HU210965B - Method for the preparation of a vaccine against escherichia coli infections and of a toxin bilding active ingredient thereof, as well as a method for the purification of such a toxin - Google Patents

Method for the preparation of a vaccine against escherichia coli infections and of a toxin bilding active ingredient thereof, as well as a method for the purification of such a toxin Download PDF

Info

Publication number
HU210965B
HU210965B HU905053A HU505390A HU210965B HU 210965 B HU210965 B HU 210965B HU 905053 A HU905053 A HU 905053A HU 505390 A HU505390 A HU 505390A HU 210965 B HU210965 B HU 210965B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
toxin
escherichia coli
coli
strains
molecular weight
Prior art date
Application number
HU905053A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT59612A (en
HU905053D0 (en
Inventor
Johannes Franciscus Bosch
Original Assignee
Akzo Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nv filed Critical Akzo Nv
Publication of HU905053D0 publication Critical patent/HU905053D0/hu
Publication of HUT59612A publication Critical patent/HUT59612A/hu
Publication of HU210965B publication Critical patent/HU210965B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás Escherichia coli (E. coli) fertőzések ellen védő vakcina és a vakcina hatóanyagát képező toxin előállítására, valamint a toxin tisztítására.
Az E. coli igen elterjedt baktérium, amely a legtöbb állat emésztőrendszerében megtelepedik. A baktérium jelenléte általában komoly káros hatásoktól mentes - a legtöbb esetben a baktérium még a gazdaszervezet számára kedvező folyamatokban is résztvesz. Egyes esetekben azonban az E. coli komoly betegségeket okozhat, különösen fiatal állatokban. Ez madaraknál is előfordulhat, és a nagyüzemi baromfitenyésztésben az ilyen fertőzés járványossá válhat, ami a fiatal állatok komoly legyengüléséhez és még nagymértékű pusztulásához is vezethet.
Természetesen megkísérelték a szárnyasok ilyen E. coli fertőzéseit kézbentartani, vakcinálási programmokkal. Erre a célra felnőtt csirkéket bakterinekkel inaktivált E. coli baktériumokkal - vakcináltak [Avian Diseases 29 (4), 1108-1117 (1985)]. A bakterin-vakcinák hátránya, hogy komoly mellékreakciókkal járnak. Ezenkívül, a bakterin-vakcinálás elsősorban lipopoliszacharidok elleni antitesteket eredményez, amelyek csak bizonyos 0 szerotípusú E. colira specifikusak, így a többi E. coli szerotípus ellen nem nyújtanak védelmet.
Az E. coli fertőzések elleni küzdelemben gyakran használnak ezekből a baktériumokból származó pilusokat tartalmazó vakcinákat is. Azonban ezek a vakcinák csak korlátozott védőhatást fejtenek ki, legfeljebb a vakcináit egyedek 80%-a válik védetté. Ezért az E. coli vakcinák gyakran egy másik virulencia faktort - inaktivált E. coli toxint - is tartalmaznak komponensként.
Az E. coli több típusa tartalmaz flagellumokat, amelyeknek a mozgásban van szerepük. Az E. coli flagellumokat nem tekintették virulencia-faktornak, így ezeket eddig az E. coli vakcinák nem tartalmazták.
A találmány azon a felismerésen alapul, hogy az E. coli flagellumai kapcsolatban vannak a Verő sejtekkel szembeni erős toxikus aktivitással, amelyet eddig nem ismertek fel, és hogy ezek a flagelláris toxinok a virulencia egy jelentős faktorát képviselik.
A fenti felismerés alapján vakcinákat készítettünk az E. coli flagellumaiból kiindulva. Az tapasztaltuk, hogy mind a teljes E. coli flagellumok, mind az azokat alkotó rész-strúkturák, például flagellinek vagy azok fragmentumai vagy aggregátumai használhatók vakcina előállítására, amely védi a vakcináit egyedeket az E. coli fertőzések ellen.
Nagyszámú, főleg csirkéből, de egyéb állatból és emberből is izolált E. coli törzzsel végzett kísérletek szerint a flagellumok kapcsolatban vannak a Verő sejtekkel szembeni toxicitással; ezt a toxikus aktivitást a flagellumok elleni antitestek semlegesítik. Azt is felismertük, hogy az összes vizsgált E. coli törzs flagellumainak toxicitása semlegesíthető a törzsek egyikének flagellumai ellen termelődött egyetlen antiszérummal.
Ezen megfigyelés alapján várható, hogy egyetlen E. coli törzsből kapott flagellumokkal végzett vakcinálás védelmet nyújt az összes, flagellummal rendelkező E. coli törzzsel szemben.
A fenti megfontolások alapján, a találmány szerinti eljárással előállított vakcina hatóanyagként E. coli flagellumokból származó új toxinokat tartalmaz, amelyek jellemzője, hogy protein jellegűek, flagellumokban és/vagy flagellumokkal kapcsolódva fordulnak elő, és móltömegük 30-100 kD, SDS-PAGE mérés alapján, nem tartalmaznak megkötött szénhidrát-maradékokat, Verő sejtekkel és napos csibékkel szemben toxikusak, és toxicitásukat 100 °C-on 1 órán át tartó melegítés után is megtartják.
A fenti jellemzők összessége megkülönbözteti ezeket az új toxinokat az E. coli ismert toxinjaitól: a hőre labilis enterotoxintól [Clements J. D.: és Finkelstein R.
A.: Infect. and Immun. 24, 760-769 (1979)], a hővel szemben stabil enterotoxintól [Alderete J. F. és Robertson D. C.: Infect. and Immun. 19, 1021-1030 (1978)], a citotoxintól [Konowalchuk N. J. és munkatársai: Infect. and Immun. 20,575-577 (1978)], a CNF-faktortól [Caprioli A. és munkatársai: Infect. and Immun. 39, 1300-1306 (1983)] és a hemolizintől [Hughes C. és munkatársai: Toxicon 20, 247-252 (1982)].
A fenti új toxinok számos E. coli törzsben megtalálhatók, és ezeket flagelláris toxinoknak (FT) nevezzük a leírásban, mivel jellegzetes módon a flagelláris szerkezetekben fordulnak elő. Ezek a flagellumok általában lényegesen nagyobbak, mint a normális fimbriák (amelyek rendszerint mintegy 7 nm átmérőjűek, és legfeljebb mintegy 1 μπι hosszúságúak), vastagságuk egészen 25 nm, hosszúságuk 7 μηι lehet.
A fenti új toxinok egyik képviselőjét csirke E. coli CH7 törzsből izoláltuk (015:K14:H10), az 1. példában ismertetett eljárással. Ez a CH7-FT (a CH7 törzs flagelláris toxinja) különféle formákban izolálható: vagy asszociálódva mint natív H10 típusú flagellum, vagy mint szabad toxin, vagy a szabad toxinból kapott apró, tűszerű filamentumokkal reasszociálódva. A fenti CH7-FT jellemzői a fent említett általános jellemzőkön kívül az, hogy van egy mintegy 47 kD móltömegű alegysége, SDS-PAGE mérés szerint, izoelektromos pH-ja mintegy 4,8, és amino-terminálisának részleges aminosav-szekvenciája Ala-GlnVal-üe-Asn-Thr-AsnSer-Leu-Ser-Leu-(?)-Thr-Gln. (A CH7-FT jellemzését a 2. példában ismertetjük.)
A CH7-FT ellen termelődő antiszérum kísérleteinek szerint keresztreakciót ad minden vizsgált E. coli törzs FT-jával. Ennek megfelelően, az ilyen CH7-FT elleni antiszérumot használhatjuk az összes többi találmány szerinti FT jellemzésére. Ezenkívül, a monoklonális antitestek vagy specifikusak, vagy keresztreakciót adók az összes többi vizsgált E. coli törzs FT-jével.
