CN105646681A - 一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用 - Google Patents
一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用。目的在于提供预防或治疗奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)将金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白的第35位的组氨酸定点突变为丙氨酸；2)将定点突变的α-溶血素蛋白基因克隆到pET28a载体中；3)将步骤2)获得的表达载体转化E.coli？BL21(DE3)，诱导表达获得重组α-溶血素蛋白；4)使用镍柱亲和层析和Resource？S柱纯化步骤3)得到的重组α-溶血素蛋白；5)将纯化得到的重组α-溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎重组亚单位疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用。属于生物疫苗制备技术领域。
背景技术
奶牛乳房炎(Mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病，主要是奶牛乳腺组织受到微生物感染而引起的一种炎症，多发生于产后哺乳期，该病广泛存在于世界各地，为奶牛常见病、多发病，是造成乳制品业经济损失最为严重的疾病。引起奶牛乳房炎的病原微生物大约有150多种，主要以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌为主，这三种细菌引起的奶牛乳房炎占总发病率的90％以上，其中尤以金黄色葡萄球菌为最。
当前奶牛乳房炎的治疗方法主要是采用抗生素治疗，抗生素用于治疗奶牛乳房炎已有50多年的历史了，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于长期单一的、大剂量的不科学使用抗生素，引起了敏感性细菌的消除，耐药性细菌逐渐占了主流，尤其是金黄色葡萄球菌的耐药问题日益严重，导致了抗生素治疗收效甚微。
用疫苗来防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以预防奶牛感染病原菌而引起乳房炎；其次，疫苗有助于降低乳腺感染的严重程度，控制亚临床型乳房炎；第三，使用疫苗防治乳房炎不会存在乳汁中抗生素残留问题；最后是操作简便，费用低廉。当前，研制成功的疫苗很少，且大都数为弱毒活菌苗或灭活菌苗，在生产实践中，对乳房炎的防治有一定作用，然而随着大规模集约化养殖的发展，人工致弱菌株存在着同源重组、自身毒力返强等潜在可能，而灭活疫苗也存在使用剂量大、免疫期短等不足，为提高传统疫苗的安全性与免疫保护力，高效、廉价的新型疫苗研制极其重要。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，简称SA)，也称“金葡菌”，是一种革兰氏染色阳性的球菌，直径0.8μm，在显微镜下排列成葡萄串状，并可以产生金黄色的色素，并因此而得名。金葡菌是引起慢性/隐性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以极大的影响牛奶的产量和质量，给奶制品产业带来巨大的经济损失。
金葡菌可产生多种毒素和酶。α-溶血素(α-hemolysin)，亦称α-toxin，是由金葡菌分泌的一种外毒素，是其主要毒力因子之一，具有良好的免疫原性。α-溶血素属于中空形状的β-桶状结构细菌毒素家族，相对分子质量为33,200，由297个氨基酸组成，其结构基因为h/a。α-溶血素对多种哺乳动物红细胞具有溶血作用，其机理为毒素分子插入红细胞的细胞膜疏水区，形成微孔，破坏了细胞膜的完整性，造成细胞溶解。将α-溶血素第35位组氨酸突变为丙氨酸后，突变体就失去了溶血活性，不具有毒性，但仍然保留完好的免疫原性，可直接用来免疫动物，是金葡菌亚单位疫苗的重要候选蛋白之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用。重组蛋白与合适佐剂混合制备的亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进细胞免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉的新型疫苗。
