CN109593129B

CN109593129B - 一种用于预防龋齿的卵黄抗体及其制备方法和卵黄抗体制剂

Info

Publication number: CN109593129B
Application number: CN201811559491.8A
Authority: CN
Inventors: 赵肃清; 贺攀; 卢明磊; 杨慧怡; 王甜甜
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Jiangsu Runjie Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: CN109593129A

Abstract

本发明公开了一种用于预防龋齿的卵黄抗体及其制备方法和卵黄抗体制剂，所述制备方法为，采用变异链球菌免疫原免疫母鸡后，收集免疫后的所述母鸡的鸡蛋并提取卵黄抗体；所述变异链球菌免疫原包括变异链球菌的破碎蛋白溶出物。本发明提供的制备方法通过采用变异链球菌的破碎蛋白溶出物免疫母鸡，最终制得的卵黄抗体特异性强，卵黄抗体效价高，能够用于制备抗龋齿制剂，特别是牙膏和漱口水能够有效抑制细菌生物膜的形成，抑制细菌生长，表现出优异的抗龋齿效果，而且，这种抗体对动物损害小，安全可靠；无毒副作用，不会产生耐药性，无有毒物质残留；易于控制规模化生产，生产成本低。

Description

一种用于预防龋齿的卵黄抗体及其制备方法和卵黄抗体制剂

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于预防龋齿的卵黄抗体及其制备方法和卵黄抗体制剂。

背景技术

龋齿，世界卫生组织认定的三大重点防治疾病之一，发病率高，分布范围广，患者常因青少年时龋齿引发的牙痛而不能充分咀嚼食物，妨碍正常的消化与吸收，从而导致生长发育方面的疾病或其他疾病。目前龋齿只能靠牙科填充手段进行治疗，不能自愈。罹患龋齿后，牙痛会影响食欲，干扰患者正常的咀嚼，进而影响食物的消化和吸收，出现缺乏营养的状况。龋齿的进一步发展，会引起颜面蜂窝织炎、牙髓炎、齿槽逸脓、根周脓肿等口腔疾病，危害青少年的颌面发育。

目前有研究表明，龋病主要是由变异链球菌(Streptococcus mutans，sm)引起的具有传染性的疾病，是人类最常见的疾病之。变异链球菌通过黏附在牙齿表面，形成口腔生物膜，即牙菌斑。同时，变异链球菌代谢产生以乳酸为主的酸性副产物导致局部pH值下降引起牙釉质层脱矿，最终形成龋洞，影响人类健康。

卵黄免疫球蛋白，又称为卵黄抗体。是从血液中的抗体，富集到鸡蛋蛋黄中的一种活性抗体，在抗菌和抗病毒方面具有优良的特性。引起来国内外学者的广泛研究。有研究表明，特异性卵黄抗体能够为人或者动物提供有效的被动免疫。应用细菌疫苗免疫产蛋鸡可获得抗变异链球菌的特异性IgY抗体，口服特异性IgY可阻止变异链球菌黏附于牙齿表面，干扰牙菌斑的形成，发挥抑龋作用，并且这一种抗体，具有安全性强，无毒副作用和生产成本低等优点。

但是，现有的卵黄抗体对变异链球菌的特异性仍不够强，需要开发出特异性强的卵黄抗体。另外，还需要开发出能够预防龋齿的制剂。

发明内容

本发明为克服上述现有技术所述的缺陷，提供一种用于预防龋齿的卵黄抗体的制备方法，所述方法制得的卵黄抗体对变异链球菌的特异性强，卵黄抗体效价高，可用于预防龋齿，无毒副作用，安全可靠，且易于规模化生产，生产成本低。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种用于预防龋齿的卵黄抗体的制备方法，所述制备方法采用变异链球菌免疫原免疫母鸡后，收集免疫后的所述母鸡的鸡蛋并提取卵黄抗体；