A találmány szerinti eljárás olyan E. coli fertőzés ellen immunizáló aktivitású vakcinák előállítására is vonatkozik, amelyek hatóanyagát a találmány szerinti eljárással előállított inaktivált toxin képezi.
A fenti vakcinák hatóanyagát képező toxinokat a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy E. coli baktériumokat flagellumképződést elősegítő körülmények között tenyésztünk, és a toxint a tenyészetből elválasztjuk a flagellumok vagy a baktériumok sejtmentes felülúszójának elválasztásával. Az FT-t tovább
HU 210 965 Β tisztíthatjuk a felülúszó kismóltömegű komponenseinek ultraszűréssel és/vagy molekulaszűrő-kromatográfiás eljárással való eltávolításával.
A fenti tisztítási eljárás során az FT-ben feldúsult frakciót CH7-FT ellen termelődött monoklonális antitestekkel való reaktivitása alapján ismerhetjük fel.
A találmány szerinti eljárással előállított vakcinák az FT egy fragmentumát is tartalmazhatják, amely az azzal vakcináit egyedeknek védelmet nyújt E. coli fertőzések ellen.
A találmány szerinti vakcinában használható FT kémiai szintézissel, E. coli sejtekből tisztítással vagy rekombináns DNS eljárással állítható elő.
Az utóbbi esetben a fent említett proteint vagy annak fragmentumát kódoló nukleinsav-szekvenciákat például úgy ismerhetjük fel, hogy egy E. coli DNS génbankot a fenti szekvenciákat tartalmazó egyedi kiónokra szűrünk, például FT elleni monoklonális vagy poliklonális antitestekkel adott specifikus reakció felhasználásával. A nukleinsav-szekvenciákat különféle expressziós vektor DNS-szekvenciákkal kapcsolhatjuk, és az így kapott ún. rekombináns nukleinsavmolekulát egy megfelelő gazdaszervezet transzformálására használhatjuk. A fenti hibrid DNS-molekulák például plazmidokból, fágokból vagy a vírusokban jelenlévő nukleinsav-molekulákból származhatnak. A gazdasejt prokariota, például baktérium, vagy eukariota, például emlős sejt lehet. A transzformált gazdasejteket az FT termelésére használhatjuk, majd a proteint izolálhatjuk és ezt követően beépíthetjük a találmány szerinti eljárással előállított vakcinába.
Másik megvalósítási mód szerint élő vektort tartalmazó vakcinát állíthatunk elő, nempatogén mikroorganizmusok, például az FT-t kódoló gént tartalmazó vírusok vagy baktériumok alkalmazásával.
A találmány szerinti eljárással előállított vakcinák az FT-n mint hatóanyagon kívül vizes közeget vagy víztartalmú szuszpenziót és/vagy egyéb komponenseket is tartalmazhatnak, például az aktivitás és/vagy a tárolási idő növelésére. Ezek a komponensek például sók, az FT toxikus aktivitását (az immunológiai tulajdonságok megmaradása mellett) gátló anyagok, például formaiin, pH-pufferek, emulgeátorok és az immunválaszt fokozó adjuvánsok (így ásványolajok, muramil-dipeptid, alumínium-hidroxid, szaponin, polianionok és amfipatikus anyagok) lehetnek.
A találmány szerinti eljárással előállított vakcina melegvérű állatok (köztük az ember) E. coli fertőzések elleni immunizálására, különösen madarak E. coli fertőzéseinek leküzdésére használható.
Ebből a célból a találmány szerinti eljárással előállított vakcina előnyösen parenterálisan, például szubkután módon vagy intramuszkulárisan adagolható. A fenti módon a vakcinát mind a vakcináit szárnyasok aktív immunizálására, mind a tojóknak, az utódok passzív immunizálására adhatjuk. Az immunizált tojókban a bennük termelődött antitestek természetesen tojásaik sárgájába kerülnek, ennek következtében a kikelt csirkébe is.
Mind a vakcina összetétele, mind a vakcinálási rendszer változtatható a védendő állat fajtájától, a védelem kívánt időtartamától, az adagolás módjától és attól függően, hogy aktív vagy az anyai antitestek segítségével passzív immunizálást kívánunk elérni. A vakcinában a hatóanyag optimális hatékony mennyisége közelítőleg 10-100 pg dózisonként, szárnyasok parenterális vakcinálására. A vakcinát egyéb vakcinákkal kombináltan is adhatjuk.
Az ábrákat röviden az alábbiakban ismertetjük: Az
1. ábra mutatja a móltömeg-markerek analitikai gélelektroforetikus képét. A
2. ábra mutatja az 1. példa A lépésében kapott termék analitikai gélelektroforetikus képét. A
3. ábra mutatja az 1. példa B lépésében kapott termék analitikai gélelektroforetikus képét.
A vízszintes tengelyek képviselik a gél hosszát cmben, míg a függőleges tengelyek a relatív optikai sűrűséget képviselik. A függőleges tengelyeken a gél optikai sűrűsége van feltüntetve a mintafelvitel helyétől (réstől) mért távolság (cm) függvényében.
1. példa
E coli CH7 törzs flagelláris toxinjának izolálása
A. Flagelláris toxin előállítása
E. coli CH7 törzset (015:K14:H10) egy éjszakán keresztül Biostat E fermentorban (Braun) tenyésztünk, 121 Tiypticase-szója-tápközegben (B.B.L.), 14%-ra beállított pO2 mellett, 100-500 fordulat/perc keveréssel. A tenyészetet Pellicon szűrőrendszerben (Millipore) HVLP szűrővel mintegy 1 literre koncentráljuk. A baktériumokat 10 000 fordulat/perccel 30 percen keresztül lecentrifugáljuk (GSA rotor, Sorvall), a felülúszót 0,45 pm-es szűrőn keresztülszűrjük, és a HVLPszűrlethez adjuk.
A szűrletet mintegy 1 literre koncentráljuk és háromszor mossuk 1-1 liter 0,2 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel, PTTK szűrő alkalmazásával.
A PTTK-val kapott koncentrátumot ismételten, mintegy 110-160 ml-es részletekben eluáljuk 10 cm magas és 154 cm2 felületű oszlopon (Amicon model P140x 250), töltetként 0,1% nátrium-azid konzerválószert tartalmazó 50 mmól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,2) (PB) ekvilibrált Sepharose 4BCl-t (Pharmacia, Uppsala, Svédország) használva. Az oszlopot addig eluáljuk, míg a regisztrálószerkezet alapvonala ismét 0 lesz.
A nagy móltömegű molekulákat tartalmazó, első csúcshoz tartozó frakciókat egyesítjük, és YM-100 ultraszűrőn (0 62 mm Amicon, Amicon UF model 202 berendezéssel) koncentráljuk, 2-3 mg/ml protein-koncentráció eléréséig, A koncentrátumot kétszer dializáljuk 5-5 liter 20 mmól/1 koncentrációjú, 0,1% nátriumazid konzerválószert tartalmazó Tris-H Cl-pufferrel (pH 7,5) szemben.
B. Szabad toxin előállítása
A koncentrátumot preparatív elektroforézisnek vetjük alá, Laemmli módszere szerint [Natúré 227, 680684 (1970)]. 20 ml glicerinből, 20 ml 0,5 mól/1 kon3
HU 210 965 Β centrációjú Tris-HCl-pufferből (pH 6,8), 20 ml 10%-os SDS-ből, 5 ml 2-merkapto-etanolból (ME) és 2 ml 0,05%-os brómfenolkékből álló pufferrel 1:1,67 arányban hígítjuk.
