記第2の改変標的ポリヌクレオチドをリガーゼ(前記リガーゼは、前記第2の領域及び前記第3の領域において前記粘着末端をライゲートする)に供して前記標的ポリヌクレオチド配列と比較して1つ以上の改変ヌクレオチドを含むライゲートされた改変標的核酸を作出すること
を含む方法。
[129]
前記第1の改変標的核酸を、(c)の後に前記細胞から単離する、第128項に記載の方法。
[130]
前記部位特異的ヌクレアーゼが、前記細胞に対して外因性である、第128項又は第129項に記載の方法。
[131]
前記リガーゼが、前記細胞に対して外因性である、第128項~第130項のいずれか一項に記載の方法。
[132]
前記第1の改変標的タンパク質が、(c)の後に前記細胞中に存在する、第128項に記載の方法。
[133]
前記部位特異的ヌクレアーゼを、前記細胞中に、前記部位特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとして導入する、第132項に記載の方法。
[134]
前記リガーゼを、前記細胞中に、リガーゼをコードするポリヌクレオチドとして導入する、第132項又は第133項に記載の方法。
[135]
前記部位特異的ヌクレアーゼが、組換え部位特異的ヌクレアーゼである、第128項~第134項のいずれか一項に記載の方法。
[136]
前記リガーゼが、組換えリガーゼである、第128項~第135項のいずれか一項に記載の方法。
[137]
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Cas9エフェクタータンパク質である、第128項~第136項のいずれか一項に記載の方法。
[138]
前記Cas9エフェクタータンパク質が、II-B型Cas9である、第137項に記載の方法。
[139]
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Cas9-エンドヌクレアーゼ融合タンパク質である、第128項~第131項のいずれか一項に記載の方法。
[140]
前記Cas9-エンドヌクレアーゼ融合タンパク質中の前記エンドヌクレアーゼが、IIS型ヌクレアーゼである、第139項に記載の方法。
[141]
前記Cas9-エンドヌクレアーゼ融合タンパク質中の前記エンドヌクレアーゼが、FokIである、第139項に記載の方法。
[142]
前記Cas9-エンドヌクレアーゼ融合タンパク質が、改変Cas9を含む、第139項~第141項のいずれか一項に記載の方法。
[143]
前記改変Cas9が、触媒的に不活性なCas9を含む、第142項に記載の方法。
[144]
前記エンドヌクレアーゼが、FokIである、第143項に記載の方法。
[145]
前記Cas9-エンドヌクレアーゼ融合タンパク質が、ニッカーゼ活性を有するCas9を含み、前記エンドヌクレアーゼが、FokIである、第142項に記載の方法。
[146]
前記Cas9-エンドヌクレアーゼ融合タンパク質が、D10A置換を有するCas9を含む、第143項に記載の方法。
[147]
前記Cas9-エンドヌクレアーゼ融合タンパク質が、H840A置換を有するCas9を含む、第143項に記載の方法。
[148]
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Cas9、Cpf1、又はCas9-FokIである、第128項に記載の方法。
[149]
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Cpf1エフェクタータンパク質である、第128項に記載の方法。
[150]
(d)の前記第2の改変標的ポリヌクレオチドの前記粘着末端が、5’オーバーハングを含む、第128項~第149項のいずれか一項に記載の方法。
[151]
(d)の前記第2の改変標的ポリヌクレオチドの前記粘着末端が、3’オーバーハングを含む、第128項~第149項のいずれか一項に記載の方法。
[152]
前記部位特異的ヌクレアーゼが、3~40ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成し得る、第128項~第151項のいずれか一項に記載の方法。
[153]
前記ヌクレアーゼが、4~30ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成し得る、第128項~第151項のいずれか一項に記載の方法。
[154]
前記ヌクレアーゼが、5~20ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成し得る、第128項~第151項のいずれか一項に記載の方法。
[155]
前記標的ポリヌクレオチド配列が、プラスミド中に存在する、第128項~第154項のいずれか一項に記載の方法。
[156]
