JP3031561B2

JP3031561B2 - 大腸菌ワクチン

Info

Publication number: JP3031561B2
Application number: JP2216453A
Authority: JP
Inventors: ヨハンネス・フランシスクス・フアン・デン・ボスフ
Original assignee: アクゾ・エヌ・ヴエー
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1990-08-16
Publication date: 2000-04-10
Anticipated expiration: 2015-04-10
Also published as: CN1062605C; CA2022420A1; JPH03184996A; HU210965B; AU635062B2; IL95175A0; KR0177510B1; NZ234933A; DK0413378T3; IL95175A; US5750115A; DE69016129T2; EP0413378B1; CA2022420C; CN1049523A; HU211827A9; ES2070266T3; KR910004209A; DE69016129D1; GR3015782T3

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、大腸菌（E.coli）の感染症から個体を防護
するためのワクチンと、この種のワクチンに使用される
毒素と、該毒素の精製方法とに係わる。

大腸菌は大部分の動物の消化器系に住みついている一
般的な細菌である。通常は、大腸菌が住みついて重大な
悪影響が及ぼされることはない。それどころか、この細
菌は多くの場合、宿主にとって有用なプロセスに寄与す
る。しかしながら、特に若い動物では、大腸菌によって
重大な病気が発生することもある。これは鳥類にも見ら
れ、家禽飼養業では大腸菌による感染症の流行によっ
て、若い家禽が著しく衰弱したり又は集団死する現象さ
え起こり得る。

勿論、若い家禽の間に発生するこのような大腸菌感染
症をワクチン接種プログラムによって抑制する試みはこ
れまでにもなされてきた。その方法は、成熟したニワト
リにバクテリン（bacterin）即ち不活性化大腸菌をワク
チン接種するというものであった（Avian Diseases29
（４）,1108−17（1985））。このバクテリンワクチン
には、重大な副作用を併発するという欠点がある。ま
た、バクテリンワクチンを使用すると主にリポ多糖に対
する抗体が形成されるが、この抗体は、特定の大腸菌０
血清型にのみ特異的であり、従って他の大腸菌血清型に
は効果がない。

大腸菌感染症に対処する方法として、大腸菌から得た
毛（pili）をベースとするワクチンも広く使用されてい
る。しかしながら、この種のワクチンによる防護率は、
予防接種した個体の約80％以下にしか達しない。そこ
で、大腸菌ワクチンにはしばしば別のビルレンス要因、
即ち大腸菌の不活性毒素が成分の１つとして混入され
る。

大腸菌には、移動機能を有する鞭毛をもつタイプのも
のが多くある。大腸菌鞭毛はこれまでビルレンス要因と
はみなされていなかったため、大腸菌ワクチンには含ま
れていなかった。

本発明では、従来の認識に反して、大腸菌鞭毛がVero
細胞に対する高度の毒性作用に関係しており、これらの
鞭毛毒素が重要なビルレンス要因の１つであることを発
見した。

この発明に基づいて、大腸菌鞭毛からワクチンを製造
する試みがなされた。本発明では、大腸菌鞭毛をそのま
まそっくり使用することも、該鞭毛を構成する基本構造
体（substructures）、例えば予防接種により個体を大
腸菌感染症から防護するフラジェリン又はそのフラグメ
ントもしくは集塊を使用することもできる。

主にニワトリから単離し、動物及びヒトからも単離し
た多くの大腸菌株を用いて行った実験では、鞭毛がVero
細胞に対する毒性に関係していた。この毒性活性は鞭毛
に対する抗体によって中和されることが判明した。ま
た、検査した総ての大腸菌株の鞭毛の毒性は、これら菌
株のうち１つの菌株の鞭毛に対応する単一の抗血清によ
って中和され得ることも判明した。

この発見から、単一の大腸菌株に由来する鞭毛をワク
チン接種すれば、鞭毛をもつ総ての大腸菌の感染症に対
する防護が得られるものと推測される。

そこで本発明では、大腸菌中に存在する新しい種類の
毒素をベースとするワクチンを提供する。これらの毒素
はタンパク質性であり、鞭毛中に存在し及び／又は鞭毛
に結合しており、SDS−PAGEで測定した分子量が30〜100
kDであり、結合炭水化物残基をもたず、Vero細胞及びニ
ワトリの雛に対して毒性を示し、100℃で１時間加熱し
てもこの毒性を失わないことを特徴とする。

これら新規の毒素は前記特徴を有する点において、当
業者に公知の大腸菌毒素と異なる。

前述の毒素は多くの大腸菌株に見られ、鞭毛構造中に
顕著に存在することから本明細書ではこれを鞭毛毒素
（flagellar toxins＝FT）と称する。これらの鞭毛は一
般に普通の房（fimbriae、通常は直径約7nm、長さ約１
μｍより）遥かに大きく、厚みが約25nm、長さが約７μ
ｍである。