所述变异链球菌免疫原包括变异链球菌的破碎蛋白溶出物。

本发明中用于免疫母鸡的变异链球菌免疫原不同于普通的甲醛灭活的变异链球菌，而是采用超声破碎的变异链球菌，还可以复合甲醛灭活的变异链球菌，从而得到本发明中使用的变异链球菌免疫原。采用含有破碎蛋白溶出物的变异链球菌免疫原免疫母鸡，最终提取的卵黄抗体特异性更强，卵黄抗体效价高，能够用于制备抗龋齿制剂，特别是牙膏和漱口水，表现出优异的抗龋齿效果，能够抑制变异链球菌口腔生物被膜的形成。而且，无毒副作用，安全可靠，且易于规模化生产，生产成本低。

发明人研究了该卵黄抗体的特异性，测试了该卵黄抗体对其他细菌的交叉反应率。研究结果显示，牙龈卟啉单胞菌、伴放线杆菌、Solobacterium moorei细菌、幽门螺杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、鼠伤寒沙门杆菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、单核球增多性李斯特菌、副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌、珊瑚色诺卡氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、荧光假单胞菌交叉反应率低，交叉反应率在0.39%~0.78%之间。

所述变异链球菌为ATCC 25175。变异链球菌ATCC 25175可通过普通市售得到。

优选地，所述破碎蛋白溶出物由变异链球菌菌液经超声破碎处理后，与变异链球菌混合，再与佐剂混合并充分乳化得到。所述佐剂包括完全佐剂和不完全佐剂。所述变异链球菌免疫原也称为疫苗。

优选地，所述免疫包括初次免疫和加强免疫。初次免疫为弗氏完全佐剂疫苗。加强免疫为弗氏不完全佐剂疫苗；加强免疫的次数可以为5次。免疫操作为，鸡胸二点和鸡翅皮下二点注射，每点注射0.3 mL。

优选地，提取卵黄抗体的步骤包括，将鸡蛋的蛋黄经聚乙二醇或水提取后，再经聚乙二醇、硫酸铵或硫酸钠盐析分离提纯得到所述卵黄抗体。

优选地，提取卵黄抗体的步骤包括，将鸡蛋的蛋黄经聚乙二醇提取后，再先后经聚乙二醇和硫酸铵溶液提纯，得到所述卵黄抗体。

提取卵黄抗体的具体步骤：

将获得的免疫鸡蛋消毒后破壳去膜收集蛋黄，加入蛋黄3倍体积的含有3.5%PEG6000的PBS缓冲液（含有3.5% PEG6000的磷酸盐缓冲溶液是指，3.5g PEG6000加入到100mL的PBS溶液中，即二者质量体积比为3.5% g/mL），混匀，调节pH为7.4，搅拌30～40 min后，静置12～15 h；10000 rpm，4℃，20 min离心，取上清液，过滤，得到滤液。

滤液中缓慢加入PEG6000；PEG6000的质量与滤液的体积之比为12% g/mL；调pH7.4，搅拌30～40 min；离心，弃上清得沉淀，即为卵黄抗体粗品。

将卵黄抗体粗品用PBS缓冲液溶解后，离心，取上清液，慢慢滴入与上清液等体积的饱和硫酸铵溶液，然后2～4 ℃静置12～15 h；离心，得到沉淀，沉淀用PBS溶液溶解，含有PBS溶液一半体积的饱和硫酸铵溶液混匀，2～4 ℃静置1～2 h；离心，得到沉淀物，沉淀物用PBS溶液溶解后透析，真空冷冻干燥，得到抗变异链球菌卵黄抗体提纯物。

提取卵黄抗体还可以采用另一种方法：将鸡蛋的蛋黄经水提取后，再先后经过硫酸铵溶液和硫酸钠溶液提纯，得到所述卵黄抗体。

上述方法具体如下：

将获得的免疫鸡蛋消毒后破壳去膜收集卵黄液，加入9倍卵黄液体积的pH为5的水稀释，搅拌30min，搅匀后4℃过夜；在10000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，收集上清液然后将上清液用滤纸过滤，即为水溶性组分。

