KR940010861B1

KR940010861B1 - 세포연관 글루코실트랜스퍼라제, 그의 항체 및 유효성분으로서 상기 항체를 함유하는 이의 카리에스 예방 조성물

Info

Publication number: KR940010861B1
Application number: KR1019890000697A
Authority: KR
Inventors: 도시오 호리꼬시; 주니찌로 히라오까; 이사무 후지따; 도루 도꼬로; 요시까쯔 고다마; 히데아끼 요꼬야마
Original assignee: 가네보가부시끼가이샤; 오까모도 스스무; 겐 코포레이션; 도꼬로 도오루
Priority date: 1988-01-22
Filing date: 1989-01-23
Publication date: 1994-11-18
Also published as: EP0334467A2; US5439680A; EP0334467A3; CN1033865C; CA1325192C; KR890011996A; JPH01190635A; DE68921908T2; DE68921908D1; EP0334467B1; CN1036036A; JP2641228B2

Abstract

내용 없음.

Description

세포연관 글루코실트랜스퍼라제, 그의 항체 및 유효성분으로서 상기 항체를 함유하는 이의 카리에스 예방 조성물

제 1 도는 실시예 3에서의 DEAE-세파셀로부터 용출된 부분에서의 단백질 농도(A₂₈₀), GTF 활성 및 FTase(D-프룩토실트랜스퍼라제) 활성을 나타낸다.

제 2 도는 실시예 3에서의 히드록실아파타이트로부터 용출된 부분에서의 단백질 농도(A₂₈₀), GTF 활성 및 FTase 활성을 나타낸다.

제 3 도는 실시예 3에서의 면역된 암탉의 항체 역가의 변화를 나타낸다.

본 발명은 수크로스와 반응하며 물에 불용성인 글루칸을 합성하는 반응을 촉매하는 세포연관 글루코실트랜스퍼라제, 이 효소를 정제하는 방법 및 이 효소 생성 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이의 카리에스를 유도하는 병원성 세균으로 알려진 스트렙토코커스 무탄스(Streptococcus mutans)에 대하여 면역학적 활성을 갖는 항체 및 유효성분으로서 상기 항체를 함유하는 이의 카리에스예방 조성물에 관한 것이다.

이의 카리에스 예방 관점에서, 이의 카리에스에 대한 원인균으로서 알려진 스트렙토코커스 무탄스의 성질 및 이의 카리에스의 발달에 상기 세균이 관여하는 메카니즘을 해명하기 위하여 다수의 연구가 수행되었다.

이의 카리에스 발달에 관여하는 스트렙토코커스 무탄스 균주로서, 혈청학적으로 혈청형 a 내지 h로 분류되는 여덟가지 균주가 이제까지 발견되었다. 이들 혈청형 중에서, 2개의 아군(subg-roup)이 혈청학적 유추를 기초로 하여 혈청형 d 및 g가 하나의 군으로 그리고 혈청형 c, e 및 f가 다른 군으로 규정되었다.

이의 카리에스 발달에서 스트렙토코커스 무탄스가 관여하는 메카니즘중 중요한 과정은 수크로스로부터 물에 불용성인 고착성 글루칸을 생성하는, 스트렙토코거스 무탄스에 의해 생성된 글루코실트랜스퍼라제(이후GTF라 칭함)가 역활을 하는 과정이다.

스트렙토코커스 무탄스에 의해 생성된 이 GTF는 배양 상징액 또는 세포표면에 연관된 형태로 발견될 수있다.

예를들어, 혈청학적으로 서로 유사한 혈청형 d 또는 g 균주의 수크로스 무존재하 배양에서, GTF는 대부분 배양 상징액에 존재하며, 그로부터 세 종류의 GTF 즉, GTF-S1, GTF-S2 및 GTF-I가 분리 및 동정되었다(S는 수용성 글루칸 합성 효소를 의미하며 I는 물에 불용성인 글루칸 합성 효소를 의미한다). 이들 세 종류의 GTF는 상호 협동하여 물에 불용성인 고착성 글루칸을 생성한다(예를들어 "스트렙토코커스 무탄스에 의한 글루칸의 합성 및 고착 메커니즘", T.Koga, Jap, J.Bactericl., 41(4), 679, 1986).

더구나, 혈청형 d 및 g 균주의 수크로스 존재하 배양에서, 전술한 세 종류의 GTF는 대부분 글루칸에 결합함으로써 세포에 결합되어 있어 세포 연관 형태를 가진다(Hamada, S.and Slade, H.D., Archs Oral.Biol, 24, 399∼402, 1979).

이와는 달리, GTF-S 및 GTF-I가 혈청학적으로 서로 유사한 혈청형 c, e 및 f 균주의 배양상징액으로부터 또한 분리되었다(Kuramitsu, H.K.and Wondrack, L.,Infect.Immun., 42, 763∼770, 1983).

그러나, 물에 불용성인 고착성 글루칸이 이들 GTF-S 및 GTF-I의 공동 작용에서 합성될 수 있다는 단 한건의 보고도 없었다.

더구나, 스트렙토코커스 무탄스를 표적 생물로 하는 이의 카리에스 예방제 또는 예방방법을 개발하기 위한 시도를 하였다. 구강내의 스트렙토코커스 무탄스의 콜로니화를 조절함으로써(특히 이 표면에 고착하는것을 조절함으로써) 이의 카리에스를 예방하는 방법의 공지의 예가 스트렙토코커스 무탄스에 대하여 면역학적 활성을 갖는 항체를 사용함으로써 이의 카리에스를 예방하는 방법이다. 즉, 스트렙토코커스 무탄스의 세포로써 면역화된 소로부터 수득한 우유를 사용함으로써 구강내의 스트렙토코커스 무탄스의 콜로니화를 예방하는 방법이 영국 특허 명세서 제1505513호에 발표되었으며, 에스 무탄스의 배양으로부터 회수한 세포벽과 같은 분획에 의해 면역화된 포유동물로부터 수득한 항혈청 및/ 또는 우유 및 글루코실트렌스퍼라제 저해제, 프로테아제 및 덱스트라나제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 시네르지스트의 조합인 이의 카리에스 예방제가 일본국 특허 공개 공보 제60-38327호에 발표되었다.

그러나, 에스 무탄스에 대한 면역학적 활성을 갖는 항체에 의한 이의 카리에스 예방효과는 항상 만족스러운 것은 아니다. 더구나, 항체는 많은 경우 통상적으로 면역화된 포유동물의 항혈청 또는 우유로부터 제조할 수 있기 때문에, 대량 생산의 부적합함 또는 높은 생산가와 같은 단점으로 인하여 그들은 실제적으로 생성되지 않는다.

보다 효과적인 이의 카리에스 예방기술을 수립하기 위하여, 본 발명자들은 인간 구강내에 가장 혼히 분포하고 인간 이의 카리에스 발달에 가장 중요한 역활을 하는 것으로 여겨지는 혈청형 c 균주뿐만 아니라 혈청형 c 균주에 혈청학적으로 유사한 혈청형 e 및 f의 균주에 주목하였다. 이들 균주가 이의 카리에스 발달에 관여하는 메카니즘을 해명하기 위한 여러가지 연구 과정중에, 본 발명자들은 이들 세균에 의해 생성된 물에 불용성인 글루칸 합성의 과정에서 역활을 하는 GTF 분획을 분리 및 정제하였다. 본 연구는 GTF의 성질의 해명이 중요하다는 관점으로부터 더 진행되었다.

그 결과, 본 발명자들은 이들 세균중에서 생성된 GTF 분획중에서 물에 불용성인 글루칸 합성 효소 활성을 가지며(이후 CA-GTF-I라고 칭함) 이의 표면에 세균의 부착, 특히 수크로스에 종속적인 부착에 중요한 역할을 하는 세포 연관 GTF의 존재를 학인하였다. 따라서, 본 발명자들은 CA-GTF-I의 분리 및 정제를 시도하였다.