本発明の毒素類の１つを実施例１に記載の方法でニワ
トリ大腸菌CH7株（015:K14:H10）から単離した。このCH
7−FTは種々の形態で単離できる。即ち、H10型天然鞭毛
に結合した状態で、又は遊離毒素として、あるいは遊離
毒素から得られる小さい針状フィラメントに再結合した
状態で単離できる。このCH7−FTは前記一般的特徴に加
えて、SDS−PAGEで測定したサブユニット分子量が約47k
Dであり、等電pHが約4.8であり、且つ部分的アミノ末端
アミノ酸配列がAla−Gln−Val−Ile−Asn−Thr−Asn−S
er−Leu−Ser−Leu−（？）−Thr−Glnであるという典
型的特徴を有する（CH7−FTの特徴は実施例２で詳述す
る）。

このCH7−FTに対応する抗血清は、検査した他の総て
の大腸菌株のFTと交差反応することが判明した（実施例
３）。従って、このようなCH7−FTに対する抗血清を使
用すれば、本発明の他の総てのFTの特徴を調べることが
できる。また、検査した他の総ての大腸菌のFTには、モ
ノクローナル抗体が特異的に反応するか又は交差反応し
た。

本発明は、大腸菌感染症に対する免疫活性を有し、本
発明の不活性化毒素を活性成分として含むワクチンにも
係わる。

このようなワクチンには前記毒性鞭毛を含ませるのが
よい。これらの鞭毛は、鞭毛の形成を促進する条件で大
腸菌を培養し且つこの細菌から鞭毛又は細胞を含まない
上清を分離することによって容易に得られるからであ
る。FTは更に、限外過及び／又は分子篩クロマトグラ
フィーを用いて上清から低分子量成分を除去することに
より精製し得る。

この精製プロセスでは、FTに富んだフラクションをCH
7−FTに対するモノクローナル抗体との反応性によって
モニターすることができる。

本発明のワクチンは、ワクチン接種によって個体を大
腸菌感染症から防護するFTフラグメントも含み得る。

本発明のワクチンに含まれるFTは、化学的合成、大腸
菌細胞培養物からの精製、又は組換えDNA技術によって
得ることができる。

組換えDNA技術を用いる場合は、例えばFTに対するポ
リクローナル抗体又はモノクローナル抗体との特異的反
応を用いて、前記タンパク質又はそのフラグメントをコ
ードする核酸配列を含む個々のクローンに関してゲノム
大腸菌DNAバンクのスクリーニングを行うことにより、
前記配列を同定し得る。この核酸配列は種々の発現用DN
A配列に連結し得、その結果適当な宿主の形質転換に使
用できるいわゆる組換え核酸分子が得られる。このよう
なハイブリッドDNA分子は例えばプラスミド、ファージ
又はウイルス中の核酸配列から誘導し得る。宿主細胞は
細菌のような原核起源のもの、又は哺乳動物細胞のよう
な真核起源のものであってよい。形質転換した宿主細胞
はFTの製造に使用でき、製造された前記タンパク質を単
離して本発明のワクチンに混入すればよい。

別の実施態様では、非病原性微生物、例えばFTをコー
ドする遺伝子を含むウイルス又は細菌を含むベクター生
ワクチンを製造し得る。

本発明のワクチンはFTの他に、水性媒質もしくは水含
有懸濁液及び／又は他の成分、例えば活性及び／又は貯
蔵寿命を増加するための成分も含み得る。これらの成分
には例えば、塩、FTの免疫原特性を保持しながらその毒
性活性を不活性化する物質（例えばホルマリン）、pH緩
衝剤、乳化剤、及び免疫応答を改善するアジュバント
（例えば鉱油、ムラミルジペプチド、水酸化アルミニウ
ム、サポニン、ポリアニオン及び両親媒性物質）があ
る。

本発明のワクチンは温血動物（ヒトを含む）を大腸菌
感染症に対して免疫にする効果があり、特に鳥類の大腸
菌感染症に対処するために使用し得る。

そのためには、本発明のワクチンを好ましくは非経口
投与、例えば皮下注射又は筋肉注射する。本発明のワク
チンは、ワクチン接種した鳥の能動免疫の場合にも、産
卵期の鳥に投与してその子孫に受動免疫を与える場合に
も、前記方法で投与し得る。免疫した産卵期の鳥の対内
で生じた抗体は卵の黄身の中に導入され、その結果孵化
した雛が前記抗体を有することになる。

