TW204353B - - Google Patents

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204353 A6 B6 濟 部 中 央 揉 準 局 印 裂 五、發明說明（1 ) 本發明是有關一種疫苗，用以保護値體拮抗大腸捍菌 感染，可用於此疫苗中之毒素，及純化此疫苗的方法。 大腸桿菌是一種分佈很廣的細®，其群集在大多數動 物之消化道中。一般而言，此種聚集不致有嚴重的負作用 一於大多數例子，該細菌甚至出力於其宿主所喜歡的過程 中。然而，偶而大腸桿菌會造成駸重疾病，特別是在年幼 的動物。此也可發生於禽類及於商品化之家禽養殖，此種 感染可變成傳染性的，造成駸重的虛弱或甚至在年幼禽類 中有重大的死亡率。 自然地，企圖以疫苗接種方式掌握禽類中的此種大腸 桿菌感染。到最後成熟的雞以菌素一經去活化的大腸桿菌 免疫接種（Avian Disease 29 (4) ，1108 —.1 7 ^ ( 1 9 8 5 ) ) 。奉夜里的羞點m有I重 。再者，菌素免疫接種主要造成拮抗脂多_之抗體，其只 對基豊太腸桿釐〇血清型具特異性，且因此缝箜里護性爭 坑其他的大腸捍菌血瘦里。 為了戰勝大腸桿菌感染，常做的也包括以得自這些細 菌的為基礎所做的疫苗。然而，這些疫苗只造成有限 的保護作用，I超過接種個體的8 〇 %。基於此理由，在 大腸桿菌疫苗中常含有另外具毒力的因子：經去活的大腸 桿菌毒素，做為一種組份。 _______ ^ 豕多丨型式座大腸桿菌含有鞭毛」其功能在於行動。由 於大腸桿菌未被考慮是一種毒力因子，且因此尚未被包括 在大腸桿菌疫苗中。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. •打· •線· 甲 4(210X297公廣） 經濟部中央揉準局印製 204353 A6 _______ _B6 五、發明說明（2 ) 依據本發明，頃發現大腸桿菌的鞭毛和對v e r 0細 胞（非洲綠猴腎細胞）之顯著毒性有關，其迄今尚未被確 認，且這些鞭毛毒素為一種顯著的毒力因子。 基於此發現，自大腸桿菌鞭毛中製備疫苗。依據本發 明，可使用完整的大腸桿菌鞭毛，以及組成該鞭毛之亞結 ，如鞭毛蛋白或其片段或集團，其對經接種的個髏可 提供保護作用拮抗大腸桿菌感染。 在以大量大腸桿菌株所進行的實驗中（這些菌株主要 分離自雞，但也有來自其他動物及人類），發現鞭毛和拮 抗v e Γ 〇細胞之毒性有關；此毒性發現可被拮抗鞭毛的 抗體所中和。進一步發現，所有受試大腸桿菌株鞭毛之毒 性，可被由拮抗其株之鞭毛所生成的單一抗血清所中 和。 基於此發現可預期，以得自單一大腸桿菌株之鞭毛行 免疫接種，可提供保護作用拮抗所有帶鞭毛大腸桿菌之感 染。 基於以上考廉，依據本發明的疫苗可以見於大腸桿菌 之新穎毒素為基礎，且其特徽在於其傺蛋白質本質，且在 鞭毛上及/或與之有鼸，於SDS-PAGE中具分子量 30- 1 00KD，不具有與之結合的碩水化合物殘基， 對Ve Γ 〇細胞及數天大的雞具毒性，且即使在1 〇 〇·〇 下加熱1小時仍保有此毒性。m f 此組合特性可使這些新穎毒素與技藝上已知之大腸捍 菌毒素有所區別。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) .¾.. -打· .綠. 甲 4(210X 297公廣） 20435¾ A6 B6 經濟部中央揉準局印製 五、發明説明（3 ) 上述的毒素可見於許多大腸桿菌中，且由於其於鞭毛 結構之顯著發生，因此命名為鞭毛毒素（JLX)。這些鞭 毛通常明顯地大於正常的細毛（其通常直徑約7毫微米， 且長可達1微米），且厚達25毫微米及長7微米。 依據本發明的毒素類中一員，係分離自雞的大腸桿菌 CH7株（015··Κ14:Η10)，依據實例1之方 法完成。比C Η 7 _ F Τ可以各種型式被分離：結合在Η 1 〇型天然鞭毛，呈游離狀毒素，或以游離毒素獲得但再 相結至類針狀之鞭毛上。此CH7-FT之典型特色，於 上述一般特性外尚有一個約4 7 KD之亞單位分子量（僳 以SDS — PAGE決定），約4. 8的等電pH及部份 胺基末端胺基酸序列：A 1 a— G 1 n— Va 1 — I 1 e —Asn— Thr— Asn — Se r— Leu — Se r — Leu (?) - Thr— Gin。（CH7-FT 之鑑定 述於實例7 )。 由此CH 7 - F T生成的抗血清，發現可與所有受試 的其他大腸捍菌株FT交叉反應（實例3)。因此，拮抗 CH- F T的此抗血清，依據本發明可用來鑑定F斤有其他 的F T。再者，單株抗體可與所有受試的大腸桿菌株之F T特異地或交叉反應。 本發明也包括具有拮抗大腸桿菌感染免疫活性的疫苗 ，其中活性成份是依據本發明的去活化毒素。 此種疫苗可適當地含該毒性鞭毛，因為這些鞭毛可由 培養大腸桿菌而極容易地獲得，培養條件僳可促進鞭毛的 ~ ~ 5 二 " 甲 4(210X297 公沒） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) 二 •装. •打， A6 B6 204353 五、發明說明（4 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 形成，並自細胞中分出鞭毛或無細胞的上清液。F T可進 —步純化，即利用超過濾及/或分子篩層析除去低分子量 的上清液組份。 在此純化過程中，當含F T之流份可以用拮抗CH 7 - F T生成的單株抗體偵測其反應性。 依據本發明的疫苗也可含有F T片段，其可保護以之 接種的個髏拮抗大腸桿薗感染。 依據本發明，欲纳入疫苗中的F T可以下列方法獲得 :化_篆含%，自大腸桿菌細胞培養中純化，视里簋篮體_公

