CN1562368A - 抗龋齿口腔喷雾剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗龋齿口腔喷雾剂及其制备方法，旨在提供一种效果好、制造和使用方便、无毒副作用的抗龋齿口腔喷雾剂及其制备方法。该抗龋齿口腔喷雾剂针对引起龋齿的主要病原菌－变形链球菌进行深入分析研究而制成卵黄抗体(IgY)，制备的所述卵黄抗体可直接识别细菌表面的抗原，对完整的、有活性的细菌有较强的杀灭作用，卵黄抗体的提取采用水稀释法或PEG沉淀法或膜过滤法或硫酸铵沉淀法，然后再配制成口腔喷雾剂，该喷雾剂由卵黄抗体(IgY)、醇、润湿剂、表面活性剂、香精、防腐剂、色素和去离子水组合而成。本发明可用于口腔抗龋、治龋领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗龋齿口腔喷雾剂及其制备方法。
背景技术
目前，随着人民生活水平的普遍提高及饮食中糖含量及其摄入量的增加，使得龋病得以流行，尤其是儿童乳牙患龋齿更为明显，随着人口寿命的延长，老年人根面龋亦在增长，这些都严重影响人们的口腔和身体健康，从而严重影响人们的生活质量。目前世界卫生组织(WHO)已经将龋齿列为是仅次于心血管疾病、癌症的第三大非传染性疾病，并且作为身体健康与否的10项指标之一。
龋齿是一种常见病、多发病，其发病率高，分布广，对人体危害大。经过科学家们不懈的努力，现在普遍认为细菌是龋齿发生的主要原因，其中变形链球菌是主要致病菌，其形成的菌斑粘附于牙齿表面，并在牙齿表面繁殖生长、产酸，腐蚀牙齿，最终形成龋齿。
目前市场上应用的防龋产品大致分为以下几类：一为含氟制剂，其防龋原理为促进牙齿钙化，减少酸性腐蚀。此为间接作用，疗效有限；二是抗菌药物的应用，如含洗必汰、甲硝唑等的漱口水，因其有明显的副作用，应用受到限制；三是由植物提取物制成的防龋产品，如中药提取物制成的含漱液、口胶片等，其对龋齿防治有一定作用，但其均为药物，需在医生指导下使用，不宜长期使用；四是目前市场上被广泛接受的利用代糖生产的用于防龋护齿类的产品，如木糖醇等，它却没有从根本上解决防龋护齿的实质性问题。中国专利公开号CN1307061A于2001年8月8日公开了一种名称为“抗龋齿菌IgY的制备及防龋齿组合物”的专利。该专利抗龋齿菌IgY的制备分以下几步：制备抗原，制备抗体，配置药物。其抗体的生产过程是将细菌的细胞直接进行裂解后作为抗原，导致制备出来的抗体主要是针对细菌内的抗原成份其作用，当面对完整的活性细菌时，由于抗体无法直接进入细菌体内起作用，而其与活体细菌表面的结合能力又弱，因此其灭菌的效果很差。故现有产品存在低效、制造和使用不方便、有毒副作用的缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种抗龋齿口腔喷雾剂，该抗龋齿口腔喷雾剂效果好、制造和使用方便、无毒副作用。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种抗龋齿口腔喷雾剂的制备方法，该抗龋齿口腔喷雾剂的制造方法针对引起龋齿的主要病原菌-变形链球菌进行深入分析研究而制成卵黄抗体，制备的卵黄抗体可直接识别细菌表面的抗原，对完整的、有活性的细菌有较强的杀灭作用。
本发明抗龋齿口腔喷雾剂所采用的技术方案是：它是由下述重量配比的原料制成的药剂：
木糖醇 0.1-5.0％
甘油 1.0-15.0％
阿斯巴甜 0.01-0.2％
安赛蜜 0.01-0.2％
山梨酸钾 0.01-0.05％
抗龋齿卵黄抗体 0.04-1.0％
去离子水 97.52-59.05％
丙二醇 1.0-15.0％
香精 0.2-1.5％
聚山梨醇酯20 0.1-2.0％
色素 0.01-1.0％
上述各组分相加为百分之百。
本发明抗龋齿口腔喷雾剂的制备方法所采用的技术方法是：它采用以下步骤进行：
一、抗龋齿卵黄抗体的制备；
(1)、制备抗原：
取血清型为C型和D型的变形链球菌，分别以固体TYCSB琼脂斜面传代，在37℃厌氧条件下培养48小时，经PCR鉴定得到所述变形链球菌的纯种后，在液体TYCSB培养基中扩大培养48~72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为抗原；
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用和产卵母鸡的免疫及取卵：
