CN117660510A - 副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建及其应用 - Google Patents
副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117660510A CN117660510A CN202311519617.XA CN202311519617A CN117660510A CN 117660510 A CN117660510 A CN 117660510A CN 202311519617 A CN202311519617 A CN 202311519617A CN 117660510 A CN117660510 A CN 117660510A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- screening
- paragallinarum
- plasmid
- avian
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 241000271566 Aves Species 0.000 title claims abstract description 33
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 241000606767 Avibacterium paragallinarum Species 0.000 claims abstract description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 4
- 101150070444 glgB gene Proteins 0.000 claims description 45
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 claims description 28
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 25
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 21
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 claims description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 7
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 5
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 5
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 2
- 101150090624 glgP gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150088678 manB gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150034540 hutZ gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 abstract description 18
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 21
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 20
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 6
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 244000144992 flock Species 0.000 description 4
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 4
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 101150031431 opa gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100075927 Aspergillus aculeatus mndA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091029499 Group II intron Proteins 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101100071829 Vibrio cholerae serotype O1 (strain ATCC 39315 / El Tor Inaba N16961) hutZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940031416 bivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000036750 egg laying performance Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建方法，具体包括如下步骤：步骤10：将质粒pSJ001导入副鸡禽杆菌，经与抗性基因相对应的抗生素筛选，得到第一次同源重组的菌株；步骤20：将质粒pSJ002导入第一次重组菌株，经蓝白斑筛选系统筛选得到第二次同源重组的菌株；该方法应用到菌株筛选后，通过正向筛选使用所对应的抗生素筛选出含有lacZ基因和抗性基因的目标菌株，反向筛选使用X‑Gal蓝白系统进行筛选。