더구나, 통상적인 기술에서, 정제된 효소 단백질로서 혈청형 c, e 또는 f 균주의 GTF(-I)의 세포 연관형의 분리는 그들의 성질을 완전히 연구할 만큼 이제까지 성공적으로 완성하지 못했다.

예를들어, 혈청형 c 균주에 의해 생성된 세포연관 GTF-I에 관하여, 구라미쯔에 의한 보고가 있다(Kuramitsu, H.K., Infect.Immun.,10, 227∼235, 1974).

즉, 구라미쯔 등은 1M NaCl을 사용하여 세포로부터 물에 불용성인 글루칸 합성 효소 활성을 갖는 추출물을 수득하였고 GTF로서 추출물의 성질을 연구하였다. 여기에서, 추출물에서 GTF 활성에 대하여 최적pH는 6.0이며 최적 온도는 37℃이었다.

그러나, 구라미쯔에 의해 수득한 추출물은 정제과정에서 필요한 탈염처리를 시킬 때 물에 불용성이 되기때문에, 추출물로부터 GTF 활성을 갖는 정제된 단백질 분획의 획득은 실질적으로 성공적이지 못했다. 따라서, 세포연관 GTF 분획에 관하여 구라미쯔에 의해 제공된 자료는 정제된 효소 단백질 분획에 기초하고 있지 않으며 따라서 GTF 활성을 갖는 효소를 구체적으로 설명하기에 지극히 불충분하다고 평가된다. 특히, 세포로부터 분획에 함유된 효소는 효소 단백질로서 전혀 특성화되지 않았다. 즉, 분자량 또는 동 전위점과 같은 어떠한 특성도 밝혀지지 않았다.

이와는 달리, 혈청형 c 균주의 GTF-I는 배양 상징액 분획에 존재한다는 것이 케니 등 및 그라미쯔 등에 의해 밝혀졌다.

케니 등은 분자량이 153k 달톤이며 물에 불용성인 다당류를 합성하는 활성을 갖는 GTF-Ic가 혈청형 c균주의 배양상징액에 존재함을 밝혔다(A.C.Kenney and J.A.Cole, FEMS Microbiol. Lett., 16, 159∼162, 1983).

그러나, 케니 등은 GTF-Ic가 배양상징액에 존재함만 밝혔으며, 효소의 분리 및 정제에 관한 정보 뿐만아니라 단백질로서 효소의 특성을 구체화하기에 필요한 자료도 제공하지 못했다.

이와는 달리, 구라미쯔 등은 c형 균주의 배양상징액으로부터 수용액 글루칸을 합성하는 활성을 갖는 덱스트라수크라제 (DS, GTF-Sc)를 함유하는 분획 및 물에 불용성인 글루칸을 합성하는 활성을 갖는 무탄신테타제(MS, GTF-Ic)를 함유하는 분획을 추출하였으며 여러가지 분석, 예를들어 GTF 활성에 대하여 이를 분획중에서 DS와 MS는 서로 다른 효소라는 것을 밝히는 분석을 수행하였다. 수득한 MS는 DS의 면역원성과는 다른 그것을 가졌으며, 155k 달톤의 분자량과 4 내지 5의 등전위점(pI)를 갖는다 (Kuramitsu, H.K.and Wondrack, L., Infect.Immun., 42, 763∼770, 1983).

이러한 상황하에서, 본 발명자들은 이 효소의 존재를 확인하기 위하여 CA-GTF-I를 분리 및 정제하기 위한 방법을 연구하고자 수많은 노력을 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 혈청형 c 세균의 세포로부터 CA-GTF-I를 분리 및 정제하는데 성공하였고 그것의 특성에 관한 신규의 정보를 수득하여 본 발명을 완성하게 되었다.

더구나, 본 발명자들은 그렇게 분리 정제한 CA-GTF-I에 대한 항체가 이 표면에 에스 무탄스의 고착을 예방하는데 충분한 효과를 가지며 항원으로서 정제한 CA-GTF-I로써 암탉을 면역시키는 방법에 의하여 저가 및 대량으로 항체를 생성할 수 있다는 신규의 정보를 획득하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 한가지 목적은 불용성 글루칸을 합성하는 효소로서 CA-GTF-I를 공급하는 것이며 이는 이의 카리에스 발달의 자세한 메카니즘을 명확히 하거나 이의 카리에스의 예방을 위해 필요한 더욱 유용한 기술은 개발하거나 다양한 의약제를 개발하는데 유용하다.

본 발명의 또다른 목적은 에스 무탄스에 대한 면역 활성을 가지고 또 이 표면에 에스 무탄스의 고착에 충분한 방지 효과를 가지며 또한 이의 카리에스 예방 조성물의 효과적인 성분으로서 유효한 그린 항체를 공급하는 것이다.

본 발명의 또 한가지 목적은 큰 규모로 값싸게 항체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

또 하나의 목적은 효과적인 성분으로서 항체를 함유하는 이의 카리에스 예방 조성물을 공급하는 것이다.

본 발명의 분리한 세포연관 글루코실트랜스퍼라제 (CA-GTF-I)는 적어도 다음의 물리 화학적 특성을갖는다.

(1) 반응 및 기질 특이성 : 수크로스와 반응하며 불용성 글루칸을 생성한다.

(2) 최적 pH : pH 6.7∼7.0

(3) 최적 온도의 범위 : 15∼50℃

(4) 불활성화 조건 : 80℃에서 5분간 가열로 불활성화

(5) 분자량 : SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로써 측정하여 150k∼l65k 달톤.

(6) 항원성 : 효소에 대하여 특이적인 항체 생성을 유도하기 위하여 동물에서 항원성을 가질 것.

또한 CA-GTF-I는 GTF 활성에 대한 최적 pH가 상기에서 기술한 구강내의 pH와 대략 동일하다는 관점에서, CA-GTF-I은 구강내의 에스 무탄스의 활동에 중요한 역활을 할 것은 곧바로 이해된다.

CA-GTF-I는 상기에 기술한 바와 같이 동물에 면역성을 가진 후, 효소에 대한 특이 항체를 동물에 효소를 투여함으로써 생성할 수 있다. 수득한 항체는 상기 언급한 바와 같이 이의 카리에스 예방의 분야에 유용한다.

더우기, CA-GTF-I는 수크로스로부터 글루칸을 생성하는데 효율적으로 적용될 수 있다.

예를들어 CA-GTF-I의 효소 활성은 효소와 기질로서 [^l4C-글루코스]수크로스의 반응에서 생성된 글루칸에로 도입되는 방사성의 양을 측정함으로써 결정할 수 있다.

GTase의 한 단위(U)는 수크로스 분자로부터 1.0마이크로몰의 클루코스 잔기를 분당 글루칸에 도입하는데 필요한 효소의 양으로서 규정한다.

CA-GTF-I는 예를들어 세포로부터 세포연관 형태로 생성된 GTF-I를 분리 및 정제함으로써 수득할수 있다.

이후 실시예에서 명백하게 기술되는 바와 같이, CA-GTF-I는 혈청형 c 세균의 배양의 상징액에 존재하는 GTF-S(CF-GTF-S)와 뚜렷하게 다르며 수용성 글루칸을 합성하는 활성을 갖는다.

본 발명에 따른 CA-GTF-I는 하기에 기술된 방식으로 혈청형 c, e, f 균주의 세균으로부터 분리 및 정제될 수 있다.

우선 혈청형 c, e 또는 f의 세포를 적절한 배지에 배양하고 수득한 세포를 수집하고 필요에 따라 세척한다.

