CN110305830B - 一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌及其构建方法与应用。该方法包括如下步骤：以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，将甲酰胺酶基因、亚磷酸脱氢酶基因扩增成融合基因，和抵抗噬菌体的CRISPR/Cas9质粒转化入大肠杆菌，得到所述重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌能表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白，能同时分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐，为重组大肠杆菌提供所需的氮源和磷源；而其他微生物因缺乏代谢甲酰胺和亚磷酸盐的酶，无法在含甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中生长繁殖，这可以解决大肠杆菌在工业发酵中染菌问题。其次，重组大肠杆菌能利用CRISPR/Cas9系统剪切噬菌体基因组，防止噬菌体的侵染。

Description

一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌及其构建 方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主之一，这是因为大肠杆菌基因组被研究的透彻，并且繁殖快、发酵周期短。所以，大肠杆菌在工业发酵行业中受到企业家密切关注和重视。但是，在大肠杆菌发酵过程中，染菌问题依然是企业最关注的问题。一旦染菌，不但造成经济损失、浪费原理和时间，还会给废料处理增加难度。所以，要是能找到一种方法，能解决大肠杆菌在发酵过程中被杂菌污染的问题，在促进企业的利润增长，还是对于社会的发展，将是很有意义的。
目前关于发酵染菌的研究多集中在发酵染菌的来源(途径)及相关的菌形、不同发酵阶段染菌对发酵的影响及防治措施、从设备角度的分析和防治等方面。为了降低染菌，企业一般是从提高设备要求和操作员的技术水平入手。但是，复杂的周边环境，和发酵仪器隐秘部位，都使得在发酵工程时常染菌。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供了一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌及其构建方法与应用。
所述能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌是一种既能组成型表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白，又能抵抗相应噬菌体的重组大肠杆菌。
该重组大肠杆菌能组成型表达甲酰胺酶与氧化亚磷酸脱氢酶融合蛋白基因(fmdA-linker-ptxD)，产生甲酰胺酶与氧化亚磷酸脱氢酶融合蛋白，该融合蛋白能同时分解甲酰胺生成NH4 +和氧化亚磷酸盐成为磷酸盐，为重组大肠杆菌工程菌提供生长繁殖所需要的氮源和磷源，而其它不同时具有这两条代谢途径的微生物则会由于缺乏氮源和磷源的代谢途径而被“饿死”。并且该重组菌拥有CRISPR/Cas9系统，赋予重组大肠杆菌具有抵抗相应噬菌体的能力。
本发明的目的还在于提供所述的一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌的构建方法与应用。
该构建方法以大肠杆菌DH5α工程菌为宿主，以类芽孢杆菌Paenibacilluspasaden ensis.CS0611的甲酰胺酶基因(fmdA)和肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumonia.OU7的亚磷酸脱氢酶基因(ptxD)为对象，委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司优化合成合成并带有组成型启动子的融合基因(pJ23101-fmdA-linker-ptxD)，再连接在载体pET Duet-1的多克隆位点上，并将得到的重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD转化入DH5α，提取质粒，并把PCR所得HR-pJ23119-N20-sgRNA经无缝连接进pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD，得到重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ 23119-N20-sgRNA；验证成功后，提取pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA质粒，并与质粒pCas-pJ23119-N20-sgRNA共转化入大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-J23119-N20-sgRNA)，并继续在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中培养重组大肠杆菌。
利用Linker把扩增得到的甲酰胺酶基因(fmdA)基因和亚磷酸脱氢酶基因(ptxD)连接在一起，使两个酶基因融合表达，发挥其酶催化功能，实现重组大肠杆菌在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中正常生长繁殖并使其正常行驶其功能。
本发明的目的还在于提供所述的一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌的构建方法与应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