两种方法的结合后，可以直观、简便且高效地筛选出副鸡禽杆菌基因缺失突变株。同时本发明还公开了该采用重组表达载体系统敲除副鸡禽杆菌的基因的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建及其应用。
背景技术
副鸡禽杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够引起鸡传染性鼻炎；副鸡禽杆菌定植在鼻腔后会造成鼻腔、面部发生炎症，进而导致鸡群全身发热，细菌繁殖产生的大量毒素也会通过血液循环损伤输卵管和卵巢，导致鸡群产蛋性能下降。鸡群发生传染性鼻炎后，其体质下降，机体处于亚健康状态，易感染其他疾病发生混合感染，对鸡群造成终身影响，给养禽业造成了巨大经济损失。然而目前还未有彻底根治鸡传染性鼻炎的药物，且副鸡禽杆菌容易产生耐药性。疫苗是防控传染性鼻炎的一种重要手段，主要采用的是灭活苗和弱毒苗，灭活苗常用的是二价苗和三价苗，由于培养副鸡禽杆菌所需要的条件苛刻，而生产灭活疫苗所需的抗原剂量大，导致灭活疫苗的生产成本高昂；优质的弱毒苗可在免疫动物体内繁殖，用量小，免疫原性好，免疫期长，成本低，使用方便，但目前市面上还没有商品化的弱毒苗可供使用，开发安全可使用的弱毒株是很有必要的。
关于防控鸡传染性鼻炎的基因工程疫苗，目前可供选择的方法较少，如TargeTron基因敲除系统来构建弱毒株，应用转座子随机突变筛选减毒菌株，构建载体表达抗原蛋白来制作亚单位疫苗等；但构建的弱毒菌株都残留有抗性标签，不符合国家减抗禁抗的规定，且基因敲除效率不高甚至无法敲除；构建载体表达抗原蛋白的方法周期较长且步骤繁琐，成本消耗也高。
本申请人的在先申请：ZL202210877323.3公开了多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的筛选系统及其应用，该方法在针对多杀性巴氏杆菌的基因敲除是有效的。其策略是：将温敏自杀系统与X-Gal蓝白斑筛选系统相结合，进而筛选得到目标菌株。
在该方案中，使用了2个质粒，分别为FSX002和FSX003，其均含lacZ基因，庆大抗生素基因，此外FSX002含多杀性巴氏杆菌部分glgB基因同源的DNA分子，FSX003含多杀性巴氏杆菌部分opa基因同源的DNA分子。
这两个质粒同时使用，以敲除glgB基因、opa基因；
但是，当我们将该方应用到副鸡禽杆菌的基因敲除时，发现该方法无法筛选得到副鸡禽杆菌的基因敲除株。
这也意味着，我们需要找到新的方法来实现对于副鸡禽杆菌的目标基因的敲除。
本方案所要解决的技术问题是：如何针对副鸡禽杆菌的目标基因通过简单的工艺实现可靠的敲除。
发明内容
本发明的目的在于提供一种副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建方法，该方法应用到菌株筛选后，通过正向筛选使用所对应的抗生素筛选出含有lacZ基因和抗性基因的目标菌株，反向筛选使用X-Gal，因为lacZ基因的正确表达能够成功分解X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-3-D半乳糖苷)产生蓝色产物，使菌落在含有X-Gal的固体培养基上呈蓝色，缺乏lacZ基因正确表达的菌落在含有X-Gal的固体培养基上则呈白色。两种方法的结合后，可以直观、简便且高效地筛选出副鸡禽杆菌基因缺失突变株。
同时本发明还公开了该采用重组表达载体系统敲除副鸡禽杆菌的基因的应用；
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建方法，具体包括如下步骤：
步骤10：将质粒pSJ001导入副鸡禽杆菌，经与相对应的抗生素筛选，得到第一次同源重组的菌株；
步骤20：将质粒pSJ002导入第一次重组菌株，经蓝白斑筛选系统筛选得到第二次同源重组的菌株；
所述质粒pSJ001是将目的基因的上下游同源臂以及lacZ基因和抗性基因整合到pUC19载体中构建所得，质粒pSJ002是将含有目的基因的上下游同源臂的敲除盒整合到pUC19载体中构建所得。
在上述的构建方法中，所述抗性基因为红霉素基因、卡那霉素基因、庆大霉素基因、氨苄青霉素中的一种。
由于抗性基因是为了后续的正向筛选所使用，因此采用抗性基因的选择实际上是多种多样的，在选择了特定的抗性基因后，保证正向筛选中抗生素的使用的一致性均可实现本发明的目的。
在上述的构建方法中，所述目标基因为glgB基因。
需要说明的是，本发明的实施例虽然只公开了对于glgB基因的敲除，基于原理的可行性，在实际应用中，敲除副鸡禽杆菌的glgP、manB、hutZ等基因均是可以理论实现的。
