CN105367632B - 两种金黄色葡萄球菌蛋白抗原及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体地，本发明涉及金黄色葡萄球菌铁调节表面决定蛋白B(IsdB)的三种截短型蛋白和一种金黄色葡萄球菌α‑溶血素(α‑hemolysin，Hla)减毒型蛋白，以及其编码基因，制备方法和应用。本发明还涉及所述三种截短型蛋白与一种α‑溶血素减毒体的联合应用。

Description

两种金黄色葡萄球菌蛋白抗原及其制备和应用
技术领域
本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体地，本发明涉及金黄色葡萄球菌铁调节表面决定蛋白B(IsdB)的三种截短型蛋白和一种金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hemolysin，Hla)减毒型蛋白，以及其编码基因，制备方法和应用。本发明还涉及所述三种截短型蛋白与一种α-溶血素减毒体的联合应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为革兰氏阳性球菌，属细球菌科、葡萄球菌属。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽孢和鞭毛，大多数无荚膜。
金黄色葡萄球菌在自然界中分布广泛，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，并且在人体中主要存在于皮肤、粘膜，特别是鼻咽部粘膜，30％～80％的人群为该病原菌的携带者，并且食品受其污染的机会很大。据美国疾病控制中心报道，由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中毒占所有细菌性食物中毒事件的33％。我国每年也有很多由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件。
金黄色葡萄球菌在食品污染病例中占据着十分重要的位置，同时也是医院临床感染的主要病原菌。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的临床感染位居所有临床感染病例的第二位，仅次于大肠杆菌。被金黄色葡萄球菌感染可引起化脓性炎症、肺炎、脑炎、心内膜炎等，严重者可导致菌血症、败血症，甚至继发死亡。其中，金黄色葡萄球菌引起的急性化脓性肺部感染占医院内获得性肺炎病例的10％～30％，其病情重，病死率高。
感染金黄色葡萄球菌，通常可选用红霉素、新型青霉素、庆大霉素、万古霉素或先锋霉素Ⅵ治疗，但由于抗生素的滥用，出现多种耐受抗生素的新菌株，特别是耐甲氧西林菌株的迅速蔓延使得单纯依靠抗生素治疗金黄色葡萄球菌引发的相关疾病变得越来越不可靠。
因此，金黄色葡萄球菌疫苗的研究成为全球热点。为此，国内外研究者为研制有效的金黄色葡萄球菌疫苗做了许多的探索与研究。近年来国内外研究成果表明，基因工程亚单位疫苗由于具有大剂量高纯度的抗原、无遗传物质、无宿主和培养基成分等优点，在传染病的免疫预防中应用较为广泛。
金黄色葡萄球菌疫苗的研究主要集中在影响其致病力的毒力因子上。国内外学者利用体外培养和动物模型对金黄色葡萄球菌的致病因子进行研究，寻找可能作为适宜的金黄色葡萄球菌疫苗的候选者。金黄色葡萄球菌通过产生溶血素、凝固酶、杀白细胞素等多种致病因子引起人和动物的多种疾病，其中α-溶血素(Hla)和铁调节表面决定蛋白B(IsdB)是两种重要的致病因子。
α-溶血素
α-溶血素是由金黄色葡萄球菌分泌的一种外毒素，它属于中空形状的β—桶结构细菌毒素家族，其编码基因为hla，位于金黄色葡萄球菌基因组上。研究表明hla缺陷型金黄色葡萄球菌突变体的致病力明显下降，并且金黄色葡萄球菌中Hla的表达水平与菌体致病力直接相关。
Hla蛋白分子量为33kDa，等电点为8.5，在水中溶解度高，在pH5～9范围内稳定。溶血素对多种哺乳动物红细胞有溶血作用，其机理为毒素分子插入红细胞的细胞膜疏水区，形成微孔，破坏膜的完整性，而造成细胞融解。Hla具有良好的抗原性，经甲醛处理可制成类毒素。
虽然Hla因其在多种金黄色葡萄球菌中高度保守的氨基酸序列、良好的免疫原性和针对金黄色葡萄球菌攻击能够提供良好保护的能力而成为金黄色葡萄球菌蛋白疫苗组分的重要候选蛋白。但是需要注意的是，Hla本身是金黄色葡萄球菌的毒力蛋白，需要减毒后才能用作疫苗组分。
铁调节表面决定蛋白B(IsdB)
铁元素是各种细胞进行新陈代谢等生物过程所必须的元素，但是，只有游离铁才能与生物分子发生反应。在脊椎动物中，铁通常能够在血红素上分离出来，而血红素又大多数结合在了氧的运输者——血红蛋白分子。只有从血红蛋白上分离出游离的铁离子才能够将其用于各种生物反应中。
金黄色葡萄球菌中有一个铁调节表面决定系统(Isd)，该系统能够编码与血红素中铁元素的捕获有关的一系列蛋白。这些蛋白能够从血红蛋白上分离出血红素，并将其转运至细胞膜内，最后从中得到游离铁元素。
金黄色葡萄球菌铁调节表面决定蛋白B(IsdB)是表达在金黄色葡萄球菌细胞表面的72kDa的蛋白，序列全长具有645个氨基酸。它的作用是从血红蛋白上捕获和运输血红素铁。由于哺乳动物的血液和组织中的低铁环境，因此IsdB在体内发病作用中非常重要。无论是在甲氧西林耐药性还是甲氧西林敏感性的金黄色葡萄球菌分离株中，IsdB蛋白序列均表现出高度的保守性。
但是由于IsdB天然蛋白的分子量过大，其在大肠杆菌基因工程表达体系中表达量小，后续纯化步骤难度较大。
发明内容