本发明提供的一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染大肠杆菌BL31(DE3)(Strain G)，命名为Escherichia coli BL31(DE3)(Strain G)，于2019年4月15在中国典型培养物保藏中心保藏(地址：湖北省武汉市武昌路珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏编号为CCTCCNO：M2019262。
本发明提供的一种构建所述能抗杂菌污染和噬菌体侵染大肠杆菌(重组菌)的方法，包括如下步骤：
(1)人工合成含组成型启动子的甲酰胺酶和亚磷酸脱氢酶融合基因
将融合基因的组成型启动子pJ23101、密码子优化后的甲酰胺酶基因、亚磷酸脱氢酶基因及连接这两个基因的接头序列Linker连接在一起，组成融合基因pJ23101-fmdA-linker-ptxD(长度为2113bp，序列如SEQ ID NO.1所示)；
(2)抗杂菌质粒的构建
将步骤(1)人工合成得到的pJ23101-fmdA-linker-ptxD基因片段利用BsrG I和Xho I双酶切后，连接入相同酶切的pETDuet-1质粒(Novagen,Cat:71146-3)上的第二个多克隆位点，得到重组质粒pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD，并转化入大肠杆菌DH 5α，得到重组大肠杆菌DH5α(pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD)；
(3)人工合成绿色荧光蛋白基因作为报告基因
将人工合成绿色荧光蛋白基因gfp(序列如SEQ ID NO.2所示)插入pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD质粒的第一个多克隆位点，得到重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD，转化入大肠杆菌DH5α中；
(4)无缝连接pJ23119-N20-sgRNA进pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD质粒
以pTargetF-N20为模板，A1和A2为引物，其中N20为T7噬菌体DNA装配蛋白部分基因，扩增得到pJ23119-N20-sgRNA(如SEQ ID NO.4所示)，其中“ACCAATCTG AACCACTGTGT”为DNA装配蛋白基因中的20个碱基序列；PCR扩增条件为94℃反应3-5min；再依次于94-98℃反应10-15s、50-55℃反应5-30s、72℃反应80-120s，并循环30次；最后于72℃反应7-10min，最后降温至4℃保存PCR产物；利用重组酶(上海翊圣生物科技有限公司，10912ES10)无缝把得到的PCR片段连接入经Pci I单酶切后的pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD，得到重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA，并转化入大肠杆菌DH5α；
(5)CRISPR/Cas9系统质粒的构建
上下游引物C1和C2；以pCas质粒(Addgene:62225)作为模板，进行全质粒扩增，扩增的条件与步骤(3)相同，延伸时间增加到12-14min，扩增得到的DNA片段pCas-pJ23119-N20-sgRNA转化入大肠杆菌DH5α，得到重组大肠杆菌DH5α(pCas-pJ23119-N20-sgRNA)；
(6)转化表达重组菌株
从重组大肠杆菌DH5α(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA)中提取重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA，并从重组大肠杆菌DH5α(pCas-J23119-N20-sgRNA)中提取重组质粒pCas-pJ23119-N20-sgRNA；将重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA和pCas-J23119-N20-sgRNA共转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-J23119-N20-sgRNA)；
(7)培养重组大肠杆菌
将得到的重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-J23119-N20-sgRNA)接种到LB培养基中，摇瓶培养后，收集菌体并加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，继续培养重组大肠杆菌12-15小时，得到所述抗杂菌污染和噬菌体侵染大肠杆菌。
进一步地，步骤(1)所述融合基因pJ23101-fmdA-linker-ptxD的基因序列如序列表SEQ3所示，所述融合基因的长度为2113bp，位于5'端的是密码子优化后的甲酰胺酶基因，位于3'端是亚磷酸脱氢酶基因，密码子优化后的甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因两基因之间有长度为30bp的Linker连接在一起，组成融合蛋白基因。
进一步地，步骤(5)所述pCas为温度敏感型质粒，表达的Cas9蛋白和N20-sgRNA结合后，能定向结合在T7噬菌体基因组上的DNA装配蛋白基因序列，并将其剪切断，使该基因蛋白失去转录翻译成有功能的蛋白，从而使噬菌体失去侵染的能力；所述pCas质粒含有Cas9蛋白基因和DNA装配蛋白基因的20bp碱基。
进一步地，步骤(7)所述摇瓶培养为在LB培养基中，37℃条件、摇床转速为160-180rpm的状态下培养12-18小时，使大肠杆菌快速繁殖增长后；再接种于另一份LB培养基中，30℃条件、摇床转速为160-180rpm的状态下继续培养20-24h，在较低温度下是重组菌诱导表达融合基因并得到有活性的酶蛋白。