ワクチンの組成及びワクチン接種システムはいずれも
多種多様であり、防護すべき動物の種類、年令、体重、
所望の防護期間、投与方法、並びに能動免疫と母親から
の移行抗体による受動免疫のいずれが望ましいかという
問題によって異なる。本発明のワクチンの活性成分の最
適有効量は、家禽に非経口投与でワクチン接種する場合
で一回分の用量当たり約10〜100μｇである。本発明の
ワクチンは他の類似ワクチンと組合わせて使用してもよ
い。

実施例１大腸菌CH7株の鞭毛毒素の単離 A.鞭毛毒素の調製大腸菌CH7株（015:K14:H10）を、Biostat E発酵装置
（Braun）を用いて、12のTrypticase Soy BHrot（B.
B.L）中でpO₂セッティング14％で100〜500rpmの可変速
度で撹拌しながら一晩培養した。この培養物を、HVLPフ
ィルターを備えたPelliconフィルターシステム（Millip
ore）で約１まで濃縮した。細菌を10,000rpmで30分間
遠心分離し（Sorvall社のGSAローター使用）、上清を0.
45μｍフィルターで過し、前記HVLP液に加えた。

この液を約１まで濃縮し、PTTKフィルタを用いて
１の0.2mol/トリスHClバッファで３回洗浄した。

このPTTK濃縮物を、保存料として0.1％のNaN₃を含むp
H7.2の50mmol/リン酸塩バッファ（PB）で平衡化した
高さ10cm、面積154cm²（AmiconモデルP140x250）のセフ
ァロース4B−C1カラム（Pharmacia,Uppsala Sweden）
で、約110〜160mlの分量に別けて繰返し溶離した。前記
カラムは記録計のベースラインがゼロに戻るまでPBで溶
離した。

高分子量分子を含む第１ピークのフラクションをプー
ルし、タンパク質濃度が約２〜3mg/mlになるまでYM−10
0限外過フィルタ（φ62mm Amicon、Amicon UFモデル2
02）にかけて濃縮した。この濃縮物を、保存料として0.
1％のNaN₃を含むpH7.5の20mmol/トリスHClバッファ５
に対して２回透析した。

B.遊離毒素の調製前記濃縮物をLaemmliの方法（Nature227,680−4;197
0）で調製用電気泳動にかけた。これを、グリセロール2
0mlと、pH6.8の0.5mol/トリス−CHlバッファ20mlと、
10％SDS20mlと、２−メルカプトエタノール（ME）5ml
と、0.05％ブロモフェノールブルー2mlとからなる試料
バッファ中に1:1.67で希釈した。

これを水中で約５分間沸騰させ、冷却し、且つ16x0.6
cmの12％（アクリルアミド：ビス30:0.8）調製用ポリア
クリルアミドスラブゲル上で電気泳動にかけた。試料装
荷量は約15〜23mgタンパク質／ゲル（7.5mlの濃縮物及
び5.0mlの試料バッファ）にした。電気泳動は、Protean
セルモデル1423（Bio−Rad,Richmond,USA）又はモデ
ルSE600（Hoefer,San Francisco,USA）を用いて行っ
た。フロントをゲルから溶離した後で、電気泳動を更に
200Vで１時間続けた。ゲルを約1.5〜2mmのスライスに切
断した。

タンパク質を10mlの0.89％塩化ナトリウム溶液＋0.1
％NaN₃中で、撹拌しながら、室温で３時間且つ４℃で一
晩溶離した。前記スライスを除去し、溶液を0.45μフィ
ルタで過した。純粋毒素サブユニットを含むフラクシ
ョンをプールし、−20℃で貯蔵した。

Folin−Ciocalteuアッセイ（J.Biol.Chem.73,627;192
7）を変形したもので試料中のタンパク質含量を測定
し、Duboisのフェノール−硫酸アッセイ（Anal.Chem.2
8,350−6;1956）で多糖を測定した。

実施例２大腸菌CH7株の毒素の特徴分析 A.日齢１日のニワトリに関する致死性最初の実験では、種々の大腸菌毒素調製物を0.2ml及
び0.5mlの用量で日齢１日のSPFブロイラーチキン（GVP,
Doorn）に腹腔内注射した。２回目の実験では、0.5mlの
毒素調製物を日齢３週間のブロイラーチキンに静脈注射
した。注射してから７日後の死亡数を記録した。

結果表１に示すように、ニワトリ大腸菌CH2株及びCH7株に
由来する毒素調製物の腹腔内注射は日齢１日のニワトリ
にとって致命的であった。CH7株の場合は上清も溶解物
も毒性であり、CH2株の場合は特に溶解物が毒性を示し
た。