在上述的构建方法中，所述glgB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述glgB基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述glgB基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在此需要说明的是，由于不同的副鸡禽杆菌的glgB基因存在轻微的核苷酸区别，因此本发明只需要保证glgB基因的上游同源臂、glgB基因的下游同源臂和所需要敲除的副鸡禽杆菌对应的glgB基因的同源臂的一致性即可；
换句话说，对于不同亚型、不同株的副鸡禽杆菌基于其glgB基因存在的差异性，灵活的去调整glgB基因的上游同源臂、glgB基因的下游同源臂的核苷酸序列是必须的。
在上述的构建方法中，所述lacZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
质粒pSJ001、质粒pSJ002的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、扩增目标基因的上游同源臂和下游同源臂，扩增LacZ基因和抗性基因，将目标基因的上游同源臂、目标基因的下游同源臂、LacZ基因和抗性基因通过重叠延伸PCR连接，构建敲除盒一；
将目标基因的上游同源臂、目标基因的下游同源臂通过重叠延伸PCR连接，构建敲除盒二；
步骤2、将敲除盒一和敲除盒二，分别与线性化的pUC19无缝克隆，热激转化，PCR确认菌株，提取质粒，得到pSJ001和pSJ002。
同时，本发明还保护采用重组表达载体系统构建副鸡禽杆菌基因缺失株的应用；
所述重组表达载体系统包括质粒pSJ001、质粒pSJ002；所述质粒pSJ001是将目的基因的上下游同源臂以及lacZ基因和抗性基因整合到pUC19载体中构建所得，质粒pSJ002是将含有目的基因的上下游同源臂的敲除盒整合到pUC19载体中构建所得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明将抗生素抗性筛选系统与X-Gal蓝白斑筛选系统相结合，建立了高效的副鸡禽杆菌基因编辑方法，成功构建出了副鸡禽杆菌glgB基因无痕突变株，同时对重组菌株筛选方法进行改进与优化，能高效快速地筛选突变株。
(2)本发明是将正向筛选系统和反向筛选系统结合，利用抗生素抗性筛选系统和蓝白斑筛选系统进行两次筛选。正向筛选使用所对应的抗生素筛选出含有lacZ基因和抗性基因的目标菌株，反向筛选使用X-Gal，因为lacZ基因的正确表达能够成功分解X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-3-D半乳糖苷)产生蓝色产物，使菌落在含有X-Gal的固体培养基上呈蓝色，缺乏lacZ基因正确表达的菌落在含有X-Gal的固体培养基上则呈白色。两种方法的结合后，可以直观、简便且高效地筛选出禽副鸡禽杆菌基因缺失突变株。
(3)本发明克服了在先方案中采用温敏自杀系统与X-Gal蓝白斑筛选系统不能成功筛选副鸡禽杆菌缺失株的缺陷；
相比在先方案，本方案构建了2个质粒，解决了现有技术中单质粒无法筛选副鸡禽杆菌缺失株的问题，同时，本发明筛选得到的菌株无抗性基因存在。
附图说明
图1为重组质粒pSJ001的质粒图谱；
图2为重组质粒pSJ002的质粒图谱；
图3为通过重组质粒敲除glgB示意图；
图4为目的片段胶图，M是DL5000核酸marker 1是glgB上游同源臂，2是glgB下有同源臂，3是红霉素抗性(EmR)基因，4是LacZ基因；
图5为一次重组和野生型凝胶图，M是DL 10000核酸marker，1是成功的一次重组菌，2是野生型；
图6为二次重组和野生型凝胶图，M是DL 2000核酸marker，1是成功的二次重组菌，2是野生型；
图7为含有X-Gal的板上野生型、一次重组菌株和二次重组菌株在培养皿上的照片，从左往右依次为板上野生型、一次重组菌株和二次重组菌株。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试剂来源参考表1：
表1试剂来源表格
| 试剂 | 公司 |
| HiPure Gel Pure DNA Mini Kit | 上海迈跟生物科技有限公司 |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 |
| 无缝克隆试剂盒 | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| TSB | 赛默飞世尔科技公司 |
| TSA | 赛默飞世尔科技公司 |
| 鸡血清 | 北京博奥拓达科技有限公司 |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD | 生工生物工程(上海)股份有限公司 |
| 红霉素 | 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 |
副鸡禽杆菌基因缺失株的方案简述如下：
步骤S1：通过PCR的方法获得片段产物，所需片段有四个，首先是目的基因的上下游同源臂，它的模板来自目标菌株的基因组，菌株的基因组用细菌基因组提取试剂盒进行处理；其次是抗性基因和LacZ基因的模板，由生物公司将从NCBI上搜索到的抗生素序列合成并克隆到pET28b-1质粒，LacZ基因序列合成并克隆到pET28b-2质粒；目的片段的引物是通过SnapGene进行设计完成后，送到生物公司进行合成。敲除盒一和敲除盒二通过重叠延伸PCR扩增得到。
以上目的片段经过1％琼脂糖凝胶电泳确认条带大小，使用胶回收试剂盒回收PCR产物，放-20℃备用。