前記標的ポリヌクレオチド配列が、染色体中に存在する、第128項~第155項のいずれか一項に記載の方法。
[157]
stiCas9タンパク質との複合体を形成する遺伝子操作ガイドRNAであって、
a)真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列;及び
b)前記Cas9タンパク質に結合し得るtracrRNA配列(前記tracrRNAは、天然発生tracrRNA配列と少なくとも10ヌクレオチドだけ異なる)
を含み、
前記Cas9タンパク質のヌクレアーゼ効率を改善する遺伝子操作ガイドRNA。
[158]
前記tracrRNA配列が、天然発生tracrRNAよりも少なくとも10個少ないヌクレオチドを有する、第157項に記載の遺伝子操作ガイドRNA。
[159]
前記tracrRNA配列が、天然発生tracrRNAよりも少なくとも10個多いヌクレオチドを有する、第157項に記載の遺伝子操作ガイドRNA。
[160]
前記ガイド配列が、配列番号104~125又は196~199のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を含む、第157項に記載の遺伝子操作ガイドRNA。
[161]
前記tracrRNA配列が、配列番号148~171のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を含む、第157項に記載の遺伝子操作ガイドRNA。
[162]
前記ガイドRNAが、配列番号172~191のいずれか1つと少なくとも90%の配列同一性を含む、第157項に記載の遺伝子操作ガイドRNA。
[163]
前記tracrRNAが、前記tracrRNAのステムループ中の1つ以上の改変を含む、第157項~第159項のいずれか一項に記載の遺伝子操作ガイドRNA。
[164]
前記改変が、前記ステムループの伸長を含む、第163項に記載の遺伝子操作ガイドRNA。
[165]
前記改変が、前記ステムループの短縮を含む、第163項に記載の遺伝子操作ガイドRNA。
[166]
前記改変が、前記ステムループ中の1つ以上のヌクレオチド置換を含む、第163項に記載の遺伝子操作ガイドRNA。
[167]
前記Cas9タンパク質の前記ヌクレアーゼ効率の改善が、生化学的アッセイ、シーケンシングアッセイ、及び/又は親和性試験により決定される、第157項~第166項のいずれか一項に記載の遺伝子操作ガイドRNA。
[168]
第157項~第163項のいずれか一項に記載の遺伝子操作ガイドRNAを含むCRISPR-Cas系。
[169]
図40Bに見出されるCas9、ガイド配列、及びtracrRNA配列の任意の組合せを含む遺伝子操作Cas9-ガイドRNA複合体。
[170]
別個のポリヌクレオチド上のtracrRNA配列を含まない、第163項に記載のCRISPR-Cas系。
[171]
Cas9タンパク質に結合する遺伝子操作ガイドRNAを産生する方法であって、
a.真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列を提供すること;
b.天然発生tracrRNA配列を、前記tracrRNA配列から少なくとも10個のヌクレオチドを除去することにより改変して改変tracrRNA配列を形成すること;及び
c.前記ガイド配列を前記改変tracrRNA配列に結合させて前記遺伝子操作ガイドRNAを生成すること
を含む方法。
[172]
a)粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質(stiCas9);及び
b)前記stiCas9との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドRNA(前記ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない);
を含み;
前記複合体は天然に生じず、
別個のポリヌクレオチド上のtracrRNA配列を含まない
非天然発生CRISPR-Cas系。
本実施例は、本明細書に開示のシームレス突然変異誘発(ObLiGaRe2.0系)を使用するAAVS1遺伝子座中への遺伝子挿入を保証する。
本実施例において、抗生物質選択を要求しない実験設定を使用して遺伝子挿入効率に対するスペーサー長さ(2つのgRNAのオフセット配列)の影響を試験した。
本実施例において、ObLiGaRe(ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用する)、及びObLiGaRe2.0を使用する遺伝子挿入を比較した。
本実施例において、本明細書の開示に提供されるシームレス突然変異誘発の一般的方法を記載する。シームレス突然変異誘発についての所望の結果を図26に示し、突然変異は標的部位において標的中のいかなる配列の変化もなしで作製する。