所述的重组α-溶血素蛋白来自金黄色葡萄球菌，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明还提供一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法，主要包括以下步骤：1)将金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白的第35位的组氨酸定点突变为丙氨酸；2)将定点突变的α-溶血素蛋白基因克隆到pET28a载体中；3)将步骤2)获得的表达载体转化E.coliBL21(DE3)，诱导表达获得重组α-溶血素蛋白；4)使用镍柱亲和层析和ResourceS柱纯化步骤3)得到的重组α-溶血素蛋白；5)将纯化得到的重组α-溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂(如ISA206VG佐剂)充分混匀后得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎重组亚单位疫苗。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：奶牛乳房炎亚单位疫苗即利用致病菌主要的保护性免疫原制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗，将其直接注入机体而激活免疫系统，以达到预防和治疗疾病的目的。重组蛋白与合适佐剂混合制备的亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进细胞免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉，且省时省力具有显著疗效的新型疫苗。
附图说明
图1、α-溶血素分段PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，M：MarkerDL2,000；1是α-溶血素定点突变片段1(128bp)，2是α-溶血素定点突变片段2(795bp)。
图2、α-溶血素定点突变重叠PCR琼脂糖凝胶电泳结果，M：MarkerDL5,000；1是α-溶血素定点突变重叠PCR产物(891bp)。
图3、α-溶血素定点突变重组质粒酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果，M：MarkerDL5000；1是pET28a-α-溶血素定点突变1号质粒(NcoI/XhoI)，2是pET28a-α-溶血素定点突变2号质粒(NcoI/XhoI)。
图4、SDS-PAGE检测α-溶血素镍柱亲和层析纯化结果，FT：flowthrough；50mM：50mM咪唑；100mM：100mM咪唑；150mM：150mM咪唑；200mM：200mM咪唑；250mM：250mM咪唑。
图5、SDS-PAGE检测ResourceS柱纯化镍柱纯化洗脱部分(50mM到250mM咪唑洗脱部分)结果。
图6、ELISA检测α-溶血素亚单位疫苗免疫小鼠后效价结果。
图7、免疫攻毒后小鼠存活率实验结果。
具体实施方式
实施例1表达载体pET28a-α-溶血素定点突变的构建
以临床分离到的奶牛金黄色葡萄球菌基因组为模板，将α-溶血素分成两段进行PCR，结果如图1所示。
1.1加样体系为(50μl)：
1.2PCR扩增程序：
1.3胶回收DNA片段：
(1)将步骤1.2的反应液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(110V30min)；
(2)在紫外灯下，切胶回收DNA片段于1.5mlEP管中；
(3)向步骤(2)中的1.5mlEP管中加入500μlPCbuffer，50℃，水浴10min；
(4)将步骤(3)中溶液移至吸附柱中心，静置2min，离心，12,000rpm，30s；
(5)弃废液，向吸附柱中心加入600μlPWbuffer，静置3min，12,000rpm，30s；
(6)重复步骤(5)；
(7)空吸附柱离心，12,000rpm，1min；
(8)向吸附柱中心加入30μlddH2O，静置3min，离心(12,000rpm，2min)；
(9)收集步骤(8)DNA样品进行电泳。
1.4重叠PCR，将α-溶血素进行定点突变，结果如图2所示：
加样体系为(50μl)：
PCR扩增程序：
1.5双酶切反应(50μl体系)：
在1.5mlEP管中按照步骤1.5进行加样、混匀，而后将这两个50μl反应液置于37℃恒温水浴锅中，水浴3h。
1.6胶回收DNA片段：
(1)将步骤1.5的反应液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(110V30min)；
(2)在紫外灯下，切胶回收DNA片段于1.5mlEP管中；
(3)向步骤(2)中的1.5mlEP管中加入500μlPCbuffer，50℃，水浴10min；
(4)将步骤(3)中溶液移至吸附柱中心，静置2min，离心，12,000rpm，30s；
(5)弃废液，向吸附柱中心加入600μlPWbuffer，静置3min，12,000rpm，30s；
(6)重复步骤(5)；
(7)空吸附柱离心，12,000rpm，1min；
(8)向吸附柱中心加入30μlddH2O，静置3min，离心(12,000rpm，2min)；
(9)收集步骤(8)DNA样品进行电泳。
1.7连接反应(10μl体系)：
在1.5mlEP管中按照上述体系进行加样、混匀，而后将上述反应液置于16℃，水浴16h后取出，65℃，水浴15min后进行灭活，将样品4℃保存。
1.8转化实验：
(1)取出步骤1.7的连接反应液，向其中添加100μlE.coliDH5α感受态细胞，混匀；
(2)冰浴30min；
(3)42℃，水浴100s；
(4)冰浴2min；
(5)取出，向EP管中加入600μl液体LB培养基，37℃，水浴1h；
(6)取出样品管，离心(8,000rpm，2min)，去掉600μl，剩余100μlLB重悬菌体；