여기에 사용되는 혈청형 c의 균주는 예를들어 에스 무탄스 균주 MT8148, 균주 잉그브리트 및 균주 NCTC 10449이다.

더우기 이들 균주는 공개되어 있으며 쉽게 구할 수 있다.

예를들어, 에스 무탄스 균주 MT8148 및 균주 잉그브리트는 오오사까 대학 치학과로부터 구입할 수 있으며 균주 NCTC10449는 균주 ATCC로서 미국형 배양 수집(ATCC)으로부터 구할 수 있다. 더우기 혈청형e 및 f의 균주에 대해서는 어떠한 공개된 구입 가능한 균주를 사용할 수 있다.

배양 배지에 관하여, 적어도 글루코스를 함유하는 임의의 배지를 사용할 수 있다. 예를를어, TTY 배지(트립티카제, 트립토스 및 효모추출액으로 구성된 복합 배지), BHI(뇌 심장 접합) 배지 및 FMC 배지를 사용할 수 있다.

더우기 배양은 적절한 세균의 증식과 CA-GTF-I 생성이 기대되는 임의의 온도 범위에서 시행될 수 있다. 그러나 충분한 세균의 증식과 CA-GTF-I 생성의 관점에서, 약 37℃의 온도가 일반적으로 사용된다.

배양에 요구되는 시간은 배양조건 즉 배양온도나 사용하는 배지의 종류에 따라 변한다. CA-GTF-I의 최적 수율에 도달하기 위한 정온 배양시간은 유리하게 선택할 수 있다. 일반적으로 18 내지 20시간이 걸린다.

더우기 상기의 입장으로부터 다른 배양조건을 적절히 선택할 수 있다.

다음은 CA-GTF-I를 세포로부터 추출한다.

세포로부터 CA-GTF-I의 추출은 요소 용액이나 구아니딘-HCl 용액같은 추출용액에 세포를 접촉시켜서 수행할 수 있다.

추출액속에 현탁된 세포의 농도, 추출액 농도 그리고 추출에 필요한 온도나 시간 같은 추출 조건들은 추출용액의 종류에 따라 적절하게 선택하여 원하는 효소를 충분히 추출할 수 있다.

더우기 높은 특이 활성을 높은 수율에서 수득하기 위하여 6 내지 10M 더욱 적절하게 8M의 요소 용액을 사용한다. 추출은 20 내지 30℃에서 더욱 적절하게는 25℃에서 약 15분에서 2시간동안 시행한다.

추출후에 세포같은 고형성분은 원심분리등에 의해서 추출액으로부터 제거한다. 수득한 상징액은 투석, 초 여과 혹은 겔 여과 같은 과정에 의해 처리하여 요소나 저분자량 불순물 등을 추출액으로부터 제거하여 CA-GTF-I의 조악한 추출물을 획득한다.

더우기 투석같은 처리동안 침전물이 형성되는 경우에는 원심분리 같은 방법에 의해서 제거한다. 더군다나 조악한 추출 제조물 정제하여 정제된 CA-GTF-I 제조물을 수득할 수 있다.

이런 정제를 위해서, 효소 정제를 위한 다양한 정제방법을 적응시킬 수 있다. 예를들면 두개의 흡착 과정의 결합 방법 즉 하나는 음이온 교환기와 그리고 나머지 하나는 히드록실아파타이트와의 과정을 유리하게 적용할 수 있다.

조악한 추출 제조물의 정제를 위한 음이온 교환기의 에가 DEAE 그룹 같은 기능성 잔기를 가진 것으로 더욱 특별하게 DEAE-세파셀(파마샤)을 사용할 수 있다. 사용하는 히드록실아파타이트의 예가 바이오-겔 HTP(Bio-Rad 실험실)이다.

음이온 교환기를 가진 정제 과정에서 조악한 추출 제조물에 함유된 추출된 성분들(조악한 단백절 성분)은 음이온 교환기 칼럼에 적용할 수 있고 그리고 원하는 효소를 함유한 분획을 용출액의 염분 농도를 조절함에 의해서 수득할 수 있다.

이 염분 농도는 음이온 교환기의 종류나 용출 조건에 따라 변한다. 부분을 함유하는 GTF(I)가 선택적으로 분해되는 범위를 선택함에 의해서 농도를 결정할 수 있다.

예를들면 DEAE-세파셀을 사용하는 경우에 포스페이트 완충용액에서 0.45 내지 1.0M 범위의 염분 농도를 갖는 GTF(-I)를 수득할 수 있다.

더우기 음이온 교환기와 접촉시킨 시료를, 암모늄 술페이트 같은 염분 용액이나 에탄올 같은 유기 용매를 사용하여 조악한 추출 제조물을 침전시켜 조악한 단백질 부분을 수득한 것 같은 방법으로 조악한 추출 제조물로부터 수득할 수 있으며 원심분리같은 방법에 의해 수득한 침전물을 회수하며 적절한 용매 속에서 침전물을 현탁하여 필요하다면 투석같은 과정으로 침전물로부터 저분자량 불순물을 제거한다.

음이온 교환기와 처리한 후에 GTF(-I) 활성을 소지한 분획을 모아서 예를들면 투석에 의해 탈염시키고나서 히드록실아파타이트 칼럼에 적용시킨다.

결국 CA-GTF-I 분획은 히드록실아파타이트에 흡착된 부분으로부터 선택적으로 용출되어 모아진 다음 필요하다면 투석같은 과정을 통해서 정제된 CA-GTF-I 제조물을 수득하게 된다.

그래서 수득한 정제 CA-GTF-I 제조물은 SDS-PAGE겔 위에 150k∼160k 달톤의 분자량을 가진 것들에 해당하는 단일 밴드를 가진다.

더우기 상기의 과정 즉 정제같은 것에 따라서 6.96U/mg 단백질 같은 특이 활성을 가진 효소를 실시예에서 기술한 것처럼 수득할 수 있다.

또한 본 발명에서의 CA-GTF-I는 박테리아 배양 및 추출에 대한 미리 언급된 과정에 의해서 생산할수 있다. 수득한 추출물을 원하는 순도까지 정제할 수 있다.

본 발명에 따르면 에스 무탄스에 대해 면역원의 활성을 가진 항체 (항-CA-GTF-I 항체)를 상기의 CA-GTF-I로 면역된 암탉의 알로부터 만들어진 임무노글로불린으로 수득할 수 있다.

암탉의 면역을 위한 항원 유체를 준비하기 위해 적절한 CA-GTF-I의 예는 CA-GTF-I의 분리를 위한 이미 언급된 과정에 의해서 수득한 세포 추출액이나 조악한 제조물에 함유된 것이나 혹은 정제된 제조물로서 수득한 것이다.

항-CA-GTF-I 항체는 언급된 CA-GTF-I로 면역된 암탉의 알로부터 준비된다. 면역된 암탉에 있어서는 어떤 암탉도 사용할 수 있지만 대량 생산의 입장에서 볼 때 화이트 레그호온 같은 달걀 생산성이 높은 종류 것들을 적절히 사용할 수 있다.

더군다나 CA-GTF-I에 의한 면역 방법은 피하 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 비강내 주사 및 눈에 약을 떨어뜨리는 것 같은 평범한 것들이다. 더우기 투여량을 적절히 선택하여 원하는 항체 역가를 수득하고 암탉에 어떤 나쁜 영향을 주지 않도록 한다.

일반적으로 첫번째 면역후 및 주가 경과하면 항원과 특히하게 반응한 항체가 달걀속에 형성된다(달걀 노른자위). 또한 필요하다면 FCA(프로인드 완전 보조액)나 FIA(프로인드 불완전 보조액) 같은 보조약을 CA-GTF-I와 겹합시켜 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 항 CA-GTF-I 항체는 면역후 약 한달이상 놓은 달걀로부터 제조할 수 있다. 더우기 효소면역측정법(ELISA)을 이용하여 항체 역가를 측정할 수 있다. 그리고 항체 역가의 변화는 면역화 후에 약 2주 간격으로 항체 역가를 측정함에 의해 알아낼 수 있다.