Ezután mintegy 5 percen keresztül vízben forraljuk, lehűtjük és 12% (akril-amid:bis = 30:0,8) preparatív poli(akril-amid) géllemezen (16 x 0,6 cm) elektroforetizáljuk. A minták gélenként rendszerint 15-23 mg proteint tartalmaznak (7,5 ml koncentrátum és 5,0 ml puffer). Az elektroforézist Protean cell model 1423 (Bio-Rad, Richmond, USA) vagy model SE 600 (Hoefer, San Francisco, USA) készülékkel végezzük. A front gélből való eluálódása után az elektroforézist még 1 órán keresztül folytatjuk, 200 V-tal. A gélt ezután közelítőleg 1,5-2 mm-es szeletekre vágjuk.
A proteineket 10 ml, 0,89% nátrium-kloridot és 0,1% nátrium-azidot tartalmazó oldattal eluáljuk, szobahőmérsékleten 3 órán keresztül, majd 4 °C-on egy éjszakán át, állandó keverés mellett. A szeleteket eltávolítjuk és az oldatokat 0,45 pm-es szűrőn keresztül szűrjük. A tiszta toxin-alegységeket tartalmazó frakciókat egyesítjük és -20 °C-on tároljuk.
A minták protein-tartalmát módosított Folin-Ciocalteu módszerrel mérjük [J. Bioi. Chem. 73, 627, (1927)], a poliszacharidokat fenol-kénsav módszerrel határozzuk meg, Dubois módszere szerint [Anal. Chem. 28, 350-356 (1956)].
2. példa
E. coli CH7 törzs toxinjának jellemzése
Halálozási arány 1 napos csirkék esetén
Első kísérletben a különböző E. coli toxin-készítményekből 0,2 és 0,5 ml-t injektálunk i.p. 1 napos SPF broiler csirkékbe (GVP, Doorn). Második kísérletben 0,5 ml toxin-készítményeket injektálunk i.v. 3 hetes broiler csirkékbe. A pusztulást az injektálást követő 7 napon keresztül feljegyezzük.
Eredmények
Az 1. táblázatból látható, hogy mindkét csirke E.coli törzsből (CH2 és CH7) származó toxin-készítmény halálos 1 napos csirkékre, i.p. injekciót követően. A CH7 törzs esetén mind a felülúszó, mind a lizátum toxikus, míg a CH2 törzs esetén különösen a lizátum bizonyult toxikusnak.
1. táblázat: Halálozási arány E. coli törzsek felülúszójának és lizátumának i.p. injektálását követően 1 napos csirkékbe
Injektált készítmény* Dózis (ml) Elpusztult csirke/összes beoltott csirke
1. napon 4. napon 7. napon
steril TSB 0,5 1/10
ZF24 felülú. 0,2 1/10
felülú. 0,5 1/10
liz. 0,2 1/10
liz. 0,5 1/10
Injektált készítmény* Dózis (ml) Elpusztult csirke/összes beoltott csirke
1. napon 4. napon 7. napon
CH2 felülú. 0,2 1/10 1/10
felülú. 0,5 1/10 1/10
liz. 0,2 9/10 9/10 9/10
liz. 0,5 6/10 7/10 8/10
CH7 felülú. 0,2 2/10 4/10 5/10
felülú. 0,5 4/10 5/10 5/10
liz. 0,2 4/10 4/10 4/10
liz. 0,5 7/10 7/10 7/10'
* a CH2 és CH7 törzsek csirkéből izolált E. coli törzsek a ZF24 törzs emberi ürülékből izolált, nem virulens E. coli törzs
Ugyanezen készítményeket i.v. injektálva 3 hetes csirkékbe, semmiféle hatás nem észlelhető (adatokat nem közöltük).
B. Vero-teszt
A Verő sejteket 37 °C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában tenyésztjük 6-os tápközegben (összetétele: literenként 85 ml MÉM Eagle tápközeg, 100 ml triptóz-foszfát-tápközeg, 50 ml 4,4%-os nátrium-hidrogén-karbonát), amelyet 5% magzati borjúszérummal (FCS), 200 egység/ml penicillinnel és 200 pg/ml streptomicinnel egészítettünk ki, és sterilre szűrés után 2 pg/ml fungizont adunk hozzá. Tripszinezés után a sejteket 96-lyukú laposfenekű polisztirol titrálólemezre (Greiner) oltjuk, 2 X 105 sejt/ml 6-os tápközegből 200 μΐ-t mérünk minden egyes lyukba. Egy éjszakán keresztül tartó inkubálás után kialakul az egysejtréteg. A tápközeget eltávolítjuk és lyukanként 200 μΐ FCS nélküli, 10 pg/ml xantinnal (3-izobutil-l-metilxantin, Sigma) kiegészített 6-os tápközeggel helyettesítjük. Ezt követően a toxin-készítmények sorozathígításos oldataiból lyukanként 20 μΐ-t mérünk a lemez lyukaiba. 5 napos inkubálás után leolvassuk a citopatogén hatást (CPE).
A toxin-termelő törzsek szűrővizsgálatára először hígítatlan és 1:2 hígítású felülúszókból mérünk be 20 μΐ-t lyukanként. Ezt követően azokat a törzseket, amelyek felülúszói a Vero-tesztben negatívnak mutatkoztak, intracelluláris toxin-termelés szempontjából vizsgáljuk, úgy, hogy hígítatlan és 1:2 arányban hígított baktériumlizátumokból mérünk be 50 μΐ-t lyukanként.
Eredmények
Kiindulásként a 2. táblázatban felsorolt törzseket vizsgáltuk toxin-termelés szempontjából. Bizonyos törzsek a felülúszóba ürítették a toxint, míg más törzsekben a toxin intracelluláris volt, és/vagy csak a sejtek ultrahangos feltárása után lehetett kimutatni. A citopatogén hatás a Verő sejtek kigömbölyödésében és zsugorodásában nyilvánult meg, míg az egysejtréteg érintetlen maradt az esetek többségében.
HU 210 965 B
2. táblázat: Különféle E. coli törzsek toxicitása Verő sejteken
Törzs* Szerotípus Toxin titere**
felülúszóban lizátumban
JA221 - -
ZF24 023:K?:H- - -
CH1 078:K80 - -
CH2 078:K80:H4 8
CH3 045:K-:H9 32 64
CH4 O2:K1:H- 8
CH5 02:Kl:H5 32 512
CH6 01:Kl:H- - 4
CH7 015:K14:H10 128 1024
CH8 0115:K? 16
CH13 035:K- 32
* a JA221 egy E. coli KI 2 törzs; a ZF24-et lásd 1. táblázatban; a CH törzseket csirkéből izoláltuk ** toxin titere definíció szerint a még toxikus hatást mutató legutolsó hígítás reciproka
C. Toxin stabilitása
A kimutatott toxin előzetes jellemzésére a toxin-készítmények különböző kezelésekkel szembeni érzékenységét vizsgáljuk. A pH-érzékenységet úgy vizsgáljuk, hogy a toxin pH-ját 3-10 értékre állítjuk, majd egy éjszakán keresztül inkubáljuk, semlegesítjük, és meghatározzuk a toxicitást.
A toxin-készítmények hőérzékenységének vizsgálatára a készítményeket különböző hőmérsékleteken melegítjük.
Az SDS és ME hatásának vizsgálatára a toxint 1% SDS és 1% SDS + 2,5% ME jelenlétében melegítjük, majd sóoldattal szemben dializáljuk.
A karbamiddal szembeni stabilitás vizsgálatára a készítményekhez 6 mól/1 koncentrációban karbamidot adunk, majd 1 óra elteltével sóoldattal szemben dializáljuk.