步骤S2：使用无缝克隆的方法获得目标质粒pSJ001和pSJ002，首先将pUC19线性化，再将敲除盒一和pUC19整合构建质粒pSJ001，同理将敲除盒二和pUC19整合构建质粒pSJ002，构建完成的质粒送生物公司测序，没有突变的存放-20℃备用。
步骤S3：制作目标菌株的感受态，将质粒pSJ001转化进目标菌株，通过涂对应抗生素板，正向筛序出阳性克隆子，得到一次重组菌株。
步骤S4：制作一次菌株的感受态，将质粒pSJ002转化进目标菌株，通过涂X-Gal无抗板，反向筛选出阳性克隆子，过夜后在混有蓝色和白色的菌落中挑取白色的菌落进行PCR，即我们的二次重组菌株——基因缺失株。蓝白斑筛选系统能够极大的提升我们的筛选效率。
实施例
下面将通过构建副鸡禽杆菌glgB基因缺失株为例，详细讲述本发明的技术方案。
1.获得目的片段
1.1引物设计与合成
目标缺失基因来源野生分离菌株SC05，经过生物公司测序得到截取glgB全基因序列，选取其中的上游和下游基因，来作为敲除盒的同源臂，上游同源臂的长度为850bp，设计引物P1和P2，下游同源臂的长度为850bp；设计引物P3、P4和P5，再设计引物P6和P7用于重组菌株的鉴定；
glgB全基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述glgB基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述glgB基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
菌株SC05的16SrRNA序列如SEQ ID NO：4所示；
引物P1、P2、P3、P4和P5的基因序列可见下表1；
正向筛选的标记基因是红霉素(EmR)，反向筛选基因是lacZ，参考GenBank中红霉素抗性(EmR)序列(NCBI序列号NC_026505.1)和lacZ全基因序列(NCBI序列号：NC_000913.3)，由通用生物公司分别合成pET28b-1质粒和pET28b-2质粒，分别设计引物P8和P9，P10和P11用于扩增红霉素(EmR)全基因和lacZ全基因；
引物P8、P9、P10和P11的基因序列可见下表1；
上述引物均通过SnapGene4.3.6.0软件设计，用于构建glgB敲除盒。引物由艾基生物技术有限公司合成，引物的工作浓度为10nmol/L。引物序列见下表2所示。
表2：引物序列
| 序号 | 序列(5’——3’) |
| P1 | GCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGTGCACCGCACTTTGTATTATTGC |
| P2 | CTCAGTGATGCTAGGACGTCGCAATACGCTAATTTGCGAAGC |
| P3 | CTGAACTTCGTCACTCATCGCACGGTAAAGGCTCACTTATCG |
| P4 | GACGTCCTAGCATCACTGAGGACGTCCTAGCATCACTGAG |
| P5 | GAATTCGAGCTCGGTACCCCGATGGCTTCACTCACCACC |
| P6 | GCCAAACCAAGCTTATCGGCGTTC |
| P7 | CTTTGCCTTTTGTGCTTTGAGGCTTGTG |
| P8 | AGACTGAGCGTCGTGAGTACAAAAAATGGGAAAGCAAAGTGCG |
| P9 | CGATGAGTGACGAAGTTCAGCACACAGGAAACAGCTATG |
| P10 | GACGTCCTAGCATCACTGAGAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATC |
| P11 | GTACTCACGACGCTCAGTCTTTATTTTTGACACCAGACCAACTGG |
| P12 | GGGTACCGAGCTCGAATTC |
| P13 | CCTCTAGAGTCGACCTGCAGGC |
1.2目的片段的扩增
通过PCR技术将目的基因上游同源臂、目的基因下游同源臂、红霉素(EmR)全基因以及LacZ全基因进行扩增。
以副鸡禽杆菌SC05为模板，用引物P1和P2扩增glgB基因得到敲除盒的上游同源臂，用引物P4和P5扩增glgB基因得到下游同源臂一，用引物P3和P5扩增glgB基因得到下游同源臂二；以pET28b-1为模板，用引物P8和P9扩增红霉素(EmR)全基因；pET28b-2为模板，用引物P10和P11扩增LacZ全基因。
以上PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳确认条带大小后(图4)，使用DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物，得到最终目的片段，放-20℃存放。以上PCR反应所采用的体系配置、程序设置如表3、4所示。
表3：PCR反应体系表
| 成分 | 用量(μL) |
| 2×Master Mix酶 | 25 |
| 模板 | 1 |
| 上游引物 | 2 |
| 下游引物 | 2 |
| ddH2O | 20 |
表4：程序设置表
2副鸡禽杆菌glgB基因缺失突变重组载体的构建
