CN101912607A

CN101912607A - 一种布鲁氏菌分子标记高免疫保护性弱毒活疫苗及构建方法

Info

Publication number: CN101912607A
Application number: CN2010102421308A
Authority: CN
Inventors: 闫广谋; 张楠; 张西臣; 李建华; 宫鹏涛; 李�赫; 杨举
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2010-08-02
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2010-12-15

Abstract

本发明提供了一种布鲁氏菌分子标记高免疫保护性弱毒活疫苗及构建方法，是对弱毒疫苗加以分子标记，减弱其毒力，用外源基因提高其免疫保护性，用血清学方法能将该疫苗接种的人和动物与野毒感染的区分开来，对布鲁氏菌病监测、诊断、净化和控制具有重要意义，具有广泛的应用实践价值。

Description

一种布鲁氏菌分子标记高免疫保护性弱毒活疫苗及构建方法

技术领域

本发明提供一种布鲁氏菌分子标记高免疫保护性弱毒活疫苗，尤其是对弱毒疫苗加以分子标记，减弱其毒力，用外源基因提高其免疫保护性，用血清学方法能将该疫苗接种的人和动物与野毒感染的区分开来。本发明还提供了该疫苗的构建方法，属于分子生物学技术与疫苗生产技术领域。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由小球杆状布鲁氏菌引起的一种人畜共患传染病，该严重危害了公共卫生安全，每年因此病造成的损失达百亿元。

当前的布鲁氏菌疫苗种类较多。重组蛋白疫苗与DNA疫苗保护性能有限，灭活疫苗保护期短。目前人和动物多用弱毒疫苗来防治该病，弱毒疫苗较前几种疫苗保护作用及效果好，但它同样存在着缺陷，致使人们不敢、不愿也不能对其广泛应用。主要原因是：其一，接种后人们无法区别自然感染和人工接种免疫。其二，毒性大。其三，也是最关键的一点是，它保护性能低。所以研制一株能用血清学方法区分人与动物是自然感染还是人工接种免疫，毒力弱、安全性能好，保护性能高的布鲁氏菌病弱毒疫苗具有重要的实践意义。

所以构建一株能区分是自然感染还是人工接种免疫，保护性能好，毒力弱的布鲁氏菌弱毒疫苗是本发明的任务。

发明内容

本发明公开一种布鲁氏菌分子标记高免疫保护性弱毒活疫苗，用血清学方法可区分自然感染或野毒感染的加上分子标记、高保护性能的布鲁氏菌弱毒疫苗，解决了常规的布鲁氏菌疫苗不能区分人与动物是人工免疫接种还是野生菌感染、保护性能低的问题。

本发明还提供了该疫苗的构建方法，建立起结核病快速诊断检测方法。

本发明的布鲁氏菌分子标记高免疫保护性弱毒活疫苗，特征在于：

该疫苗是用外源基因30KD基因代替布鲁氏菌弱毒疫苗株S19的VirB5基因，对S19加以分子标记。

本发明所述弱毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：

以布鲁氏菌的弱毒疫苗株S19为起始材料，用PCR的方法从S19的染色体中扩增出要改造的目的基因VirB5的引导序列，并把它克隆到T载体上，进行基因改造；通过分子克隆将结核杆菌外分泌蛋白30KD替换VirB5基因，再克隆到pBK-CMV上而成重组质粒pBK-VIRB5，并在pBK-VirB5加上sacB基因，最终成为同源重组载体pBVs；

用电转化法把同源重组载体pBVs转入布鲁氏菌S19中，使其线性化，而后插入受菌体S19的基因组中，并与VirB5基因发生置换；筛选出单交换子后，再筛选同源重组双交换子，即得疫苗。

本发明的积极效果在于：提供布鲁氏菌分子标记、高免疫性弱毒活疫苗，及提供基于所说的突变株疫苗的方法。这对布鲁氏菌病监测、诊断、净化和控制具有重要意义，具有广泛的应用实践价值。

附图说明

图1、在基因打靶引诱臂上，用PCR方法分别从S19基因组中扩赠出30KD基因片段电泳图，证实了30KD基因替换了virB5基因。

图2、VIRB5蛋白纯化电泳图。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。

实施例1

一、同源重组载体(自杀性质粒)的构建

1材料与方法

1.1菌株、质粒、载体布鲁氏菌S19株、DH5a、T-sacB、pBluescript SK⁺本研究室保存；pBK-CMV购自Stratagene公司；pSP-Luc NF⁺购自Promega公司；pMD18-T simplevector购自TakaRa公司。