＊ CH2株及びCH7株はニワトリ大腸菌単離物である。ZF
24株はヒト排泄物の無毒性大腸菌単離物である。

日齢３週間のニワトリに類似の調製物を静脈注射して
も影響は皆無であった（データは示さない）。

B.Veroテスト５％ウシ胎児血清（FCS）と200U/mlペニシリンと200
μg/mlストレプトマイシンとを加え且つフィルター滅菌
後に２μg/mlのfungizoneを加えた培地６（１当たり8
5mlのMEMイーグルと100mlのリン酸トリプトースブロス
（tryptose phosphate broth）と50mlの4.4％NaHCO₃と
を含む）を用いて、５％CO₂雰囲気下37℃でVero細胞を
増殖させた。トリプシン処理の後で、これらの細胞をウ
ェル数96の平底形ポリスチレン培養プレート（Greine
r）に播種した。即ち、2x10⁵/mlの細胞を含む完全培地
６をウェル当たり200μｌで植込んだ。一晩インキュベ
ートすると単層が形成された。この培地を捨て、代わり
に、FCSを含まず10μg/mlのキサンチン（３−イソブチ
ル−１−メチル−キサンチン;Sigma）を添加した培地６
をウェル当たり200μｌで使用した。次いで、ウェル当
たり20μｌの毒素調製物を（一連の希釈度で希釈して）
加えた。５日間インキュベートしてから細胞病理学的効
果（CPE）を記録した。

毒素製造に関して株のスクリーニングを行った。その
ためには先ず非希釈上清と1:2で希釈した上清とをウェ
ル当たり20μｌ加えた。次いで、Vero試験で上清が陰性
を示した株を細胞内毒素形成試験にかけた。この試験
は、非希釈細胞溶解物と1:2で希釈した細菌溶解物とを
ウェル当たり50μｌ加えることによって実施した。

結果最初に、表２に挙げた株の毒素製造を検査した。或る
株は上清中に毒素を分泌したが、或る株では毒素が細胞
内に存在し及び／又は細菌細胞を超音波で破壊した時に
だけ検出された。細胞病理学的効果によってVero細胞は
円くなり且つ収縮したが、単層には殆どの場合変化がな
かった。

＊ JA221は大腸菌Ｋ−12株である。ZF24は表１参照の
こと。CH株はニワトリ単離物である。

＊＊毒素力価は毒素効果を与える最後の希釈度の逆数
であると定義される。

C.毒素の安定性種々の処理に対する毒素調製物の感度を調べることに
よって、同定した毒素の予備的特性検査を行った。先
ず、毒性試験に先立ちpH感度を調べるために、毒素をpH
3〜10に調整し且つ室温で一晩インキュベートして中和
した。

熱感度の検査では毒素調製物を様々な温度に加熱し
た。また、SDS及びMEの作用を調べるために、１％SDSの
存在下及び１％SDSと2.5％MEとの存在下で毒素を加熱
し、次いで生理食塩水に対して透析した。尿素に対する
感度の検査では、毒素調製物に6M尿素を１時間加え、次
いで生理食塩水に対して透析した。

Vero細胞アッセイで毒性を検査する前に、ホルマリン
感度を調べるべく種々の濃度のホルマリンを加え、様々
な温度で一晩インキュベートし且つ透析を行った。100
μg/mlのトリプシン（ウシ膵臓;Millipore）を加え、37
℃で４時間インキュベートし、次いで150μg/mlのトリ
プシンインヒビター（大豆;Sigma）を37℃で30分間加え
ることによって、毒性検査の前にトリプシン感度も調べ
た。

結果 Vero細胞毒性アッセイにおける正確なニワトリ毒素力
価の測定は、Vero細胞の状態が日によって変化するため
再現性に乏しい。従って、ここでは典型的実験で得られ
た結果の実例を示すに留どめる。

CH5及びCH7上清をpH3〜10に調整しても毒性には全く
影響がなく、毒素力価は夫々32〜64及び128〜256のまま
であった。

熱感度及びSDS又はSDS＋ME処理に対する感度は表３に
示した。

CH2溶解物の毒性並びにCH5及びCH7上清の毒性は、よ
り高い温度に長時間暴露すると幾らか減少し、120℃に
加熱すると完全に消滅したが、この毒素は比較的熱安定
性であるとみなされる。SDS又はSDS＋MEの存在下で10分
加熱しても、CH5及びCH7上清の毒性には何の変化もない
からである。

CH2溶解物並びにCH5及びCH7上清を6M尿素で処理して
も夫々のVT力価には全く影響がなかった。

表４に示すように、CH7上清の毒性は室温及び37℃で
ホルマリンにより不活性化される。

CH5及びCH7上清の毒性はいずれもトリプシンで処理す
ると完全に消滅したが、偽処理（sham treatment）及び
トリプシンインヒビターだけでの処理では毒性は全く変
化しなかった。