이하에 언급한 실시예에서 항체 역가의 변화는 ELISA로 측정하여 알아낼 수 있고 항체 역가가 본 발명의 항-CA-GTF-I 항체를 준비하기에 충분할 만큼 증가하면 계란을 모은다.

일반적으로 고 항체 역가는 약 3달에 걸쳐 유지할 수 있다. 면역화후에 항체 역가가 감소할 때에는 적당한 시간 간격으로 적절히 추가 면역화하여 항체역가를 증가시킬 수 있다.

예를들면, 본 발명에 따르는 항-CA-GTF-I 항체는 상기한 대로 면역화한 암탉의 계란 노른자에 함유된 임무노글로불린을 추출하여 분리함에 의하여 얻을 수 있다. 추출과 분리에 적용되는 방법의 실시예에는 덱스트란 슬페이트나 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하는 침전법과 프로판올이나 클로로포름을 사용하는 추출법과 같은, 임무노글로불린의 추출과 분리에 흔히 사용되는 다양한 방법들이 포함된다.

상기한 것과 같이 얻어진 항-CA-GTF-I 항체는 특별히 에스 무탄스의 세포와 연관된 형태로 존재하는 CA-GTF-I와 항체로서 반응한다. 즉 그것은 에스 무탄스에 대하여 면역학적 활성을 가진다.

에스 무탄스에 대하여 면역학적 활성을 가지는 항-CA-GTF-I 항체는 에스 무탄스 치아표면에 달라붙는 것을 방해하는 효과를 나타낸다. 따라서 구강내 항체를 줌으로써 구강내에서의 에스 무탄스 활성을 제어하여 충치를 막아 줄 수 있다.

본 발명에 따르는 충치 예방 조성물중 효과적인 성분으로 전술한 항-CA-GTF-I 항체를 들 수 있고 구강에 주어지는 방법에 따라 갖가지 형태로 준비된다.

예를들면 입 세척이나 치약으로 작용할 때에는, 항-CA-GTF-I 항체는 제조과성중에 다양한 성분에 효과적인 양만큼 첨가할 수 있다. 충치 예방 조성물에 첨가되는 항-CA-GTF-I의 양은 매개의 투여 양상에 적합한 일회 복용양에 따라 적당히 선택할수 있다. 예컨데 10³이상의 항체 역가를 갖는 항체를 0.0001 내지 10중량%로 사용할 수 있다.

본 발명에 따르는 충치 예방 조성물은 치약, 입세척, 구강청정제, 정제, 츄잉껌 등을 망라한 갖가지 품목으로 제공된다. 충치 예방 조성물은 상기의 항-CA-GTF-I 항체를 여러가지의 담체 및 첨가제와 결함시킴으로써 준비할 수 있다. 그것의 조제를 위하여 품목의 제조에 사용되는 공지의 절차를 사용할 수도 있다.

품목의 제조시 통상적으로 사용되는 담체와 첨가물의 혼합비는 본 발명의 조성물의 제조에도 적용할 수있다. 치약은 일반적으로 마모제, 결합제, 수분함유제, 발포제와 방향제로 이루어져 있다.

마모제의 예로는 제이 인산칼슘, 탄산칼슘, 피로인산칼슘, 불용성 아인산나트륨, 실리콘산 무수물 등이 있다. 치약은 약 10∼95중량%의 마모제를 함유하고 있다. 결합의 예로는 카르복시 메틸 셀룰로오스, 알지네이트나트륨, 캐러기넌등이 있다. 치약은 0.5∼4%의 결합제를 함유하고 있다.

수분함유제의 예로는 소비톨, 글리세롤, 프로필렌글리콜 등이 있다. 치약에는 일반적으로 5∼30%의 수분함유제가 들어있다.

발포제의 예로는 로릴 황산 제이나트륨, 로로일 사코시닐 및 모놀로린, 수크로오스 지방산 효모와 같은 비이온활성제, 로릴 이 에탄올아미드와 스테어릭산 모노글리세라이드등이 있다. 치약에는 0.5∼2%의 발포제가 들어있다.

더우기, 상기한 것처럼 암탉을 사용한 방법으로 얻은, 본 발명에 따르는, 항-CA-GTF-I 항체는 통상적인 포유류의 면역화 처리에 의해 얻어지는 항체에 비하면 다음과 같은 장점이 있다.

(1) 본 발명에 따른 항체는 면역된 암탉의 계란으로부터 생성될 수 있고 계란을 모아 다루는데 있어서나, 계란으로부터 항체를 얻는데 있어서 특별한 숙련된 기술이 필요치 않다.

뿐만 아니라 임무노글로불린 중에서 IgG족의 항체만이 계란 노른자로 전달되어 IgG만을 쉽게 얻을 수 있다. 반면 항체를 면역된 포유동물의 피로부터 얻을 경우에는 수혈하는데 특별한 기술이 필요할 뿐만 아니라 아직까지는 혈청으로부터 다량의 IgG를 분리하여 정제하는 것이 어렵다.

(2) 본 발명에 따른 항체의 제조에 사용되는 암탉은 쉽게 사육되어 사육비가 쥐의 경우에 비하여 횔씬 저렴하다. 또한 포유동물을 사용하는 방법은 다량의 혈액이나 젖을 계속적으로 포유동물로부터 얻는 것이 어렵기 때문에 항체의 대량생산에 적합치 못하다. 반면에 본 발명에 따른 방법에 의하면 암탉이 장기간에 걸쳐서 계속해서 알을 낳기 때문에 항체를 저렴하게 대량 생산할 수 있다.

(3) 많은 경우에 면역된 포유동물의 혈액이나 젖으로부터 준비된 항체의 안정성은 항상 만족스러운 것은 아니며 그래서 약 -80℃에서 보관하는 것이 혈청이나 정제된 형태에서는 필요하다.

반면에 본 발명에 따르는 항체는 우수한 안정성을 나타내어, 예컨데 4℃에서 1∼2달간 달걀의 형태로 보존할 수 있다.

더우기 암탉을 사용한 항체의 제조시에 어떤 항원 형태에서는 충분한 항체 역가가 항상 얻어지는 것은 아니다. 예를들어 항원으로서 바이러스가 사용될 때 충분한 항체 역가를 수득할 수 없다.

[실시예]

본 발명은 다음의 실시예들에서 더욱 상세하게 설명할 것이다.

[실시예 1]

에스 무탄스의 다른 혈청형에서 GTF의 국제에 관한 연구.

표 1에 나타낸 다른 혈청에서의 각각의 에스 무탄스(오오사까 대학 치학부에서 입수한)를 50ml의 BHI배지와 TH(Todd-Hewitt)배지에서 각각 37℃ 및 18시간 동안 정온 배양한다.

정온 배양후에, 세포와 배양상징액을 원심분리에 의해서 분리하고 수득한 세포를 식염수로 세척한다. 그리고 나서 세포의 각 GTF 활성과 배양상징액을 하기의 방법에 따라 측정한다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

[GTF 활성 측정방법]

1) 측정을 위한 시료

세포의 경우에는 : 배양한 세포를 수득하여, 식염수로 세척하고, 5ml의 10mM 포스페이트 완충용액(pH6.0)에 현탁한 다음 초음파 처리에 의해서 파괴하여 측정을 위한 세포 현탁액 시료를 수득한다.

상징액의 경우에는 : 시료로서 어떤 처리도 하지 않고 배양상징액을 사용한다.