1.2试剂限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I(Klenow大片段)，大肠杆菌DNA聚合酶I，LA-Taq DNA polymerase、1kbp DNA Ladder Marker、质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均为TaKaRa公司产品。

1.3PCR扩增

1.3.1含有VirB5基因同源重组指导序列的扩增根据VirB5基因的序列以及pMD18-Tsimple vector和pBK-CMV噬菌粒载体特点分别设计引物。从布鲁氏菌S19的基因组中扩增。

1.3.2结核杆菌30KD基因扩增设计引物从结核杆菌基因组中扩增。

1.3.3sacB基因的扩增分别设计5′端含有限制性内切酶BamH I的上游引物与含有Sal I酶切位点的下游引物。上游引物GTCGACACTCAGTACATAATAAAGGAG ACAT；下游引物GGATCCTGGGATTCAC CTTTATGTTGATAAG，以95℃预变性5min，94℃变性75s，60℃退火75s，72℃延伸90s反应条件，最后72℃延伸10min，以质粒pIP279为模板，扩增sacB基因。

1.4自杀性质粒的构建

把1.3.1中的扩增出的的基因片段(其中包含VirB5基因)，与pMD18-T相连得到重组质粒p VirB5。把1.3.3扩增出的30KD与pMD18-T相连而成重组质粒p30KD。把1.3.4扩增出sacB基因片段与pMD18-T相连而成重组质粒pSacB。最后按照设计方案组成自杀质粒pBVs。

2结果

2.1PCR扩增结果从布鲁氏菌S19株基因组扩增出含有VirB5基因；可观察到与理论值大小相符条带。

2.2质粒pBVs酶切电泳鉴定经Xho I单酶切，在7100bp左右有一电泳带，与预期值相符；经XbaI单酶切，在5400bp左右有一电泳带，与预期值相符；经EcoR I单酶切，在12000bp左右有一条带，与预期值相符。

二、布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△S19-30KD的构建

1.1试剂试剂同上。

1.2肝汤培养基取新鲜的牛肝去脂肪、筋膜后绞碎，秤取500g，加自来水1000mL与之混合，置锅中煮沸1h，过滤，加水补足原量，加入NaCl 5g，蛋白胨10g。肝汤琼脂配制：取上述肝汤培养基1000mL，加入琼脂20g，高压灭菌备用

1.3电转化

1.3.1感受态的制备取240mL对数生长前中期(OD₆₀₀＝0.15)布鲁氏菌液体培养物放入预冷的250mL离心管中，迅速将培养物置于冰水混和物中15~30min，不时的缓慢摇匀保证内容物充分冷却。然后4℃1000×g离心15min，回收细胞，倒去培养液，用冰冷10％的丙三醇重悬沉淀，以1000×g离心15min洗涤细胞3次。最后用3mL 10％的丙三醇重悬沉淀制成感受态。

1.3.2电转化操作步骤取0.5μg自杀质粒加入100μL上述制作的布鲁氏菌电转感受态中混匀，加入电击杯中，以E＝12.5kv/cm电击，然后立即加入37℃预热的1mL 的肝汤培养基中。放入摇床以37℃180r/min振荡培养24h。取出200mL涂布于含有筛选标记的肝汤琼脂平板上，3d后筛选出重组子，挑选出单菌落，进一步培养鉴定。

1.4同源重组子的筛选

1.4.1单交换子的筛选把电转化受体菌涂布在含有筛选标记(Amp 100mg/L，Kan50mg/L)的肝汤琼脂平板上，因同源重组载体上带有筛选标记基因，所以很容易的筛选出单交换子。

1.4.2双交换子的筛选将获得的同源重组单交换子液体培养3d，适当稀释，涂布于添加5％蔗糖的肝汤培养基平板上，37℃培养4d。因自杀质粒上含有sacB基因，该基因编码的果糖蔗糖酶，能将蔗糖水解为果糖并生成大相对分子量质的果聚糖，在G-细菌周质空间(极少数G+细菌的假周质空间结构)累积，导致细胞停止生长或死亡，挑取单菌落即为阳性同源重组双交换子(丢失sacB基因和抗性等载体序列)命名为：△S19-30KD。

1.5双交换子的验证

1.5.1PCR方法的验证在VirB5基因的同源臂上设计引物，同时在S19与双交换子△S19-30KD基因组中扩增目标基因片段，比较其大小。

2结果

2.1PCR法法验证同源载体pBVs插入S19染色体上与△S19-30KD双交换子正确性用PCR方法分别从S19、同源载体插入后的S19、△S19-30KD的基因组中分别扩增出不同片段，与预期目标一样。