D.分子量の測定 CH7株の毒素の分子量を、Laemmliの方法により12％ゲ
ル（アクリルアミド：ビス＝30:0.8）で分析用ゲル電気
泳動を行い且つ基準と比較することによって測定した。

ゲルはクーマシーブリリアントブルー（CBB）で染色
した。走査はゲルスキャナーモデルCS−930及び記録計D
R−２（京都市、島津製作所）を用いて行った。

第１図は分子量マーカーを付与し且つクーマシーブリ
リアントブルーで染色したゲルの走査図を示している。
ピーク１〜６に対応する基準は夫々78000、66000、4500
0、30000、17200及び12300Dの分子量を有する（LKB1860
−12Bromma,Sweden）。

第２図及び第３図は夫々実施例１のステップＡ及びス
テップＢで得た生成物の走査図を示している。

大腸菌CH7株の毒素サブユニットの分子量はこれらの
実験では約47kDであった。

E.等電点の測定実施例１のステップＡで得た大腸菌CH7株の毒素3mlを
pH3〜７のServalytes（分析グレードServa,Heidelberg,
Germany）0.5mlと蒸留水（aqua dest）46.5mlとの混合
物と一緒に12Wで５時間フォーカシングにかけることに
よって、毒素の等電点を調べた（Rotofor,Bio−Rad,Ric
hmond,USA）。毒素含量は分析用ゲル電気泳動によって
測定した。

この実験の結果を表５に示す。

これらの結果から、大腸菌CH7株毒素の等電点はpH約
4.8であることが判明した。

結果＊−＝毒素無検出＋＝かろうじて検出＋＝検出＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋＝毒素量の増加 F.糖含量実施例１のステップＢで得た大腸菌CH7株の毒素は、
多糖も他の糖類も、Duboisらのフェノール−硫酸アッセ
イ（Analytical Chemistry28,350−356;1956）での測定
によれば、全く含んでいなかった。Limulus Amoebocyte
Lysateテスト（Pyrotell,MA,USA）では顕著なLPS（エ
ンドトキシン）活性は検出されなかった。

G.アミノ酸の分析 Changの液相DABITC法（Methods Enzymology91,455−4
66;1983）でＮ末端アミノ酸配列を測定した。DABTH−ア
ミノ酸の同定は薄層クロマトグラフィーによって行っ
た。アミノ酸組成はJanssenらのPTC法（Chromatographi
a22,345−358;1986）により、CH7−FTの47kDというサブ
ユニット分子量が合計446個のアミノ酸に対応すると仮
定した算出した。

結果実施例１のステップＡ及びステップＢで得た大腸菌CH
7株の毒素は下記のＮ末端アミノ酸配列を有していた： Ala−Gln−Val−Ile−Asn−Thr−Asn−Ser−Leu−Ser−
Leu−（？）−Thr−Gln この配列は、Kuwajimaらによって記述されている大腸
菌Ｋ−12フラジェリン（Journal of Bacteriology168,1
479−1483:1986）のＮ末端アミノ酸配列と同じである。

この毒素のアミノ酸組成を表６に示した。この組成も
大腸菌Ｋ−12フラジェリンにかなり類似している。

１）PTC法により推定（Chromatographia22,345−358;19
86）。

２）DNA配列に基づいて算出（Journal of Bacteriology
168,1479−1483;1986）。

実施例３ FT発現に関するニワトリ大腸菌株のスクリーニング及び
FTの血清学的特性検査世界中から集めた合計124のニワトリ大腸菌単離物を
毒性、致死性及び細菌表面でのFT抗原の発現に関してス
クリーニングした。FTの可視化及び交差反応の検査に
は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を使用
した。

方法毒性検査及び毒素の中和これらの株を実施例2Bで記述したようなVero細胞上で
の毒性に関して検査した。毒性検査の前に、毒素調製物
を抗血清希釈物と共に37℃で２時間インキュベートして
中和した。

運動性検査これらの株の運動性を、寒天濃度の低い（0.25％）栄
養ブロスの入ったＵ形管で検査した。これらのＵ形管の
片側に大腸菌株を接種し、37℃で一晩インキュベートし
た後、該管の反対側への移動を記録した。

抗血清の産生ウサギ及びニワトリの体内で、実施例1Aの方法で調製
した大腸菌CH7株のFTに対する抗血清を産生させた。実
施例1Bの方法で調製したCH5株及びCH7株の毒素を用いて
モノクローナル抗体（MoAb）を産生した。MoAbを産生す
るには、先ず免疫したマウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞と
融合し、得られたハイブリドーマをELISAでの抗毒素抗
体分泌に関してスクリーニングした。陽性ハイブリドー
マを限界希釈によってクローン化した。このクローン化
ハイブリドーマをマウスに腹腔内注射して腹水を調製し
た。この腹水を56℃で10分間不活性化し、脂質を1,1,2
−トリクロロトリフルオロエタン（Merck）で抽出し、5
0％飽和硫酸アンモニウムによってMoAbを沈澱させた。