A formaiinnal szembeni érzékenység vizsgálatára a toxinhoz különböző koncentrációkban formaiint adunk, egy éjszakán keresztül különböző hőmérsékleteken inkubáljuk, és a Verő sejteken mért toxicitási vizsgálat előtt dializáljuk.
A tripszinnel szembeni érzékenység vizsgálatára a toxinhoz 100 pg/ml tripszint (marha pankreász, Millipore) adunk, 37 °C-on 4 órán keresztül inkubáljuk, hozzáadunk 150 pg/ml tripszin-inhibitort (szójabab, Sigma) és 37 ’C-on 30 percen keresztül inkubáljuk, majd meghatározzuk a toxicitást.
Eredmények
Mivel a pontos csirke-toxin titer-meghatározások Verő sejtek elleni toxicitási vizsgálattal nem jól reprodukálhatók, a Verő sejtek különböző napokon mutatott állapotában bekövetkező változások miatt, az alábbi eredmények csak tájékoztató jellegűek.
A CH5 és CH7 törzsek felülúszójának pH 3 - pH 10 közötti kezelése nem befolyásolja a toxicitást, a toxin titerek változatlanul 32-64, illetve 128-256.
A hőérzénységet és az SDS illetve SDS + ME kezeléssel szembeni érzékenységet a 3. táblázatban ismertetjük.
3. táblázat: Hőkezelés hatása csirke-toxin titerekre SDS vagy SDS + ME jelenlétében, illetve távolétében
Kezelés CH2 lizátum CH5 felülúszó CH7 felülúszó,
kontroll 8 32 128
80 ’C (1 óra) 4 8 64
100 ’C (1 óra) 4 8 16
120 ’C (20 perc) 0 0 0
65 ’C (10 perc) 16 64
SDS, 65 ’C (10 perc) 32 64
SDS + ME, 65 ’C (10 perc) 32 64
100’C (10 perc) 8 64
SDS, 100 ’C (10 perc) 32 128
SDS + ME, 100’C, (10 perc) 16 128
Noha a CH2 lizátumának és a CH5 és CH7 felülúszóinak toxicitása némileg csökkent magasabb hőmérsékleteken hosszabb időn tartó kezelés hatására, és teljesen megszűnt 120 °C-on melegítve, a toxint viszonylag hőstabilnak kell tekinteni. 10 perces melegítés SDS, sőt még SAS + ME jelenlétében sem befolyásolta a CH5 és CH7 felülúszók toxicitását.
A CH2 lizátum és a CH5 és CH7 felülúszók 6 mól/1 karbamiddal való kezelése egyáltalán nem változtatta meg a megfelelő Vero-teszt (VT) titereket.
A 4. táblázat adatai szerint a CH7 felülúszó toxicitását a formaiin szobahőmérsékéleten és 37 °C-on teljesen inaktiválta.
4. táblázat: CH7 felülúszó toxicitásának inaktiválása különbözőformalin-koncentrációk mellett 1 éjszakán keresztül tartó inkubálással
Formaiin koncentráció (%) Toxin titer inkubálás után
szobahőmérsékle- ten 37 ’C-on
0 64 64
0,2 32 16
0,5 16 4
1,0 8 2
2,0 1 0
D. Móltömeg meghatározása
ACH7 törzs toxinjának móltömegét analitikai gélelektroforézissel határoztuk meg, 12%-os gélben (akrilamid:bis = 0:0,8), Laemmli módszere szerint, standard mintákkal összehasonlítva.
HU 210 965 Β
A géleket coomassie-brilliant blue (CBB) festékkel festjük meg. A kiértékelést CS-930 gélscannerrel, és DR-2 regisztrálóval (Shimadzu, Kyoto, Japán) végezzük.
Az 1. ábrán látható az ismert móltömegű markereket tartalmazó, CBB-vel festett gél futtatása utáni kiértékelés. Az 1-6. csúcsoknak megfelelő standardok móltömege 78 000, 66 000,45 000, 30 000,172 000 és 12 300 D (LKB 1860-12 Bromma, Svédország).
A 2. és 3. ábrán látható az 1. példa A, illetve B lépésében kapott termék kiértékelése.
Az E. coli CH7 törzs toxin-alegysége a kísérletek szerint mintegy 47 000 D móltömegű.
£. Izoelektromos pont meghatározása
A toxin izoelektromos pontját úgy határoztuk meg, hogy az 1. példa A lépése szerint előállított E. coli CH7 törzs toxinjának 3 ml-ét 0,5 ml Servalytes pH 3-7 (analitikai tisztaságú, Serva, Heidelberg, NSZK) és 46,5 ml desztillált víz elegyével együtt 12 W teljesítménnyel 5 órán keresztül fókuszáljuk (Rotofor, BioRad, Richmond, USA). A toxintartalmat analitikai gélelektroforézissel detektáljuk.
Az eredményeket az 5. táblázatban foglaljuk össze.
Az eredményekből látható, hogy az E. coli CH7 toxinjának izoelektromos pontja mintegy 4,8.
5. táblázat: 3 ml Seph 4B-C1 minta fókuszálásával kapott pH és toxin értékek
Frakciószám PH Toxin*
1. 2,6B +
2. 3,26 +
3. 3,50 -
4. 3,73 -
5. 4,18 -
6. 4,38 +
7. 4,55 +
8. 4,80 ++++
9. 5,09 +
10. 5,32 +
11. 5,50 -
12. 5,82 -
13. 6,23 -
14. 6,57 -
15. 6,85 -
16. 7,14 -
17. 7,47 -
18. 7,97 -
19. 8,41 -
20. 8,75 -
* - nincs látható toxin + éppen látható + látható ++, +++, ++++ növekvő mennyiségű toxin
E Szacharid-tartalom
Az E. coli CH7 törzsből az 1. példa B lépése szerint előállított toxin sem poliszacharidot, sem egyéb más cukrot nem tartalmaz, Dubois és munkatársai szerint végzett fenol-kénsav meghatározás szerint [Analytical Chemistry 28, 350-356 (1956)]. Limulus Amoebocita lizátum teszttel (Pyrotell, MA, USA) nem mutatható ki jelentős mértékű LPS (endotoxin) aktivitás.
G. Aminosav-analízis
Az N-terminális aminosav-szekvenciát folyadékfázisú DABITC eljárással határozzuk meg, Chang [Methods in Enzymology 91,455-466 (1983)] szerint.
A DABTH-aminosavakat vékonyréteg-kromatográfiás eljárással azonosítjuk. Az aminosav-összetételt PTC eljárással határozzuk meg, Janssen és munkatársai [Chromatographia 22, 345-358 (1986)] módszere szerint, feltételezve, hogy a 47 kD móltömegű CH7-FT alegység összesen 446 aminosavat tartalmaz.
Eredmények
Az 1. példa A lépésében és B lépésében kapott E. coli CH7 toxin N-terminális aminosav-szekvenciája az alábbi: Ala-Gln-Vla-Ile-Asn-Zhr-Asn-Ser-Leu-SerLeu-(?)-Thr-Gln
Ez a szekvencia azonos az E. coli K-12 flagellin N-terminális aminosav-szekvenciájával, amelyet Kuwajima és munkatársai ismertettek [Journal of Bacteriology 168, 1479-1483 (1986)].
A toxin aminosav-összetételét a 6. táblázatban ismertetjük, ez is nagymértékű homológiát mutat az E. Coli K-12 flagellinnel.