进一步地，步骤(7)所述收集菌体为将培养结束后的菌液在4℃条件、离心速率为8000-10000rpm的状态下离心5-10min后，再用预冷至4℃的盐水悬浮，再次4℃条件、离心速率为8000-10000rpm的状态下离心5-10min，重复用盐水悬浮并离心的步骤两次收集菌体。
进一步地，步骤(7)所述含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，甲酰胺的终浓度为200mM，亚磷酸盐的终浓度为1.32mM。
进一步地，步骤(7)所述收集的菌体加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中后，菌体浓度OD600为0.1-0.15。
进一步地，步骤(7)所述继续培养为在30℃条件、摇床转速为160-180rpm的状态下继续培养84-96小时。
本发明提供的能抗杂菌污染和噬菌体侵染大肠杆菌能够应用在工业发酵中。
本发明提供的一种抗杂菌污染和噬菌体侵染大肠杆菌的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)人工合成含组成型启动子的甲酰胺酶和亚磷酸脱氢酶融合基因
以类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611的甲酰胺酶基因序列和和肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7的亚磷酸脱氢酶基因序列，把Linker序列添加到甲酰胺酶基因的3'末端。添加Linker的作用是使甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶之间有10个疏水性氨基酸作为链桥作用，使两个蛋白在形成有活性的空间三维结构时，不会互相影响。并在融合基因前加上组成型启动子J23101；
(2)抗杂菌质粒(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD)的构建
以步骤(1)人工合成得到的pJ23101-fmdA-linker-ptxD片段利用BsrG I和Xho I对融合基因pJ23101-fmdA-linker-ptxD进行双酶切后，连接入相同酶切后的pETDuet-1表达质粒上，得到重组质粒pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD，并转化入大肠杆菌DH 5α，得到重组大肠杆菌DH5α(pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD)；
同时，把绿色荧光蛋白基因插入pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD质粒的第一个多克隆位点(MSC1)位置，得到pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD重组质粒，作为报告基因，用于检测系统合成外源蛋白的能力，最终得到重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD(；绿色荧光蛋白基因作为报告基因，用于检测系统合成外源蛋白的能力；
(3)无缝连接HR-pJ23119-N20-sgRNA(HR代表同源重组序列)进pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD质粒
以pTargetF-N20为模板，A1和A2为引物，其中N20为T7噬菌体DNA装配蛋白部分基因，扩增得到HR-pJ23119-N20-sgRNA；PCR扩增条件为94℃反应3-5min；再依次于94-98℃反应10-15s、50-55℃反应5-30s、72℃反应80-120s，并循环30次；最后于72℃反应7-10min，最后降温至4℃保存PCR产物；利用重组酶(上海翊圣生物科技有限公司，10912ES10)无缝把得到的PCR片段连接入经Pci I单酶切后的pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD，得到重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA，并转化入空白大肠杆菌DH5α；
(4)CRISPR/Cas9系统质粒的构建
上下游引物C1和C2；以pCas质粒作为模板，进行全质粒扩增，扩增的条件与步骤(3)相同，延伸时间增加到12-14min，扩增得到的DNA片段pCas-pJ23119-N20-sgRNA转化入空白大肠杆菌DH5α，得到重组大肠杆菌DH5α(pCas-pJ23119-N20-sgRNA)；
利用定点突变的方法，去除pCas质粒上的lac I阻遏蛋白基因序列和lac O操纵子序列，取而代之是在N20-sgRNA前端添加pJ23119组成型启动子。PCR改造后的pCas-pJ23119-N20-sgRNA转化入DH5α，得到重组大肠杆菌DH5α(pCas-pJ23119-N20-sgRNA)；
(6)转化表达重组菌株
从重组大肠杆菌DH5α(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA)中提取重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA，并从重组大肠杆菌DH5α(pCas-J23119-N20-sgRNA)中提取重组质粒pCas-pJ23119-N20-sgRNA；并将重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA和pCas-J23119-N20-sgRNA共转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-J23119-N20-sgRNA)；
(7)诱导培养重组大肠杆菌
将得到的重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-J23119-N20-sgRNA)接种到LB培养基中进行培养，摇瓶培养后，收集菌体并加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，继续培养重组大肠杆菌12-15小时，得到所述抗杂菌污染和噬菌体侵染大肠杆菌。