(7)取菌液铺板于LK平板中(Kan浓度为50μg/ml)，将LK平板置于生化恒温培养箱中，37℃培养12h。
1.9重组质粒提取及酶切鉴定：
(1)从转化平板中挑取单克隆至3mlLK液体培养基中，37℃，260rpm摇菌过夜；
(2)取1ml菌液至1.5mlEP管中，离心(12,000rpm，2min)，弃上清；
(3)向步骤(2)中的EP管中加入250μlP1buffer，重悬菌体；
(4)向步骤(3)溶液中加入250μlP2buffer，温和混匀，静置2min；
(5)向步骤(4)溶液中加入350μlP3buffer，温和混匀；
(6)将步骤(5)溶液，离心(12,000rpm，10min)；
(7)将步骤(6)中的上清溶液移至吸附柱中心，离心(8,000g，30s)；
(8)弃废液，向吸附柱中心加入500μlwashbuffer，离心(9,000g，30s)；
(9)重复步骤(8)；
(10)空吸附柱离心(9,000g，1min)；
(11)向吸附柱加入30μlElutionbuffer，静置2min，离心(12,000rpm，2min)；
(12)收集步骤(11)DNA样品进行电泳；
(13)如步骤1.5所示，对提取到的质粒进行酶切鉴定，而后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。
重组质粒酶切鉴定结果见图3。
实施例2转化大肠杆菌BL21
吸取1μl质粒加入100μlBL21感受态细胞中，冰浴30min；
42℃热激90s；
冰浴2min；
在超净台内加入900μl无抗性的LB培养液；
37℃180rpm摇1h；
吸取100μl菌液涂卡那抗性LB平板，37℃过夜培养。
实施例3大量诱导表达
挑菌：挑取单克隆至50ml卡那抗性LB培养液中，37℃过夜培养；
转接：按1∶100比例转接菌液至500ml卡那抗性LB培养液，共摇3.5L，37℃220rpm培养2-2.5h至OD600值到0.6；
诱导：菌液OD600值到0.6后，加入500μlIPTG(1M)至IPTG终浓度为1mmol/L，37℃220rpm诱导培养4h；
菌体收集：菌液6,000rpm离心10min，收集菌体；用40mlPBS清洗菌体，6,000rpm离心10min，收集菌体，置于-20℃保存；
实施例4镍柱亲和层析纯化重组α-溶血素蛋白
菌体破碎：用裂解液(50mMNaH2PO4，500mMNaCl，0.1mMPMSF，10mMBenzamideme，0.01％NaN3，pH8.0)重悬菌体，用注射器将菌体吹打均匀，避免块状沉淀物产生；用细胞破碎机Avestin裂解菌液，破碎后离心菌体，取上清；
结合：取适量Ni-agaroseBeads加入到上清液，摇床上混匀结合30min；
4,000rpm4℃离心5min，收集上清Flowthrough部分，Beads部分进行下一步；
洗涤：裂解液中加入咪唑，咪唑终浓度为5mM，配制得到WashBuffer。取适量WashBuffer加入到Beads中，缓慢摇5min，4,000rpm4℃离心5min，重复洗一次；
洗脱：用洗脱液(10mMNaH2PO4，150mMNaCl，0.1mMPMSF，10mMBenzamideme，0.01％NaN3，pH7.4)配制50mM、100mM、150mM、200mM和250mM的咪唑洗脱液，每次用5ml咪唑洗脱液进行洗脱，每个浓度进行3次洗脱；
SDS-PAGE分析：凝胶浓度：12％，样品点样量为10μl，Marker点样量为5μl；蛋白纯化结果如图4所示。
实施例5ResourceS柱纯化镍柱纯化洗脱部分(50mM到250mM咪唑洗脱部分)
(1)AKTA柱平衡；
(2)镍柱纯化洗脱部分浓缩：将镍柱纯化洗脱部分(50mM到250mM咪唑洗脱部分)进行超滤浓缩，浓缩后体积约为1.5-2ml；
(3)样品瞬间稀释：准备一个100ml烧杯，烧杯中加入适量BufferA(10mMNaH2PO4，pH6.0)，再将步骤(2)中浓缩的蛋白样品加到BufferA中，轻轻吹打均匀，终体积为30ml；
(4)过滤：将步骤(3)的样品过0.45μm滤器；
(5)上样：用50ml注射器吸取样品液，尽量赶掉针筒注射器中的气泡，将样品缓慢注射进入AKTA样品柱；
(6)洗脱：
1)上样：根据样品体积设定，流速2ml/min；
2)Flowthrough收集5-10ml/fraction；
3)洗脱未结合的蛋白：20CV，5-10ml/fraction；
4)盐浓度洗脱：0-60％BufferB(10mMNaH2PO4，500mMNaCl，pH6.0)，60CV，2ml/fraction；
5)60％-100％BufferB，10CV，2ml/ffaction；
6)100％BufferB，10CV，不收集；
7)100％BufferA，10CV，不收集，结束程序。
SDS-PAGE分析：选取出峰位置对应的样品收集管，每管吸取16μl到新的1.5mlEP管中，用于SDS-PAGE分析，结果如图5所示。
浓缩：根据SDS-PAGE结果收集蛋白，混匀后进行超滤浓缩，用蛋白保存液(PBS，10％甘油，pH7.4)更换三次Buffer，α-溶血素浓度为3.5mg/ml，分装保存于-80℃。
实施例6重组α-溶血素蛋白亚单位疫苗制备
按照实验需要，计算疫苗溶液各成分的量，使疫苗中重组α-溶血素蛋白终浓度为25μg/ml，其中重组α-溶血素蛋白与佐剂ISA206VG体积比为46∶54；