6. táblázat: E. Coli CH7-FT aminsav-összetétele és összehasonlítása az E.coli K-12 flagellinnel
Aminosav Aminosavak száma (%-a) alegységenként
CH7-FT0 E.coli K-12 flagellin2)
Alá 50(11,2) 59 (11,9)
Arg 12(2,7) 11 (2,2)
Asn Λ Asp J 52(11,7) 48 X 117,5) 39 f
Cys 4 (0,9) 0(0)
Gin Λ Glu f 43 (9,6) 27 X6,2) 14
Gly 37 (8,3) 44 (8,9)
His 0(0) 0(0)
Ile 24 (5,4) 28 (5,6)
Leu 32 (7,2) 37 (7,4)
Lys 28 (6,3) 25 (5,0)
Met 2 (0,4) 3 (0,6)
Phe 9 (2,0) 5(1,0)
Pro 8(1,7) 6(1,2)
Ser 58 (13,0) 43 (8,7)
HU 210 965 Β
Aminosav Aminosavak száma (%-a) alegységenként
CH7-FT» E. coli K-12flagellin2’
Thr 48 (10,8) 65(13,1)
Trp 0(0) 0(0)
Tyr 11 (2,5) 10(2,0)
Val 28(6,3) 33 (6,6)
Összesen 446 497
1) PTC eljárással meghatározva [Chromatographia 22, 345 (1986)]
2) DNS-szekvencia alapján számolva [J. of Bact. 168, 1479 (1986)]
3. példa
Csirkéből izolált E. coli törzsek vizsgálata FT expresszió szempontjából és az FT szerológiai jellemzése
A világ különböző tájairól összegyűjtött, összesen 124, csirkéből izolált E. coli törzset vizsgáltunk toxicitásuk, mozgékonyságuk és a baktérium felületén az FT antigén kifejeződése szempontjából. Az FT kimutatására és a keresztreakciók vizsgálatára poliklonális és monoklonális antitesteket használtunk.
Módszerek
Toxicitás vizsgálata és toxin semlegesítése
A törzsek toxicitását Verő sejteken vizsgáljuk, a 2 példa B lépésében leírtak szerint. Semlegesítés céljából a toxin-készítményket az antiszérum hígításokkal 2 órán keresztül 37 ’C-on inkubáljuk a toxicitási vizsgálatot megelőzően.
Mozgékonyság vizsgálata
A törzsek mozgékonyságát alacsony (0,25%) agarkoncentrációjú tápközeget tartalmazó U-alakú csövekben vizsgáljuk. Az U-csöveket egyik végén beoltjuk egy E. coli törzzsel, és a csöveket egy éjszakán keresztül 37 ’C-on inkubálva regisztráljuk a baktérium vándorlását a cső másik vége felé.
Antiszérum-te rmelés
Az E. coli CH7 törzs 1. példa A lépése szerint előállított FT-ja ellen nyulakban és csirkékben termelődött antiszérum. Az 1. példa B lépése szerint előállított CH5 és CH7 toxinokat használtuk monoklonális antitestek (MoAb) termelésére. MoAb termelés céljából immunizált egérből származó lépsejteket mielomasejtekkel fuzionáltunk, és a kapott hibridomákat ELISN módszerrel szűrtük antitoxin antitest szekrécióra. A pozitív hibridomákat határhígítással klónozzuk. A klónozott hibridomákat intraperitoneálisan egerekbe injektálva állítjuk elő az aszcitesz-folyadékot. Az aszciteszt 56 ’C-on 10 percen keresztül kezelve inaktiváljuk, a lipideket 1,1,2-triklóí-trifluoretánnal (Merck) extraháljuk, és az MoAb-ket 50%-os telített ammónium-szulfát-oldattal kicsapjuk.
FT antigén expressziója E. coli törzsekben
A CH7 törzs FT-ja ellen termelődött nyúl-antiszérumot (015:K14:H10) szobahőmérsékleten 24 órán keresztül abszorbeáljuk a nem-toxigén E. coli RDEC-1 törzzsel (015:K14). Az így abszorbeált antiszérumot használjuk az FT-t kifejező törzsek kiszűrésére, az alábbiak szerint teljes baktériumokban kivitelezett ELISA módszerrel.
A baktériumokat keverés nélkül, 6 órán keresztül TSB-ben tenyésztjük, majd 15 percen keresztül 3000 fordulat/perccel centrifugáljuk (Sorvall RT6000) és CBB-pufferben (1,59 g/1 nátrium-karbonát, 2,93 g/1 nátrium-hidrogén-karbonát, 0,2 g/1 nátrium-azid, pH 9,6) újraszuszpendáljuk, 660 nm-en 0,140-0,180 O.D. koncentrációban. Az így kapott baktérium-szuszpenziókból 100 μΐ-t mérünk lyukanként laposfenekű polisztirol mikrotitráló lemezekbe (Grener), és 50 ’C-on egy éjszkán keresztül száradni hagyjuk. A lemezeket csapvízzel mossuk és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül lyukanként 110 μΐ PBS-T-N-nel (0,04 mól/1 PBS, pH 7,2, 0,5% Tween 80, 15% újszülött borjú szérum) blokkoljuk. Ezután hozzáadunk lyukanként ΙΟΟμΙ-t az abszorbeált szérum sorozathígításaiból, a kiindulási hígítás 1:100, a hígítást PBS-T-N-nel végezzük. Háttérkontrollként törzsenként két lyukba csak PBS-T-N-t mérünk. A lemezeket 37 ’C-on 1 órán keresztül inkubáljuk, mossuk, majd minden lyukba 100 pg peroxidázzal konjugált kecske-anti-nyúlIgG(H+L)-t adunk, PBS-T-N-nel megfelelően hígítva. A lemezeket 37 ’C-on 30 percen keresztül inkubáljuk, majd ismét mossuk. Az antitest-megkötést kolorimetriásan detektáljuk, lyukanként 100 μΐ, karbamid-peroxidot (Organon Teknika, Oss, Holandia) és nátrium-acetát-citromsav-pufferes (pH 5,5) 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidint tartalmazó TMB-puffer hozzáadásával. A reakciót sötétben 10 percen keresztül hagyjuk lejátszódni, majd 50 μΐ 4 n kénsav hozzáadásával leállítjuk, és Microelisa leolvasó készülékkel 450 nm-en elvégezzük a mérést. A titert azzal a legnagyobb antiszérum hígítással definiáljuk, amelynek A450 értéke a háttér A450 értékének legalább kétszerese.
Minden egyes vizsgálatban használjuk a CH7 és RDEC-1 törzseket pozitív, illetve negatív kontrollként.
Western biot módszer
Az immunoblotting vagy Western blotting eljárást Muilerman és munkatársai szerint végezzük [Anal. Biochem. 120, 46-51 (1982)].
A törzsekből nyers FT-preparátumokat készítünk úgy, hogy a baktáriumokat Trypticase-szój a-tápközegen tenyésztjük 6 órán keresztül, keverés közben. A baktériumokat erőteljes keverés után centrifugálással eltávolítjuk, és a felülúszót kb. 40-szeresre koncentráljuk etanolos kicsapással (1 rész felülúszóhoz 2 rész 96%-os etanolt adunk, egy éjszakán keresztül 4 ’C-on inkubáljuk, centrifugáljuk és a csapadékot 0,04 mól/1 koncentrációjú PBS-ben (pH 7,2) oldjuk. Az így kapott nyers FT-preparátumokat SDS-PAGE lemezen futtatjuk és cellulóz-nitrát membránszűrőre átvisszük Cblotting). Az antigéneket úgy tesszük láthatóvá, hogy egy7
HU 210 965 B mást követően inkubáljuk az antitesttel, megfelelő peroxidázzal konjugált IgG(H+L) antispeciesekkel és karbamid-peroxiddal együtt 3,3’-diamino-benzidin·
HCl-dal.
Immuno-arany-elektmnmikmszkópia (IG-EM)
Az IG-EM-et lényegében Alphen és munkatársai módszere szerint végezzük [Infect. Immun. 56, 18001806(1988)].
A Trypticase-szója tápközegen tenyésztett baktériumokat 1% BSA-t és 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel (PBS-B-T) készült antitest-hígításokkal inkubáljuk, PBS-sel háromszor mossuk és PBS-B-T-ben aranygömbökkel jelzett protein Aval inkubáljuk. A baktériumokat PBS-sel még háromszor mossuk, majd Formvar-bevonatú rácsra visszük és 1 %-os uranil-acetáttal vagy foszfo-volfrámsavval megfestjük.
Eredmények
A világ különböző részeiről származó, 124, csirkéből izolált E. coli törzsből 73 törzs (59%) választott ki mérhető mennyiségű, Verő sejtekre aktív toxint. További 37 törzs (30%) toxikusnak bizonyult Verő sejtekre a baktériumok lízise után. Teljes baktériummal végzett ELISA módszerrel 52 törzs (42%) reagált CH7-FT ellen termelt antiszérummal. Az ELISA szerint pozitív összes törzs extracelluláris Verő toxint is termelt (7. táblázat).
7. táblázat: Összefüggés a Verő sejtekkel szembeni toxicitás és a CH7-FT ellen termelődött antiszérummal való reaktivitás között (törzsek száma)
Verő sejtek elleni toxicitás2'
+ -
anti-CH7-FT-vel való + 52 0
reaktivitás - 21 51
1) CH7-FT antiszérummal adott reakció teljes baktériummal végzett ELISA módszerrel
2) Baktériumtenyészet felülúszójának toxicitása Verő sejtekre Szoros összefüggést találtunk a törzsek Verő toxin ürítése és mozgékonysága között is (8. táblázat).
8. táblázat: Összefüggés a Verő sejtekkel szembeni toxicitás és a mozgékonyság között (törzsek száma)
Verő sejtek elleni toxicitás2'
+ -
Mozgékonyság + 69 10
- 4 41
1) Mozgékonyság U-csőben
2) Baktériumtenyészet felülúszójának toxicitása Verő sejtekre
A fenti eredmények további bizonyítékot adnak arra vonatkozóan, hogy a Verő sejtekkel szembeni toxicitást a flagellumok hordozzák. Azt is kimutattuk, hogy a
Verő sejtekkel szembeni toxicitás növekedik a baktériumok U-csövön való áthaladása után. Ezenkívül az eredmények azt mutatják, hogy a különböző törzsek toxinjai szerológiailag keresztreakciót adnak.
A különböző törzsek toxinjai közötti keresztreakci20 ót közelebbről is megvizsgáltuk. A 9. táblázatból látható, hogy a CH7 törzs FT-jára termelődött nyúl és csirke antiszérum az Öszszes többi toxintermelő vizsgált törzs Verő sejtekkel szembeni toxicitását semlegesíti. A CH5 és CH7 törzs FT-ja ellen termelődött MoAb-k egyálta25 Ián nem semlegesítik a toxicitást.
9. táblázat: Verő toxicitás semlegesítése tenyészet felülúszójában CH7-FT-vel szemben termelődött antiszérumokkal
Törzs Szerotípus Verő toxin titer
Kontroll2' K075773’ (1:10) BB1-24’ (1:10)
CH3 045:K-:H9 8 - -
CH5 02:Kl:H5 16 - -
CH7 015:K14:H10 32 - -
CH125 01:Kl:H7 32 4 -
CH135 O2:K1:H4 64 4 -
1) lásd 2. táblázatot
2) álkezelt, vagy pre-immunszérummal kezelt felülúsző
3) nyúl anti CH7-FT antiszérum, 1:10 hígítás
4) csirke anti-CH7-FT antiszérum, 1:10 hígítás
A különböző törzsekből preparált nyers FT-k Western biot analízisének eredményeit különböző antiszérumokkal a 10. táblázat tartalmazza.
10. táblázat: Különböző törzsekből nyert nyers FT-preparátumok Western biot analízise antiszérumokkal, és összehasonlítása a megfelelőflagellin-móltömegekkel
Törzs Szerotípus Antitestek1' Flagellin móltömege
K07577 BB1-2 H10 Int 1-7 Int 12-13
CH3 045:K-:H9 702’ 70 70 - 70 693'
CH5 O2:K1:H5 43 43 43 - 43 463'
CH7 015:K14:H10 47 47 47 47 47 45-474'
CH125 O1:K1:H7 60 60 60 - 60 613'
CH135 O2:K1:H4 35 35 35 - 35 373'
HU 210 965 Β
1) K07577; CH7-FT ellen termelődött nyúl antiszérum
BB1-2: CH7-FT ellen termelődött csirke antiszérum
H10: agglutináló antiszérum H10 flagellumok tipizálására, gyártja a RIVM (Bilthoven, Hollandia)
Int 1-7: CH7-FT ellen termelődött MoAb Int 12-13: CH5-FT ellen termelődött MoAb
2) az adatok a blotban lévő egyetlen sáv vagy fő sávok közelítő látszólagos móltömegét jelentik, kD-ban
3) A. M. Lawn [J. Gén. Microbiol. 101, 112-130 (1977)]
4) saját meghatározásunk H10 flagellumos referenciatörzsekkel
A CH7-FT ellen termelődött nyúl és csirke antiszérum (K07577 és BB1-2) az Összes többi vizsgált FT-preparátummal reagált, annak ellenére, hogy a sávok móltömeg-értékei az egyes törzseknél különbözőek. Azonos eredményeket kaptunk akkor is, ha anti-HlO-flagellumokat agglutináló antiszérumot használtunk. A CH5-FT ellen termelődött MoAb Int 12-13 is hasonlóképpen viselkedett Western biot analízisben. A CH7-FT ellen termelődött MoAb Int 1-7 azonban csak a CH7-FT 47 kD-os sávjával lépett reakcióba. Meglepő módon a különböző törzsek H típusainak megfelelő flagellin-móltömegek majdnem azonosak a megfelelő FT-k látszólagos móltö- 25 megével. Számos H10 típusú flagellumot tartalmazó törzs [amelyeket az RIVM-től (Bilthoven) szereztünk be] poliklonális antiszérumokal végzett Western biot analízissel vagy 45 kD-nál, vagy 47 kD-nál mutatott sávokat.
Az MoAb Int 1-7 a H10 flagellumos törzseknek csak a 30 47 kD-os sávjával reagált. A sávok intenzitása a Western biot analízisben megnövekedett, ha a törzsek a nyers FT preparálása előtt áthaladtak egy U-csövön.
Az IG-EM vizsgálat során a CH5 és CH7 baktériumok flagellumszerű szálait aranygömbökkel jeleztük, 35 CH7-FT ellen termelődött poliklonális antiszérumokat használva. A CH7-FT ellen termelődött MoAb Int 1-7-tel csak a CH7-en lévő flagellumszerű szálakat lehetett arany gömbökkel jelezni, a CH5 baktériumát nem. Az 1.
példa B lépése szerint, preparatív SDS-PAGE alkalmazásával előállított CH5-FT preparátummal szemben termelődött MoAb Int 12-13-mal a flagellumszerű szálak nem jelölődtek jelentős mértékben; csak néhány aranygömböt 5 észleltünk a CH5 és CH7 baktériumok felületén.
Az összes fenti eredmény azt mutatja, hogy a Verő sejtekkel szembeni toxikus aktivitás a flagellumokban lokalizálódik, illetve az FT azonos a flagellummal. Kimutattuk továbbá, hogy a különböző törzsek FT-jai szeroló10 giailag erősen keresztreaktívak, és kereszt-semlegesítők.
4. példa
Broilerek passzív immunizálása
Az 1. példa A lépésében leírtak szerint előállított 15 CH7-FT-nal csirkéket vakcináivá állítjuk elő a CH7-FT ellen termelődött antiszérumot. A különböző csirkékből származó antiszérumokat összegyűjtjük és 56 ’Con 10 percen keresztül inaktiváljuk.
Az így kapott antiszérum 1 ml-ét intravénásán 3 20 hetes brojlerekbe (Euribrid, Boxmeer, Hollandia) injektáljuk. Az antiszérum beadása után 1 órával a csirkéket megfertőzzük, úgy, hogy a jobb hátsó tüdőalveolumba 0,2 ml baktérium-szuszpenziót injektálunk. A szuszpenziót úgy állítjuk elő, hogy a baktériumokat egy éjszakán keresztül véres agarlemezen (Oxoid) tenyésztjük, PBS-ben szuszpendáljuk és a megfelelő koncentrációra hígítjuk. A felhasznált E. coli törzseket colibacillosisos csirkék szívéből izoláltuk. A kontroll csirkéket - amelyeknek nem adtunk antiszérumot, vagy csak negatív kontroll szérumot adtunk - azonos dózisú baktériummal fertőzzük. A csirkéket a fertőzés után csökkentett nyomású izolátorokban tartjuk, élelmet és vizet ad libitum kapnak. A pusztulást a fertőzés után 7 napon keresztül feljegyezzük.
A 11. táblázat adataiból látható, hogy a csirkék CH7-FT antiszérummal való passzív immunizálása jelentős védelmet nyújtott a vizsgált 5 E. coli törzs közül 3 esetén. A fenti 3 törzs közül 2 törzs a tenyészet felülúszójába ürítette a toxint,
11. táblázat: Broilerek védése E. coli fertőzés ellen CH7-FT antiszérummal való passzív immunizálással
Fertőzésre használt törzs CH7-FT antiszérum adagolás Pusztulás p 0,054\elpusztult/összes)
Szám Szerotípus ToxinO Mozgékony- ság Dózis
CH2 078:K80:H4 liz. + 5X106 + 7/17 +
CH2 078:K80:H4 liz. + 5X106 - 14/16
CH5 02:Kl:H5 fu. + 1 X 106 + 3/16 +
CH5 02:Kl:H5 fu. + 1X106 - 6/9
CH6 01:Kl:H- liz. - 1X107 + 15/33 -
CH6 01:Kl:H- liz. 1 X 107 - 21/36
CH7 015:K14:H10 fu. + 2X106 + 3/32 +
CH7 015:K14:H10 fu. + 2X106 - 18/29
CH245 O35:K-:H- liz. - 5X106 + 6/17 -
CH245 035:K-:H- liz. - 5X106 - 7/19
1) Tenyészet felülúszójának (fu) vagy a baktériumsejtek lizátumának (liz) toxicitása Verő sejteken
2) törzsek mozgékonysága U-alakú csőben
3) elpusztult állatok/összes állat száma a fertőzés után 7 nappal
4) antiszérum védőhatásának szignifikanciája (Chi2-teszt)
HU 210 965 Β míg egy törzs esetén csak a baktérium lizátuma volt toxikus Verő sejtek ellen. Az a két törzs, amelyek ellen nem tapasztaltunk szignifikáns védelmet, szintén csak a baketérium-lizátumban mutatott toxicitást. Igen figyelemreméltó, hogy csak a mozgékony törzsekkel való fertőzés ellen tapasztalható szignifikáns védőhatás.

Claims (9)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás Escherichia coli fertőzések ellen védő vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként Escherichia coli flagellumokból származó valamely toxint a vakcina készítésben szokásos segédanyagokkal összekeverünk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Verő sejtekkel szemben toxikus aktivitást mutató toxint alkalmazunk.
  3. 3. Eljárás melegvérű állatokat Escherichia coli fertőzések ellen immunizáló aktivitású toxin - amely (a) egyetlen polipeptid-láncból áll;
    (b) móltömege 30-100 kD, SDS-PAGE módszerrel meghatározva;
    (c) szálas aggregátumokban és/vagy aggregátumokkal együtt fordul elő;
    (d) kötött szénhidrát-maradékokat természetben nem tartalmaz;
    (e) Verő sejtekkel és napos csibékkel szemben toxikus; és (f) toxicitását 100 °C-on 1 órán keresztüli melegítés után is megtartja előállítására, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli sejteket flagellumok képződését elősegítő körülmények között tenyésztünk, és a toxint a tenyészetből elválasztjuk.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (i) az Escherichia coli baktériumot triptikáz-szója-tápközegben tenyésztjük, (ii) a tenyészet sejtmentes felülúszóját 30 kD vágási értékű szűrőn koncentráljuk, (iii) a szűrőn maradt anyagot 20 mmól/1 koncentrációjú
    Tris-HCl pufferrel mossuk, (iv) a mosott anyagot Sepharose 4B oszlopon szeparáljuk;
    (v) összegyűjtjük a nagy móltömegű frakciókat; és (vi) preparatív SDS-PAGE eljárásnak vetjük alá.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy H10 szerotípusú Escherichia coli törzset tenyésztünk.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás olyan toxin vagy annak egy fragmentuma előállítására, amely toxin (a) móltömege mintegy 47 kD, SDS-PAGE módszerrel meghatározva;
    (b) izoelektromos pH-ja mintegy 4,8; és (c) amino-terminális rész-szekvenciája Ala-Gln-ValIle-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-(?)-Thr-Gln, azzal jellemezve, hogy a megfelelő elválasztási módszert alkalmazzuk.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 3-6. igénypontok bármelyike szerint előállított toxint alkalmazzuk.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 3-6. igénypontok bármelyike szerinti toxint vagy annak egy fragmentumát kódoló DNS-szekvenciát expresszálni képes transzformált mikroorganizmust alkalmazunk.
  9. 9. Eljárás melegvérű állatokat Escherichia coli fertőzések ellen immunizáló aktivitású toxin - amely (a) egyetlen polipeptid-láncból áll;
    (b) móltömege 30-100 kD, SDS-PAGE módszerrel meghatározva;
    (c) szálas aggregátumokban és/vagy aggregátumokkal együtt fordul elő;
    (d) kötött szénhidrát-maradékot természetben nem tartalmaz;
    (e) Verő sejtekkel és napos csibékkel szemben toxikus; és (f) toxicitását 100 °C-on 1 órán keresztüli melegítés után is megtartja - tisztítására, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli CH7 törzs toxinjával szemben termelődött antitestekkel reaktív E. coli sejtmentes felülúszójából a kismóltömegű komponenseket célszerűen ultraszűréssel, centrifugálással és/vagy molekulaszűrő-kromatográfiás eljárással eltávolítjuk, mimellett a toxin-tartalmú frakciókat a fenti antitestekkel szembeni reaktivitásuk alapján szelektáljuk.
HU905053A 1989-08-18 1990-08-17 Method for the preparation of a vaccine against escherichia coli infections and of a toxin bilding active ingredient thereof, as well as a method for the purification of such a toxin HU210965B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP89202110 1989-08-18

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU905053D0 HU905053D0 (en) 1991-01-28
HUT59612A HUT59612A (en) 1992-06-29
HU210965B true HU210965B (en) 1995-09-28

Family

ID=8202455

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU905053A HU210965B (en) 1989-08-18 1990-08-17 Method for the preparation of a vaccine against escherichia coli infections and of a toxin bilding active ingredient thereof, as well as a method for the purification of such a toxin
HU95P/P00573P HU211827A9 (en) 1989-08-18 1995-06-29 Escherichia coli vaccine

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU95P/P00573P HU211827A9 (en) 1989-08-18 1995-06-29 Escherichia coli vaccine

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5750115A (hu)
EP (1) EP0413378B1 (hu)
JP (1) JP3031561B2 (hu)
KR (1) KR0177510B1 (hu)
CN (1) CN1062605C (hu)
AU (1) AU635062B2 (hu)
CA (1) CA2022420C (hu)
DE (1) DE69016129T2 (hu)
DK (1) DK0413378T3 (hu)
ES (1) ES2070266T3 (hu)
GR (1) GR3015782T3 (hu)
HU (2) HU210965B (hu)
IL (1) IL95175A (hu)
NZ (1) NZ234933A (hu)
TW (1) TW204353B (hu)
ZA (1) ZA906100B (hu)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3871489D1 (de) * 1987-10-26 1992-07-02 Akzo Nv Impfstoff gegen e.coli-blutvergiftung bei gefluegel.
US6749831B1 (en) 1997-05-16 2004-06-15 Medical Defense Technology, Llc Vaccine against lipopolysaccharide core
CA2289760A1 (en) * 1997-05-16 1998-11-19 Medical Defense Technologies, Llc. Vaccine against lipopolysaccharide core
AU4078699A (en) * 1998-05-15 1999-12-06 Mkb Investments Limited Partnership Compositions and method for immunizing poultry
US8828226B2 (en) 2003-03-01 2014-09-09 The Trustees Of Boston University System for assessing the efficacy of stored red blood cells using microvascular networks
WO2007025333A1 (en) 2005-08-30 2007-03-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Bacterial delivery of biologically active polypeptides
JP2013507447A (ja) 2009-10-12 2013-03-04 ニュー ヘルス サイエンシーズ、インク． 酸素減損装置及び赤血球から酸素を除去する方法
US9199016B2 (en) 2009-10-12 2015-12-01 New Health Sciences, Inc. System for extended storage of red blood cells and methods of use
US11284616B2 (en) 2010-05-05 2022-03-29 Hemanext Inc. Irradiation of red blood cells and anaerobic storage
US8535421B2 (en) 2009-10-12 2013-09-17 New Health Sciences, Inc. Blood storage bag system and depletion devices with oxygen and carbon dioxide depletion capabilities
WO2012027582A1 (en) 2010-08-25 2012-03-01 New Health Sciences Method for enhancing red blood cell quality and survival during storage
PT3539381T (pt) 2010-11-05 2023-09-26 Hemanext Inc Irradiação de glóbulos vermelhos e armazenamento anaeróbico
US9067004B2 (en) 2011-03-28 2015-06-30 New Health Sciences, Inc. Method and system for removing oxygen and carbon dioxide during red cell blood processing using an inert carrier gas and manifold assembly
WO2013009843A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Camas Incorporated Compositions against bacterial toxins
ES2742949T3 (es) 2011-08-10 2020-02-17 New Health Sciences Inc Dispositivo integrado de filtrado para el agotamiento de leucocitos, oxígeno y/o co2 y separación de plasma
PT2961269T (pt) 2013-02-28 2021-12-16 Hemanext Inc Dispositivo de depleção de gás para produtos sanguíneos
CN113694272A (zh) 2015-03-10 2021-11-26 希玛奈克斯特股份有限公司 氧减少一次性套件、装置及其使用方法
KR102661405B1 (ko) 2015-04-23 2024-04-25 헤마넥스트 인코포레이티드 혐기성 혈액 저장 용기
CN107735095B (zh) 2015-05-18 2022-06-14 希玛奈克斯特股份有限公司 储存全血的方法及其组合物
ES2910948T3 (es) 2016-05-27 2022-05-17 Hemanext Inc Almacenamiento anaeróbico de sangre y procedimiento de inactivación de patógenos
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58135819A (ja) * 1982-02-09 1983-08-12 Nisshin Flour Milling Co Ltd 鶏の大腸菌症の予防法
US4772464A (en) * 1985-08-01 1988-09-20 Miles Laboratories, Inc. Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens
DE3787820T2 (de) * 1986-03-11 1994-04-28 Shionogi & Co Für Flagellin kodierende DNS und dieses enthaltender Vektor.

Also Published As

Publication number Publication date
CN1062605C (zh) 2001-02-28
CA2022420A1 (en) 1991-02-19
JPH03184996A (ja) 1991-08-12
AU635062B2 (en) 1993-03-11
IL95175A0 (en) 1991-06-10
KR0177510B1 (ko) 1999-03-20
NZ234933A (en) 1992-06-25
DK0413378T3 (da) 1995-05-15
IL95175A (en) 1994-05-30
US5750115A (en) 1998-05-12
DE69016129T2 (de) 1995-05-24
EP0413378B1 (en) 1995-01-18
CA2022420C (en) 2000-03-28
CN1049523A (zh) 1991-02-27
HU211827A9 (en) 1995-12-28
ES2070266T3 (es) 1995-06-01
KR910004209A (ko) 1991-03-28
DE69016129D1 (de) 1995-03-02
GR3015782T3 (en) 1995-07-31
TW204353B (hu) 1993-04-21
EP0413378A1 (en) 1991-02-20
HUT59612A (en) 1992-06-29
AU6109990A (en) 1991-02-21
HU905053D0 (en) 1991-01-28
ZA906100B (en) 1991-05-29
JP3031561B2 (ja) 2000-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU210965B (en) Method for the preparation of a vaccine against escherichia coli infections and of a toxin bilding active ingredient thereof, as well as a method for the purification of such a toxin
KR100361562B1 (ko) 프로테이나제k에대해내성을갖는네이쎄리아메닝기티디스의표면단백질
Munson et al. Purification and comparison of outer membrane protein P2 from Haemophilus influenzae type b isolates.
Ala'Aldeen et al. Immune responses in humans and animals to meningococcal transferrin-binding proteins: implications for vaccine design
US7776335B2 (en) Proteinase K resistant surface protein of Neisseria meningitidis
JP2955014B2 (ja) 分類できないヘモフイルス・インフルエンザエに対するワクチン
CA2040544C (en) Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine
Inzana et al. Characterization of a non-hemolytic mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 5: role of the 110 kilodalton hemolysin in virulence and immunoprotection
CA2365915C (en) Recombinant toxin a/toxin b vaccine against clostridium difficile
KR100219126B1 (ko) 비정형 헤모필루스의 고분자량 표면 단백질들
Mahajan et al. Isolation, characterization, and host-cell-binding properties of a cytotoxin from Campylobacter jejuni
Lübke et al. Isolation and partial characterization of the major protein of the outer membrane of Pasteurella haemolytica and Pasteurella multocida
Rolfe et al. Purification of a functional receptor for Clostridium difficile toxin A from intestinal brush border membranes of infant hamsters
Mahasreshti et al. Purification and partial characterization of the OmpA family of proteins of Pasteurella haemolytica
NO175735B (no) Fremgangsmåte ved fremstilling av Pasteurella-vaksine
JP4081140B2 (ja) 非耐熱性エンテロトキシンとコレラトキシンｂサブユニットの雑種分子
HAGA et al. Protective efficacy of an affinity-purified hemolysin vaccine against experimental swine pleuropneumonia
Tagawa et al. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Haemophilus somnus
WO2004041182A2 (en) M. haemolytica outer membrane protein plpe as a vaccine or vaccine component against shipping fever
EP0980389A1 (en) Antigen
Ayalew et al. Characterization of Immunodominant and

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: INTERVET INTERNATIONAL B.V., NL

Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO N.V., NL