本実施例において、核酸消化及びライゲーションを以下のとおり実施する:
1.RNアーゼ不含の0.5mLチューブ中で、
1μLのCas9 10×緩衝液
1μLのCpf1タンパク質(10μg/μL)
1μLのgRNA
10μLまでのRNアーゼ不含H2O(この量は、ステップ3において添加されるDNAの量により決定する)
を一緒に添加する。
2.室温において5分間インキュベートする。
3.切断すべき2~2.5μgのプラスミドDNAを添加する(この容量は濃度に応じて変動し;それに従ってステップ1における水の量を調整する)。
4.37℃において2時間インキュベートする。
5.消化後、150Vにおいて1.5%のアガロースゲルを用いてゲル電気泳動を実施する。
6.適切な長さを有するDNAをゲルから切断する。
7.Gel Extraction Kit(例えば、QIAGEN製)を使用してDNAをゲルから抽出する。
8.NANODROP上でDNA濃度を計測する。
9.PCRチューブ中で、
25~30ngのプラスミドDNA(この容量は濃度に応じて変動する)
1μLのDTT
1μLの10×T4リガーゼ緩衝液
1μLのT4リガーゼ
10μLまでのH2O
を一緒に添加する。
10.16℃において2時間インキュベートする。
11.形質転換のために10μlを使用する。
12.NEB10β細胞(NEW ENGLAND BIOLABS)を氷上で10分間配置することにより-80℃の冷凍庫から解凍する。それぞれのバイアルは、50μL(3つの形質転換に十分)を含有する。SOC培地を解凍する。
13.10μLのライゲーション反応物を1.5mLのEPPENDORFチューブに添加し、氷上に配置して冷却する。
14.解凍後、15μLのNEB10β細胞をライゲーション反応物に添加する。
15.氷上で30分間放置する。42℃の水浴を加温する。
16.細胞を水浴中で42℃において30秒間配置することにより熱ショック処理し、次いで氷上で2分間配置する。
17.300μLのSOC培地を細胞に添加し、37℃において45分間インキュベートする。
18.100μLの細胞をプレート上の1/3に、又は300μLをプレート上の全体にプレーティングし;プレートは、適切な抗生物質を含有する。
本実施例において、Cas9による基質DNAのインビトロ消化を以下のとおり実施する(30μLの反応物用):
1.反応物を室温において以下の順:
20μLのヌクレアーゼ不含水
3μLの10×Cas9ヌクレアーゼ反応緩衝液
3μLの300nMのsgRNA(30nMの最終濃度)
1μLの1μMのCas9ヌクレアーゼ(約30nMの最終濃度)
で集め、
25℃において10分間プレインキュベートし、次いで
3μLの30nMの基質DNA
を添加する。
2.十分に混合し、微小遠心管中でパルススピン(pulse-spin)する。
3.37℃において15分間インキュベートする。
4.1μLのプロテイナーゼKをそれぞれの試料に添加する。十分に混合し、微小遠心管中でパルススピンする。
5.室温において10分間インキュベートする。
6.断片分析に移行する。
本実施例において、コンピュータ計算分析を使用してオペロン中のcas4の存在を検索することによりII-B型Cas9オペロンを同定した。フランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)からのCas9タンパク質(FnCas9)を産生のために選択した。ヌクレアーゼ活性は、図34Aに示されるとおりインビトロ開裂アッセイにおいて実証した。開裂産物のサンガーシーケンシングにより、図34Bに示されるとおりFnCas9がインビトロで5’粘着末端を生成することが明らかになった。タンパク質発現構築物を、HEK293ヒト細胞系中でバリデートした。RIMAを使用して図34Cに示されるとおりFnCas9及び化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)からのCas9タンパク質(SpyCas9)における突然変異パターンを比較した。
フランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)からのII-B型Cas9バリアント(FnCas9)は、実施例7に記載のとおり哺乳動物細胞において低い編集効率で粘着末端を形成することが示された。II-B型Cas9ファミリーの他のメンバーを、粘着末端の生成について試験した。シーケンシングされた腸内メタゲノムMH0245からの新たなCas9バリアントが同定された(MHCas9)。MHCas9のために設計されたガイドRNA、tracrRNA、及びcrRNAの配列を図33に示す。インビトロアッセイは、図35Aに示されるとおりMHCas9がDNA断片を開裂させ得ることを示した。サンガーシーケンシングにより、MHCas9が図35Bに示されるとおりインビトロで5’オーバーハングを生成することが明らかになった。さらに、セル1アッセイを実施して図35Cに示されるとおりMHCas9がHEK293-REMINDELヒト細胞系においても機能的であることをバリデートした。