初次免疫选用弗氏完全佐剂与所述抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为初次免疫抗原，加强免疫均选用弗氏不完全佐剂与所述抗原按照重量比为1∶1混合乳化后作为加强免疫抗原；
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述初次免疫抗原，此为初次免疫；隔2周后开始加强免疫，对初次免疫的母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述加强免疫抗原，以后每隔一周加强免疫一次，其初次免疫和加强免疫共三次，从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃条件下储存备用；
②、卵黄抗体的提取；
将鸡卵中的卵黄抗体提取，冷冻干燥，即得抗体；
二、溶液的配制；(以下配比为重量比)
A溶液
木糖醇 0.1-5.0％
甘油 1.0-15％
阿斯巴甜 0.01-0.2％
安赛蜜 0.01-0.2％
山梨酸钾 0.01-0.05％
抗龋齿卵黄抗体 0.04-1.0％
去离子水 70.0-50.0％
B溶液
丙二醇 1.0-15.0％
香精 0.2-1.5％
聚山梨醇酯20 0.1-2.0％
C溶液
色素 0.01-1.0％
D溶液
去离子水 27.52-9.05％
三、先将所述A溶液充分混合溶解，然后将所述B溶液在搅拌机搅拌所述A溶液的情况下添加到所述A溶液中，得到的混合溶液通过0.22uM的滤膜进行过滤后，在无菌的条件下加入所述C溶液，然后再将所述D溶液加入到所述混合溶液，使上述各组分相加为百分之百，在无菌的条件下分装到不同规格的喷雾器罐内，即可。
所述的卵黄抗体的提取采用水稀释法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，用所述去离子水稀释，调节PH值在4.0-5.0范围内，在4℃条件下搅拌4小时，用离心机加工后弃去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥，即可。
所述的卵黄抗体的提取采用PEG沉淀法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，加入体积为所述蛋黄3倍体积的浓度为4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，取上清，然后向所述上清内逐滴滴加1/6所述上清体积的浓度为40％的PEG，充分搅拌混匀后在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即可。
所述的卵黄抗体的提取采用膜过滤法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，用所述去离子水稀释，在温度为4℃条件下静置12小时后，用分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD-200KD的蛋白物质，冷冻干燥，即可。
所述的卵黄抗体的提取采用硫酸铵沉淀法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，重复提取3次：第一次，取所述蛋黄等体积的生理盐水稀释并混合均匀后，缓慢滴加2倍蛋黄体积且浓度为50％的饱和硫酸铵，在温度为4℃条件下作用3小时，并在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，弃上清，留沉淀；第二次，用所述生理盐水溶解沉淀，然后加入2/3所述生理盐水体积且浓度为40％的饱和硫酸铵，在温度为4℃条件下作用3小时，并在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，弃上清，留沉淀；第三次，用所述生理盐水溶解沉淀，然后加入1/2所述生理盐水体积且浓度为33％的饱和硫酸铵，在温度为4℃条件作用3小时，将沉淀直接冷冻干燥，即可。