2) GTF 활성의 측정

각각의 시료에서 10마이크로리터씩 취하여 기질로서 20mM의 [¹⁴C-글루코오스] 수크로스(0.05Ci/mol)를 함유하는 0.2M 포스페이트 완충용액 10마이크로리터와 혼합하여, 37℃에서 1시간동안 반응시킨다. 반응후에 모든 반응 혼합물을 사각형 여과지(1.0×2.0cm)에 떨어뜨린다음 메탄올로 세척한다. 여과지에 남아있는 메탄올에 불용성인 글루칸에 스며있는 방사성을 측정하여 GTF 활성을 계산한다.

[표 1]

표 1에 나타난 결과로부터 명백하듯이, BHI 배지에서의 배양에서 즉 수크로스 무존재하에서, 혈청형 d 및 g 박테리아에 관해서, 대부분의 GTF 활성을 상징액에서 발견하지만, TH 배지에서의 배양에는 즉 수크로스 존재하에서는 대부분의 GTF 활성을 세포에서 발견한다(세포 연관 형태에서).

반면에 혈청형 c, e 및 f의 박테리아에서는, 혈청형 d 및 g의 박테리아에서 발견하는 만큼 그렇게 큰 차이는 관찰할 수 없다.

[실시예 2]

[세포로부터 CA-GTF-I의 추출]

에스 무탄스 균주 MT8148(혈청형 c)을 TTY배지 1리터속에서 37℃에서 18시간동안 배양한다. 세포를 원심분리로 수득하고 식염수로 두번더 세척한다. 결국 다양한 추출용액속에서 세포부분을 현탁하고 수득한 현탁액을 교반하여 추출한다.

추출과정을 끝낸후에, 원심분리에 의해 추출용액으로부터 세포를 분리하고 수득한 상징액을 10mM 포스페이트 완충용액(pH 6.0)에서 투석한다. 투석후에 개개의 상징액에서 생성된 불순물을 원심분리에 의해 제거하고 GTF 활성과 개개의 상징액에서의 단백질 농도를 측정한다.

게다가 실시예 1에서 기술한 방법으로 GTF 활성을 측정하고, 표준으로서 소의 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 로우리 등의 방법에 의해 단백질 농도를 측정하여 특히 활성을 계산한다.

표 2는 추출용액과 추출과정에 사용되는 추출조건과 추출액의 특이 GTF 활성의 대표적인 예를 보여준다. 게다가, 상기에서 수득한 세포를 1mM 포스페이트 완충용액(pH 6.0)에서 현탁하고, 3분동안 20KHg 및 200W에서 초음파 진동에 의해서 수득한 현탁액을 파괴시켜 세포파괴 혼합물을 제조한다. 불용성 부분을 제거하기 위해 원심분리 후에 수득한 현탁액을 GTF 활성을 위해 비슷하게 분석한다. 그 결과를 표 2에 또 나타낸다.

[표 2]

* 투석과정동안 생성된 불용성 화합물의 회수율

GTF 활성을 가진 단백질 부분을 개개의 추출과정에 의해 세포로부터 추출할 수 있고, 높은 수율에서 고도의 특이 활성을 가진 추출액을 수득하기 위해서 8M 요소 용액에서 25℃ 1시간동안 하는 추출과정이 가장 적절함은 표 2에 나타난 결과로부터 확실하게 알 수 있다.

[실시예 3]

[CA-GTF-I 정제물 제조]

8M 요소와 함께 25℃에서 1시간동안 하는 추출과정이 가장 적절하다고 판명되었기 때문에 에스 무탄스 MT8148을 실시예 2에서 기술된 방법과 똑같이 TTY배지(8리터)에서 배양한다. 그리고 수득한 세포를 모아서 세정한 다음 8M 요소용액 300ml에서 현탁한다. 배양한 세포의 양은 건조 중량으로 9.7g이다.

결국 현탁액을 교반과 함께 25℃에서 1시간동안 추출시킨다. 추출후에 원심분리에 의해 상징액을 얻어 추출용액으로부터 세포를 제거하고 10mM 포스페이트 완충용액(pH 6.0)으로 투석한다.

투석후에 상징액속에 생성된 불용성 물질을 원심분리에 의해 제거하고 CA-GTF-I 즉 조악하게 추출한 조제물을 수득한다. 결국 암모늄 술페이트를, 60% 포화액을 수득하기 위해 조악하게 추출한 CA-GTF-I 조제물에 첨가하여 침전물을 얻는다. 침전물은 50mM 포스페이트 완충용액(pH 7.5) 20ml속에서 더 용해시키고 수득한 용액을 50ml 포스페이트 완충용액(pH 7.5)으로 투석한다.

투석후에 투석동안 생성된 불용성 물질을 원심분리에 의해 용액으로부터 제거하고 수득한 상징액을 DEAE-세파셀 칼럼(2.5×13cm)(파마시아)에 적용한다. 칼럼에 흡수된 부분을 포스페이트 완충용액(pH7.5)에서 NaCl의 선형 농도 구배와 함께 선택적으로 용출한다.

각 부분을 실시예 1에서 기술된 방법에 의해 GTF 활성을 분석하고 280nm에서 UV흡광도를 측정함에 의해서 단백질 농도를 분석한다. 그래서 표 1에 나타난 것처럼 현격한 활성을 0.45에서 1.0M의 NaCl농도를가진 분획들에서 발견한다.

0.45에서 1.0M의 NaCl 농도의 용출된 분획들을 모아서 10mM 포스페이트 완충용액(pH 6.0)으로 투석하고 나서 이전에 10mM 포스페이트 완충용액(pH 8.0)으로 평형을 이룬 히드록실아파티테(BiO Cel HTP, BiO-Rad 실험실) 칼럼에 적용시킨다.

칼럼에 흡수된 분획들을 0.01M, 0.2M, 0.26M 및 0.5M 포스페이트 완충용액(pH 6.0)과 함께 차례로 용출시킨다. 각각의 분획들을 상기와 같이 GTF 활성과 단백질 농도를 위해 분석한다. 표 2에 나타낸 것처럼 GTF 활성을 0.5M 포스페이트 완충용액과 함께 용출된 분획들 속에서 발견한다.

결국 0.5M 포스페이트 완충용액과 함께 용출된 높은 활성의 분획들을 모아서 10mM 포스페이트 완충용액(pH 6.0)으로 투석하여 순수한 효소 제조를 준비한다.

더우기 상기의 추출 및 정제과정의 각 단계에서 수득한 GTF 활성 분획들에서, GTF 활성, 단백질 함량, 특히 GTF 활성 및 수율을 표 3이 보여주고 있다.

[표 3]

게다가 이 정제한 효소 제조를 하기의 조건하에서 SDS-PAGE(단백질이 쿠마시에 브릴리안트 블루우에 의해 착색되는 경우)에 적용할 때 156K 달톤의 분자량의 위치에서 만일 밴드를 관찰하고, 정제한 효소 제조가 156K 달톤의 분자량을 가진 효소 단백질임이 확실하다.

SDS-PAGE 과정을 위한 조건 : SDS-PAGE는 라엠리 등에 의해 수행된다.

즉 조악한 추출 제조와 정제한 효소 제조(0.2에서 35마이크로그램)는 2% SDS, 5% 2-메르캅토에탄올 및 20% 글리세롤을 함유한 62.5mM Tris-HCl 완충용액(pH 6.8)에서 l00℃ 3분동안 각각 처리하는 것이다.

전기 영동은 0.1% SDS 및 4% 아크릴아미드 스택킹 겔을 함유한 7.5% 아크릴아미드 분리겔에서 실온에서 10mA에서 2시간동안 수행한다. 더구나 사용하는 표준 분자량들은 페리틴(220K 달톤), 포스포릴라제(94K 달톤), 소의 혈청 알부민(67K 달톤), 카탈라제(60K 달톤), 오발부민(43K 달톤) 및 락테이트 디하이드로게나제(36K 달톤)둘이다(모두가 파마시아에서 획득한 것임).