用引物P1和P11将胶回收后的glgB基因的上游同源臂，glgB基因的下游同源臂，红霉素全基因以及LacZ全基因通过重叠延伸PCR的方法扩增，得到一个四搭的片段，即为敲除盒一，使用引物对P12和P13将pUC19质粒线性化，再使用无缝克隆试剂盒(上海生工生物公司产品)将敲除盒一与线性化载体pUC19连接，通过热激转化将连接产物导入大肠杆菌TOP10感受态细胞(通用公司)后通过PCR鉴定筛选阳性克隆子，使用质粒小量提取试剂盒(Omega公司产品，美国)从菌株中抽提质粒，获得具有敲除盒一基因的质粒pSJ001。经过同样的方法，将glgB基因的上游同源臂和glgB基因的下游同源臂二，用引物P1和P5进行重叠延伸PCR扩增，得到一个二搭的片段，即为敲除盒二，再和线性化的pUC19载体无缝克隆连接，转化进TOP10后PCR得到阳性克隆子，最终抽提质粒，获得具有敲除盒二基因的质粒pSJ002。
敲除盒一和敲除盒二的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳确认大小后(图2)，用DNA胶回收试剂盒进行纯化，放-20℃保存，所对应的质粒pSJ001和质粒pSJ002，也放入-20℃保存。以上重叠延伸PCR反应体系如表2所示、程序设置和扩增体系如表5和表6所示。
表5：程序设置
表6：扩增体系表
3初次自然转化
3.1副鸡禽杆菌株SC05感受态的制备
(1)用移液枪吸取副鸡禽杆菌SC05株的单个菌落溶解于无菌水中，取适量进行聚合酶链式反应鉴定，鉴定正确后将剩余部分菌液接种到含有0.01wt％NAD和10wt％鸡血清的6mL TSB液体培养基，37度培养12小时；
(2)用移液枪吸取1mL SC05株菌液到含有0.01wt％NAD和10wt％鸡血清的100mL新鲜的TSB液体培养基中，放入摇床后，恒温培养约6小时，培养期间不时吸取1mL菌液进行测量，观察OD600值约0.6时，将菌液分装到50mL离心管，设置4度，5000g/min离心约10分钟；
(3)弃去上清的培养基，保留剩余底部菌体。加入1M甘露醇和1M山梨醇到离心管中，使菌体充分重悬后放入离心机，设置4℃，5000g/min，离心5min后弃上清，重复5次；
(4)加入5mL 1M甘露醇和1M山梨醇到洗涤好的菌体沉淀中，使其充分悬浮，用移液枪吸100μL到1.5mL离心管中，离心管应提前冰浴，保证全程低温，分装后放置在-80℃冰箱中保存。
3.2一次重组菌株的构建及鉴定
在生物安全柜中，将步骤3.1所制备好的副鸡禽杆菌株SC05感受态恢复至室温，加入10μl步骤2中构建好的质粒pSJ001，混匀完成后加入含有0.01wt％NAD和10wt％鸡血清的1mL TSB培养基，轻轻吹打混匀并转移至2mL离心管内，置于200rpm/min的37℃摇床复苏3小时，随后4000r/min离心5min后弃900μl上清，将剩余菌体与培养基吹打混匀后均匀涂到含有40μg/mL红霉素(EmR)并添加了0.01wt％NAD和10wt％鸡血清的TSA培养板上，随后置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h以上。使用引物对P6和P7进行PCR反应鉴定菌株，扩增glgB重组菌株大小均约为6000bp左右，野生型副鸡禽杆菌株SC05大小均约为2000bp左右(图5)。
一次重组菌株的glgB基因序列如SEQ ID NO：5所示；
4二次自然转化
4.1副鸡禽杆菌SC05一次重组菌株感受态的制备
(1)将步骤3中经过PCR鉴定正确的菌株，即一次重组菌株，在含抗生素40μg/mL红霉素的0.01wt％NAD和10wt％鸡血清TSA板上连续传代培养三代后，刮取少量菌落悬浮，取100μl悬浮液加入到6mL含30μg/mL红霉素的0.01％NAD和10％鸡血清TSB培养液里，置于37℃摇床以200rpm/min震荡培养过夜。
(2)过夜后用移液枪吸取1mL一次重组菌的菌液到含30μg/mL红霉素的0.01wt％NAD和10wt％鸡血清的100mL新鲜的TSB液体培养基中，放入摇床后，恒温培养约6小时，培养期间不时吸取1mL菌液进行测量，观察OD600值约0.6时，将菌液分装到50mL离心管，设置4度，5000g/min离心约10分钟；
(3)弃去上清的培养基，保留剩余底部菌体。加入10wt％甘油到离心管中，使菌体充分重悬后放入离心机，设置4℃，5000g/min，离心5min后弃上清，重复5次；
(4)加入5mL 10wt％甘油到洗涤好的菌体沉淀中，使其充分悬浮，用移液枪吸取100μl到1.5mL离心管中，离心管应提前冰浴，保证全程低温，分装后放置在-80℃冰箱中保存。
4.2二次重组菌的构建及鉴定
将步骤4.1所制备好的副鸡禽杆菌SC05一次重组菌株感受态恢复至室温，加入10μl步骤2中构建好的质粒pSJ002，混匀完成后加入含有0.01wt％NAD和10wt％鸡血清的1mLTSB培养基，轻轻吹打混匀并转移至2mL离心管内，置于200rpm/min的37℃摇床复苏3小时，随后4000rpm/min离心5min后弃900μl上清，将剩余菌体与培养基吹打混匀后均匀涂到含80μg/mL X-gal、0.01wt％NAD和10wt％鸡血清的无抗TSA培养板上，随后置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h以上。使用引物对P6和P7进行PCR反应鉴定菌株，扩增glgB二次重组菌株大小约为1500bp左右，野生型大概为2000bp(图6)。
二次重组菌株的glgB基因序列如SEQ ID NO：6所示。
野生型菌株、glgB一次重组菌株、glgB二次重组菌株在培养皿上的照片参考图7。
对比例1
本对比例用于验证采用在先申请：ZL202210877323.3所述的温敏自杀系统与X-Gal蓝白斑筛选系统进行基因敲除的实验。
实验大体的方法为：
1.构建副鸡禽杆菌glgB基因插入突变载体；