2.2PCR方法验证改造后的virB5基因在△S19-30KD双交换子的正确性在基因打靶引诱臂上，设计一对引物，用PCR方法分别从S19基因组中扩赠出30KD基因片段。证实了30KD基因替换了virB5基因，电泳图见附图1。

2.4△S19-30KD遗传稳定性分析将△S19-30KD传至20代，用PCR验证，结果同上述(2.4PCR方法验证)。证明△S19-30KD具有遗传稳定性。

试验例1：

布鲁氏菌VIRB5蛋白基因的克隆、表达及纯化

布鲁氏菌VIRB5蛋白是一种具有强免疫原性的外周浆蛋白。使用VIRB5蛋白作为检测抗原，应该有较高的准确性。

本发明克隆了布鲁氏菌的VIRB5蛋白基因，并进行了表达，表达产物通过亲和层析进行了纯化。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与、质粒、载体

布鲁氏菌S19、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21和pET28a+本研究室保存；pMD18-Tsimple vector购自TakaRa公司。

1.1.2仪器

分光光度计Lambda 3B(UV/V/S)，Perkin-ELMER；脱色摇床TY-80B，南京大学。

1.1.3限制性内切酶及其它试剂

限制性内切酶NdeI、EcoRI、SacI、HindⅢ、SalI和T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。DNA回收试剂盒同第一章；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体购自鼎国生物公司；RNase购于华美生物工程公司；IPTG及TMB购自Sigma公司；PVDF膜为Millipore公司产品；丙烯酸胺、双甲基丙烯酞胺、低分子量蛋白Marker购自TaKaRa公司；布鲁氏菌阳性牛血清本室研制，辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG购自鼎国生物公司；金属鳌合层析介质Sepharose-4-B购自Pharmacia公司。

1.2方法

1.2.1目的基因的扩增与克隆

根据VirB5基因的序列以及pMD18-T simple vector和pET28a+表达载体的特点分别设计引物用PCR的方法从S19基因组中扩增出VirB5基因片段。重组质粒pMDVirB5送上海生工生物公司进行测序。

1.2.2重组表达质粒pETVirB5的构建

用限制性内切酶同时消化pMDVirB5与pET28a+，分别凝胶回收纯化VirB5与pET28a+基因片段。取目的片段1μL、载体3ul混合后，加10×Ligation buffer 2μl，T4 DNA连接酶。

1.2.3表达质粒转入BL21表达菌

将质粒快速转化受体菌：将1μL质粒加入到冰浴的已融化的BL21感受态细菌中，轻轻混匀。继续冰浴30min，42℃热休克90s后，立即冰浴3min。将处理过的全部感受态菌铺到预先在37℃预热的含50ug/mL的卡那霉素LB平板上，用涂布棒均匀涂布菌液，至平板表面的菌液被全部吸收。37℃孵箱过夜培养。

1.2.4融合蛋白VIRB5-His的表达。

取单个转化菌落接种到3ml含有卡那霉素(50ug/mL)的LB培养液中。于摇床中37℃，转震荡培养4h至OD₆₀₀值达0.38。取出1mL未诱导的培养物，转移到另一管中，12000转离心1min，弃上清，保留菌体作为未诱导的对照。剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L进行诱导，37℃继续震荡培养。4h后，收集菌体。

1.2.重组蛋白的亲和层析

每克菌(湿重)加入3ml裂解缓冲液(pH7.920mmol/L Tris-HCl，5mmol/L imidazole，0.5mmol/L NaCl)，重悬细菌沉淀。按每毫升裂解缓冲液加入10μl MgSO₄(1mol/L)，10μlDnase(2mg/mL)，2μl PMSF(50mmol/L)的比例，加入上述三种试剂，冰上孵育30min 5000转离心15min收集沉淀，按每克菌湿重加入5ml结合缓冲液的比例，将沉淀用结合缓冲液重悬，-70℃放置过夜。将-70℃放置的菌液冰上融化后，超声破碎菌体。5000rpm，4℃离心15min，收集上清。-70℃保存或立即用于纯化。

将待纯化的样品加到金属鳌合的柱中，并以最佳流速让其流过柱床。加入洗脱缓冲液，待紫外监测仪数值上升时开始接样，随数值上升可分段接样。直到数值回落后一段时间停止接样。