发明人在Hla天然序列的基础上，通过氨基酸突变而得到了在毒性降低的同时依然能诱导出有效的高滴度抗体的减毒型Hla蛋白。这种减毒型Hla蛋白不具有溶血性并保持了良好的免疫原性，从而可作为疫苗组分用于金黄色葡萄球菌的预防和治疗。
发明人还通过减小IsdB蛋白的分子量大小而达到增大蛋白表达量、降低蛋白纯化难度的目的，并最终获得了三种截短型IsdB蛋白：IsdB614(全长IsdB蛋白的第42位至第614位氨基酸)、IsdB639(全长IsdB蛋白的第42位至第639氨基酸)、IsdB645(全长IsdB蛋白的第42至第645位氨基酸)。这三种截短型IsdB蛋白具有与天然IsdB蛋白类似的活性，并且表达量大，可以作为疫苗组分用于金黄色葡萄球菌的预防和治疗。
出人意料地，发明人还发现所得到的减毒型Hla蛋白与所述三种截短型IsdB蛋白中的一种或多种联合使用时，具有协同效应，比单独使用一种组分时更好地抑制金黄色葡萄球菌的入侵，从而更好地用于金黄色葡萄球菌的预防和治疗。
在第一个方面，本发明提供了一种金黄色葡萄球菌α-溶血素减毒型蛋白，其核苷酸序列的第35位氨基酸由组氨酸突变为亮氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，下文简称为HlaM35。
在第二个方面，本发明提供了一种金黄色葡萄球菌铁调节表面决定蛋白B(IsdB)的截短型蛋白，所述截短型蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11。
在本文中，氨基酸序列为SEQ ID NO:7的截短型蛋白称为IsdB614，其具有IsdB蛋白全长氨基酸序列的第42-614位氨基酸；氨基酸序列为SEQ ID NO:9的截短型蛋白称为IsdB639，其具有IsdB蛋白全长氨基酸序列的第42-639位氨基酸；氨基酸序列为SEQ ID NO:11的截短型蛋白称为IsdB645，其具有IsdB蛋白全长氨基酸序列的第42-645位氨基酸。
在第三方面，本发明提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码本发明第一方面的金黄色葡萄球菌α-溶血素(Hla)减毒型蛋白或本发明第二方面的金黄色葡萄球菌铁调节表面决定蛋白B(IsdB)的截短型蛋白。
优选地，所述核苷酸序列经密码子优化用以适于在大肠杆菌中高效表达。
在一个优选实施方案中，所述编码第一方面的金黄色葡萄球菌α-溶血素(Hla)减毒型蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。在一个优选实施方案中，所述编码第二方面的IsdB614的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。在一个优选实施方案中，所述编码第二方面的IsdB639的核苷酸序列为SEQ ID NO:10。在一个优选实施方案中，所述编码第二方面的IsdB645的核苷酸序列为SEQ ID NO:12。
在第四方面，本发明提供了一种重组表达载体，其包含本发明第三方面的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与表达载体的表达控制序列可操作地连接。
在本发明的一个优选实施方案中，所述表达载体是PET20b。
在第五方面，本发明提供一种重组细胞，其包含本发明第三方面的核苷酸序列或本发明第四方面的重组表达载体。所述重组细胞可以是真核细胞或原核细胞。在本发明的一个优选实施方案中，所述重组细胞是大肠杆菌细胞。
在第六方面，本发明提供了一种制备蛋白的方法，其包括将本发明第三方面的核苷酸序列插入表达载体并使所述核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接，然后将所得的重组表达载体导入生物体使所述核苷酸序列表达并分离和纯化。
在一个优选实施方案中，所述表达载体为PET20b。
在一个优选实施方案中，所述生物体为大肠杆菌。
在一个优选实施方案中，纯化蛋白的方法为亲和层析法、离子交换层析法和/或凝胶过滤层析法。
在第七方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含本发明第一方面的金黄色葡萄球菌α-溶血素减毒型蛋白和一种以上本发明第二方面的截短型蛋白。
优选地，所述疫苗组合物还包含佐剂。
在本发明的优选实施方案中，所述佐剂为弗式佐剂或铝佐剂。
在第八方面，本发明提供了联合疫苗组合物，所述联合疫苗组合物包含本发明第一方面的金黄色葡萄球菌减毒型α-溶血素蛋白和一种以上本发明第二方面的截短型IsdB蛋白，其中所述减毒型α-溶血素蛋白和一种以上截短型IsdB蛋白单独分开使用，单独同时使用或混合使用。
单独分开使用是指所述减毒型α-溶血素蛋白和一种以上截短型蛋白包含在不同的疫苗组合物中，并且不同时给予受试者。给予不同疫苗组合物的间隔时间可以是2-60分钟，1-24小时或2-6天。
单独同时使用是指所述α-溶血素减毒型蛋白和一种以上截短型IsdB蛋白包含在不同的疫苗组合物中，并且同时给予受试者。本领域技术人员知道在实际操作中，难以精确地同时给予小鼠两种不同的疫苗组合物。如果所述不同的疫苗组合物的给予的间隔时间小于2分钟，也被认为是同时给予了受试者。
混合使用是指所述减毒型α-溶血素蛋白和一种以上截短型IsdB蛋白混合在同一疫苗组合物中，一起给予受试者。
当所述减毒型α-溶血素蛋白和一种以上截短型IsdB蛋白混合在同一疫苗组合物时，优选地，所述联合疫苗组合物还包含佐剂。当所述减毒型α-溶血素蛋白和一种以上截短型IsdB蛋白混合在不同的疫苗组合物时，所述不同的疫苗组合物优选分别包含佐剂。在本发明的优选实施方案中，所述佐剂为弗式佐剂或铝佐剂。