滤液中加入缓慢加入饱和硫酸铵溶液使其浓度达到50%的饱和度，边加入边搅拌，停止加入后继续搅拌10 min后4℃静置2 h；将提取液在8000 rpm，4℃条件下离心20 min后，收集沉淀。

将卵黄抗体粗品用卵黄液体积的PBS缓冲液溶解后，加入6倍卵黄液体积的19%硫酸钠溶液（19%硫酸钠溶液是指，19g硫酸钠溶于100mL的水溶液中，即二者质量体积比为19%g/mL），混匀，室温静置过夜；在8000 rpm，4℃条件下离心20 min后，收集沉淀；沉淀物用PBS溶液溶解后透析，真空冷冻干燥，得到抗变异链球菌卵黄抗体提纯物。

本发明还保护上述制备方法制得的卵黄抗体。

上述卵黄抗体在制备抗龋齿制剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明还保护一种用于预防龋齿致病菌的卵黄抗体制剂，所述卵黄抗体制剂包括如下重量百分含量的组分：卵黄抗体0.01%~5%，辅料95%~99.99%。

优选地，所述卵黄抗体制剂为卵黄抗体牙膏，所述卵黄抗体牙膏包括如下重量百分含量的组分：卵黄抗体0.01%~5%；葡萄糖酸氯己定溶液0.01%~0.2%，甘油1.0%~15.0%，聚乙烯吡咯烷酮 0.1%~2.0％；余量为牙膏膏基。一般地，牙膏膏基的成分为：磷酸氢钙、山梨糖醇、水合硅石、去离子水、月桂醇硫酸酯钠、聚乙二醇、香精、纤维素胶、薄荷脑、黄原胶、糖精钠、植酸钠、冰片、硅酸钠、DMDM乙内酰脲、氨甲环酸、羟苯甲酯、焦磷酸四钠、硼砂等。

优选地，所述卵黄抗体制剂为卵黄抗体漱口水，所述卵黄抗体漱口水包括如下重量百分含量的组分：卵黄抗体0.1%~2%，甘露醇 5.0%，甘油 1.0%~15.0%，葡萄糖酸氯己定溶液0.01%~0.2%，余量为基础漱口水。一般地，基础漱口水的成分为：山梨醇、乙醇、食用香精、焦磷酸四钠、 EDTA二钠、植酸钠、糖精钠、薄荷醇、去离子水等。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的制备方法通过采用变异链球菌的破碎蛋白溶出物免疫母鸡，最终制得的卵黄抗体特异性强，卵黄抗体效价高，能够用于制备抗龋齿制剂，特别是牙膏和漱口水，表现出优异的抗龋齿效果，能够抑制变异链球菌口腔生物被膜的形成，而且，无毒副作用，安全可靠，且易于规模化生产，生产成本低。

附图说明

图1为实施例中的变异链球菌ATCC 25175的透射电镜图。

图2为母鸡免疫后制得的卵黄抗体的效价测试结果。

图3为实施例1提取的卵黄抗体的电泳图。图3中，M: marker；1:聚乙二醇提取的抗体粗提取物；2:聚乙二醇提取后二次硫酸铵盐析。

图4为实施例2提取的卵黄抗体的电泳图。图4中，M: marker；3:水提取抗体；4:硫酸铵盐析；5:硫酸钠盐析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例中的原料均可通过市售得到；

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

检测方法

1. 抗变异链球菌特异性卵黄抗体的效价检测：

采用酶联免疫分析法（ELISA）检测变异链球菌卵黄抗体的效价。

（1）包被：用包被缓冲液（CBS，pH=9.6，0.05 mol/L）将变异链球菌抗原稀释至一定浓度，包被于96孔酶标板，100 μL/孔，4℃包被过夜，甩干孔中液体并用PBST（含有0.05%吐温-20的PBS）洗板三次并用吸水纸拍干。