2.将上述载体通过电击转化的方式进入副鸡禽杆菌，得到阳性克隆子；
3.利用温敏载体工作原理，筛选SCO5第一次重组菌株，42℃高温摇菌16h后涂含有30μg/mL卡那霉素的0.01％NAD和10％鸡血清TSA板，PCR确认菌株，即单交换菌株；
4.通过蓝白斑和庆大霉素筛选第二次重组菌株，将单交换菌株在30度培养箱连续转接三代，涂含有80μg/mL X-Gal、30μg/mL庆大霉、0.01％NAD和10％鸡血清TSA板，PCR确认菌株，即双交换菌株。
实验结果为：
实验第一步和第二步按计划顺利进行，但第三步的单交换菌株在尝试多次后无法得到，即无法得到副鸡禽杆菌的单交换菌株；因此副鸡禽杆菌的突变株通过该敲除系统无法得到。
结果分析：
1.通过实施例和对比例的验证可以发现，采用对比例所述的方法无法针对副鸡禽杆菌的目标基因进行敲除；
2.本发明的实施例的逻辑和对比例(即CN202210877323.3)的逻辑完全不同；
对比例的策略为：利用单交换、温敏筛选的方式，来筛选单交换阳性克隆子；然后在二次筛选过程中通过蓝白筛选、抗性筛选结合的方式得到双交换的基因缺失菌株；
该策略存在的问题在于：温敏单交换阳性克隆子转化效率低；在蓝白筛选、抗性筛选结合的筛选系统中，要从众多蓝色菌落中筛选白色菌落，其工作量大，如果白色菌落过少，还需要通过二次分离的方式进一步筛选出被色菌落，工作量巨大。
本实施例的策略为：通过带抗性基因、lacZ基因、同源臂的质粒、以自然转化的方式实现高效的双交换，实现了一次重组，然后通过带同源臂的质粒、以自然转化的方式实现高效的双交换，实现了二次重组；
相比对比例，本实施例的优势在于：
①两次重组都是利用自然转化的方式进行双交换，其转化效率高；
②通过抗生素实现一次重组筛选，在二次重组的过程中，通过蓝白系统来筛选菌落，更容易筛出白色菌落；
③无抗性基因、lacZ基因残留，实现了彻底、无残留敲除；
如果采用对比例的方法，即使其能成功，其整个敲除逻辑也并不适用本发明，其原因在于：对比例的方法由于采用的并非为自然转化，其转化效率比较低，因此其需要再二次转化过程中通过抗生素筛选和蓝白体系的筛选结合来提高筛选成功率；这么一来，导致菌体内含有抗性基因，要再次敲除；所以无论从哪个角度来说，对于本发明的高效筛选、无抗残留的目的都是难于实现的。
3.本发明的优势在于：本发明将抗生素抗性筛选系统与X-Gal蓝白斑筛选系统相结合，采用先后正反筛选的方式，建立了高效的副鸡禽杆菌基因编辑方法，成功构建出了副鸡禽杆菌glgB基因无痕突变株，同时对重组菌株筛选方法进行改进与优化，能高效快速地筛选无抗突变株。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (7)
1.一种副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤10：将质粒pSJ001导入副鸡禽杆菌，经与抗性基因相对应的抗生素筛选，得到第一次同源重组的菌株；
步骤20：将质粒pSJ002导入第一次重组菌株，经蓝白斑筛选系统筛选得到第二次同源重组的菌株；
所述质粒pSJ001是将目的基因的上下游同源臂以及lacZ基因和抗性基因整合到pUC19载体中构建所得，质粒pSJ002是将含有目的基因的上下游同源臂的敲除盒整合到pUC19载体中构建所得。
2.根据权利要求1所述的副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建方法，其特征在于，所述抗性基因为红霉素基因、卡那霉素基因、庆大霉素基因、氨苄青霉素中的一种。
3.根据权利要求1所述的副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建方法，其特征在于，所述目标基因为副鸡禽杆菌的glgB基因、glgP基因、manB基因或hutZ基因。
4.根据权利要求3所述的副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建方法，其特征在于，所述glgB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述glgB基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述glgB基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求1所述的副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建方法，其特征在于，所述lacZ基因的核苷酸序列如NCBI序列号NC_000913.3所示。
6.根据权利要求1所述的副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建方法，其特征在于，所述步骤10具体为：
步骤101：将:质粒pSJ001通过自然转化法导入副鸡禽杆菌，经与抗性基因相对应的抗生素筛选，获得阳性克隆子；
步骤102、将阳性克隆子转接到含有与抗性基因相对应的抗生素的TSA培养基中，连续转接至少三代，得到第一次同源重组的菌株；所述TSA培养基含0.01wt％NAD和10wt％鸡血清。
7.采用重组表达载体系统构建副鸡禽杆菌基因缺失株的应用；