在第九方面，本发明提供了本发明第一方面的金黄色葡萄球菌α-溶血素的减毒型蛋白和/或本发明第二方面的金黄色葡萄球菌铁调节表面决定蛋白B(IsdB)的截短型蛋白在制备用于预防或治疗受试者中由金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的用途。
优选地，所述药物为疫苗。
优选地，所述受试者是哺乳动物。在一个实施方案中，所述受试者是小鼠。更优选地，所述受试者是人。
优选地，所述金黄色葡萄球菌是ATCC登录号为BAA-1556的金黄色葡萄球菌毒株和/或ATCC登录号为10832的金黄色葡萄球菌毒株WOOD46。
附图说明
图1示出了六种目标蛋白表达质粒的酶切鉴定结果。图1-1示出了表达质粒PET20b-HlaWT的酶切鉴定结果，其中Lane 1：DNA marker；Lane 2：质粒PET20b-HlaWT；Lane3：Nde I/Xho I酶切PET20b-HlaWT质粒。图1-2示出了表达质粒PET20b-HlaM35的酶切鉴定结果，其中Lane1：质粒PET20b-HlaM35；Lane 2：Nde I/Xho I酶切PET20b-HlaM35质粒；Lane3：1kb marker。图1-3示出了表达质粒PET20b-全长IsdB的酶切鉴定结果，其中Lane1:质粒PET20b-全长IsdB；Lane2:Nde I/Xho I酶切质粒PET20b-全长IsdB；Lane3:DNA marker。图1-4示出了表达质粒PET20b-IsdB614的酶切鉴定结果，其中Lane1:质粒PET20b-IsdB614；Lane2:Nde I/Xho I酶切质粒PET20b-IsdB614；Lane3:DNA marker。图1-5示出了表达质粒PET20b-IsdB639的酶切鉴定结果，其中Lane1:DNA marker；Lane2:质粒PET20b-IsdB639；Lane3:Nde I/Xho I酶切质粒PET20b-IsdB639。图1-6示出了表达质粒PET20b-IsdB645的酶切鉴定结果，其中Lane1:质粒PET20b-IsdB645；Lane2:Nde I/Xho I酶切质粒PET20b-IsdB645；Lane3:DNA marker。
图2示出了六种目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达结果及纯化结果。图2-1示出了蛋白HlaWT和HlaM35的表达结果，其中Lane 1：HlaM35表达菌诱导前；Lane 2：HlaM35表达菌诱导后；Lane 3：HlaWT表达菌诱导前；Lane 4：HlaWT表达菌诱导后；Lane 5：蛋白marker。图2-2示出了蛋白全长IsdB和IsdB614的表达结果，其中Lane 1：表达菌诱导前；Lane 2：全长IsdB表达菌诱导后；Lane 3、4：IsdB614表达菌诱导后；Lane 5：蛋白marker。图2-3示出了蛋白IsdB639的表达结果，其中Lane 1：表达菌诱导前；Lane 2、3：IsdB639表达菌诱导后；Lane 4：蛋白marker。图2-4示出了蛋白IsdB645的表达结果，其中Lane 1：表达菌诱导前；Lane 2、3：IsdB645表达菌诱导后；Lane 4：蛋白marker。图2-5示出了蛋白HlaWT和HlaM35的纯化结果，其中Lane 1：蛋白marker；Lane 2：蛋白HlaM35；Lane 3：蛋白HlaWT。图2-6示出了蛋白全长IsdB、IsdB614、IsdB639和IsdB645的纯化结果，其中Lane 1：蛋白marker；Lane 2：蛋白全长IsdB；Lane 3：蛋白IsdB614；Lane 4：蛋白IsdB639；Lane 5：蛋白IsdB645。
图3示出了用HlaM35、IsdB614、IsdB639和IsdB645分别免疫小鼠后，诱导出的抗体的滴度。图3-1示出了用HlaM35作为抗原免疫小鼠后诱导出的抗体的滴度。图3-2示出了用IsdB614、IsdB639和IsdB645分别作为抗原免疫小鼠后诱导出的抗体的滴度。
图4示出了HlaWT和HlaM35的溶血性鉴定以及HlaM35诱导出的多抗血清对HlaWT溶血性的中和作用。图4-1示出了HlaWT和HlaM35的毒性鉴定结果。图4-2示出了HlaM35诱导出的多抗血清对HlaWT的溶血性的中和作用。
图5示出了HlaM35、IsdB639和HlaM35+IsdB639作为疫苗组分的保护作用。图5-1示出了与弗氏佐剂一起免疫，用USA300(ATCC登录号BAA-1556)攻毒后小鼠的生存率；图5-2示出了与铝佐剂一起免疫，用USA300攻毒后小鼠的生存率；图5-3示出了与弗氏佐剂一起免疫，用WOOD46(ATCC登录号:10832)攻毒后小鼠的生存率；图5-4示出了与铝佐剂一起免疫，用WOOD46攻毒后小鼠的生存率。
图6示出了HlaM35与IsdB614或IsdB645联合作为疫苗组分的保护作用。图6-1示出了HlaM35联合IsdB614免疫，用USA 300(ATCC登录号BAA-1556)(左图)和WOOD46(ATCC登录号:10832)(右图)腹腔攻毒后小鼠的生存率；图6-2示出了HlaM35联合IsdB645免疫，用USA300(左图)和WOOD46(右图)腹腔攻毒后小鼠的生存率。
具体实施方式