大腸菌株によるFT抗原の発現 CH7株（015:K14:H10）のFTに対するウサギ抗血清を、
毒素を発生しない大腸菌RDEC−１株（015:K14）に室温
で24時間吸収させた。この吸収された抗血清を使用し、
下記の方法で実施される全菌（whole bateria）ELISAに
おけるFT発現について株のスクリーニングを行った。

細菌をTSB中で撹拌せずに６時間増殖させ、3,000rpm
で15分間遠心分離し（Sorvall RT6000）、660nmでのO.
D.が0.140〜0.180になるまでCBBバッファ（1.59g/ Na
₂CO₃;2.93g/ NaHCO₃;0.2g/ NaN₃;pH9.6）に再懸濁
させた。平底形ポリスチレン微量滴定プレート（Greine
r）にこれらの細菌懸濁液をウェル当たり100μｌで播種
し、50℃で一晩乾燥した。これらのプレートをなま水で
洗浄し、ウェル当たり110μｌのPBS−Ｔ−Ｎ（0.04M PB
S,pH7.2;0.5％ Tween80;15％ウシ新生児血清）により室
温で１時間ブロックした。次いで、PBS−Ｔ−Ｎで1:100
の希釈度から希釈した吸収血清の一連の希釈物をウェル
当たり100μｌで加えた。株当たり２つのPBS−Ｔ−Ｎを
含むウェルをバックグラウンド対照として使用した。37
℃で１時間インキュベートした後、これらのプレートを
洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG（Ｈ＋
Ｌ）をPBS−Ｔ−Ｎで適当に希釈して各ウェルに100μｌ
ずつ加えた。37℃で30分間インキュベートした後、これ
らのプレートを再度洗浄した。ureum−ペルオキシド（O
raganon Teknika,Oss）と3,3′,5,5′−テトラメチルベ
ンジジンとを酢酸ナトリウム−クエン酸バッファ（pH5.
5）中に溶解したTMB基質バッファをウェル当たり100μ
ｌ加えることによって、抗体結合を比色法で調べた。こ
の反応は暗所で10分間生起させ、50μｌの4N H₂SO₄を加
えることによって停止させ、Microelisaリーダーにより
450nmで測定した。力価は、バックグラウンドA₄₅₀の少
なくとも２倍のA₄₅₀を与える最大抗血清希釈度として測
定した。

いずれのアッセイでも、CH7株及びRDEC−１株が夫々
陽性対照及び陰性対照として含まれていた。

ウェスターンブロッティング本質的にMuilermaらの方法（Anal.Biochem.120,46−5
1;1982）に従ってイムノブロッティング又はウェスター
ンブロッティングを行った。細菌をTrypticase Soy Bro
th中で撹拌しながら６時間増殖させることによって、株
の未精製FT調製物を調製した。激しく混合した後遠心分
離にかけて細菌を取出し、上清をエタノール沈澱で約40
倍に濃縮した（上清１部を96％エタノール２部と共に４
℃で一晩インキュベートし、遠心分離にかけ、沈澱物を
pH7.2の0.04mol/ PBS中に溶解した）。SDS−PAGE中で
これらの未精製FT調製物を泳動させ、硝酸セルロース膜
フィルターにトランスブロットさせた。抗体とのインキ
ュベーション、適当なペルオキシダーゼ結合抗種（anti
−species）IgG（Ｈ＋Ｌ）とのインキュベーション、並
びにureumペルオキシド及び3,3′−ジアミノベンジジ
ン.4HClとのインキュベーションを順次行って、抗原を
可視化した。

イムノゴールド（immunogold）−電子顕微鏡検査（IG−
EM）本質的にvan Alphenらの方法（Infect.Immun.56,1800
−6;1988）でIG−EMを実施した。即ち、Trypticase Soy
Broth中で増殖させた細菌を、PBSに１％BSA及び0.05％
Tween20を加えたもの（PBS−Ｂ−Ｔ）で希釈した抗体希
釈物と共にインキュベートし、PBSで３回洗浄し、金の
球体（gold spheres）で標識したプロテインＡと共にPB
S−Ｂ−Ｔ中でインキュベートした。PBSで更に３回洗浄
した後、細菌をFormvarコーティングしたグリッドに移
し、１％酢酸ウラニル又はホスホタングステン酸でネガ
ティブ染色した。