本実施例において、sgRNAの設計方法を記載する:
1.タンパク質BLAST(NCBI、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins)を使用して関連CRISPRオペロンを見出す。検索に現れる種のそれぞれについて、RefSeqの1つをさらなる分析のために選択する。BLASTは、種々の入力及び異なる設定で数回ランする。
2.既にアノテートされたCRISPR RNA(crRNA)を確認する。そうでなければ、CRISPR-Finder(crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/)を使用してcrRNAをアノテートする。
3.CLC Genomics Workbench v.9.5(QIGEN)の「Create Alignment」を使用してtracrRNAの考えられる局在を見出す。crRNAの両方の鎖をCas4及びCRISPR反復配列間の配列にアラインする。
4.crRNAとの類似性を示す領域に近接するTATAAボックスを探索する。
5.(アラインメントにおいて見出される)全ての考えられるtracrRNAを有するcrRNAの二次構造を試験し、所望の構造を作製するものを選択する。
6.crRNA及びtracrRNAをトリミングして短鎖ガイドRNA(sgRNA)を作製する。
図45(ガイド-1、ガイド-2、ガイド-3、ガイド-4)に概略されるとおり種々のヌクレオチドを除去することにより4つの異なるガイドRNAを遺伝子操作した。次いで、インビトロ消化アッセイにおいて改変ガイドRNAを元のガイドRNAと比較した。図45は、一部の改変がMHCas9の消化効率を改善したことを実証する。
図49Aに模式的に示される方法を使用してMHCas9に好ましいPAM配列を調査した。種々のPAM配列組合せ及び標的開裂部位をカバーするプールされた64個のプラスミドのライブラリーを生成した。SpCas9及びMHCas9を使用してライブラリーを別個に消化した。プラスミド用のフォワード及びリバースプライマーを使用して標的開裂部位及びPAMを含有する領域を増幅させ、次いで増幅させた領域を次世代シーケンシングによりシーケンシングした。SpCas9又はMHCas9のいずれかに好ましいPAM配列を含有するプラスミドは消化され、したがって、増幅もシーケンシングもされなかった。他方、SpCas9又はMHCas9に好ましくないPAM配列を含有するプラスミドは消化されず、増幅させることができた。
II-B型Cas9タンパク質による開裂を、末端プロセシングエキソヌクレアーゼ酵素と組み合わせて編集効率を増加させた。方法の模式図を図50に説明する。図50Aに示されるとおり、II-B型Cas9による開裂により生成されたオーバーハングは、細胞により正確に修復されて元の配列に戻され、したがって、挿入-欠失又は置換改変が望まれる場合に編集効率が制限され得る。図50Bにおいて、II-B型Cas9による開裂後、末端プロセシングエキソヌクレアーゼ酵素Artemis又はTREX2を導入し、それがII-B型Cas9切断部位における開裂オーバーハングをさらにプロセシングする。これらのプロセシングされた末端の細胞修復は、元の配列に対して不正確な修復(すなわち、挿入-欠失又は置換改変の数の増加)をもたらし、それにより編集効率を増加させる。
異なるCas9により作製された切断についての突然変異パターン分析を実施した。HEK293細胞にSpCas9、Cl1Cas9、又はMHCas9及びそれらのそれぞれのガイドRNAを形質移入した。72時間後に細胞を溶解させ、ゲノムDNAを抽出し、次世代アンプリコンシーケンシングに供した。バイオインフォマティックツールを使用してシーケンシングリードを分析して検出された改変リード間のそれぞれの突然変異の相対頻度を定量した。
Claims (24)
- a)配列番号71と少なくとも95%の同一性を有するドメインを含む、粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質;及び
b)前記Cas9エフェクタータンパク質との複合体を形成し、ガイド配列(前記ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない)を含むガイドポリヌクレオチド
を含む、CRISPR-Cas系。 - 前記ガイドポリヌクレオチドが、tracrRNA配列を含む、請求項1に記載のCRISPR-Cas系。
- tracrRNA配列を含む別個のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項1または2に記載のCRISPR-Cas系。