进一步地，步骤(1)中所述含组成型启动子(pJ23101)的融合基因，是依据类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611的甲酰胺酶基因和肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumonia.OU7的亚磷酸脱氢酶基因序列，经密码子优化后人工合成融合基因，并利用接头序列Linker(30bp)把两个基因连接在一起。含组成型启动子的融合基因总长度为2113bp，如SEQ ID NO.SEQ1所示。其中，所述类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611于2014年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M2014458和肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7于2017年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M 2017449。
进一步地，步骤(3)中所述的人工合成绿色荧光蛋白基因gfp来源于pGFP-N1质粒上，人工合成后，无缝连接入pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD质粒的第一个多克隆位点，得到重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD，转化入大肠杆菌DH5α中。
进一步地，步骤(4)中所述PCR扩增条件均为：94℃反应3-5min；再依次于94-98℃反应10-15s、50-55℃反应5-30s、72℃反应80-120s，并循环30次；最后于72℃反应7-10min，最后降温至4℃保存PCR产物。得到重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA。
进一步地，步骤(5)中所述pCas为温度敏感型质粒，表达的Cas9蛋白和N20-sgRNA结合后，能定向结合在T7噬菌体基因组上的DNA装配蛋白基因序列，并将其剪切断，使该基因蛋白失去转录翻译成有功能的蛋白，从而使噬菌体失去侵染的能力；所述pCas含有Cas9蛋白基因和DNA装配蛋白基因的20bp碱基(N20基因序列)。
进一步地，所述pCas-pJ23119-N20-sgRNA是利用定点突变的方法对原始pCas进行改造，改造得到的pCas含pJ23119-N20-sgRNA序列，得到pCas-pJ23119-N20-sgRNA质粒，约11000bp。
进一步地，步骤(7)中所述培养是在LB培养基中，37℃、160-180rpm培养12-18小时后(目的是使大肠杆菌快速生长繁殖)，再接种于另一份新配LB培养基中，于30℃条件下继续培养20-24h(目的是使表达融合蛋白形成有活性的的酶)。
进一步地，步骤(7)中所述收集菌体为将培养结束后的菌液在4℃、8000-10000rpm、离心5-10min后，再用预冷至4℃的盐水悬浮，再次4℃、8000-10000rpm、离心5-10min，重复用盐水悬浮并离心的步骤两次，以洗除残留的LB培养基，收集菌体；所述含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，甲酰胺的终浓度为200mM，亚磷酸盐的终浓度为1.32mM；步骤(7)中收集的菌体加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中后，菌体浓度OD600为0.1-0.15；所述继续诱导培养是在30℃、摇床转速为160-180rpm继续培养12-18小时。
进一步地，步骤(7)中，所述含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，甲酰胺的终浓度为200mM，亚磷酸盐的终浓度为1.32mM。
进一步地，步骤(7)中，收集的菌体加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中后，菌体浓度OD600为0.1-0.15。
进一步地，步骤(7)中，所述继续诱导培养是在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，并于30℃、摇床转速为160-180rpm继续培养12-18小时。
由上述的方法构建得到的一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌，即重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)。
本发明提供的所述一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌能够应用于大肠杆菌工业发酵合成包括抗体或者有价值的蛋白酶制剂。
MOPS培养基中缺乏基础营养成分NH4 +和HPO4 2-而添加有甲酰胺和亚磷酸盐，同时杂菌微生物不具备分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐获取营养成分的功能，使杂菌微生物缺乏氮源和磷源，使重组大肠杆菌由于具有高效的分解甲酰胺和氧化亚磷酸的功能而获得充足的营养成分而成为优势菌。
由上述方法构建得到的一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌，在MOPS培养基中能利用甲酰胺和亚磷酸盐进行生长繁殖，并且能共表达外源绿色荧光蛋白基因，合成绿色荧光蛋白(GFP)，发挥其表达外源基因的功能。