通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。应当理解的是，除非另有说明，下述各实施例中所用到的仪器设备均为本领域的常规设备；除非另有说明，所使用的培养基均为市售可得的常规培养基，本领域技术人员均熟知其中的成分及含量。
实施例
实施例1：编码金黄色葡萄球菌α-溶血素减毒型蛋白的核苷酸序列的合成及包含其的克隆的获得
网络检索获得天然金黄色葡萄球菌α-溶血素的氨基酸序列(GenBank登录号:AAA26598.1)，如SEQ ID NO:1所示。对该序列进行下述修改：第35位上的组氨酸(His,H)置换为亮氨酸(Leu,L)，从而获得如SEQ ID NO:3所示的金黄色葡萄球菌α-溶血素突变体(HlaM35)的氨基酸序列。
选择大肠杆菌偏爱的密码子对编码HlaM35氨基酸序列的核苷酸序列进行优化，化学合成得到序列为SEQ ID NO:4的核苷酸序列。在SEQ ID NO:4的核苷酸序列上游加入NdeI，下游加入Xho I酶切位点。从而获得用于蛋白表达的核苷酸序列。
将获得的测序鉴定正确的核苷酸序列以Nde I和Xho I双酶切后，与经同样双酶切的表达载体PET20b(购自Novagen公司)，用T4连接酶(购自NEB)连接，然后转化大肠杆菌top10(购自Takera公司)，涂布在含有浓度为50ug/ml的氨苄抗生素的LB平板上，挑取阳性克隆，在10ml含有50ug/ml浓度的氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃下培养12小时，收集菌液，提取质粒，用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ对质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图1-2所示。对酶切鉴定正确的质粒进行测序，挑选包含具有测序正确的HlaM35基因的质粒PET20b-HlaM35的克隆。
实施例2.编码天然金黄色葡萄球菌α-溶血素(HlaWT)的核苷酸序列的获得及包含其的克隆的获得
设计引物，用PCR的方法,以如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为模板进行突变，得到如SEQ ID NO:2所示的编码HlaWT的核苷酸序列。
突变引物如下：
HlaWT-1:
5’-CGATAAAGAAAACGGTATGCACAAGAAAGTTTTCTACTCTTTCA-3’
HlaWT-2:
5’-TGAAAGAGTAGAAAACTTTCTTGTGCATACCGTTTTCTTTATCG-3’
PCR体系：1μl(10ng)上文获得的PET 20b-Hla M35质粒模板DNA，突变引物HlaWT-1和HlaWT-2各2μl(浓度为0.5μM)，dNTP 1μl，0.5μl Pfu Turbo DNA聚合酶(2.5U/μl，购自Takera公司)，10×反应缓冲液5μl，去离子水38.5μl，总体积50μl。
突变PCR条件：95℃预热5min；95℃，1min，58℃，1min，68℃6min，共18个循环。
PCR反应结束后，在50μl体系中加入1μl Dpn I(购自Takera公司)消化2-3小时，取1μl消化产物转化大肠杆菌TOP10，涂布在含有浓度为50ug/ml的氨苄抗生素的LB平板上，挑取阳性克隆，在10ml含有50ug/ml浓度的氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃下培养12小时，收集菌液，提取质粒，用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ对质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图1-1所示。对酶切鉴定正确的质粒进行测序，挑选包含具有测序正确的HlaWT基因的质粒PET20b-HlaWT的克隆。
实施例3.编码全长IsdB蛋白的核苷酸序列的合成及包含其的克隆的获得
网络检索获得金黄色葡萄球菌铁调节表面决定蛋白B(IsdB)的氨基酸序列，如SEQID NO:5所示。
选择大肠杆菌偏爱的密码子对编码IsdB氨基酸序列的核苷酸序列进行优化，化学合成得到SEQ ID NO:6的编码IsdB的核苷酸序列。在SEQ ID NO:6的核苷酸序列上游加入Nde I，下游加入Xho I酶切位点。从而获得可以用于蛋白表达的核苷酸序列。
将获得的测序鉴定正确的核苷酸序列以Nde I和Xho I双酶切后，与经同样双酶切的表达载体PET20b(购自Novagen公司)，用T4连接酶(购自NEB)连接，然后转化大肠杆菌top10(购自Takera公司)，涂布在含有浓度为50ug/ml的氨苄抗生素的LB平板上，挑取阳性克隆，在10ml含有50ug/ml浓度的氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃下培养12小时，收集菌液，提取质粒，用限制性内切酶Nde I和Xho I对质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图1-3所示。对酶切鉴定正确的质粒进行测序，挑选包含具有测序正确的IsdB基因的质粒PET20b-IsdB的克隆。
实施例4.编码IsdB截短型蛋白IsdB614、IsdB639、IsdB645的核苷酸序列的获得及包含其的克隆的获得
以表达质粒PET20b-IsdB为模板，以如下所示的引物，用PCR方法得到如SEQ IDNO:8所示的IsdB614的核酸序列，
IsdB614-1:
5’-ATATATGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCATGCTGAAGAGACCGGCG-3’
IsdB614-2:
5-ATATATGGATCCCTCGAGTTAACCCGTCTGTGGCAGAG-3’；
以表达质粒PET20b-IsdB为模板，以如下所示的引物，用PCR方法得到如SEQ IDNO:10所示的IsdB639的核酸序列，
IsdB639-1:
5’-ATATATGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCATGCTGAAGAGACCGGCG-3’
IsdB639-2:
5’-ATATATGGATCCCTCGAGTTACAGAACGAACGCCACG-3’；
以表达质粒PET20b-IsdB为模板，以如下所示的引物，用PCR方法得到如SEQ IDNO:12所示的IsdB645的核酸序列，
IsdB645-1:
5’-ATATATGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCATGCTGAAGAGACCGGCG-3’
IsdB645-2:
5’-GAATCCCTCGAGCTATCAT-3’；
PCR体系：1μl(10ng)上文获得的PET20b-IsdB质粒模板DNA，相应的各突变引物1和突变引物2各2μl(浓度为0.5μM)，dNTP 1μl，0.5μl Pfu Turbo DNA聚合酶(2.5U/μl，购自Takera公司)，10×反应缓冲液5μl，去离子水38.5μl，总体积50μl。
突变PCR条件如表1所示：
表1 PCR条件设置
将PCR产物以Nde I和Xho I双酶切后，与经同样双酶切的表达载体PET20b(购自Novagen公司)，用T4连接酶(购自NEB)连接，然后转化大肠杆菌top10(购自Takera公司)，涂布在含有浓度为50ug/ml的氨苄抗生素的LB平板上，挑取阳性克隆，在10ml含有50ug/ml浓度的氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃下培养12小时，收集菌液，提取质粒，用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ对质粒进行酶切鉴定，
IsdB614、IsdB639和IsdB645的酶切鉴定结果分别如图1-4、1-5和1-6所示。对酶切鉴定正确的质粒进行测序，分别挑选包含具有测序正确的各基因的质粒PET20b-IsdB614、PET20b-IsdB639和PET20b-IsdB645的克隆。
实施例5：蛋白的表达和纯化
1.在宿主菌中表达目的基因：
实验组：将实施例1-4获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自Takera公司)。用含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板筛选。挑取单菌落接种于5ml LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中，37℃振荡培养复苏过夜。次日取50μl过夜培养物接种于5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中。30℃振荡培养约3小时，至OD600≈0.4至0.6时，添加终浓度1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃下诱导表达5-6小时，4℃下以6000rpm离心10分钟收集细胞沉淀，弃上清。
对照组：除不加入IPTG之外与实验组均相同。
用SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白的表达，表达情况很好。SDS-PAGE的结果如图2-1、2-2、2-3和2-4所示。
2.扩大表达：
实验组：将蛋白表达量高的克隆，接种于5ml LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中，37℃振荡培养复苏过夜。次日取50μl过夜培养物接种于5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中。30℃振荡培养约3小时，至OD600≈0.4至0.6时，添加终浓度1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃下诱导表达5-6小时，4℃下以6000rpm离心10分钟收集细胞沉淀，弃上清。对照组：除不加入IPTG之外与实验组均相同。
3.目的表达产物的分离纯化：
将细胞沉淀重悬于细菌裂解液(50mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH8.0)中；冰浴下超声破碎15min；在4℃下以10000rpm离心30min；取上清，以0.45μm微孔滤膜过滤后，用Ni-NTA柱(购自GE)进行亲和层析。首先以50mM Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液平衡镍柱，将上清上样到镍柱中，用洗脱液(包含50-500mM咪唑的50mMTris-HCl(pH8.0))进行梯度洗脱，收集各梯度洗脱液。将洗脱液进行SDS-PAGE电泳。纯化的HlaM35和HlaWT的电泳结果如图2-5所示，纯化的IsdB、IsdB614、IsdB639、IsdB645的电泳结果如图2-6所示。结果表明获得的纯化的HlaM35比HlaWT更多，并且获得的纯化的IsdB614、IsdB639、IsdB645都比IsdB更多。
所获得HlaM35、IsdB614、IsdB639、IsdB645的蛋白纯度很高，可以用于后续实验。目标蛋白的表达情况见SDS-PAGE电泳图2-1、2-2、2-3和2-4，目标蛋白的纯化情况见SDS-PAGE电泳图2-5和2-6。
发明人也应用离子交换层析和凝胶过滤层析法对目的蛋白进行了分离纯化。得到的蛋白纯度也很高，可以用于后续实验(数据未示出)。
结论：通过该实施例的实验，可以获得大量纯度达到95％以上的目标蛋白。
实施例6：HlaM35和IsdB614、IsdB639、IsdB645的免疫原性
用实施例5纯化得到的HlaM35、IsdB614、IsdB639和IsdB645分别免疫6周龄雌性BALB/c小鼠(购自长春生物制品研究所)。每组实验使用10只小鼠。第一天进行初次免疫，蛋白剂量为20微克/只，与同体积完全弗氏佐剂混合均匀，然后皮下免疫小鼠；第14天进行加强免疫，蛋白剂量为20微克/只，与同体积不完全弗氏佐剂混合均匀，然后皮下免疫小鼠；第28天重复进行加强免疫，免疫剂量和佐剂与第一次加强免疫相同。末次免疫14天后取血，使用免疫所用的蛋白(即分别为HlaM35、IsdB614、IsdB639和IsdB645)包板，使用酶联免疫吸附试验检测血清中的抗体水平。
结论：如图3-1和3-2所示，HlaM35、IsdB614、IsdB639和IsdB645都能诱导出相当滴度的抗体，说明氨基酸减毒突变后获得的HlaM35和IsdB全长蛋白截短后获得的蛋白IsdB614、IsdB639、IsdB645都具有很好的免疫原性。
实施例7：HlaWT和HlaM35的毒性鉴定以及HlaM35诱导出的多抗血清对HlaWT溶血性的中和作用
1.溶血性实验检测蛋白毒性：
1)取0.05g乙二胺四乙酸二钠(国药集团)作为抗凝剂加入到50ml离心管中，用9ml生理盐水溶解，轻摇，使其彻底混匀；
2)取1ml新鲜兔血加入上述50ml离心管中，轻轻混匀，配成10％全血溶液；
3)室温下以1000rpm离心10min，用枪吸出上清液并记录吸出的体积(注意不要吸出血细胞)，吸完后沿管壁缓慢加入与吸出的体积相等体积的生理盐水，温和混匀；
4)室温下以1000rpm离心10min，仍旧吸出上清后再次加入等体积生理盐水；
5)共5个实验组，分别加入终浓度为200μg/ml的HlaM35、终浓度为50μg/ml的HlaWT、终浓度为5μg/ml的HlaWT、终浓度为0.5μg/ml的HlaWT、终浓度为0.05μg/ml的HlaWT，阴性对照组不加任何蛋白，阳性对照组与阴性对照组成分一致(注：阳性对照组样品先反复冻融三次，再超声破碎5min，以使得血细胞全部破碎裂解)。然后温和混匀。37℃下孵育1小时。每个实验组和对照组做3次平行试验。
6)将孵育后的溶液以1000rpm的转速离心5min，然后取上清检测其中血红蛋白的浓度。
采用长春汇力生物技术有限公司生产的血红蛋白测定试剂盒利用叠氮高铁法测定样品中血红蛋白的含量：
①配制工作试剂：取试剂盒中浓缩试剂1ml加入蒸馏水24ml，混匀；
②按照说明书进行加样到新的离心管中，充分混合样品，室温放置3min后，分别取100μl样到96孔板中，然后用分光光度计测定在550nm处的吸光度值。
③根据公式C样＝A样/A标*C标(C样为测定样的浓度，A样为测定样在550nm处的吸光值，A标为标准样在550nm处的吸光值，C标为标准蛋白浓度：100mg/ml)计算出样品中的血红蛋白浓度。
8)根据各样品中血红蛋白浓度评价各样品对血细胞的破坏作用，从而检测它们的溶血性。吸光度越高，释放的血红蛋白越多，血细胞裂解越多，那么待测蛋白的溶血性就越强。如图4-1所示，HlaM35组的血红蛋白浓度与负对照基本相同，说明其不具有溶血性，而各种浓度的HlaWT均引起溶血。
2.检测HlaM35诱导出的多抗血清对HlaWT溶血性的中和作用：
1)取0.05g乙二胺四乙酸二钠(国药集团)作为抗凝剂加入到50ml离心管中，用9ml生理盐水溶解，轻摇，使其彻底混匀；
2)取1ml新鲜兔血加入上述50ml离心管中，轻轻混匀，配成10％全血溶液；
3)室温下以1000rpm离心10min，用枪吸出上清液并记录吸出的体积(注意不要吸出血细胞)，吸完后沿管壁缓慢加入与吸出的体积相等体积的生理盐水，温和混匀；
4)室温下以1000rpm离心10min，仍旧吸出上清后再次加入等体积生理盐水；
5)共4个实验组，分别加入终浓度为50μg/ml的HlaWT、终浓度为5μg/ml的HlaWT、终浓度为0.5μg/ml的HlaWT、终浓度为0.05μg/ml的HlaWT，4个实验组中均加入如实施例6所述获得的HlaM35诱导的多抗血清20微升。阴性对照组不加任何蛋白，阳性对照组与阴性对照组成分一致(注：阳性对照组样品先反复冻融三次，再超声破碎5min，以使得血细胞全部破碎裂解)。然后温和混匀。37℃孵育1小时。每个实验组和对照组做3次平行试验。
6)将孵育后的溶液以1000rpm的转速离心5min，然后取上清检测其中血红蛋白的浓度。检测方法如实施例7-1中所示。
如图4所示，发明人运用基因工程手段获得的天然金黄色葡萄球菌α-溶血素(HlaWT)具有很强的溶血活性，这与文献报道的性质一致，其浓度在50ng/ml时依然能检测到溶血性。Hla减毒型蛋白HlaM35的溶血性在浓度高达200μg/ml时依然检测不到，基本与生理盐水的现象相同。这说明蛋白HlaM35的突变成功减毒了天然金黄色葡萄球菌α-溶血素，使其可以安全地运用于抗金黄色葡萄球菌疫苗。本实施例中，HlaWT的浓度为四个梯度：50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml，最小浓度的HlaWT 0.05μg/ml依然能检测到相当的溶血性；而20微升的蛋白HlaM35诱导出的多抗血清能够完全中和5μg/ml的HlaWT的溶血活性，说明本发明获得的减毒突变体HlaM35诱导出的多抗血清可以中和天然金黄色葡萄球菌α-溶血素(HlaWT)的毒性。由此表明Hla M35的减毒是成功的，并且Hla M35作为疫苗免疫机体后，其诱导出的抗体可以对金黄色葡萄球菌上的天然金黄色葡萄球菌α-溶血素的毒性进行很好地中和。
实施例8：HlaM35和IsdB639作为疫苗组分的保护作用
对照组：不含HlaM35或IsdB639，仅使用弗氏佐剂或铝佐剂
实验组1：使用HlaM35和弗氏佐剂或铝佐剂
实验组2：使用IsdB639和弗氏佐剂或铝佐剂
实验组3：使用HlaM35、IsdB639和弗氏佐剂或铝佐剂
将实施例5纯化得到的HlaM35和IsdB639，分别与和蛋白溶液等体积的弗氏完全佐剂(购自鼎国试剂)(图5-1和图5-3)或铝佐剂(购自Accurate Chemical&ScientificCorparation)(图5-2和图5-4)充分混合。皮下免疫6周龄雌性BALB/c小鼠(购自长春生物制品研究所)，蛋白剂量为20微克/只(实验组1，20微克HlaM35/只；实验组2，20微克IsdB639/只；实验组3，20微克HlaM35+20微克IsdB639/只)，10只/组。首次免疫后第14天和28天加强免疫，加强免疫时，弗氏佐剂组采用不完全弗氏佐剂(购自鼎国试剂)与蛋白样品充分混合处理。末次免疫后第14天，用金黄色葡萄球菌毒株USA300(ATCC登录号BAA-1556)或WOOD46(ATCC登录号10832)进行攻毒。攻毒方式和攻毒剂量分别为：USA300，腹腔攻毒，4.6×109CFU/只；WOOD46，腹腔攻毒，3×108CFU/只。攻毒后14天为生存观察期。
如图5-1所示，HlaM35或IsdB639或HlaM35和IsdB639的联合使用弗氏佐剂免疫10只小鼠，毒株USA300(ATCC BAA-1556)腹腔攻毒后，生存率如下：
对照组存活0只；实验组1(HlaM35免疫组)存活10只；实验组2(IsdB639免疫组)存活3只，但相对安慰剂组而言，有一只小鼠生存时间延长一天；实验组3(HlaM35+IsdB639免疫组)存活10只。即对照组、实验组1、实验组2和实验组3最终的存活率分别为：0、100％、30％和100％。
如图5-2所示实验，HlaM35或IsdB639或HlaM35和IsdB639的联合使用铝佐剂免疫10只小鼠，毒株USA300(ATCC BAA-1556)腹腔攻毒后，生存率如下：
对照组存活1只；实验组1(HlaM35免疫组)存活10只；实验组2(IsdB639免疫组)存活3只；实验组3(HlaM35+IsdB639免疫组)存活10只。即对照组、实验组1、实验组2和实验组3最终的存活率分别为：10％、100％、30％和100％。
如图5-3所示，HlaM35或IsdB639或HlaM35和IsdB639的联合使用弗氏佐剂免疫10只小鼠，毒株WOOD46(ATCC登录号：10832)腹腔攻毒攻毒后，生存率如下：
对照组存活2只；实验组1(HlaM35免疫组)存活6只；实验组2(IsdB639免疫组)存活6只；实验组3(HlaM35+IsdB639免疫组)全部存活。即对照组、实验组1、实验组2和实验组3的存活率分别为20％、60％、60％和100％。
如图5-4所示，HlaM35或IsdB639或HlaM35和IsdB639的联合使用铝佐剂免疫10只小鼠，毒株WOOD46(ATCC登录号：10832)腹腔攻毒后，生存率如下：
对照组存活3只；实验组1(HlaM35免疫小鼠组)存活8只；实验组2(IsdB639免疫组)存活6只；实验组3(HlaM35+IsdB639免疫组)全部存活。即对照组、实验组1、实验组2和实验组3的存活率分别为30％、80％、60％和100％。
结论：本实施例的实验表明，单蛋白HlaM35作为抗原免疫小鼠后，可以对金黄色葡萄球菌的入侵起到较大的抑制作用，单蛋白的保护效果就非常明显。单蛋白IsdB639作为抗原免疫小鼠后，其保护效果弱于单蛋白HlaM35，但依然具有一定的保护力。HlaM35和IsdB639联合免疫小鼠，可使实验小鼠的生存率达到100％，是非常理想的组合。
实施例9：HlaM35和IsdB614作为疫苗组分的保护作用
实施例8中对比了弗氏佐剂和铝佐剂的效果，发现由于铝佐剂和弗氏佐剂在保护效果方面差距不大，而铝佐剂是可以安全地用于人体的免疫佐剂，所以实施例9中只采用铝佐剂。
对照组：不含HlaM35或IsdB614，仅使用铝佐剂
实验组1：使用HlaM35和铝佐剂
实验组2：使用IsdB614和铝佐剂
实验组3：使用HlaM35、IsdB614和铝佐剂
将实施例5纯化得到的HlaM35和IsdB614，分别与和蛋白溶液等体积的铝佐剂(购自Accurate Chemical&Scientific Corparation)充分混合。皮下免疫6周龄雌性BALB/c小鼠(购自长春市生物制品所)，蛋白剂量为20微克/只(实验组1，20微克HlaM35/只；实验组2，20微克IsdB614/只；实验组3，20微克HlaM35+20微克IsdB614/只)，10只/组。首次免疫后第14天和28天加强免疫。末次免疫后第14天，用金黄色葡萄球菌毒株USA300(ATCC登录号BAA-1556)或WOOD46(ATCC登录号10832)进行攻毒。攻毒方式和攻毒剂量分别为：USA300，腹腔攻毒，4.6×109CFU/只；WOOD46，腹腔攻毒，3×108CFU/只。攻毒后14天为生存观察期。
如图6-1右图所示，HlaM35或IsdB614或HlaM35和IsdB614的联合使用弗氏佐剂免疫10只小鼠，毒株WOOD46(ATCC登录号：10832)腹腔攻毒后，生存率如下：
对照组全部死亡；实验组1(HlaM35免疫组)存活7只；实验组2(IsdB639免疫组)存活4只；实验组3(HlaM35+IsdB639免疫组)全部存活。即对照组、实验组1、实验组2和实验组3的存活率分别为0、70％、40％和100％。
如图6-1左图所示，HlaM35或IsdB614或HlaM35和IsdB614的联合使用弗氏佐剂免疫10只小鼠，毒株USA300(ATCC登录号BAA-1556)腹腔攻毒后，生存率如下：
对照组全部死亡；实验组1(HlaM35免疫组)存活8只；实验组2(IsdB639免疫组)存活5只；实验组3(HlaM35+IsdB639免疫组)全部存活。即对照组、实验组1、实验组2和实验组3的存活率分别为0、80％、50％和100％。
实施例10：HlaM35和IsdB645作为疫苗组分的保护作用
实施例8中对比了弗氏佐剂和铝佐剂的效果，发现由于铝佐剂和弗氏佐剂在保护效果方面差距不大，而铝佐剂是可以安全地用于人体的免疫佐剂，所以实施例10中只采用铝佐剂。
对照组：不含HlaM35或IsdB645，仅使用铝佐剂
实验组1：使用HlaM35和铝佐剂
实验组2：使用IsdB645和铝佐剂
实验组3：使用HlaM35、IsdB645和铝佐剂
将实施例5纯化得到的HlaM35和IsdB645，分别与和蛋白溶液等体积的铝佐剂(购自Accurate Chemical&Scientific Corparation)充分混合。皮下免疫6周龄雌性BALB/c小鼠(购自长春生物制品所)，蛋白剂量为20微克/只(实验组1，20微克HlaM35/只；实验组2，20微克IsdB645/只；实验组3，20微克HlaM35+20微克IsdB645/只)，10只/组。首次免疫后第14天和28天加强免疫。末次免疫后第14天，用金黄色葡萄球菌毒株USA300(ATCC登录号BAA-1556)或WOOD46(ATCC登录号10832)进行攻毒。攻毒方式和攻毒剂量分别为：USA300，腹腔攻毒，4.6×109CFU/只；WOOD46腹腔攻毒，3×108CFU/只。攻毒后14天为生存观察期。
如图6-2右图所示，HlaM35或IsdB645或HlaM35和IsdB645的联合使用铝佐剂免疫10只小鼠，毒株WOOD46(ATCC登录号：10832)腹腔攻毒后，生存率如下：
对照组全部死亡；实验组1(HlaM35免疫组)存活6只；实验组2(IsdB639免疫组)存活4只；实验组3(HlaM35+IsdB639免疫组)全部存活。即对照组、实验组1、实验组2和实验组3的存活率分别为0、60％、40％和100％。
如图6-2左图所示，HlaM35或IsdB645或HlaM35和IsdB645的联合使用铝佐剂免疫10只小鼠，毒株USA300(ATCC登录号BAA-1556)腹腔攻毒后，生存率如下：
对照组全部死亡；实验组1(HlaM35免疫组)存活8只；实验组2(IsdB639免疫组)存活3只；实验组3(HlaM35+IsdB639免疫组)全部存活。即对照组、实验组1、实验组2和实验组3的存活率分别为0、80％、30％和100％。
结论：实施例9和10的实验说明，HlaM35与IsdB614或HlaM35与IsdB645组合免疫小鼠后，可以对金黄色葡萄球菌的入侵起到较大的抑制作用。单蛋白IsdB614或IsdB645作为抗原免疫小鼠后，其保护效果弱于单蛋白HlaM35，但依然具有一定的保护力。HlaM35分别IsdB614或IsdB645联合免疫小鼠，均可使实验小鼠的生存率达到100％，是非常理想的组合。

Claims (6)

1.一种联合疫苗组合物，所述联合疫苗组合物包含氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的金黄色葡萄球菌α-溶血素减毒型蛋白和一种以上氨基酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11所示的金黄色葡萄球菌铁调节表面决定蛋白B(IsdB)的截短型蛋白，其中所述α-溶血素减毒型蛋白和一种以上截短型蛋白单独分开使用，单独同时使用或混合使用。
2.氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的金黄色葡萄球菌α-溶血素减毒型蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11所示的金黄色葡萄球菌铁调节表面决定蛋白B(IsdB)的截短型蛋白在制备用于预防或治疗受试者中由金黄色葡萄球菌引起疾病的药物中的用途。
3.权利要求2的用途，其中所述药物为疫苗。
4.权利要求2的用途，其中所述受试者是哺乳动物。
5.权利要求4的用途，其中所述受试者是人。
6.权利要求2的用途，所述金黄色葡萄球菌是ATCC登录号为BAA-1556的金黄色葡萄球菌毒株和ATCC登录号为10832的金黄色葡萄球菌毒株WOOD46。
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