結果世界中から集めた124のニワトリ大腸菌株のうち73の
株（59％）が、Vero細胞上で活性を示す毒素を検出可能
な量で分泌した。別の37の株（30％）は、細菌溶解後に
Vero細菌に対する毒性を示すようになった。全菌ELISA
では52の株（42％）がCH7−FTに対応する抗血清と反応
した。このELISAで陽性であった株は総て細胞外Vero毒
素も産生した（表７参照）。

１）全菌ELISAにおけるCH7−FT抗血清との反応。

２）細菌培養上清のVero細胞に対する毒性。

Vero毒素の分泌と株の運動性との間には密接な相関関
係が存在していた（表８参照）。

１）Ｕ形管内での運動性２）細菌培養上清のVero細胞に対する毒性。

これらの結果も、鞭毛中にVero毒素活性が存在するこ
とを立証している。また、Vero毒性は細菌がＵ管を通っ
た後で増加することが判明した。これらの結果は更に、
種々の株の毒素が血清学的に交差反応することも示して
いる。

種々の株の毒素の間の交差反応を更に調べた。表９に
示すように、株CH7のFTに対するウサギ及びニワトリの
抗血清は、検査した他の総ての毒発生株のVero毒性を中
和した。株CH5及びCH7のFTに対するMoAbは毒性を全く中
和しなかった。

１）表２参照。

２）偽処理した上清、又は免疫前血清で処理した上清。

３）ウサギ抗CH7−FT抗血清、希釈度1:10。

４）ニワトリ抗CH7−FT抗血清、希釈度1:10。

１）KO7577＝CH7−FTに対するウサギ抗血清。

BB1−２＝CH7−FTに対するニワトリ抗血清。

αH10＝H10鞭毛をタイピングするための凝集性抗血
清、RIVM（Bilthoven）から入手。

Int1−７＝CH7−FTに対するMoAb。

Int12−13＝CH5−FTに対するMoAb。

２）単一もしくは主要ブロットバンドの大体の見掛け分
子量（kD）を表すデータ。

３）A.M.Lawn（J.Gen.Microbiol.101,112−130;197
7）。

４）H10鞭毛基準株との比較により本発明で算出した
値。

種々の抗血清を用いて実施した未精製FT調製物のウェ
スターンブロッティングの結果を表10に示す。CH7−FT
に対するウサギ及びニワトリ抗血清（夫々KO7577及びBB
1−２）は、検査した他の総てのFT調製物と反応した
が、バンドの分子量は株の間で異なっていた。抗H10鞭
毛凝集性抗血清を使用した場合も同様の結果が得られ
た。また、CH5−FTに対するMoAb Int12−13は、ウェス
ターンブロッティングで同じパターンを示した。CH7−F
Tに対するMoAb Int1−７はＣ、H7−FTの47kDバンドとだ
け反応した。種々の株のＨ型に対応するフラジェリンの
分子量は、各FTの見掛け分子量と殆ど同じであった。RI
VM（Bilthoven）から入手したH10型鞭毛を有する株の多
くは、ポリクローナル抗血清でのウェスターンブロッテ
ィングでは45kD又は47kDのいずれかでバンドを示した。
MoAb Int1−７は、H10鞭毛株の47kDバンドとだけ反応し
た。ウェスターンブロッティングのバンドの強度は、未
精製FTの調製の前に株をＵ管に通すと増加した。

IG−EMでは、CH7−FTに対するポリクローナル抗血清
を用いると、CH5細菌及びCH7細菌の鞭毛様フィラメント
が金の球体で標識された。CH7−FTに対応するMoAb Int1
−７を用いた時は、CH5ではなくCH7の鞭毛様フィラメン
トだけが金の球体で標識された。分離用SDS−PAGEを用
いて実施例1Bの方法で調製したCH5−FTに対するMoAb In
t12−13を使用すると、鞭毛様フィラメントは余り標識
されず、幾つかの金の球体がCH5及びCH7細菌表面に観察
されただけであった。実際、MoAb Int12−13は解離FTと
だけ反応し（ウエスターンブロット、ELISA）完全なFT
とは反応しなかった（IG−EM、ELISA）。

これらの結果はいずれも、Vero毒性活性が鞭毛中に存
在するか又はFTが鞭毛と同じであることを証明してい
る。また、種々の株のFTは血清学的に交差反応し合う傾
向が強く、交差中和作用も有する（cross−neutralizin
g）。

実施例４受動免疫によるブロイラーの防護実施例1Aの方法で調製したCH7−FTをニワトリにワク
チン接種することによって、CH7−FTに対する抗血清を
産生させた。種々のニワトリに由来する抗血清をプール
し、56℃で10分間不活性化した。