所述的一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌表达融合蛋白来高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐，并拥有抗噬菌体侵染的CRISPR/Cas系统，应用于大肠杆菌工业发酵酶促合成包括抗体或有价值的蛋白酶制剂，具有较为深远的意义。
本发明针对现有技术的大肠杆菌发酵过程染菌现象，研究从营养物质底物谱的摄取进行研究，对大肠杆菌的营养代谢途径进行改造，使改造后的大肠杆菌工程菌能表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白，该融合蛋白能分解甲酰胺产生氨作为氮源和分解氧化亚磷酸盐成为磷酸盐作为磷源，改变其氮源和磷源的来源途径，使其在特定的MOPS培养基中能正常生长，而不同时具有这两条代谢途径的杂菌微生物就会由于缺乏氮源或磷源营养物质的来源而被“饿死”。一方面，重组菌能表达融合蛋白利用甲酰胺和亚磷酸盐；另一方面，重组菌还能表达外源基因，包括抗体和其他有价值的酶制剂。同时，为验证该构建的工程菌合成外源基因的能力，还把绿色荧光蛋白基因转化入该工程菌进行共表达。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌能表达甲酰胺酶和亚磷酸脱氢酶融合蛋白，该融合蛋白能同时分解甲酰胺生成NH4 +和氧化亚磷酸盐磷酸盐成为磷酸盐，为重组大肠杆菌的正常生长繁殖提供氮源和磷源，而其他微生物由于缺乏拥有这两条途径，无法在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中生长繁殖，解决了大肠杆菌在工业发酵中染菌问题，降低了发酵设备需求，并能发挥其本来的工程菌表达外源基因的功能；
(2)本发明提供的能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌，通过基因工程的生物技术解决了大肠杆菌发酵过程中的染菌和噬菌体侵染问题，并且不会丧失作为工程菌表达外源蛋白的特性；
(3)本发明提供的能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌，应用于大肠杆菌工业发酵酶促合成包括抗体或有价值的酶制剂，使酶促合成包括抗体或有价值的酶制剂的过程高效，合成的物质纯度高，并且可以在生产发酵过程中防止杂菌微生物的入侵污染和噬菌体侵染的问题。
附图说明
图1为本发明提供的抗杂菌污染和噬菌体侵染的重组大肠杆菌的构建过程图。
图2为本发明实施例5提供的重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)在MOPS培养基中的生长曲线图。
图3为本发明实施例5提供的重组大肠杆菌BL21(DE3)(BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)在MOPS培养基中表达绿色荧光蛋白(GFP)的荧光图。
图4为本发明实施例5提供的重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)在MOPS培养基中表达外源蛋白(绿色荧光蛋白GFP)的SDS-PAGE检测结果图，其中1-5泳道为实验组BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)，6泳道为BL21(DE3)对照组。
图5为本发明实施例5中T7噬菌体侵染大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)的双层平板检测结果图。
图6为本发明实施例5中大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)抵抗T7噬菌体侵染效果的柱状图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下结合实施例及附图对本发明技术方案作进一步阐述，但所描述的内容仅用于阐述本发明，而不应当也不限制本发明。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程或参数，均是本领域技术人员可参照现有技术理解或实现的。
本发明具体实施例中采用的类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611于2014年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌路珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO.M2014458，并已完成全基因组测试，基因组中的甲酰胺酶基因的片段长度为1111bp，含Linker序列，编码347个氨基酸。
本发明具体实施例中的肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7于2017年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(湖北省武汉市武昌路珞珈山武汉大学，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO.M 2017449，且肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7为通过如下方法培养自主筛选得到，通过全基因组测试，其中的亚磷酸脱氢酶基因的片段长度为1008bp，编码336个氨基酸。
本发明具体实施例中pCas质粒为杨晟教授(中国科学院上海生命科学研究院)惠赠，具体序列参考addgene:62225。通过改造，去除质粒上的lac I和lac O序列，而添加组成型启动子pJ23119-N20-sgRNA，其中N20序列是T7噬菌体基因组上的DNA装配蛋白基因的一段20bp序列，作为靶向基因。质粒表达的Cas9蛋白和N20-sgRNA结合后，能特异性结合在入侵到大肠杆菌内的基因组，对其进行剪切，使其失去侵染能力。
实施例1
含组成型启动子的甲酰胺酶和亚磷酸脱氢酶融合基因的获取