50mU 효소활성에 상응하는 정도로 정제한 효소 제조물을 1% 수크로즈 및 0.1% 소디움 아자이드(각각이 최종 농도임)를 함유한 0.1M 포스페이트 완충용액(pH 6.0)에 첨가한다. 그리고나서 혼합물을 증류수와 함께 전체 부피 3ml로 만든 다음 37℃에서 18시간동안 반응시킨다. 게다가 효소 반응은 얼음과 함께 4℃로 반응용액을 냉각함에 의해서 종결시킨다.

효소반응 종결후에 반응물을 1.600×g로 원심분리하고 물에 녹지않는 침전된 분획과 상징액을 분리시킨다. 물에 녹지 않는 분획을 증류수로 2번 씻고 물에 증류수 3ml로 현탁하여 물에 녹지 않는 글루칸 제조물을 수득한다.

더불어 2.5부피의 에탄올을 상징액에 첨가하고 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 방치한 후에 생성된 침전물을 1.600×g로 원심분리하여 회수한 다음 3ml의 증류수에 용해시킨다. 또한 침전 과정은 비슷하게 반복되고 회수된 침전물은 다시 3ml 증류수에 용해시켜 수용성 글루칸 제조물을 수득한다.

더우기 이 제조에서 포함된 글루칸은 앤쓰론 방법에 의해 정량적으로 분석되고 정제된 효소 제조에 의해 합성된 글루칸의 종류들을 조사한다. 결과적으로 정제한 효소 제조물은 물에 불용성인 글루칸을 합성하는 능력을 가진 CA-GTF-I 임을 보여주고 있다.

따로이, 상기 효소반응을 반복하고 수득한 물에 불용성인 글루칸 침전물을 원심분리로 분리한다. 침전물(2mg)을 세척한 후 하꼬모리의 방법(Hakomori, S., J. Biochem., 55, 205, 1964)에 의해 그것을 완전히 메틸화하고 90%(v/v)포름산 및 계속해서 2M 트리플루오로아세트산으로 수화시킨다. 수득한 수화물은 붕소소화나트륨의 존재하에서 환원하고 피리딘-아세트무수물 혼합액(1 : 1v/v)에서 아세틸화하여 부분적으로 메틸화한 알디톨아세트산염 유도체를 얻는다. 다음으로 수득한 유도체를 실리콘 SPB-5(Shimadzu 제품)로 피복된 모세관(0.25mm×30m)을 연결시킨 가스크로마토그래프 분석기를 이용하여 분석한다. 덱스트란 T10(Pharmacia)의 알디톨아세트산염 유도체도 상기한 것과 동일한 방법으로 준비하여 표준시료로 사용한다.

분석결과 상기의 과정에 의해 얻어진 불수용성 글루칸은 62mol% 알파-1,3 연결 28% 알파-1,6 연결, 및 5% 알파-1,3,6 연결-글루코오스 잔기를 포함하고 있음을 알 수 있다.

더우기, 실시예 1에서와 같이 GTF 활성을 결정할 때 온도와 pH를 변화시켜, 불수용성 합성효소 활성에 있어서 정제된 효소 준비시의 최적온도와 최적 pH를 조사한다. 또한 통상적 방법에 의해 각각의 km값도결정한다.

상기의 측정과 시험에 의해 얻어진 데이타가 표 4에 나타나 있다. 비교하기 위하여 표 4에는 투석된 BHI를 포함하고 있는 배지에서 배양된 에스 무탄스 MT8148 배양의 부유물로부터 바바등의 방법에 의해얻은 CF-GTF-S에 대한 데이타도 주어져 있다.

[표4]

* 겔에 형성된 광범한 집락체 때문에 측정이 불가능하다.

본 발명의 CA-GTF-I로 면역된 쥐로부터 준비한 항혈청으로 임무노블로팅(immunoblotting)함으로써 본 발명의 CA-GTF-I와 반응할 수 있는 항체가 항혈청내에서 얻어짐을 확증한다. 반면에, 상기의 절차에 의해 얻어진 CA-GTF-I와 CF-GTF-S의 항원적 성질은 ELISA법을 이용하여 조사한다. 이러한 목적을 위하여 프로인드 완전 보조액(FCA)과 사또 등의 방법에 의하여 배양된 균주 MT8148의 상징액으로부터 준비된 수용성 글루칸 합성 효소와 반응하는 단일항체를, 균주 MT 8148로부터 CA-GTF-I와 함께 피부주사하여 면역시킨 쥐로부터 CA-GTF-I에 대한 쥐의 항혈청을 준비한다. 또한 알칼리포스퍼타제로 표기된 염소 항-쥐 IgA+IgG+IgM 항체를 제 2의 항체로 사용하고 p-니트로페닐포스페이트이 나트륨을 기질로 사용한다. 이 결과를 표 5에 제시하였다. 즉, CA-GTF-I에 대한 쥐의 항혈청은 CF-GTF-S와 반응하지 않고 CF-GTF-S에 대한 단일항체는 CA-GTF-I와 반응하지 않음을 알 수 있는데 이것은 이러한 효소들의 항원성이 다름을 입증해 준다.

[표 5]

[실시예 4]

[항원의 준비]

에스 무탄스 균주 잉그브리트를 15리터의 37℃ TTY 배지내에서 18시간동안 배양하고 이때 배양된 세포를 식염수로 두어번 세척한다.

그리고 나서 세척한 세포를 400ml의 8M 우레아 용액내에서 현탁하고 세포 현탁액을 25℃에서 1시간동안 교반한다. 다시 세포현탁액을 원심분리하여 세포를 제거하고 수득한 상징액은 10mM 인산 완충용액(pH 6.0)에 투석한다. 투석후에 상징액에 생긴 침전물은 원심분리에 의해 제거하고 수득한 상징액은 60% 포화의 황산암모늄으로 침전시킨다.

이때 얻어진 침전물은 원심분리하여 회수한다. 침전물을 다시 10mM 인산 완충용액(pH 6.0)으로 용해하여 수득한 용액을 같은 완충용액에 투석한다. 용액에 나타나는 침전물은 원심분리로 제거하여 상징액을 얻는다. 상징액은 원(면역-항원) 제조에 사용한다.

제조의 단백질 농도와 총 단백질은 CBB-G법에 의해 측정하여 단백질 농도는 5.1mg/ml, 총 단백질 양은 141mg이 되도록 한다. 또한 제조는 실시예 3의 조건하에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 작동시킨 후 쿠마시브릴리언트 블루(CBB)로 착색한다. 그 결과 155K 달톤의 위에 대응하는 밴드를 포함하는 수개의 밴드를 확인할 수 있다.

별도로, 제조를 37℃의 Tris-HCl 완충용액내에서 30분동안 처리하여, 전기 영동시의 온도가 4℃인 것을 제외하고는 상기의 방법과 똑같이 SDS-PAGE를 작동시킨다. 수득한 겔은 1% 수크로스와 0.05%소디움아지드를 포함하는 37℃의 인산 완충용액속에 18시간동안 담궈 놓는다. 그리고나서 담궈놓은 겔을 집어내어 PAS 시약으로 착색한다. 그 결과 155K 달톤의 위치에서, 글루칸의 생성을 나타내주는 분명하게 착색된 밴드를 확인할 수 있다. 또한 상술한 SDS-PAGE의 결과로부터 계산된 제조의 CA-GTF-I양은 40%의 중량비를 나타낸다.

[실시예 5]

[정제된 CA-GTF-I 제조의 준비]

균주 Ingbritt를 실시예 4와 같은 조건하에서 TTY배지(8ℓ)내에서 배양한다. 수득된 세포를 거둬들여 세척한 후에 300ml의 8M 우레아 용액으로 현탁한다.