本发明的有益效果是：由于本发明针对引起龋齿的主要病原菌-变形链球菌进行深入分析研究而制成卵黄抗体，其抗体的生产过程不是将细菌的细胞直接进行裂解后作为抗原，制备出来的抗体主要是针对细菌表面的抗原成份起作用，当面对完整的活性细菌时，其与活体细菌表面的结合能力较强，所以抗体可直接进入细菌体内起作用，因此其对细菌有较强的杀灭作用，故该抗龋齿口腔喷雾剂效果好、制造和使用方便、无毒副作用；又由于本发明抗龋齿口腔喷雾剂的制备方法中卵黄抗体的提取采用水稀释法、PEG沉淀法、膜过滤法、硫酸铵沉淀法等方法，故采用本发明卵黄抗体来配制口腔喷雾剂的方法是卫生、环保、方便、低成本的。
具体实施方式
实施例一
本发明所采用的技术机理是：首先制备一种抗龋齿的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱检测可以在分子量170～190KD处呈现单一条带，Western Bloting检测可以在分子量170～190KD处发现一条单一的特异性条带；或按照变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，Western Bloting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性条带，采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.1～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
本发明抗龋齿口腔喷雾剂，它是由下述重量配比的原料制成的药剂：
木糖醇 0.1％
甘油 1.0％
阿斯巴甜 0.01％
安赛蜜 0.01％
山梨酸钾 0.01％
抗龋齿卵黄抗体 0.04％
去离子水 97.52％
丙二醇 1.0％
香精 0.2％
聚山梨醇酯 0.1％
色素 0.01％
上述各组分相加为百分之百。
本发明抗龋齿口腔喷雾剂的制备方法采用以下步骤进行：
一、抗龋齿卵黄抗体的制备：
(1)、制备抗原：
经过科学家们不懈的努力，现在普遍认为细菌是龋齿发生的主要原因，其中变形链球菌是主要致病菌。取血清型为C型和D型的变形链球菌，分别以固体TYCSB琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下培养48小时，经PCR鉴定得到所述变形链球菌的纯种后，在液体TYCSB培养基中扩大培养48-72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用和产卵母鸡的免疫及取卵：
初次免疫选用弗氏完全佐剂与所述抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为初次免疫抗原，加强免疫均选用弗氏不完全佐剂与所述抗原按照重量比为1∶1混合乳化后作为加强免疫抗原；
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述初次免疫抗原，此为初次免疫；隔2周后开始加强免疫，对初次免疫的母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述加强免疫抗原，以后每隔一周加强免疫一次，其初次免疫和加强免疫共三次，从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃条件下储存备用；
②、卵黄抗体的提取：
卵黄抗体的提取可采用以下四种方法之一：
a、所述的卵黄抗体的提取采用水稀释法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，用所述去离子水稀释，调节PH值在4.0-5.0范围内，在4℃条件下搅拌4小时，用离心机加工后弃去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥，即可。
b、所述的卵黄抗体的提取采用PEG沉淀法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，加入体积为所述蛋黄3倍体积的浓度为4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，取上清，然后向所述上清内逐滴滴加1/6所述上清体积的浓度为40％的PEG，充分搅拌混匀后在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即可。