日齢３週間のブロイラー（Euribrid,Boxmeer,The Net
herlands）に前記CH7−FT抗血清1mlを静脈注射した。抗
血清注射してから１時間以内に、細菌懸濁液0.2mlをニ
ワトリの右側後部の胸部気嚢に注射して感染させた。細
菌は血液寒天ベースプレート（Oxoid）上で一晩培養
し、PBS中に懸濁させ、且つ適当な濃度に希釈した。使
用した大腸菌株は総て大腸菌（colibacillosis）に感染
したニワトリの心臓から単離したものである。抗血清を
投与しない、又は陰性対照血清のみを投与した対照グル
ープのニワトリにも同量の細菌を投与した。この誘発処
理（challenge）の後で、ニワトリを減圧隔離室に収容
して、随意に食糧及び水を与えた。誘発から７日後の死
亡率を記録した。

表11に示すように、ニワトリをCH7−FT抗血清で受動
免疫すると、検査した５つの大腸菌株のうち３つの株で
の誘発に対して高度の防護が得られた。高度の防護が見
られたこれら３つの株のうち２つは培養上清中に毒性活
性を分泌しており、１つは細胞溶解後に初めてVero細胞
に対する毒性活性を示した。著しい防護が見られなかっ
た残りの２つの株はいずれも細胞溶解後でないと毒性活
性を示さなかった。驚くべきことに、高度の防護が得ら
れたのは運動性株による誘発の場合だけである。

【図面の簡単な説明】

第１図はクーマシーブリリアントブルーで染色し分子量
マーカーを備えたゲルの走査図、第２図及び第３図は夫
々実施例１のステップＡ及びＢで得た生成物の走査図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭63−12286（ＪＰ，Ａ) 特表平４−502402（ＪＰ，Ａ) 米国特許4702911（ＵＳ，Ａ) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 168（３），ｐ1479−1483（1986) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/245 A61K 39/108 C12P 21/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】個体を大腸菌感染症から防御するためのワ
クチンであって、大腸菌の鞭毛あるいは鞭毛のフラジェ
リンサブユニットを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項２】鞭毛がVero細胞に対する毒性活性を有する
ことを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】大腸菌の鞭毛毒素あるいはこの毒素のフラ
グメントであって、１）ベロ細胞および生後間もないニワトリに対して毒素
活性を有する鞭毛を持った大腸菌細胞を培養し２）大腸菌細胞から鞭毛を分離しすることによって得る
ことができ、その単離され、精製された毒素が更にａ）単一ポリペプチド鎖からなり、ｂ）SDS−PAGEで測定した分子量が30〜100kDであり、ｃ）フィラメント集合体の中に及び／又はフィラメント
集合体と結合した状態であり得、ｄ）結合炭化水素残基を生来もたず、ｅ）ベロ細胞及び生後間もないニワトリに対して毒性を
示し、ｆ）100℃で１時間加熱しても毒性を失わず、且つｇ）温血動物において、大腸菌感染に対して免疫活性を
有することを特徴とする毒素又はこの毒素のフラグメント。
【請求項４】請求項３に記載の大腸菌鞭毛毒素あるいは
そのフラグメントであって、１）血清型H10に属する株の大腸菌をTrypticase Soy
Broth中に培養し、２）得られた培養物の無細胞上清をカットオフ値30kDの
フィルターで濃縮し、３）このフィルター上の物質を20mmol/のトリス−塩
酸緩衝液で洗浄し、４）洗浄した物質をSepharose4Bカラムで分離し、５）高分子量画分を回収し、６）この画分を調製用SDS−PAGEにかけることによって得ることができることを特長とする、前記大腸菌鞭毛毒
素あるいはそのフラグメント。
【請求項５】SDS−PAGEでの分子量が約47kDであり、等
電pHが約4.8であり、部分的アミノ末端アミノ酸配列がA
la−Gln−Val−Ile−Asn−Thr−Asn−Ser−Leu−Ser−L
eu−（？）−Thr−Glnであることを特徴とする請求項４
に記載の毒素又は該毒素のフラグメント。
【請求項６】請求項３から５のいずれか一項に記載の毒
素から誘導されることを特徴とする、個体を大腸菌感染
症から防護するためのワクチン。
【請求項７】請求項３から５のいずれか一項に記載の毒
素又はそのフラグメントをコードするDNA配列を発現で
きる形質転換した微生物を含むことを特徴とする、個体
を大腸菌感染症から防護するためのワクチン。
【請求項８】請求項３に記載の毒素の精製方法であっ
て、CH7株の毒素に対応する抗体と反応する大腸菌の無
細胞フラクションを、例えば限外濾過、遠心分離及び／
又は分子篩クロマトグラフィーを用いて上清から低分子
量成分を除去することによって精製し、毒素含有フラク
ションを前記抗体との反応性によって選択することを特
徴とする精製方法。