다음으로 추출을 위하여 현탁액을 25℃에서 1시간동안 교반한다.

추출후에 추출액을 원심분리하여 세포를 제거하고 수득한 상징액을 10mM 인산 완충용액(pH 6.0)에서 투석한다. 투석이 끝나면 상징액내에 생성된 침전물을 제거하여 CA-GTF-I 크루드 추출 제조를 얻는다.

다음으로 크루드 추출 제조에 60% 포화되게 황산암모늄을 첨가하여 침전물을 얻는다. 수득한 침전물을 50mM 인산 완충용액 20ml내에 더 용해시켜 동일한 완충용액에 투석한다. 투석후에 투석시 생성된 침전물을 원심분리하여 제거한다. 수득한 상징액은 DEAE-세파셀(파마시아)칼럼(2.5×13cm)에 가한다.

관에 흡수된 분획은 인산 완충용액(pH 7.5)속의 NaCl의 선형 농도구배에 따라 선택적으로 용출한다. 용출된 각각의 분획에 있어서의 GTF 활성은 실시예 1에서와 같이 측정하고 단백질 농도는 280nm에서의 흡광도를 측정하여 결정한다. 그 결과 뚜렷하게 높은 활성을 0.45 내지 1.0M의 NaCl 농도로 용출된 분획에서 관찰할 수 있다.

0.45 내지 1.0M의 NaCl 농도로 용출된 분획을 모으고 10mM의 인산 완충용액(pH 6.0)에서 투석한 후10mM 완충용액(pH 6.0)으로 평형이 이루어진 히드록실아페리트 칼럼(1.0 ×13cm)에 가한다.

관에 흡수되는 분획은 0.01M, 0.2M, 0.26M 및 0.5M 인산 완충용액(pH 6.0)에 따라 차차 용출된다. 각 분획의 GTF 활성 및 단백질 농도는 상술한 방법으로 결정한다. 그 결과 GTF 활성도는 0.5M 인산 완충용액(pH 6.0)으로 용출된 분율에서 나타난다.

그 다음, 0.5M 인산 완충용액(pH 6.0)으로 용출된 높은 활성을 갖는 분획을 모으고, 10mM 인산 완충용액(pH 6.0)으로 투석하여 정제된 효소 제조를 얻는다. 정제된 효소 제조는 상기 언급한 조건하에서 SDS-PAGE를 적용하여 단백질을 CBB시약으로 착색한다. 그 결과 155K 달톤의 분자량에 대응하는 위치에서 단일 밴드가 탐지된다. 이로부터 정제된 효소 제조는 155K 달톤의 분자량을 가지는 효소 단백질임이 확증된다.

다음으로 실시예 1에서와 같은 GTF 측정 조건을 GTF 활성의 최적 pH 반응의 최적온도 범위 및 불활성화 조건에 의해 정제된 효소 제조를 조사할 수 있도록 수정한다. 그 결과, 수득한 정제된 효소제조가 전술한 (2)∼(4)의 물리화학적 특성을 갖고 있음을 확증한다.

정제된 효소 제조의 작용에 의해 합성된 글루칸의 종류는 50mU 효소 활성에 대응하는 양에서 정제된 효소 제조를 사용하여 실시예 3에서와 같은 방법에 따라서 조사한다. 그 결과 정제된 효소 제조가 수용성 글루칸을 합성할 수 있는 활성을 가지는 CA-GTF-I임을 밝힌다. 더우기 수득한 정제 효소 제조의 단백질의 양은 상기한 방법에 의하여 측정한다. 이 양은 9.7mg이다.

[실시예6]

[항체의 제조]

W/O형 유제는 실시예 4에서 얻는 (CBB-B법에 의한 측정에 따라 1mg의 단백질을 포함하는) 0.5ml의 크루드 CA-GTF-I 제조와 0.5ml의 FCA(프로인드의 완전 보조액)를 1 : 1의 비율로 혼합하여 준비한다.

첫번째의 면역은 0.5ml의 각각의 유제를 암탉의 왼쪽 가슴 근육에 주사하여 행한다. 그 후에 달걀에서 얻은 WSF의 항체 역가를 하기의 방법으로 측정하고 그 변화를 관찰한다.

(1) 달걀로부터의 항체 분리법

달걀로부터 분리된 달걀 노른자를 동일한 부피의 PBS(포스페이트-완충식염수, pH 7.4)와 그 부피의 클로로포름과 혼합한다.

혼합액을 상온에서 30분간 부화하고 3000rpm으로 20분간 원심분리한 후 상층을 WSF(수용성 분율)로 사용한다.

(2) 항체 역가의 측정법

항체 역가의 측정은 ELISA에 의해 행한다.

먼저 실시예 1에서 얻은 크루드 면역 항원 제조를 SDS-PAGE에 작동시켜, 전기영동법을 사용하여 155K 달톤의 분자량에 대응하는 SDS-PAGE 상으로부터 단백질 함유부를 분리한다. 다음으로 이것을 SDS-PAGE에 작동시켜 155K 달톤의 분자량에 대응하는 부분에 생기는 단일 밴드를 CBB-R 250으로 겔을 착색하여 탐지한다. 얻어진 분율은 50mM 탄산나트륨 완충용액(pH 9.6)으로 용해하여 1.2㎍/ml의 단백질농도를 구한다. 100㎕의 수득 용액의 증류수를 96-웰 마이크로 역가판(Inmulon2, Dynateck) 위의 각각의 웰에 나누고 분획에 포함된 정제된 항원이 판까지 피복되도록 4℃에서 밤새도록 부화시킨다. 그 후에 판을 PBS-T(pH 7.4)로 5회 세척한다. 세척이 끝나면 웰을 3% BSA를 포함하는 PBS(pH 7.4)로 37℃에서 1시간 동안 막고서 판은 PBS-T로 5회 세척한다. 그리고나서 PBS-T로 두 차례에 걸쳐 희석된 100㎕의 WSF를 각각의 웰에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응하게 한다.

반응이 끝난 후 판을 PBS-T로 5회 세척하고, 100ℓ의 콘쥬게이트퍼옥시다제 항-닭 IgG항체(1.67㎍/ml의 단백질 함량)를 판위의 각각의 웰에 첨가한다. 판은 25℃에서 30분간 부화시킨 후에 PBS-T로 5회 세척한다.

판의 각각의 웰에 다가, 20mg의 o-페닐렌디아민을 용해하여 준비한 100㎕의 용액과 기질로서, 0.2M 디소디움포스페이트-0.1M 시트르산 완충용액(pH 5.0)에 녹인 10㎕의 퍼옥시드 25℃에서 20분간 정온 방치하여 반응을 수행하고 3N 황산 용액 100마이크로리터를 첨가하여 반응을 종결시킨다.

반응 후, 항체 역가를 각 웰의 광학밀도(OD₄₉₂)로써 측정한다. 항체 역가를 광학밀도 0.2를 나타내는 희석으로 종점 역가 방법에 의해 평가한다. 계속해서 달걀 노른자에서 항체 역가가 제 1 도에서 나타낸 바와같이 제 1차 면역 8주후에 감소하기 시작하는 것을 확인함으로써 제 2차 면역을 전에 실시한 바와 동일한 방식으로 수행한다.

제 2차 면역후 계란을 약 한달동안 수집하고 항체 역가를 상기의 방법에 의해 결정한다. 그 결과 8.4×10³의 항체 역가를 갖는 WSF를 제 1차 면역 12주 후에 수득한다(제2차 면역 4주후). 더우기 8.4×10³의 항체 역가를 갖는 WSF(13ml, 13ml의 계란 노른자로부터 제조) 단백질 농도는 뷰렛 방법으로 측정한다. 그 결과 WSF의 총 단백질은 약 26mg이다(약 20.mg/ml×13ml).