（2）封闭：用含3%脱脂奶粉的PBS（0.01 mol/L）进行封闭（100 μL/孔），于水浴锅中37℃下温育1 h，如上步骤1洗涤操作。

（3）加一抗：分别将特异性IgY用PBS（0.01 mol/L）进行倍比稀释后，用移液枪加入到96孔酶标板（100 μL/孔）中，同时加入PBS作为空白对照，于水浴锅中37℃下温育1 h，然后甩干酶标板孔中的液体，如上步骤1洗涤操作。

（4）加酶标二抗：每孔加入1:5000稀释过的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡的IgY抗体100μL，于水浴锅中37℃下温育1 h，然后甩干孔中液体，如上步骤1洗涤操作。

（5）显色和终止反应：加入新鲜配制的TMB显色液，100 μL/孔，于水浴锅中37℃下温育15 min，然后加入终止液，50μL/孔。

（6）检测吸光值：立即检测酶标板各孔在450nm处的吸光值。以阳性孔OD值≧2.1倍阴性孔OD值时的最高稀释倍数作为特异性卵黄抗体的效价。

效价检测结果见说明书附图2 （20~100天抗体的效价）。

2. 抗变异链球菌特异性卵黄抗体的分子量以及纯度

采用SDS-PAGE测定抗变异链球菌特异性卵黄抗体的纯度。

用SDS-PAGE电泳检测得到的抗变异链球菌卵黄抗体的纯度。具体如下：使用10％(质量分数)分离胶，5％(质量分数)浓缩胶，电泳结束后用考马斯亮蓝染色，最后脱色；其中，marker为标准分子量的蛋白。

实施例1

一种用于预防龋齿的卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：

S1. 菌体种类。变异链球菌（ATCC 25175），购买于广东省微生物菌种保存中心。经透射电镜观察细菌形态。

S2. 免疫原的制备。

在37摄氏度，接种变异链球菌于血平板中培养，培养24小时，有草绿色溶血现象，用PBS溶液冲洗，4摄氏度条件下 8000 rpm离心15 min。收集菌体。将细菌沉淀加入少量的PBS溶液，在冰水浴条件下用超声破碎仪破碎细菌，8000 rpm条件下离心收集上清可溶性蛋白（超声条件：间隔3 s，超声时间4 s，全程时间20 min）。离心，取上清液，用透析袋透析三天（透析袋分子量14KDa，透析液为PBS缓冲溶液）。通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测量可溶性蛋白的含量，调节蛋白浓度为2 mg/mL，分装备用。将蛋白破碎物和灭活细菌全菌混合，至蛋白最终浓度为1 mg/mL。细菌全菌的最终浓度为10⁹CFU/mL，全菌体为甲醛灭活的变异链球菌，加入等量的完全佐剂或不完全佐剂，充分乳化，制成疫苗。用来免疫母鸡。

S3. 免疫。初次免疫为弗氏完全佐剂，后面加强免疫为弗氏不完全佐剂。每只鸡翅下皮下免疫注射和鸡胸浅层肌肉注射。

S4. 抗变异链球菌卵黄抗体的特异性卵黄抗体的制备方法。

（1）将鸡蛋用 75%的酒精浸泡消毒，敲开鸡蛋，用蛋清蛋黄分离器除去蛋清，将卵黄放置到滤纸上面，胶头吸管破坏蛋黄膜，获得卵黄液，量取卵黄液的体积。

（2）在磁力搅拌下加入 3 倍于卵黄液体积的含有3.5% PEG6000的磷酸盐缓冲溶液（含有3.5% PEG6000的磷酸盐缓冲溶液是指，3.5g PEG6000加入到100mL的PBS溶液中，即二者质量体积比为3.5% g/mL）。在室温下搅拌约 30 min 后静置，至有分层。四层纱布过滤。取滤液。