N_A一V 在後一例子中，编碼上述蛋白質或其片段的核酸序列 ，可由筛選基因體大腸桿菌DNA庫尋求含有該序列之値 別純条而鑑定，如利用拮抗F T而誘出的多株或單株抗體 行特異反應而成。核酸序列可與各種可達成表現之DNA 序列連接，生成所諝的重組體核酸分子，其再用於適當宿 主之轉形作用。此雜種DNA分子可衍自如：質髏，噬菌 體，或存在於病毒中之核酸序列。宿主細胞可為真核細胞 來源，如細菌，或真核細菌來源，如哺乳動物細胞。經轉 形的宿主細胞可用來産生F T，之後該蛋白質可依據本發 明分離及繼而納入疫苗中。 經濟部中央揉準局印裝 於另一種具體實例中，可製備活的載體疫苗，其中含 非病原性的微生物，如含有编碼F T基因之病毒或細菌。 除了 F T之外，本發明的疫苗也可含水性介質或含水 之懸浮，及/或其他組份，如用以增加活性及/或貯架期 甲 4(210X 297W 廣） -〇 - 204353 A6 B6 經濟部中央橾準局印裝 五、發明説明（5 ) ◊這些組份可為鹽類，去活化F T毒性但仍保持其免疫特 性之作用物（如福馬林），PG緩衝物質，增加免疫反應 之乳化劑及伏劑（如礦油，胞壁醯基二肽，氫氧化鋁，容 素，聚陰離子及兩性物質）。 疫苗可用於免疫溫血動物（包括人）拮抗大腸桿菌感 染，且特別用於抗爭於禽類中之大腸桿菌感染。 結果，疫苗最好以腸外方式投予，如皮下或肌肉。疫 苗以此方式投予可供經免疫禽類之自動免疫接種，以及對 産卵禽類之子代做被動免疫接種。於經免疫之産卵禽類， 拮抗而生成之抗體當然可引入其蛋之卵黃中，因而於所卵 之雞中。 疫苗的組成物及免疫接種糸可變化，且依下列而變化 :欲被保護之動物型式，動物之年齡及體重，欲求的保護 期，抗藥方法，以及利用母髏抗體到底所須的是自動免疫 或被動免疫。疫苗中活性成份之最佳有效劑量，於禽類腸 外接種免疫約為每劑1 0 - 1 0 0徹克。疫苗可與其他相 關疫苗混合。 窨例1 分離大脹捏馘CH 7株之鞭丰羞袤 A.鞭毛毒素，靱備 大腸桿菌CH7 (015:K14:H10)於12 升之胰化酪蛋白大豆肉湯（B. B. L)中，於Biostat E發酵槽（Br aun)培養一夜，pO,設定在1 4% 且攪拌變化由1 0 0 — 5 0 0 r_i>m。培養物於Peil.ico- 甲4(210X297公发） 1 =Γ_7 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .¾. .打. .線· 204353 A6 B6 五、發明説明（6 ) η過滴条統中（Millipore)藉Η V L P滤膜之助濃縮至約1 升。細菌以1 〇，〇 〇 〇 r pm離心3 0分（GSA旋轉 子，Sor vail)，上清液以0. 4 5微米濾膜過濾，再加至 Η V L P濾液中。 濾液濃縮至約1升，再以1升〇. 2莫耳/升Tr i s - HCj?缓衝液洗3次，其中使用PTTK濾膜。 Ρ Τ Τ Κ濃縮液重覆地溶離於Sephar〇se4 Β — C又 管柱，其為 1 1 〇 - 1 6 0 毫升（Pharmacia, Uppsala Sweden)，-其中高1 0公分且面積1 5 4公分2 (Amicon 機型P1 4 0X2 5 0)，平衡於磷酸鹽缓衝液中，50 毫莫耳/升ΐ)Η7. 2,以0. l%NaN3為保藏劑（ P B )。管柱以PB溶離，直到計錄器之基準線再次為零 而止。 第一個峰之流份（含有高分子量分子）匯集再濃縮於 YM - 1 0 0超過濾濾膜（6 6 2毫米 Amicon,以 Amicon OF機型202)，直到蛋白質濃度約2-3毫克/毫升 。濃縮物以5升的Tr i s HCj?缓衝液2 0毫莫耳/ 升t>H7.5(帶0.1% NaN3g保藏劑）透析兩 次。 B.製備游離的塞袤 經濟部中央搮準局印裝 濃縮物依Laemmli的方法（Nature 2 2 7，6 8 0中 ;1970)製備式電泳。其偽以1 : 67稀釋於樣 品缓衝液中，後者含有2 〇毫升甘油，2 〇毫升T r i s 一110又缓衝液0.5某耳/升，1>116.8,2 0毫升