将稀释混匀好的重组α-溶血素蛋白溶液及ISA206VG佐剂放置在恒温水浴锅内加热至32℃±1℃，待温度稳定后将抗原加入到佐剂管中，震荡器震荡10min进行预乳化；
将预乳化完的疫苗放置于盛满冰的烧杯中，固定在预先处理好的超声波细胞破碎仪上进行乳化；
乳化结束后，观察乳化效果：取部分疫苗置于离心管中，3,000rpm离心15min，疫苗不分层为合格；
检测合格的疫苗分装到15ml离心管中，标记，封口膜封口，置于4℃保存。
实施例7小鼠免疫实验
将疫苗拿到室温(25℃)放置2h左右，使疫苗温度恢复到常温；
给小鼠称重、分组并标记，一组为免疫试验组(n＝6)，免疫α-溶血素亚单位疫苗；另一组为对照组(n＝6)，免疫PBS，并记录数值；
用1ml注射器吸取1ml疫苗，注意将气泡排尽；然后用75％酒精棉球给后腿肌肉消毒，在肌肉块中部进针，左右后腿各注射50μl疫苗。
实施例8小鼠免疫后攻毒实验
挑取SA单菌落(菌株为本实验室保存的CQ339菌株)于5ml液体肉汤培养基中中，220rpm、37℃摇菌过夜；
按百分之一的体积(1ml)将摇过夜的细菌接种于100ml新鲜液体肉汤培养基中，220rpm、37℃摇菌过夜；
将100ml菌液装入到500ml离心瓶中，8,000rpm离心10min，吸去培养基，菌体用100mlPBS重悬，重复上述步骤3次，最后将所有的菌体用5mlPBS重悬混匀；
将菌液做10,000倍稀释后计数。根据菌液的浓度，将原菌液稀释到1.5×108CFU/ml(2MLD50)；
给免疫组和对照组小鼠称重，一组为免疫试验组(n＝6)，另一组为对照组(n＝6)记录数值；
用1ml注射器吸取菌液，按照各浓度细菌对应的小鼠进行尾静脉注射，注射量为200μl/20g小鼠。
连续观察小鼠的生存状况，记录每一只小鼠的死亡时间：早中晚各检查一次；攻毒后小鼠存活率结果如图7所示。
实施例9ELISA检测α-溶血素抗体效价
(1)包被：用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH9.5)稀释纯化的检测用蛋白至0.5μg/ml，在酶标板上每孔加入100μl，封口膜封好后4℃冰箱放置过夜；
(2)洗涤：从冰箱取出酶标板后，放入洗板机中洗涤，洗涤液用PBST；
(3)封闭：每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；
(4)样品准备：按已知的信息和需要用量，用封闭液将血清进行适度稀释；
(5)洗涤：同(2)；
(6)加样：加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37℃孵育1h；
(7)洗涤：同(2)；
(8)加二抗：每孔加入适度稀释的HRP标记的二抗100μl，37℃孵育0.5h；
(9)洗涤：同(2)；
(10)显色：避光条件下每孔加入100μl的TMB显色液，37℃孵育10min；
(11)终止：每孔加入50μl终止液(2M的H2SO4)，终止反应；
(12)检测：于450nm波长测定样品OD值，分析数据；
(13)结果分析：判断抗体阳性的标准：P/N≥2.1，OD450≥0.1。
Claims (4)
1.一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用，其特征在于：1)金黄色葡葡球菌保护性抗原蛋白α-溶血素的定点突变与克隆；2)重组α-溶血素蛋白的表达与纯化；3)将重组α-溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎重组亚单位疫苗。
2.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌保护性抗原蛋白α-溶血素，其特征在于：
(a)由SEQIDNO.1所示的氨基酸组成的蛋白质；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有金黄色葡萄球菌保护性抗原蛋白α-溶血素抗原性的由(a)衍生的蛋白质；
(c)重组α-溶血素蛋白表达系统包括但不限于大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞以及昆虫细胞等。
3.权利要求1所述的奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白的第35位的组氨酸定点突变为丙氨酸；
2)将定点突变的α-溶血素蛋白基因克隆到pET28a载体中；
3)将步骤2)获得的表达载体转化E.coliBL21(DE3)，诱导表达获得重组α-溶血素蛋白；
4)使用镍柱亲和层析和ResourceS柱纯化步骤3)得到的重组α-溶血素蛋白；
5)将纯化得到的重组α-溶血素蛋白与药学上可接受的佐剂(如ISA206VG佐剂)充分混匀后得到奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎重组亚单位疫苗。
4.权利要求1所述的亚单位疫苗在预防或治疗奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎中的应用。
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