以Paenibacillus pasadenensis.CS0611基因组中甲酰胺酶基因和Klebsiellapneumonia.OU7的亚磷酸脱氢酶基因为模板，并拟用Linker序列作为链接桥把两基因连接成融合基因。委托生工生物工程(上海)股份有限公司对甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因进行密码子优化和合成。
实施例2
抗杂菌质粒的构建(pJ23110-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA)
扩增条件如下：94℃反应3min；再依次于94℃反应10s、50℃反应5s、72℃反应2min，并循环30次；最后于72℃反应7min，最后降温至4℃保存PCR产物。以扩增得到pJ23101-fmdA-linker和ptxD片段为模板，以A1和A2分别为上游、下游引物，扩增得到HR-pJ23119-N20-sgRNA(如SEQ ID NO.3所示)。无缝连接入经Pci I单酶切后的pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD，得到重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA，并转化入重组大肠杆菌DH5α。
PCR所用的酶试剂为TaKaRa公司的
Figure BDA0002113461670000101
HS DNA Polymerase withGCbuffer；PCR反应体系及条件如下：
Figure BDA0002113461670000111
实施例3
CRISPR/Cas9系统质粒的构建
扩增条件如下：94℃反应4min；再依次于94℃反应30s、50℃反应5s、72℃反应12min，并循环30次；最后于72℃反应7min，最后降温至4℃保存PCR产物。以质粒pCas为模板，以引物C1和引物C2分别为上游、下游引物，PCR反应体系如实施例2。扩增得到改造型pCas质粒(pCas-pJ23119-N20-sgRNA)。
实施例4
重组菌BL21(DE3)(pETDuet-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)的构建
将实施例2和实施例3中得到的重组质粒pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA，并与质粒pCas-pJ23119-N20-sgRNA共转化入BL21(DE3)，得到重组菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)。
重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)同化代谢利用甲酰胺和亚磷酸盐而成为培养基中的优势工程菌，其构建过程图如图1所示，大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)由于插入了融合基因(甲酰胺酶基因+Linker+亚磷酸脱氢酶基因)，和拥有CRISPR/Cas9系统，所以改造后的大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)既能分解甲酰胺成NH4 +和氧化亚磷酸盐成磷酸盐，又能产生Cas9和N20-sgRNA对T7噬菌体基因组进行切割，使噬菌体失去侵染能力。从而能为大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)提供生长可利用的氮源和磷源，而其他杂菌微生物由于缺乏同时拥有这两条途径，所以不能生长。同时该工程菌(即所述能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌)拥有抵抗相应噬菌体的能力。
实施例5
验证重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)既能在特定MOPS培养基中的生长，又能抵抗相应的T7噬菌体侵染。
将获得的重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)进行培养，具体过程如下：将BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)按照体积比1：100接种到含有30mL的LB培养基，37℃、摇床转速为160rpm过夜培养16-18小时(这一步骤的目的是使重组菌快速生长繁殖)；传代培养，取1mL过夜培养的重组大肠杆菌接种到装有100mL新鲜的LB培养基，于30℃条件、摇床转速为160rpm继续培养16-18小时(这一步骤的目的是使重组菌在较低的温度下合成融合蛋白以折叠正确的酶分子)，然后4℃、8000rpm、离心5min收集菌体，即所述能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌；
用生理盐水(4℃预冷)悬浮收集的菌体，4℃条件、离心速率为8000rpm、离心5min收集菌体，并重复此步骤2次，洗除残留的LB培养基；再把菌体加入到含有甲酰胺(200mM)和亚磷酸盐(1.32mM)的基础MOPS培养基，使菌体OD600为0.1-0.15；培养重组大肠杆菌的条件为30℃(此温度是为工程菌在MOPS培养中的最适生长温度)、摇床转速为160rpm。
考察重组菌(所述能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌)在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中的生长情况，重组菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)在含有甲酰胺(200mM)和亚磷酸盐(1.32mM)的MOPS培养基中的生长曲线图如图2所示，由图2可知重组菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)能在该培养基中生长，培养8-10小时后，菌浓度达到最大值，A600为2.47；而对照菌株BL21(DE3)在该MOPS培养基基本没有生长。