2结果

2.1VirB5基因的扩增与克隆

用PCR方法从布鲁氏菌基因组中扩增与VirB5理论大小值相符把目标基因克隆到T载体上，提取质粒，与环形pMDVirB5理论大小值相符。

2.2VirB5蛋白在大肠杆菌BL21中表达及SDS-PAGE分析

把重组质粒pETVirB5转化到大肠杆菌BL21中，挑选阳性克隆，培养到OD₆₀₀＝0.38时，加入IPTG到最终浓度1mmol/L，分别诱导2、3、4小时，观察VirB5蛋白在大肠杆菌BL21中表达情况，分析认为诱导4个小时的表达量最高。

2.4融合蛋白亲合层析纯化

SDS-PAGE分析纯化的VIRB5蛋白可见只有一条带，如附图2所示，凝胶薄层扫描分析纯度为89％。

实验例2

△S19-30KD分子标记功能的验证

用纯化的VIRB5蛋白可以区别开野毒株感染与△S19-30KD接种动物。为了进一步验证这一理论，用S19与△S19-30KD接种小鼠实验，而后验证。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

布鲁氏菌S19本研究室保存；△S19-30KD见前述。

1.1.2ELISA试剂配制：

(1)包被液碳酸盐缓冲液

Na₂CO₃(无水碳酸钠)1.6g，NaHCO₃(碳酸氢钠)2.9g，加去离子水至1000mL。

(2)洗涤液pH9.2磷酸盐缓冲液(Tween-20)

Na₂HPO₄ 12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，NaCl 18g，吐温-20 0.5mL加去离子水至1000mL

(3)甲液0.1mol/L柠檬酸4.2g/200mL，乙液0.2mol/L Na₂HPO₄·12H₂O 14.3g/200mL，取甲液24.3mL与乙液25.7mL混合，临用前加20mg邻苯胺(OPD)，加过氧化氢(H₂O₂)0.02mL。

(4)终止液2mol/L H₂SO₄溶液取分析纯浓硫酸110mL，加去离子水至100mL。

1.1.3实验动物

昆明鼠购自长春市生物制品所

1.2方法

1.2.1布鲁氏菌接种小鼠前的处理

用PBS洗两次，然后用生理盐水稀释到1万/mL。

1.2.2实验小鼠的接种

把布鲁菌S19与△S19-30KD培养到对数生长期，用生理盐水洗涤三次；用生理盐水稀释到目的浓度；对小鼠采用腹腔注射。

1.2.3被检动物血清的制备

对用S19与△S19-30KD免疫14天的小鼠断尾采血，血样在4℃冰箱放置3个小时后，5000rpm离心5min，取上清即为制备血清。

1.2.4检测方法

(1)ELISA检测：按常规方法进行，将纯化的目的蛋白稀释到10ng/mL后包被酶标板，用被检动物血清1∶300稀释作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 1∶3000稀释作为二抗。同时用标准阴性和标准阳性血清作对照。

(2)操作过程：用微量移液器向每个孔内加100μL包被液稀释的蛋白样品，置湿盒内于37℃恒温培养箱中1h，然后于4℃冰箱中包被过夜。次日，用洗涤液洗涤二次，甩去洗涤液，倒置在纱布上轻轻拍扣使孔内的液体充分流出，每次间隔3min。向孔内分别加入用稀释液稀释好的1∶100阳性血清、阴性血清0.1mL，置湿盒内于37℃恒温箱中反应1h后，甩去血清，用上面的方法洗涤3次，再加入稀释好的1∶200酶标记兔抗牛IgG 0.1mL，置于湿盒内于37℃恒温箱静置，甩去残留的酶标记物溶液，以同法洗涤三次。加入底物溶液100μL/mL，置湿盒内于37℃恒温箱中静置30min，取出后立即向孔内加入0.02mL终止液，终止反应。

(3)结果判定：将培养板放入分光光度计读取450吸收波的OD值。

2结果：

用VIRB5蛋白区分接种10万S19与△S19-30KD菌体，7d后的小鼠

将纯化的VIRB5蛋白作抗原，用ELISA法检测S19与△S19-30KD接种的小鼠血清中是否含有VIRB5蛋白的抗体，很易容区分S19和△S19-30KD接种的小鼠。具体ELISA读数如下表。从表中数据可以明显分辨出S19与△S19-30KD接种的差异。证实了△S19-30KD具有分子标记功能。

S19与△S19-30KD接种小鼠7d后ELISA检测血清结果

Claims

1.一种布鲁氏菌分子标记高免疫保护性弱毒活疫苗，特征在于：

2.根据权利要求1所述弱毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：

用电转化法把同源重组载体pBVs转入布鲁氏菌S19中，使其线性化，而后插入受菌体S19的基因组中，并与VirB5基因发生置换；筛选出单交换子后，再筛选同源重组双交换子，即得。