（3）10000 r/min、4 ℃离心 20 min，去除沉淀，取上清液，并采用 4 层纱布过滤上层不溶性物质，量取滤液的体积。

（4）将滤液放置烧杯中，用磁力搅拌器搅拌，称取一定量的 PEG6000，缓慢加入滤液中；PEG6000的质量与滤液的体积之比为12% g/mL。搅拌至充分溶解后继续搅拌 40 min，静置沉淀。

（5）在4℃下 10000 r/min 离心 10 min，去掉上清液，沉淀部分即为提取的 IgY的粗品或粗提取物，留取粗品用来测量抗体的效价。

（6）IgY 粗品用磷酸盐缓冲液溶解，在磁力搅拌器搅拌下缓慢加入等体积的配好的饱和硫酸铵溶液，即为50%饱和度，继续搅拌10 min 后放置 4℃过夜。

（7）8000 r/min， 4℃离心 10 min 后，得到沉淀，再加入一定量的磷酸盐缓冲液溶解，边搅拌边缓慢加入PBS溶液一半体积的饱和硫酸铵溶液，即为33%的饱和度。在 4℃下静置 2 h，然后于 4℃，8000 r/min 离心 10 min，收集沉淀部分。

（8）沉淀用少量的磷酸缓冲溶液溶解沉淀，取已溶解的抗体溶液装入透析袋中，在PBS溶液、 4℃条件下透析3天，每12 h更换PBS溶液一次；放置冷冻真空冷冻干燥机干燥，成品成粉末状，即为提取的 IgY 纯品。放置-20℃保存。卵黄抗体经还原性SDS-PAGE查看分子量和分析抗体纯度。其纯度可达80%以上。测试结果如图3所示。

母鸡初次免疫后20~100天后，抗体的效价的测试结果如图2所示。

实施例2

本实施例为本发明的用于预防龋齿的卵黄抗体的制备方法的第二实施例，包括如下步骤：

步骤S1.~S3.与实施例1相同；

S4. 抗变异链球菌卵黄抗体的特异性卵黄抗体制备方法。

（1）收集免疫后母鸡鸡蛋做标记后用75%酒精消毒鸡蛋外壳，破壳，用蛋清分离器分离蛋清与卵黄并且将卵黄在无菌滤纸上滚动以尽可能除去蛋白，去膜收集卵黄液。充分混匀。

（2）量取并记录所收集的卵黄液的体积，加入9倍卵黄液体积的pH为5的水稀释，搅拌30min。搅匀后四摄氏度过夜。

（3）卵黄液在10000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，收集上清液然后将上清液用滤纸过滤，即为水溶性组分。

（4）量取并记录过滤后的上清液的体积，缓慢加入饱和硫酸铵溶液使其浓度达到50%的饱和度，边加入边搅拌，停止加入后继续搅拌10 min后4 ℃静置2 h，得到提取液。

（5）将提取液在8000 rpm，4 ℃条件下离心20 min后，收集沉淀。

（6）加入约卵黄液体积的磷酸盐缓冲液溶解收集得到的沉淀，加入6倍卵黄液体积的19%硫酸钠溶液（19%硫酸钠溶液是指，19g硫酸钠溶于100mL的水溶液中，即二者质量体积比为19% g/mL），混匀，室温静置过夜，得到提取液。

（7）将提取液在8000 rpm，4 ℃条件下离心20 min后，收集沉淀；

（8）将沉淀溶于少量的磷酸缓冲溶液，待透析；取已溶解的抗体溶液装入透析袋中，在PBS溶液、 4℃条件下透析3天，每12 h更换PBS溶液一次；

（9）透析3天后放置真空冷冻干燥机干燥，成品为粉末状，即为提取的IgY纯品。放置-20℃保存。卵黄抗体经还原性SDS-PAGE查看分子量和分析抗体纯度。其纯度可达85%以上。结果如图4 所示。