[실시예 7]

[항체에 의한 에스 무탄스의 부드러운 표면에의 고착의 저해의 확인]

에스 무탄스의 이 표면에의 고착에 관한 모델 실험으로서, 유리 표면에의 고착에 관한 실험을 수행하였다. 즉, 실시예 6에서 수득한 항체의 첨가에 의해 에스 무탄스의 유리 표면에의 고착의 저해의 정도를 평가하기 위하여 실험을 고안한다. 과정은 하기에서 설명한다.

먼저, 8.2×10³의 항체 역가를 갖는 실시예 6에서 수득한 WSF 및 그의 10배 희석한 용액을 시험용액으로서 사용한다.

따로이 실시예 6에서 기재한 바와 동일한 방식으로 비면역화 암탉의 계란(실시예 5에서 사용한 바와 동일한 종류의 것)으로부터 WSF를 제조하여 시험용액으로서 사용한다. 더구나, 이 WSF는 CA-GTF-I와 특이적으로 반응하지 않음이 확인된다.

그런 다음, 이들 시험용액 각각의 1ml부분을 시험관(13mmψ×100mm)에 분배하고 1.5% 수크로스를 함유하여 1.5배 농축한 BHI배지 각각 2ml의 부분을 시험관에 더 첨가한다.

시험관 각각에 BHI배지에서 전배양한 에스 무탄스 균주 잉그브리트의 현탁액 0. 1ml을 첨가하고, 30℃의 각도로 경사지게한 시험관을 37℃에서 18시간동안 정적으로 정온 배양한다.

각 시험관에서 제조한 조성물을 표 6에 나타낸다.

정적 정온방치를 종료한 후에, 각 시험관(이후 제1차 시험관이라 칭함)을 부드럽게 회전시키고, 시험관벽에 고착되지 않은 세포를 함유하는 전체 유동액을 제 2차 시험관에 각각 전달한다. 그런 다음, 50mM 포스페이트 완충용액(pH 6.8) 3ml 각각을 벽에 고착한 세포를 갖는 제 1차 시험관 각각에 첨가하고, 시험관을 다시 회전시킨다. 방출된 세포를 함유하는 전체 완충용액을 제 3차 시험관에 전달하고, 50mM 포스페이트 완충용액(pH 6.8) 3ml 각각을 수득한 제 1차 시험관의 각각에 첨가한다.

더우기, 제 1차, 제 2차 및 제 3차 시험관을 초음파 처리하여 시험관 각각에 균질한 세포 현탁액을 제조한다. 각 현탁액의 흡광도(OD₅₅₀)를 측정하고, 개개의 고착율을 다음과 같이 계산한다.

수득한 결과를 표 6에 나타낸다.

[표 6]

[실시예 8]

실시예 5에서 수득한 정제한 CA-GTF-I을 항원으로 사용한 점을 제외하고 실시예 6에서 기재한 바와 동일한 방식으로 항체를 제조한다. 그 결과, CA-GTF-I와 구체적으로 유사하게 반응할 수 있는 항체를 수득한다.

더구나, 수득한 항체가 유사하게 뚜렷한 예방 효과를 가짐을 확인한 실시예 7에 기재한 바와 동일하게 세균의 고착에 대한 예방 효과를 수득한 항체에 대하여 조사한다.

[실시예 9]

실시예 6에서 수득한 8.4×10³의 항체 역가를 갖는 WSF를 표 7에 나타낸 조성물을 갖는 성분에 첨가하여(0.5중량%) 치약을 제조하고 표 8에 나타낸 조성물을 갖는 용액에 첨가하여 구강 세척물을 제조한다.

구체적으로, 1.2중량% 카르복시메틸셀룰로스 및 0.1중량% 사카라이드소디움을 증류수에 용해시켜 제조한 용액을 42중량% 칼슘 피로포스페이트에 첨가하여 혼합물을 수득한다.

혼합물에 15중량% 글리세롤, 10중량% 소르비톨, 2.0중량% 소디움로릴술페이트, 1.0중량% 방향제 및 0.5중량% WSF를 더 첨가한다. 수득한 혼합물을 반죽기 또는 혼합교반기로 완전히 혼합하고 굴려서 표 7에 나타낸 치약 조성물을 수득한다. 조성물로부터 기포를 제거한 후, 조성물을 튜브에 채운다.

따로이, 1.0중량% 방향제 및 0.3중량% 로릴디에탄올아미드를 22.5중량% 에탄올에 용해시켜 수득한 용액에 0.05중량% 사카라이드소디움 및 0.5중량% WSF를 증류수에 제조한 용액을 첨가하여 혼합물을 수득한다. 증류수를 혼합물에 더 첨가하여 표 8에 나타낸 조성물을 갖는 구강 세척물을 수득한다.

[표 7]

[표 8]

Claims

a) 수크로스와 반응하고 물에 불용성인 글루칸을 합성하며 : b) 6.7과 7.0사이에서 최적 pH를 가지며 : c) 15와 50℃ 사이에서 최적 온도를 가지며 : d) 80℃에서 5분간의 열처리로 그의 활성을 상실하며 : e) SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 측정하여 150 내지 165킬로달톤의 분자량을 가지며 : f) 효소 그 자체에 특이적인 항체를 생성시키는 동물에 항원성을 가지는 생리화학적 특성을 갖는 세포-연관 글루코실트랜스퍼라제 분리체.
a) 세포-연관 글루코실트랜스퍼라제를 갖는 스트렙트코커스 무탄스 혈청형, c, e 또는 f의 세포를 추출용매와 접촉시켜 세포로부터 세포-연관 글루코실트랜스퍼라제를 방출시켜 이렇게 방출된 세포-연관 글루코실트랜스퍼라제를 함유하는 추출물을 형성하고, b) 음이온 교환기 또는 히드록실아파티테를 사용하는 흡착에 의해 추출물로부터 세포-연관 글루코실트렌스퍼라제를 정제하는 단계를 특징으로 하는, 제 1 항의 세포-연관 글루코실트랜스퍼라제 분리체의 분리 및 정제방법.
수크로스로부터 물에 불용성인 글루칸을 합성하는 반응을 촉매하는 세포-연관 글루코실트랜스퍼라제를 생성하는 능력을 갖는 혈청형 c, e 또는 f중의 하나의 에스 무탄스를 배양하고, 수득한 배양세포로부터 제 1 항에 따른 분리한 세포 연관 글루코실트랜스퍼라제를 제조하는 단계를 특징으로 하는, 물에 불용성인 글루칸을 합성하는 효소활성을 갖는 세포-연관 글루코실트랜스퍼라제의 생성방법.
제 1 항에 따른 분리한 세포-연관 글루코실트랜스퍼라제로써 면역화한 암탉에 의해 생성된 계란으로부터 제조되며 이의 카리에스를 생성하는 혈청형 c, e 또는 f의 에스 무탄스에 대하여 면역학적 활성을 나타내는 항체.
제 1 항에 따른 분리한 세포-연관 글루코실트랜스퍼라제로써 암탉을 면역화하고, 면역화된 암탉의 계란으로부터 상기 글루코실트랜스퍼라제에 대하여 면역학적 활성을 갖는 임무노글로블린을 제조하는 단계를 특징으로 하는, 이의 카리에스를 생성하는 혈청형 c, e 또는 f의 이의 에스 무탄스에 대하여 면역학적 활성을 나다내는 항체의 제조방법.
유효 성분으로서 제 4 항에 따른 항체를 함유하는 이의 카리에스 예방 조성물.
제 4 항에 따른 항체와 적어도 담체를 혼합하는 단계를 포함하는 이의 카리에스 예방 조성물의 제조방법.