- 前記ガイドポリヌクレオチド、tracrRNA配列、及び前記Cas9エフェクタータンパク質が、複合体を形成し得る、請求項3に記載のCRISPR-Cas系。
- 前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の10ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、請求項1~4のいずれか一項に記載の系。
- 前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、請求項1~5のいずれか一項に記載の系。
- 前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の3ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、請求項1~6のいずれか一項に記載の系。
- 前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’に存在し、前記PAMは、3’Gリッチモチーフを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の系。
- 前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の5’に存在し、前記PAM配列は、NGG(Nは、A、C、G、又はTである)である、請求項1~8のいずれか一項に記載の系。
- 前記粘着末端が、3~40ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の系。
- 前記粘着末端が、4~20ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の系。
- 前記粘着末端が、5~15ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の系。
- 前記Cas9エフェクタータンパク質が、1E-5のE値カットオフを用いてTIGR03031タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の系。
- 前記Cas9エフェクタータンパク質が、1E-10のE値カットオフを用いてTIGR03031タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の系。
- 前記真核細胞が、動物又はヒト細胞である、請求項1~14のいずれか一項に記載の系。
- 前記真核細胞が、植物細胞である、請求項1~14のいずれか一項に記載の系。
- 前記ガイド配列が、ダイレクトリピート配列に結合している、請求項1~16のいずれか一項に記載の系。
- 請求項1~17のいずれか一項に記載の系を含む送達粒子。
- 請求項1~17のいずれか一項に記載の系を含むベシクルであって、前記ベシクルが、エキソソーム又はリポソームである、ベシクル。
- 請求項1~17のいずれか一項に記載の系を含むウイルスベクターであって、前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのものである、ウイルスベクター。
- インビトロまたはエクスビボで真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって、
a)前記細胞中に、
i.配列番号71と少なくとも95%の同一性を有するドメインを含む、粘着末端を生成し得るCas9エフェクタータンパク質;及び
ii.前記Cas9エフェクタータンパク質との複合体を形成し、ガイド配列(前記ガイド配列は、前記真核細胞中の前記標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない)を含むガイドポリヌクレオチド
を導入すること;並びに
b)前記Cas9エフェクタータンパク質及び前記ガイドポリヌクレオチドにより前記標的配列中の粘着末端を生成すること;並びに
c)
i.前記粘着末端を一緒に、又は
ii.目的ポリヌクレオチド配列(SoI)を前記粘着末端に
ライゲートすること
を含み;
それにより前記標的配列を改変する方法。 - エキソヌクレアーゼを導入して前記Cas9エフェクタータンパク質により生成されたオーバーハングを除去することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 前記エキソヌクレアーゼが、Cas4、Artemis、又はTREX2である、請求項22に記載の方法。
- 前記複合体の構成成分をコードするポリヌクレオチドを、1つ以上のベクター上に導入する、請求項21~23のいずれか一項に記載の方法。
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