实施例3

抗变异链球菌特异性卵黄抗体牙膏：

特异性卵黄抗体提取物0.1%~5%；葡萄糖酸氯己定溶液0.01%~0.2%，甘油1.0%~15.0%，聚乙烯吡咯烷酮 0.1%~2.0％；余量为牙膏膏基。牙膏膏基成分为：磷酸氢钙、山梨糖醇、水合硅石、去离子水、月桂醇硫酸酯钠、聚乙二醇、香精、纤维素胶、薄荷脑、黄原胶、糖精钠、植酸钠、冰片、硅酸钠、DMDM乙内酰脲、氨甲环酸、羟苯甲酯、焦磷酸四钠、硼砂等；牙膏膏基中各成分的含量可以为本领域常规含量。

卵黄抗体牙膏的活性效价是通过酶联免疫分析分析法评价。取60~70天聚乙二醇提取、硫酸铵纯化的卵黄抗体提纯物添加到牙膏中进行稳定性评价。一个月后，其结合效价可以达到1:800每毫克蛋白。

实施例4

抗变异链球菌特异性卵黄抗体漱口水：

特异性卵黄抗体提取物0.1%~2%，甘露醇 5.0%，甘油 1.0%~15.0%，葡萄糖酸氯己定溶液0.01%~0.2%，经微孔滤膜过滤除菌，与基础漱口水混合，无菌灌装入罐中。基础漱口水成分为：山梨醇、乙醇、食用香精、焦磷酸四钠、 EDTA二钠、植酸钠、糖精钠、薄荷醇、去离子水等；基础漱口水中各成分的含量可以为本领域常规含量。

卵黄抗体的活性通过酶联免疫分析分析法评价。取初次免疫后50~60天聚乙二醇提取、硫酸铵纯化的卵黄抗体提纯物添加到漱口水中，一个月后，其卵黄抗体的结合效价可达到1:1000每毫克蛋白。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种用于预防龋齿的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，采用变异链球菌免疫原免疫母鸡后，收集免疫后的所述母鸡的鸡蛋并提取卵黄抗体；

所述变异链球菌免疫原为变异链球菌菌液经超声破碎处理后，离心收集上清可溶性蛋白，与变异链球菌混合，再与佐剂混合并充分乳化得到；

所述提取卵黄抗体的步骤包括，将鸡蛋的蛋黄经水提取后，再先后经过硫酸铵溶液和硫酸钠溶液提纯，得到所述卵黄抗体；

所述变异链球菌为灭活的变异链球菌。

2.权利要求1所述制备方法制得的卵黄抗体。

3.权利要求2所述卵黄抗体在制备抗龋齿制剂中的应用。

4.一种用于预防龋齿致病菌的卵黄抗体制剂，其特征在于，包括如下重量百分含量的组分：卵黄抗体0.01%~5%，辅料95%~99.99%；

所述的卵黄抗体为权利要求2中的卵黄抗体。

5.根据权利要求4所述的卵黄抗体制剂，其特征在于，所述卵黄抗体制剂为卵黄抗体牙膏，所述卵黄抗体牙膏包括如下重量百分含量的组分：卵黄抗体0.01%~5%，葡萄糖酸氯己定溶液0.01%~0.2%，甘油1.0%~15.0%，聚乙烯吡咯烷酮 0.1%~2.0％；余量为牙膏膏基。

6.根据权利要求4所述的卵黄抗体制剂，其特征在于，所述卵黄抗体制剂为卵黄抗体漱口水，所述卵黄抗体漱口水包括如下重量百分含量的组分：卵黄抗体0.1%~2%，甘露醇5.0%，甘油 1.0%~15.0%，葡萄糖酸氯己定溶液0.01%~0.2%，余量为基础漱口水。