为验证该菌在MOPS培养基中合成外源基因的表达能力，利用绿色荧光蛋白基因(gfp)对重组菌表达外源基因的能力进行验证。把gfp基因连接入pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA质粒，并与pCas-pJ23119-N20-sgRNA共转化入BL21(DE3)，形成重组菌，并且命名为BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)，得到的重组菌在含甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中诱导表达GFP。然后利用荧光倒置显微镜，激发波长为488nm，发射波长为507nm对培养发酵后的重组菌进行观察，从图3中可以看出，重组菌能在MOPS培养基正常生长，并且能表达外源绿色荧光蛋白基因。并且从图4的SDS-PAGE电泳图中可以看出，在30kDa左右得到一条明显的蛋白条带，这条带的大小与绿色荧光蛋白的大小吻合。进一步说明工程菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)能高效地合成外源蛋白的能力。
下一步，利用T7噬菌体侵染BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)，利用其在LB双层平板中噬菌斑的形成数量，来评判工程菌抗噬菌体的效率。图5中的对照组使用了T7噬菌体侵染大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，实验组使用了T7噬菌体侵染重组大肠杆菌BL21(DE3)(pETDuet-gfp-pJ23101-fmdA-linker-ptxD-pJ23119-N20-sgRNA+pCas-pJ23119-N20-sgRNA)进行实验，从图5中可以看出，工程菌能显著的抵抗T7噬菌体的侵染，其效率为能把噬菌体侵染减低一个数量级。从图6中可以看出，本发明构建的加强型的大肠杆菌能MOPS培养基中有效的抵抗5×108个T7噬菌体。
本发明构建的加强型大肠杆菌(能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌)不但能利用甲酰胺和亚磷酸盐合成氮源和磷源以供自身生长和繁殖来合成外源蛋白(如绿色荧光蛋白)，而且能有效的抵抗T7噬菌体。本发明构建的加强型大肠杆菌既能防止在培养发酵过程中杂菌的污染，而且能大大降低噬菌体的侵染，有效有效的抵抗5×108个T7噬菌体。本发明构建的加强型大肠杆菌(能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌)在工业发酵行业中具有巨大的应用潜力。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌及其构建方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2125
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 1
tgtacattga cggctagctc agtcctaggt acagtgctag ctactagaga aagaggagaa 60
atactagatg aatggtctgg gtggcctgaa caaatctccg gacggtgttg ttatcggcct 120
ggctcaactc cagctgccgg ccgtcgaaac tccggagcag ctggcggcgc aggcccgtcg 180
cattgcggaa atgaccgcta aggcacgcaa aggtagccgt agcatggatc tgatcgtttt 240
cccggaatac agcctgcacg gcctgtccat gaacaccgat ccggcgctga tgtgccgtgt 300
tgatggcccg gaagttgaac tgtggcgcga agcgtgccgt gaacatcgca tctggggctg 360
ctttagcatt atggaactga acccggatgg caacccgtac aacaccggcc tgatcattga 420
cgatgaaggt ggcatccgtc tgaaataccg caaactgcac ccgtgggttc cggtggaacc 480
gtgggaaccg ggcgacctgg gcatcccgat gtgcgacggc ccgaacggct ctcgcctggc 540
actggtgatc tgccacgacg gcatgttccc ggaaatggct cgtgaatgcg cgtacctggg 600
tgcggatatc atgctgcgta ccgcgggcta caccgcgccg atccgtcacg cgtggcaggt 660
taccaaccag gcgcacgcgt tctgcaacct gatgtatacc gcgtctgttt gcctgagcgg 720
tagcgatggc gttttcgata gcatgggcga agctatgatc gttggcttcg atggcatgac 780
cctggttcac ggcggcggtc gtccggatga aatcgttgcg ggtgaagtgc gtccgtctct 840
ggttcgtgaa gcgcgtcgta tctggggcgt tgaaaacaac ctgtaccagc tgggtcaccg 900
tggctacgtt gcggttcagg gcggcgcggg cgattgcccg tacacttaca tgcacgatct 960
ggcggcgggc cgttaccgtc tgccgtggga agatgaagtt ctgatcaaag atggtacctc 1020
tgaaggtttc ccgccgccgg aacgtcgtta cggtggcgcg aaaggcggcg cagcgcgtgg 1080
tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcgat gctgccgaaa ctggttatca cccaccgtgt 1140
tcacgatgaa atcctgcaac tgctggcgcc gcactgcgaa ctggtgacca accagaccga 1200
tagcaccctg acccgcgaag aaatcctgcg ccgttgccgt gacgcgcagg ctatgatggc 1260
gttcatgccg gatcgtgtgg atgcggattt tctgcaagcg tgcccggaac tgcgtgtggt 1320
tggctgtgcg ctgaaaggtt tcgataactt cgacgtggac gcgtgcaccg cgcgtggcgt 1380
ttggctgact ttcgtgccgg atctgctgac cgttccgacc gcggaactgg cgatcggcct 1440
ggcggttggc ctgggtcgtc acctgcgcgc ggcagatgcg ttcgttcgct ctggcgagtt 1500
ccagggctgg cagccgcaat tctatggtac cggtctggat aacgcgaccg ttggcatcct 1560
gggtatgggt gcgatcggcc tggcgatggc ggaacgtctg caaggctggg gcgcaaccct 1620
ccagtaccac gaagcaaaag cgctggatac ccagaccgag cagcgtctgg gcctgcgtca 1680
ggttgcttgc tctgaactgt ttgcgtctag cgatttcatc ctgctggcgc tgccgctgaa 1740
cgcagatacc cagcacctgg ttaacgcgga actgctggct ctggttcgtc caggcgctct 1800
gctggtgaac ccgtgccgtg gttctgtcgt ggatgaagca gcagtgctgg ctgctttaga 1860
acgtggccag ctgggcggct atgcggcgga tgttttcgaa atggaagatt gggctcgtgc 1920
ggatcgtccg cgcctgatcg acccggcgct gctggcgcac ccgaacaccc tgttcacccc 1980
gcacatcggt tctgcggttc gtgctgttcg tctggaaatc gaacgttgcg cggcgcagaa 2040
cattatccag gttctggcgg gcgcgcgtcc gatcaacgcg gcgaaccgtc tgccgaaagc 2100
ggaaccggcg gcgtgctgac tcgag 2125
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 2
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
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gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcgc 420
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ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 3
<211> 182
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 3
ccttttgctc acatgtggat ccttgacagc tagctcagtc ctaggtataa tactagtacc 60
aatctgaacc actgtgtgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt 120
tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt gaattcacat gttctttcct 180
gc 182
<210> 4
<211> 139
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 4
ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagtaccaa tctgaaccac tgtgtgtttt 60
agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac 120
cgagtcggtg ctttttttg 139

Claims (2)

1.一种能抗杂菌污染和噬菌体侵染大肠杆菌，其特征在于，于2019年4月15在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2019262。
2.权利要求1所述能抗杂菌污染和噬菌体侵染大肠杆菌在工业发酵中的应用。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107760642A (zh) * 2017-09-29 2018-03-06 华南理工大学 一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN108315288A (zh) * 2017-11-22 2018-07-24 华南理工大学 一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

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