所述重组表达载体系统包括质粒pSJ001、质粒pSJ002；所述质粒pSJ001是将目的基因的上下游同源臂以及lacZ基因和抗性基因整合到pUC19载体中构建所得，质粒pSJ002是将含有目的基因的上下游同源臂的敲除盒整合到pUC19载体中构建所得。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311519617.XA CN117660510A (zh) | 2023-11-15 | 2023-11-15 | 副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311519617.XA CN117660510A (zh) | 2023-11-15 | 2023-11-15 | 副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117660510A true CN117660510A (zh) | 2024-03-08 |
Family
ID=90085466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311519617.XA Pending CN117660510A (zh) | 2023-11-15 | 2023-11-15 | 副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117660510A (zh) |
-
2023
- 2023-11-15 CN CN202311519617.XA patent/CN117660510A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103097537B (zh) | 自删除质粒 | |
| CN112522173A (zh) | 一种生产异源碱性蛋白酶的工程菌及其构建方法 | |
| JP2009523428A (ja) | 直鎖状ベクター、宿主細胞およびクローニング法 | |
| CN115768886A (zh) | 一种基因组编辑系统及方法 | |
| CN109486814A (zh) | 一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑试剂盒 | |
| CN109929788A (zh) | 一种具有ccdB负筛作用的菌株及其构建方法 | |
| CN112980891B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas的大肠杆菌基因组编辑工具 | |
| CN116286931B (zh) | 用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用 | |
| CN109468256B (zh) | 整合四拷贝f18菌毛操纵子基因和双拷贝f4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法 | |
| CN111718964A (zh) | 用于修复dmd基因突变的核酸序列及系统 | |
| CN109468255B (zh) | 整合单拷贝功能性f4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用 | |
| CN117660510A (zh) | 副鸡禽杆菌基因缺失与筛选系统的构建及其应用 | |
| CN115948440A (zh) | 一种分泌表达人胰岛素原的大肠杆菌益生菌构建方法 | |
| CN103146753B (zh) | 一种新的腺病毒载体及其生产方法 | |
| CN109536494A (zh) | 一种用于修复HBB1基因点突变的gRNA、基因编辑系统、表达载体和基因编辑试剂盒 | |
| CN109504643B (zh) | 整合四拷贝功能性f18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用 | |
| CN109628361B (zh) | 整合双拷贝功能性f4菌毛操纵子基因猪源益生菌ep1克隆株、构建方法及应用 | |
| CN115927426B (zh) | 多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株的筛选系统及其应用 | |
| Cohen et al. | Biotechnology: principles and processes | |
| CN112011555A (zh) | 一种调控沙门氏菌自裂解的重组基因、重组质粒及其应用 | |
| US20200061210A1 (en) | Novel method for gene therapy using intranasal administration of genetically modified viral vectors | |
| Wang et al. | Recombineering-Mediated Genome Editing in Burkholderiales Strains | |
| CN111139258A (zh) | 一种线性化DNA载体pHB-1质粒及用其制备的用于编辑细菌基因组的试剂盒 | |
| CN116254284A (zh) | 一种pCasRA质粒及其制备方法和应用 | |
| CN110305830B (zh) | 一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌及其构建方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |