CN115819624B - 一种重组融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金黄色葡萄球菌α‑溶血素和β‑溶血素重组融合蛋白，所述的重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明同时公开了一种疫苗，所述的疫苗含有所述的融合蛋白。本发明公开的重组融合蛋白具有良好的抗原性，适用于金黄色葡萄球菌中α‑溶血素和β‑溶血素的抗体检测，且使用一个融合蛋白即可实现两种蛋白抗体的检测，可降低生产成本和时间。另外，使用本发明公开的重组融合蛋白制备疫苗，具有良好的免疫原性，本发明的一个重组融合蛋白可达到金黄色葡萄球菌α‑溶血素和β‑溶血素重组蛋白的免疫效果，可降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种重组融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)也称“金葡菌”，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病微生物。该菌最适宜生长温度为37℃，pH为7.4，耐高盐，可在盐浓度接近10％的环境中生长。金黄色葡萄球菌常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口中，空气、污水等环境中也无处不在。
金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，广泛存在于自然环境中。金黄色葡萄球菌在适当的条件下，能够产生肠毒素，引起食物中毒。金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右，金黄色葡萄球菌成为仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌。
金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，广泛存在于自然环境中。金黄色葡萄球菌在适当的条件下，能够产生肠毒素，引起食物中毒。金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右，金黄色葡萄球菌成为仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌。
金葡菌可产生多种毒素和酶。α-溶血素(α-hemolysin)，亦称α-toxin，是由金葡菌分泌的一种外毒素，是其主要毒力因子之一，具有良好的免疫原性。α-溶血素属于中空形状的β-桶状结构细菌毒素家族，由297个氨基酸组成，其结构基因为hla。α-溶血素对多种哺乳动物红细胞具有溶血作用，其机理为毒素分子插入红细胞的细胞膜疏水区，形成微孔，破坏了膜的完整性，造成细胞溶解。
金葡菌可产生多种毒素和酶。β-溶血素(亦称β-toxin)就是其毒素之一，它具有白细胞毒性、溶血活性等特性。β-溶血素是由330个氨基酸组成的单链多肽。β-溶血素是一种镁依赖神经酯酶，具有磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)活性，可以分解甘油磷酸胆碱，β-溶血素依靠这种酶活性，水解组成细胞膜的磷脂双分子层，从而破坏细胞膜的完整性，导致细胞裂解，引起溶血。
虽然α-溶血素和β-溶血素具有良好的免疫原性，是金葡菌较好的免疫原性蛋白，但这2种蛋白对人体或动物体有较强的毒性，需要突变或其他方式处理后(消除毒性)才能应用于体内。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种α-溶血素和β-溶血素的重组融合蛋白及其应用。
因此，一方面，本发明公开了一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白为金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素重组融合蛋白，所述的重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明所述的重组融合蛋白由4条金黄色葡萄球菌α-溶血素抗原表位多肽和4条金黄色葡萄球菌β-溶血素抗原表位多肽、连接子以及His标签组成。
本发明所述的4条金黄色葡萄球菌α-溶血素抗原表位多肽的氨基酸序列分别为：
抗原表位多肽2：LVTYDKENGMAKKVFYSFID；
抗原表位多肽5：TLKYVQPDFKTILESPTDKK；
抗原表位多肽9：TMDRKASKQQTNIDVIYERV；
抗原表位多肽10：WTDRSSERYKIDWEKEEMTN。
本发明所述的4条金黄色葡萄球菌β-溶血素抗原表位多肽的氨基酸序列分别为：
抗原表位多肽17：TQSEDSRCGAGHDRKIRAEQ；
抗原表位多肽18：AEQMKEISDFVKKKNIPKDE；
抗原表位多肽21：YPNGKPEHLDYIFTDKDHKQ；
抗原表位多肽22：EVVTEKPKPWDVYAFPYYYV。
本发明所述的连接子的氨基酸序列为：GGGGS。
再一方面，本发明还公开了一种疫苗，所述的疫苗含有所述的重组融合蛋白。
再一方面，本发明还公开了一种所述的重组融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素抗体检测试剂中的应用。如ELISA试剂盒中，作为包被抗原使用。
本发明公开的重组融合蛋白具有良好的抗原性，适用于金黄色葡萄球菌中α-溶血素和β-溶血素的抗体检测。且在检测过程中，只需要包被本发明公开的重组融合蛋白，即可满足金黄色葡萄球菌中α-溶血素和β-溶血素抗体检测的需求，不需要使用金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素分别包被酶标板进行检测，节约成本和时间。
另外，使用本发明公开的重组融合蛋白制备疫苗，具有良好的免疫原性。说明，本发明的一个重组融合蛋白即可达到金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素重组蛋白的免疫效果，可降低生产成本。
再者，本发明的重组融合蛋白包含4条金黄色葡萄球菌α-溶血素和4条β-溶血素的抗原表位多肽。这8条抗原表位多肽单独免疫小鼠均可产生较高的抗体效价，说明这8条抗原表位多肽具有良好的免疫原性。为金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素重组蛋白的研究提供了重要的参考(无需突变即可实现无毒且有良好免疫原性的重组蛋白的制备)，也为后续开发金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素的单克隆抗体提供了重要的线索(每条抗原表位多肽均可直接作为单克隆抗体开发中的免疫原使用，从而筛选特定靶位的单克隆抗体)。
附图说明
图1金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素重组融合蛋白SDS-PAGE图，其中1是纯化后的金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素重组融合蛋白。
图2疫苗免疫后相对抗体效价检测结果。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素突变体重组蛋白的制备
参见中国发明专利CN201610068723实施例1～实施例5制备α-溶血素突变体重组蛋白。参见中国发明专利CN201610068816实施例1～实施例6制备β-溶血素突变体重组蛋白。
实施例2：金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素抗原表位多肽的设计和筛选
对实施例1中设计的α-溶血素突变体重组蛋白和β-溶血素突变体重组蛋白分别进行分析，设计合成了23条抗原表位多肽(表1)，其中α-溶血素突变体重组蛋白10条，β-溶血素突变体重组蛋白13条。将23条抗原表位多肽分别免疫小鼠，采集小鼠血清分别进行ELISA抗体效价检测，筛选抗体效价最高的抗原表位多肽。经过检测，共有8条抗原表位多肽的抗体效价最高(表1)，其中α-溶血素突变体重组蛋白4条，β-溶血素突变体重组蛋白4条。因此，选择这8条抗原表位多肽(第2、第5、第9、第10、第17、第18、第21、第22)作为后续研究的重点，其中第2、第5、第9、第10为α-溶血素突变体重组蛋白筛选得到，第17、第18、第21、第22为β-溶血素突变体重组蛋白筛选得到。
使用常规的ELISA方法检测抗体效价，简述为：使用α-溶血素突变体重组蛋白和β-溶血素突变体重组蛋白(实施例1制备)分别包被酶标板，100ng/孔，0.1ml/孔，4℃包被过夜；洗涤3次后，使用含2％的BSA的PBST封闭，37℃孵育2h；用PBS将小鼠血清做10倍系列稀释(10～107)，再分别加到相应的酶标板中，0.1ml/孔，37℃孵育1h；洗涤3次后，加入1:5000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，0.1ml/孔，37℃孵育30min；洗涤3次后，加入0.1ml TMB单组分显色液，37℃孵育10min；加入终止液(2M硫酸)，测定OD450nm值；当OD450nm值大于0.1时判定为阳性。
表1α-溶血素和β-溶血素重组蛋白抗原表位多肽筛选结果
实施例3：金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素重组融合蛋白的设计和制备
合并实施例2筛选到的8条抗原表位多肽，两两之间通过连接子进行连接，所述连接子的氨基酸序列为GGGGS，并在C端添加His标签，形成一条完整的重组融合蛋白，其序列(SEQ ID NO.1)为：
LVTYDKENGMAKKVFYSFIDGGGGSTLKYVQPDFKTILESPTDKKGGGGSTMDRKASKQQTNIDVIYERVGGGGSWTDRSSERYKIDWEKEEMTNGGGGSTQSEDSRCGAGHDRKIRAEQGGGGSAEQMKEISDFVKKKNIPKDEGGGGSYPNGKPEHLDYIFTDKDHKQGGGGSEVVTEKPKPWDVYAFPYYYVGGGGSHHHHHH。
将设计好的重组融合蛋白进行原核表达体系密码子优化以及全基因合成，合成的基因克隆到pET28a载体中，参照中国发明专利CN201610068723的原核表达方法制备重组融合蛋白。经过镍柱纯化后的融合蛋白使用SDS-PAGE蛋白凝胶进行电泳检验，在25KD左右有一条清晰条带，纯度大于95％(图1)；使用BCA检测蛋白浓度，融合蛋白浓度为2.12mg/ml。通过对表达过程中的产量统计，常规原核表达产量能达到0.2～0.3mg/ml。
实施例4：两个重组蛋白和重组融合蛋白毒性研究
将实施例1制备的2个重组蛋白(金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素重组蛋白)和实施例3制备的重组融合蛋白(金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素重组融合蛋白)分别稀释至500μg/ml。
用20只6周龄的雌性Balb/c小鼠，随机分成4组，每组5只，其中3组每每只腹腔注射0.2ml重组蛋白或重组融合蛋白，一组腹腔注射0.2ml生理盐水作为对照，连续观察14日。结果显示，14日内，4组小鼠均正常，未见异常，说明两个重组蛋白和一个重组融合蛋白均没有毒性，均是安全的，均可作为疫苗抗原使用。
实施例5：疫苗制备
将实施例1制备的两个重组蛋白以及实施例3制备的重组融合蛋白均制备成疫苗，将重组蛋白稀释至特定浓度形成水相，将水相按照体积比46:54的比例与ISA 201 VG佐剂乳化制备疫苗。具体疫苗信息见表2所示。所有疫苗均按照现行《中国兽药典》附录进行检验，检验结果符合要求。制备及检验合格的疫苗置于2～8℃保存备用。
表2 疫苗制备
实施例6：疫苗免疫以及检验
小鼠免疫：将6周龄的雌性Balb/c小鼠随机分组，每组5只，按照表3进行分组和免疫，于首次免疫前、二免14日采集小鼠血清，使用常规的ELISA方法对小鼠血清效价进行检测。
表3 小鼠免疫分组
| 组别 | 免疫剂量和方式 | 免疫次数 |
| 组1(疫苗1) | 0.2ml/只，腿部肌肉注射 | 间隔2周加强免疫一次 |
| 组2(疫苗2) | 0.2ml/只，腿部肌肉注射 | 间隔2周加强免疫一次 |
| 组3(疫苗3) | 0.2ml/只，腿部肌肉注射 | 间隔2周加强免疫一次 |
| 对照组 | 0.2ml/只，腿部肌肉注射 | 间隔2周加强免疫一次 |
使用常规的ELISA方法检测小鼠血清抗体效价，简述为：使用制备的α-溶血素突变体重组蛋白、β-溶血素突变体重组蛋白、α-溶血素和β-溶血素重组融合蛋白分别包被酶标板，100ng/孔，0.1ml/孔，4℃包被过夜；洗涤3次后，使用含2％的BSA的PBST封闭，37℃孵育2h；用PBS将小鼠血清做2倍系列稀释(100、200、400、800、1600......)，再加到包被的酶标板中，0.1ml/孔，37℃孵育1h；洗涤3次后，加入1:5000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，0.1ml/孔，37℃孵育30min；洗涤3次后，加入0.1ml TMB单组分显色液，37℃孵育10min；加入终止液(2M硫酸)，测定OD450nm值；当P/N值(样品OD450nm值/空白对照孔OD450nm值)大于2.1且样品ODOD450nm值＞0.1时判定为阳性。
抗体检测结果显示(图2)：使用α-溶血素和β-溶血素重组融合蛋白包被的酶标板检测结果与α-溶血素突变体重组蛋白、β-溶血素突变体重组蛋白分别包被的酶标板的检测结果一致，说明本发明制备的重组融合蛋白具有良好的抗原性，适用于金黄色葡萄球菌中α-溶血素和β-溶血素的抗体检测。如在后续研究中，针对α-溶血素和β-溶血素的抗体检测，只需要使用本发明制备的重组融合蛋白即可满足两个蛋白抗体的检测需求，不需要使用两个蛋白分别包被酶标板进行检测，节约成本和时间。
另外，使用α-溶血素和β-溶血素重组融合蛋白制备的疫苗(疫苗3)的抗体效价与α-溶血素突变体重组蛋白、β-溶血素突变体重组蛋白分别制备的疫苗(疫苗1和疫苗2)的抗体效价基本一致，甚至要高，说明本发明的重组融合蛋白具有良好的免疫原性，一个重组融合蛋白即可达到2个重组蛋白的免疫效果，降低生产成本。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白为金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素重组融合蛋白，所述的重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的重组融合蛋白由4条金黄色葡萄球菌α-溶血素抗原表位多肽和4条金黄色葡萄球菌β-溶血素抗原表位多肽、连接子以及His标签组成。
3.根据权利要求2所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的4条金黄色葡萄球菌α-溶血素抗原表位多肽的氨基酸序列分别为：
抗原表位多肽2：LVTYDKENGMAKKVFYSFID；
抗原表位多肽5：TLKYVQPDFKTILESPTDKK；
抗原表位多肽9：TMDRKASKQQTNIDVIYERV；
抗原表位多肽10：WTDRSSERYKIDWEKEEMTN。
4.根据权利要求2所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的4条金黄色葡萄球菌β-溶血素抗原表位多肽的氨基酸序列分别为：
抗原表位多肽17：TQSEDSRCGAGHDRKIRAEQ；
抗原表位多肽18：AEQMKEISDFVKKKNIPKDE；
抗原表位多肽21：YPNGKPEHLDYIFTDKDHKQ；
抗原表位多肽22：EVVTEKPKPWDVYAFPYYYV。
5.根据权利要求2所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的连接子的氨基酸序列为：GGGGS。
6.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗含有权利要求1所述的重组融合蛋白。
7.一种如权利要求1所述的重组融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌α-溶血素和β-溶血素抗体检测试剂中的应用。
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