S {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂· 線- 甲 4(210X297公沒） 204353 A6 B6 經濟部中央橾準局印製 五、發明説明（7 ) 10% DSD，5毫升2 —魏基乙醇（ME)及2毫升 0 . 0 5 %溴酚藍。 之後於水中煮沸約5分鐘’冷卻再：電泳於1 2% (丙 烯醯胺：b i s 3 G : 0. 8)製備式聚丙烯醯胺水平 凝膠中（l6X〇. 6公分）。通常所填料之樣品為每凝 膠約15-2 3毫升蛋白質（7. 5毫升濃縮液及5 . 0 毫升樣品缓衝液）°於Protean Q11 1423機型（ .Bio-Rad，Richmond USA)或 S E 6 0 0 機型（Hoefer.San Fransico，USA)中進行電泳。待前頭溶離出凝膠後，可以 200V再繼缠電泳1小時。凝膠切成約1. 5—2毫米 之薄Η。 蛋白質溶離於1〇毫升〇. 89%氣化鈉溶液+0. 1 % NaN3*，於室溫下3小時，及4°C下一夜，並 採連缠攪動方式，取出薄片，溶液以〇. 45微米濾膜過 濾。匯集含有純毒素亞單位之流份*貯於-2 0 -C下。 樣品中之蛋白質含量以經修飾的Folin-Ciocaeten分 析法偵測（J· Biol. Chem. 73，627;1927)， 多醏則依Dubois的方法以酚-硫酸分析法偵測（Anal. Ch-em · 28，350 — 6; 1956) 〇 窨例2 鑑定大腸捍菌CH 7株之羞素 A .對（D天大的雜：>致命桦 於第一値實驗中，將0. 2及0. 5毫升各種大腸桿 菌毒素製劑，以IP注入1天大的SPF嫩雞（GVP， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) .¾. •打， •線· 甲 4(210X 297公发） y 204353 A6 B6 五、發明說明（8 )

Do or η)。於第二個實驗中，0. 5毫升的毒素製劑 I V注入3週大嫩雞中。於注射後7天記錄死亡率。 結果 如表1所示，來自雞大腸桿菌CL2及（3117株之毒 素製劑，經注射後對1天大的雞均具致死性◊對CH 7株而言，上清液及溶菌産物均具毒性，而對CH2株而 1，尤其是溶菌産物具毒性。 f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· •打· •線· 經濟部中央橾準局印裂 甲 4(210X297公寒） -10 ~ A6 B6 204353 五、發明說明（9 ) 表1 : 1天大雜致死件：夾自大腸桿菌A· 經濟部中央揉準局印裂 l·：清液或溶蘭産物I p注射 注射之 製劑* 劑量 (毫升） 死雞/總注射量 1 4 7 無菌的TSB 0.5 1/10 ZF24 sup 0.2 1/10 sup 0.5 1/10 1 y s 0.2 l/io 1 y s 0.5 1/10 CH 2 sup 0.2 1/10 1/10 sup 0.5 1/10 1/10 1 y s 0.2 9/10 9/10 9/10 ly s 0.5 6/10 7/10 8/10 CH7 sup 0.2 2/10 4/10 5/10 sup 0.5 4/10 5/10 5/10 ly s 0.2 4/10 4/10 4/10 1 y s 0.5 7/10 . 7/10 7/10 ¥CH2及（3117株為雞大腸桿菌分離物；ZF 2 4株是人類糞便中無毒力之大腸桿菌分離物。 ί請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂. •線_ 甲 4(210X297 公发） 204353 A6 B6 五、發明說明（1()) 相似製劑I V注射至3週大的雞，根本無作用（數據 未示出）。 B . V e r 〇測試 V e r 〇細胞生長於3 7-C，5%C〇2下之培養基 6中（每升含8 5毫升MEM Εορ 1 e，1 0 0毫升 胰化蛋標际磷酸鹽肉計，5 0毫升4，4%NaHC〇3 )，並添加5%牛胚胎血精（FCS)及2 0 0單位/毫 升青霉素及2 0 0微克/毫升鐽霉素，且經過濾滅菌後， 再添加2微克/毫升的兩性霉素B。經胰蛋白酶化作用後 ，細胞種於9 6孔洞之平底聚苯乙烯培養盤（Greiner)， 每孔洞有2 0 0微升完全的培養基6，且每毫升有2 X 1 〇 5個細胞。經一夜培育後，可發展成單層。丢棄培養基 ，以每孔洞2 0 0微升培養基6 (雖不含FCS但添加1 〇微克/毫升黃嘌昤（3 -異丁基-1 _甲基-黃嘌昤； Sigma)取代。接著，加入毎孔洞2 0撤升的毒素製劑，其 像經連缠稀釋及1:2稀釋的上清液。其次，將其上清液 對V e r 〇測試呈陰性之菌株，於每孔洞加入5 0撤升未 稀釋及經1:2稀釋之溶豳産物，進行細胞内毒素産製之 測試。 雉濟部中央橾準局印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 結果 起初，列於表2之菌株先做毒素産製測試。某些菌株 可分泌毒素於上清液中，而其他菌株之毒素是在細胞内， 及/或只於細菌細胞經超音波瓦解後才測得到°胞毒作用 甲 4(210X297父角） A6 B6 204353 五、發明説明（11) 可使V e r 〇細胞變圓及縮小，而在大多例子單層仍保持 完整。 声2 :客種女瞄揑蘭株之Ve Γ 〇細朐羞素 菌株' 血清型 毒素效價〃 上清液 於 溶菌産物 JA221 - - - ZF24 023：K?：H- - - CH1 078：K80 - — CH2 078：Κ80：Η4 — 8 CH3 045：Κ-：Η9 32 64 CH4 02：Κ1：Η- - 8 CH5 02：ΚΙ：Η5 32 512 CH6 01 :Κ1:Η- — 4 CH7 015：Κ14：Η10 128 1,024 CH8 CH13 0115：K? 035"Κ- 32 16 f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. •打. .線· 級濟部中央接準局印焚‘ 米JA2 2 1為一種大腸桿菌K— 1 2株；2F2 4見表 1;CH株為雞之分離物 毒素效價定義為最後稀釋生成毒性作用之例數 甲 4(210X297 公廣） 13 3 5 3 4 %

A B 五、發明說明（) C .羞袤之穰定件 經鑑定毒素之初步特性，藉著測試毒素製劑對各種處 理之敏感性而進行。P Η敏感性測試，是將毒素調至P Η 3 - 1 0，經室溫下一夜培育中和之，此像在毒性測試之 前。 針對熱敏感性測試，毒素製劑以各種溫度加熱之。也 測試SDS及ME之作用，即在1%SDS及1%SDS 加1. 5%ME下加熱毒素，之後於食鹽水中透析。對尿 素敏感性測試，則將6 Μ尿素加至毒素製劑中1小時，再 以食鹽水透析。 福馬林敏感性測試，則加各種濃度的福馬來，於各種 溫度下培育一夜，於V e r 〇細胞分析之毒性試驗前再透 。對胰蛋白酶之敏感性則加入1 〇 〇微克/毫升的胰蛋白 酶（牛胰臓；Mill i pore)，於3 7 °C下培育4小時，再加 1 5 0微克/毫升的胰蛋白酶抑制劑（大豆；SUme)在 毒性測試前於3 7 "C下歴3 0分。 結果 由於於V e r 〇細胞毒性分析中所決定之確實雞毒素 效價非極易再生偽由於V e r 〇細胞之條件依不同天數而 變化，在此呈現出之結果只為典型實驗之一實例。 經濟部中央揉準局印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) CH 5及CH 7上清液於PH 3 — 1 〇下之處理不會 影響毒性。 甲 4(210X 297Y 发） 14 - 204353 A6 B6 五、發明説明（13) 表3 :加熱毒素製劑，於雒大隄捍舖羞件 效價上之作用，吐傜於S D S或 S D S + ME不存#或存存下^搐形 雉濟部中央梯準局印焚 . 處理 CH21y s * CH5sup .CH7sup . 對照組 8 32 128 80。。（1 h) 4 8 64 100。。（1 h) 4 8 16 120。。（20 min.) 0 0 0 65·。（10 min.) 16 64 SDS,65〇C (10 ' min.) 32 64 SDS + ME,65〇C (10 min.) 32 64 10CTC (10 min ·) 8 64 SDS, 100°C (10 min.) 32 128 SDS + ME, 100°C (10 min -) 16 128 雖然CH2溶菌産物 (1 y s ) 及C H 5及C H 7上 淸液（SUP)之毒性經較高溫延長曝露有些減少，且於 1 2 0 °C加熱後完全消除，毒素仍可被認為相當的熱穩定 甲 4(210X297 公尨） {請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) •装· •打· .線. 204353 A6 B6 五、發明説明（14) 。於SDS或甚至SDS+ME存在下加熱10分鐘，對 於CH5及CH7上清液之毒素並没有作用。 以6M尿素處理CH2溶菌産物及CH5及CH7上 清液，對於値別VT效價根本無作用。 如表4所示，CH 7上清液的毒性可被福馬林在室溫 下及37 °C下處理而去活化。 CH 5及CH 7上清液的毒性，經胰蛋白酶處理後完 全消除，而偽造處理及單獨以胰蛋白酶抑制劑處理則根本 對毒性沒有作用。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) 經濟部中央揉準局印裝 表4CLM上_清液羞袢猙名種港度的福馬林 培-童一夜後：> 去活介.作用 福馬林濃度 (%) 經培育後之毒素效價 室溫 37 eC 0 6 4 6 4 0 .2 3 2 16 0 .5 16 4 1 .0 8 2 2 .0 1 0 •訂. •線. 甲 4(210X297 公沒） 204353 A6 B6 經濟部中央梂準局印裂 五、發明説明（X5) D. 決定分平畺 CH 7株毒素之分子量，於1 2 %凝膠（丙稀醒胺： b i s . 3 0 : 0. 8)上分析電泳’採用Laemmli的方 法並與標準品比較。 凝膠以考馬斯音藍（CBB)染色，以凝膠掃描器機 型 CS - 9 3 0 及計錄器 DR— 2 (shimadzu, Kyoto Japan)進行掃描。 圖1示出填料分子量標記後，以考馬斯音藍染色之電 泳掃描。檫準品相當於1 - 6峰，分別具分子量：7 8 0 00，66000，45000，30000，17 2 0 0 及 12300D (LKB 1860—12， Bromma， Sweden) 0 於圖2及3代表由賁例1中A及B步驟分別獲得的産 物之掃描。 大腸桿菌CH 7株毒素亞單位之分子量，由這些實驗 中可知為約<^15： D。 E. 等雷點的決宙 毒素等電點之決定，係將由實例1 A步驟中獲得的大 腸桿菌CH7株的毒素取3毫升加上〇. 5毫升Servaly-te Ρ Η 3 - 7 (分析级的 Serva Heidelberg Germeny)及 46. 5毫升試驗水溶液之混合物，以12w電焦聚5小 時（Rotofor，Bio_Rad Richmond，USA)。毒素含量以分析 式凝膠電泳偵測〇 此實驗之結果综合於表5 ° (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) *装. •打* -綵· 甲 4(210X297公廣） 204353 A6 B6 五、發明议明（1G)可由這些結果知道，大腸桿菌CH 7株之毒素具有P Η 4 . 8之電等點。 结果 耒5 :猙3臺并Seph厂）4B-Cg樣品雷焦 聚後之PH及羞素數倌 流份 pH 毒素# 流份 pH 毒素' 1 2.68 + 11 5.50 - 2 3.26 土 12 5.82 - 3 3.50 一 13 6.23 - 4 3.73 - 14 6.57 - 5 4.18 - 15 6.85 - 6 4.38 土 16 7.14 - 7 4.55 + + 17 7.47 - 8 4.80 十+ + + 18 7.97 - 9 5.09 十+ 19 8.41 - 10 5.32 十 20 8.75 一 (請先閑讀背面之注意事項再填寫本頁) _裴. ，訂， •sl· 經濟部中央揉準局印裂 -=無可見的毒素 ± =正好可見 + =可見+ +，+ + +，+ + + +_ =毒素量增加 甲 4(210X297公沒） 2043^3 A6 B6 蛆濟部中央搮準局印製 五、發明説明（17) F .酷含鼉 得自實例1 B步驟的大腸桿菌CH 7株之毒素，依D-ubois et al的酣一硫酸分析法（AnalyT !ca1 chemistry 28，350-356 ; 1956)決定知即不含多醣也 不含任何糖類。於Limulus Amoebocyte溶解産物試驗中（ pyrotell, MA，USA)也偵測不到顯著的LPS (内毒素） Ο G .胺某酴分析 以液相DAB ITC步驟，依據Chang的方法（Methods Enzymology 9 1 ，455 — 466 ; 1 9 .8 3 )決定 胺基末端胺基酸序列。DABTH -胺基酸之鑑定以薄層 層析進彳了。胺基酸組成物.以P T C技術，依Janssen et a 1 所述決定（chrom a t ograd t i c 22，3 4 5 — 3 5 8 ；1 9 8 6 )，結果得知分子量為|_l_k D之C Η 7 - F T亞單位，相當於共有値胺基酸。 结果 由實例1之Α及Β步驟獲得的大腸桿菌CH 7株毒素 /具有以下的胺_基末端胺基酸序列： Ala— Gin— Val — I 1 e— Asn_Tbr —Asn — Se r— Leu — Se r— Leu (?) — T h r — G 1 n 此序列和kuwajima et al所述的大腸桿菌K - 1 2鞭 毛蛋白胺基末端胺基酸序列相同（Journal of Bacterioi-ogy 168， 1479-1483; 1980) 〇 (請先閩讀背面之注意事項再填寫本頁)

St· •打· •線. 甲 4 (210X297 公廣） 204353 A6 B6 五、發明說明（18 )毒素的胺基酸組成示於表6，且和大腸捍菌k - 1 2 鞭毛蛋白有相當程度的同源性。 袠: C Η 7 11$基酴如成之估計 祐斑大腊捍聞Κ 一 1 2鞭$_ 番白的胺某酴紐成fch較： 凸菫份中之胺基酸數 胺基酸 CIH-FT" 大腸桿菌K-12 鞭毛蛋白〜 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) .裝· 經濟部中央抹準局印裝

Ala A r g A s η Asp Cy s Glu Glu Gly His lie

Le u 甲4(210X 297公潘） 50(11.2) 12(2.7) 52(11.7) 4(0.9) 43(9.6) 37(8.3) 〇(〇) 24(5.4) 32(7.2) 59(11.9) 11(2.2) 48 (17.5) 39 〇(〇) 27η (6·2) •訂， •線. 14 44(8.9) 0(0) 28(5.6) 37(7.4) ^20

3 a Λ

6 6 A B 五、發明說明（19) (绩上頁） Ly s 28(6.3) 25(5.0) Met 2(0.4) 3(0.6) Phe 9(2.0) 5(1.0) Pro 8(1.7) 6(1.2) Se r 58(13.0) 43(8.7) Thr 48(10.8) 65(13.1) Tr p 〇(〇) 〇(〇) Ty r 11(2.5) 10(2-0) Va 1 28(6.3) 33(6.6) 總數 446 497 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .装. -訂， 1)以？1'0技術估計（(^1>〇11161〇8犷&1^111&2 2，3 4 5 -358； 1986)。 •線· 2 )依 D.N A 序列基礎計算（Journal of Bacteriology 168，1479-1483，1986) 〇 奮例3 篩撰雜的大腸揑舖秩以為F T表現及F T血清學鑑定_ 將總共1 2 4種得自全世界的雞大腸桿菌分離物，篩 選其毒性，蓮動性及F T抗原於細菌表面之表現。使用多 株及單株抗體以目視出F T並檢査交叉反應。 甲 4 (210X297 公发） ^21 - Α6 Β6 五、發明説明（20) 方法 羞袢測試及羞素中和作1 這些菌株於v e Γ 0細胞上做毒性測試’偽依實例2 B所述◊至於中和作用’毒素製劑與抗血清稀釋液於進行 毒性測試前先以3 7 t：培育2小時。 渾動袢測試 各菌株的蓮動性於ϋ型試管中進行測試’其中含低濃 度（0. 2 5%)瓊脂之營養肉汁。這些U型管中大腸桿 菌接種在一側，並於3 7 °C下培育一夜後記錄其移動至管 另一端的情形。 抗Ifn清商製 經濟部中央揉準局印装 (請先閲讀背兩之注意事項再填寫本頁) 抗血清於兔子及雞中由拮抗大腸桿菌CH 7株F T而 生成，其製備如實例1 A中所述。依實例1 B所述而製備 的CH 5及CH 7株之毒素，用來産製單株抗髏（Mo A b)。針對MoAb産製，將得自經免疫老鼠之脾細胞與 骨髄瘤細胞融合，所得的融合瘤以EL I S A篩選抗毒素 抗體之分泌。陽性融合瘤以有限稀釋選殖。腹水之製備是 將經選殖的融合瘤以腹膜内注入老鼠而製成。腹水以5 0 eCl 0分鐘去活化，脂質以1，1，2 -三氣三氟乙烷（ Me r c k)萃取，MoAb s再以5 0%飽和的硫酸銨 沈澱。 大腸捍鍤株對F T抗鹿的丟規 由拮抗CH7株FT所生成的兔子抗血清（0 1 5 : K1 4 : H1 0)以無毒性的大腸桿菌HDEC-1株（ 甲 4(210X297 公沒） 經濟部中央揉準局印製 甲 4(210X297 公沒） Ο 4沾 Α6 . _Β6 五、發明説明（21) 0 1 5 : K1 4)在室溫下吸收2 4小時。經吸收的抗血 清於完整細菌EL I SA中用來篩選FT表現株，如下述 般進行。 細菌於T S B中以不攪拌情況下生長6小時，之後以 3000rpm 離心 15 分（Sorva 1 1 RT 6 0 0 0 )， 再懸浮於CBB缓衝液中（1. 59克/升Na2 C〇3 ;2. 9 3 克/升 NaHC〇3 ;0. 2 克/升 NaN3 ；P Η 9 . 6)使660毫微米波長下之〇D=0. 14 0-0. 180 ◊在平底聚苯乙烯徹滴定盤（Greiner)中 毎孔洞種入1 〇 〇微升細菌懸液，並令其在5 Ot：下乾燥 一夜。培養盤以自來水洗滌並於室溫下，以毎孔洞1 10 微升的PBS-T-N(0.04M PBS;PH7. 2 ; 0. 5%吐溫一 8 0 ; 1 5%新生的牛血清）阻斷1 小時。之後，每孔洞加入1 0 0微升經吸收血清之連續稀 釋液（稀釋於PBS-T — N中），由1:1 〇〇稀釋液 開始◊每株2値孔洞以PB S - T- N為背景對照組。經 3 7 Ό下培育1小時後，培養盤洗滌，再於各孔洞加入1 〇 〇微升與過氣化酶共軛的山羊抗兔子I gG (H+2) (其像以PBS— T — N適當地稀釋◊經3 7 °C培育3 0 分鐘後，培養盤再次洗滌。抗髏結合採比色方式偵測，係 在各孔洞加入1 0 0徹升的TBS-受質缓衝液，其是在 醋酸銷-檸檬酸缓衝液（PH 5. 5)中含尿素-過氧化 物（Organon Teknika，0 s s)及 3，3 一 -，5，5^ —四

甲基聯苯胺。反應於暗處展開1 0分鐘，加5 0微升4N ~ Ζό~ - 請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) -裝. Λ •線. 2043&3 A 6 B6 蛭濟部中央抹準局印製 五、發明説明（22) H 2 S Ο 4停止反應，再於Microelisa計讀器上以4 5 〇毫微米波長偵測。以可得至少背景A 4 5。2倍的A 4 5 〇 之最高抗血清稀釋倍數決定為效價。 於每一分析中，分別以CH 7株及RDEC_ 1為陽 及陰性對照組。 Western 吸清 進行免疫吸漬或Western吸漬，基本上依Mmilerman e t a 1 所述（Ana 1 B i ochem. 120，46 — 51 ; 19 82) ◊各種初步的FT製劑，其製備是將細菌培養於胰 化酪蛋白大豆肉湯中，以不攪動方式生長6小時。經劇烈 混合後以離心除去細菌，且上清液以乙醇沈澱濃縮成約4 〇倍（1份上清液加2份9 6%乙醇，4 °C下培育一夜， 離心並將沈澱物溶解於〇. 04莫耳/升PBS. PH7 .2中）。這些初步的FT製劑行SDS-PAGE，再 轉漬於硝化纖維濾膜上。目視抗原是相繼與下列培育而成 :抗體，適當過氣化酶共軛的抗種屬IgG(H+L)， 及尿素過氧化物及3，3 / -二胺基聯苯胺· 4HCP。 免疮—雷子顯榭鐘（IG — EM) 進 ί了 I G — EM，基本上依 Van Alphen et ,al 所述（ Infect， Immun· 56， 1.8 00—6; 1988) 〇 簡 言之，細菌培養胰化酪蛋白大豆肉湯中，再與於PBS ( 加1%BSA加0. 05%吐溫20) (PBS-B-T )之抗體稀釋液培育，以P B S以三次，再與蛋白質A培 育，後者以於PB S - B- T之金球檫記。細菌經三次以 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) ·«-· •打. -線· 甲 4 (210X297 公尨） A6 B6 五、發明說明（23) 上洗滌後，轉移至塗覆有Formvar柵條，再以1 %醋酸雙 氧鈾或磷鎢酸負染色。 结果 於來自世界各地1 2 4種雞大腸桿菌株以收集中，有 7 3株（5 9%)可分泌可偵測量的毒素，其在Ve r 〇 細胞上具活性。再3 7株（3 0%)於細薗溶解後，可對 Ve r 〇細胞呈現毒性。於完整細菌EL I SA中，有5 2株（i. 可與由拮抗CH7- FT生成的抗血清 $>所有在E L I S A中呈陽性的菌株，也可産生細胞外 Vero毒素（表7)。 (請先W讀背面之注意事項再填寫本页) .装. •線· 經濟部中央揉準局印製 甲 4(210X 297 公沒） % A6 B6 五、發明説明（24)

表7 : Ve Γ 〇羞#及逛由拮抗CH7— FT 生成的抗血清反應性間的關 傜（蘭株數目） Vero毒性2 ; 十 - 抗 C Η 7 - F T + 52 0 反應性〃 — 21 51 1) 於完整細菌ELISA中與CH7-FT抗血清之反 TftC 應 2) 細菌培養物上清液對Ve r 〇細胞之毒性。 在V e r 〇毒素分泌及菌株蓮動性間可見強烈的相關 性（表8 )。 甲 4 (210X297 公廣） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) •装· •打· •線. 州娜 A6 B6 五、發明說明（25) y S : V e r 〇羞件及渾動袢間夕關傜 f舖株數目） Vero毒性^ 十 — 蓮動性i; + 69 10 - 4 41 {請先閲讀背面之注意事項再填筠本页) •裝. 1 )於U型管中之蓮動性 •打· 2)細胞培養物上清液對Ve r 〇細胞之毒性。 •綠. 這些結果提供額外的證據；即V e r 〇毒性殘留在鞭 毛上。也可見，細菌經過U型管後，Ve Γ 〇毒性會增力Π 。再者，這些結果顯示，不同菌株的毒性具血清學上交叉 反應性。 經濟部中央橾準局印裂 不同菌株之毒素間的交叉反應進一步檢梘。於表9示 出，由拮抗CH 7株FT所生成的兔子及雞抗血清，可中 和所有受試毒性株之Ve r 〇毒性。由拮抗CH5及CH 7株FT所生成的Mo Ab s則根本不會中和毒性。 甲 4 (210X297公角） 幺〇4‘糾 A6 B6 五、發明説明（％ ) 耒9 :培秦物上清液中Ve r 〇羞件 為由桔抗C Η 7 — F T牛成的 抗rfn清之中和作用 菌株 血清型 Vero毒素效價〃 對照組2 〃 Κ075773; (1:10) ΒΒ1-24; (1:10) CH3 045：K-：H9 8 - - CH5 02：K1：H5 16 - - CH7 015：K14：H10 32 一 - CH125 01:K1:H7 32 4 - CH135 02 ： ΚΙ ： H4 64 4 — 1 )見表2 2) 假處理的上清液，或以預先免疫的血清處理 3) 兔子抗CH7-FT抗血清，1:10稀釋 4) 雞抗CH7— FT抗血清，1 : 1 0稀釋 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. .訂， •線· 經 濟 部 中 林 準 印 甲 4(210X297，a'«) ^28 五 、發明說明（27, 1) k07577=茄筠CΗ7丨F许铒3痴屮筠&»; D3D31 丨 2 =葫洋C Η 7 I F THias 雜筠&» ; rH 1 0=雎 Η 10雄tw^llN-ilKs&iii.IKnD· WIV2(Bilthoven)； I n t 1 — 7 =ffl-ss^c Η 7 I F τΗΡ&3ίΐ&» I n t 1 2 I 1 3 =ffl-ns筠C H 5 丨 F THfas 20 Ab 〇 2) 娌琪方谢Βδα-B·姻丨媒卅斓濉N-H啓筘MW, Nkb It·。 3) A.H. Lawn(J. Gen. Hicrobiol. 101 , 1 1 2丨 1 3〇；1 977)。 仁)^ΞΗ 1 0灌册脒JNtmiM-Im-^MI规。 A6 B6 經濟部中央揉準局印裂 甲 4 (210X 297公发） CH3 CH5 CH7 CH125 CH135 菌株 I _1 Ο Ο 〇 〇 〇 ro ►-* η-· is5 • · · · CJi · · CT1 & 9¾ 9¾ ·· η- ►-* >« >-» • · · · « · 1 S ：C 备 3： ·· -j ·* cji ac s <〇 1-» m 702) 43 47 ί 60 35 K07577 09 CO co σ> 办私·《〇 CJ1 O CO Ο 丫 ΓΟ co σ> ΟΙ Ο W CO ο aHIC 抗器 t 1 办 I ι ►-* 1 co σ> ««j cn o cd o Int 12-13 m C*> 〇> ιΡ» »|kk C7> ― Ol O) CO 2 ritt ω co 丨 ω ω w N·/ 办 V·/ s/ IfM m V·/ m 唞一 〇 :葙证妗«at落笤咮rqT 涯aiu^&gplwfistern 蝴ED-t»w_ -29 - 請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) M. …-線· A6 B6 «濟部中央揉準扃印裝 五、發明說明（28) 初步Γ T製劑以各種抗血清進行的Western吸漬結果 示於表1 〇。拮抗CH7- F之兔子及雞抗血清（分別為 K0 7 5 7 7及BB 1_ 2)可與所有其他受試的FT試 劑反應，雖然菌株間之帶，其MW有異。利用抗- H1 0 --鞭毛凝结抗血清可得相同的結果。同時由拮抗CH 5 —FT所生成的MoAb I n t 1 2-1 3也顯示相同 的Western吸漬型式。括抗C Η 7 - F T生.成的Μ 〇 A b Int 1 - 7只與47KD之CH7-FT帶反應。顯 著地，相當於Η型的各種菌株，其鞭毛蛋白MW幾乎和個 別F Τ的視M W相同。得自R I V M (Bi lthoven)，帶有 Η 10型鞭毛的許多菌株，於利用多株血清進行的Wes tern 吸漬中顯示 45KD 或 47KD 之帶。 MoAb In t 1 _ 7只與Η 1 0鞭毛菌株之4 7KD帶反應。當於製 備初步所前，菌株通過U型管則其在Western吸漬上的帶 強度可增加。 於I G_EM，於CH5及CH7細菌上的類鞭毛絲 利用由拮抗C Η 7 - F I生成的多株抗賭，標記金球。以 Inti — 7 (由拮抗CH7 - FT而生成的），只有位 於CH 7而非C Η 5細菌上的類鞭毛絲可被金球所標記。 以MoAb Intl2 — 13 (由拮抗 CH5-FT 而 生成，其製備依實例1 B所述使用製備式SDS _PAG E)，類鞭毛絲並不被顯著地標記；只可於CH5及CH 7細菌表面觀察到一些金球。事實上，MoAb Int 12 - 13只與經解離的FT反應（Wes tern吸漬，E L I —ISC)— {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· .打. •線· 甲 4(210X297公发） A6 B6 經濟部中央橾準局印製 五、發明説明（29) SA)不與完整的FT反應（IG — EM，EL I SA) Ο 所有的試驗均指出，v e Γ 〇毒性殘留在鞭毛*或F T和鞭毛相同。再者，不同菌株的F T具血清學上高度交 叉反應性，且也具交叉中和性。 奮例4 以被動免疮保譁嫩雒 由拮抗CH 7 _FT生成的抗血清俗依實例1 A製備 的CH 7 - F T免疫接種於雞内而成。匯集來自不同雞隻 之抗血清，於5 6 °C下1 0分鐘以去活化。 3 週大的嫩雞（Euribrid，Boxmeer，the Netherla.n-ds)以靜脈 内注入 1 毫升此 CH7 _FT 抗血清 。在注入 抗血清1小時内，雞以〇. 2毫升細菌懸液注入右後側胸 氣囊而感染之。細薗俗於以血液瓊脂為基礎之培養盤（0 x〇 i d)上培養一夜，懸浮於DBS再稀釋於適當濃度 。所使用的大腸桿菌株均分離自有大腸菌病雞隻之受侵害 心臓。至於對照組的雞，不是未投予抗血清即是單純的陰 性對照組，也以相同劑量之細菌感染。經施以挑戰後，雞 關在減壓之隔離室中，食物及飲水則無限制供應。經挑戰 後7天記錄死亡率。 如表11所示，經CH7-FT抗血清被動免疫雞隻 後可提供顯著的保護作用拮抗挑戰，其中5株受試大腸桿 薗可克服3株。此3株可見顯著的保護作用，2株分泌毒 性於培養物上淸液而1株只在溶菌産物中提供對Ve Γ 〇 甲 4(210X297公沒） " ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) .装. ♦打- •線· A6 B6 五、發明說明（30)細胞之毒性。不見顯著保護作用的此2株，均只在溶菌産 物中才具毒性。顯著地，只對拮抗具蓮動性菌株之挑戰中 才可得明顯的保護作用。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) .裝. -訂- •綠· 經濟部中央採準局印裝 甲 4(210X 297L'廣） ="32: 2〇 ^Γ〇3 Λ6 B6 經濟部中央揉準局印裝 五、發明說明（31) 1) 葫嬸漥±菘搿(SUP)媒)0谢璲醱!1潷(1 y s ) 雠Ve r o皆蒂lxIM-撕阵。2) 醑笫筇0瞇喊书^_»砗。3) 酿漭® 7州笨，银薄-71^浼雜»皿。粞。 S2 S2 CH5 CH5 CHcn i CH7 CH7 S245 S245

NP 015110 s5:K-:〒 0351- 02:K1:H5 01:K1:〒 01:K1:〒 015:K14:H10 078:Kg:H4 078:K§:H4 02:K1:H5 &»Hi lyslys coup Seplyslyssup oluplyslys 00 n Ρ0000 (請先閑讀背面之注意事項再填寫本頁) 5X10® 5i 1¾ 1¾ ION 1¾ 2i 2x10 ⑦ 5x10® sxlocn 6/17 7/19 15/33 llsi. 丨3,、3「 18/29

3/1S 7/S 14/10» »SM- sit ia^CH7-FT ^5 i薄Τ ^薄@) ΐ 1 g维茄茸斗钼茈郵芻暌V葙ag^a 莰 pinH7IFT茸^-¾^^¾^^^ ! I— ry---n--Μ -¾. •^. •線，

PS.05S 甲 4(210X 297 么'寿） ;33 ~

Claims (1)

1. 公〇4於3 A7 B7 C7 D7 經濟部中央標準渴貝工消費合作杜印製 六、申請專利範困 竹正^ |“1日 附件一 a : c!ii：___ 第79106165號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國82年1月呈 1. 一種用以保護個體以拮抗大腸桿菌之感染的疫苗 ，此疫苗特徽偽在於其包含大腸桿菌之鞭毛。 2. 根據申請專利範圍第1項之疫苗，其特徴在於該 鞭毛具有拮抗Vero細胞（非洲緣猴腎細胞）之毒性。 3. —種具有可於溫血動物中拮抗大腸桿菌感染之免 疫活性的毒素，此毒素特徵在於 a. 分離自H4、 H5、 H6、 H7、 H9、 H10 、Η 5 2血清型之大腸桿菌菌株； b. 由單一之多肽鏈所組成； c. 具有介於SDS- PAGE測量之30 — 1 00 . K D分子童值之間； d. 可發現其係與絲狀聚集物相結合及/或與之有關 5 e. 不會自然地具有己結結合之碳水化合物殘基； f .對Ve r 〇細胞及數天大的雞具有毒性；及 g.即使於l〇〇t：下加熱1小時仍保有其毒性，或 得自此毒素之Η段。 4. 根據申請專利範圍第3項之毒素，其像可得自屬 於Η 10血清型之大腸桿菌株，傺藉由 a .培養該細菌於胰化蛋白大豆肉汁中； 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）~~_ ι _ 81.9.10,000 公告本 (請先-«讀背而之注意事項再填窝本頁). i裝_ 訂· A7 B7 C7 D7 六、申請專利範团 〈請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) b·將所得培養物之無細胞上清液，濃縮於帶截去值 30KD之濾膜上； c.以20毫莫耳/升的Tr i s_Hcj缓衝液洗 滌此濾膜上的物質； 、d .於Sephar〇se4 B管柱上分出經洗滌的物質； e. 收集高分子量流份； f. 此流份接受製備式SDS-PAGE, 或得自此毒素之片段。 5 .根據申請專利範圍第4項之毒素，其待徴在於： 於SDS—PAGE具有約47KD之分子量，約4. 8 之等電PH值，及部份胺基末端胺基酸序列為A 1 a — G 1 η — V a 1 — I 1 e— Asn — Thr— Asn — Se r — Leu — Ser — Leu — (?) — Thr* — Gin ，或得自此毒素之片段。 6 . —種用以保護以個體拮抗大腸桿菌之感染的疫苗 ，此疫苗的特徵偽在於其係衍生自根據申請專利範圍第3 —5項之毒素。 經濟部中央標準居貝工消費合作社印製 7.—種用以純化如申請專利範圍第3項之毒素的方 法，該方法係包含， a .於一適當培養基中培養大腸桿菌細胞，. b.以一截去值為30KD之薄膜，濃縮所得培養物 之無菌體上清液， c .以Sepharose 4B層析管柱分離殘留於該薄膜上之 所得産物， 81.9.10,000 本紙張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -2 - 六、申請專利範園 d. 收集高分子量流份， e. 於解離條件下，處理該流份， f. 收集該解離之毒素多肽。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨裝· 經濟部中央標準局DK工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） _ 3 _ 81.9.10,000 204353 第791Q6165號專利申諸案中文補充資料 民國82年1月 表1 :得自不同來源之雞大腸桿菌株，以ELISA測定完整細菌中I8K卩缴之表現 並測定該菌株於含有軟瓊聘之3!型試管内的活動性 !來源Γ7«ηύι清型 y活fe性’

   204353 :續表1 :得自不同來源之雞大腸捍®菌株，以EUSA测定完整細菌中18KD缴之表現