c、所述的卵黄抗体的提取采用膜过滤法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，用所述去离子水稀释，在温度为4℃条件下静置12小时后，用分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD-200KD的蛋白物质，冷冻干燥，即可。
d、所述的卵黄抗体的提取采用硫酸铵沉淀法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，重复提取3次：第一次，取所述蛋黄等体积的生理盐水稀释并混合均匀后，缓慢滴加2倍蛋黄体积且浓度为50％的饱和硫酸铵，在温度为4℃条件下作用3小时，并在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，弃上清，留沉淀；第二次，用所述生理盐水溶解沉淀，然后加入2/3所述生理盐水体积且浓度为40％的饱和硫酸铵，在温度为4℃条件下作用3小时，并在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，弃上清，留沉淀；第三次，用所述生理盐水溶解沉淀，然后加入1/2所述生理盐水体积且浓度为33％的饱和硫酸铵，在温度为4℃条件作用3小时，将沉淀直接冷冻干燥，即可。
二、溶液的配制：
A溶液
木糖醇 0.1％
甘油 1.0％
阿斯巴甜 0.01％
安赛蜜 0.01％
山梨酸钾 0.01％
抗龋齿卵黄抗体 0.04％
去离子水 70.0％
B溶液
丙二醇 1.0％
香精 0.2％
聚山梨醇酯 0.1％
C溶液
色素 0.01％
D溶液
去离子水 27.52％
三、先将所述A溶液充分混合溶解，然后将所述B溶液在搅拌机搅拌的情况下添加到所述A溶液中，得到的混合溶液通过0.22uM的滤膜进行过滤后，在无菌的条件下加入所述C溶液，然后再将所述D溶液加入到所述混合溶液，使上述各组分相加为百分之百，在无菌的条件下分装到不同规格的喷雾器罐内，本发明选用100毫升的包装瓶。
本发明所述的抗龋齿的口腔喷雾剂还可以与预防口腔疾病的药物制剂及蛀牙预防剂配合使用，协同增加抗龋齿的功效。
实施例二
本发明抗龋齿口腔喷雾剂，它是由下述重量配比的原料制成的药剂：
木糖醇 5.0％
甘油 15.0％
阿斯巴甜 0.2％
安赛蜜 0.2％
山梨酸钾 0.05％
抗龋齿卵黄抗体 1.0％
去离子水 59.05％
丙二醇 15.0％
香精 1.5％
聚山梨醇酯 2.0％
色素 1.0％
上述各组分相加为百分之百。
溶液的配制：
A溶液
木糖醇 5.0％
甘油 15.0％
阿斯巴甜 0.2％
安赛蜜 0.2％
山梨酸钾 0.05％
抗龋齿卵黄抗体 1.0％
去离子水 30.0％
B溶液
丙二醇 15.0％
香精 1.5％
聚山梨醇酯 2.0％
C溶液
色素 1.0％
D溶液
去离子水 29.05％
其余部分同实施例一。
实施例三
本发明抗龋齿口腔喷雾剂，它是由下述重量配比的原料制成的药剂：
木糖醇 3.0％
甘油 8.0％
阿斯巴甜 0.1％
安赛蜜 0.1％
山梨酸钾 0.03％
抗龋齿卵黄抗体 0.5％
去离子水 78.77％
丙二醇 8.0％
香精 1.0％
聚山梨醇酯 1.0％
色素 0.5％
上述各组分相加为百分之百。
溶液的配制：
A溶液
木糖醇 3.0％
甘油 8.0％
阿斯巴甜 0.1％
安赛蜜 0.1％
山梨酸钾 0.03％
抗龋齿卵黄抗体 0.5％
去离子水 50.0％
B溶液
丙二醇 8.0％
香精 1.0％
聚山梨醇酯 1.0％
C溶液
色素 0.5％
D溶液
去离子水 28.77％
其余部分同实施例一。
Claims (6)
1、一种抗龋齿口腔喷雾剂，其特征在于，它是由下述重量配比的原料制成的药剂：
木糖醇 0.1-5.0％
甘油 1.0-15.0％
阿斯巴甜 0.01-0.2％
安赛蜜 0.01-0.2％
山梨酸钾 0.01-0.05％
抗龋齿卵黄抗体 0.04-1.0％
去离子水 97.52-59.05％
丙二醇 1.0-15.0％
香精 0.2-1.5％
聚山梨醇酯 0.1-2.0％
色素 0.01-1.0％
上述各组分相加为百分之百。
2、一种根据权利要求1所述的抗龋齿口腔喷雾剂的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
一、抗龋齿卵黄抗体的制备：
(1)制备抗原：取血清型为C型和D型的变形链球菌，分别以固体TYCSB琼脂斜面传代，在37℃厌氧条件下培养48小时，经PCR鉴定得到所述变形链球菌的纯种后，在液体TYCSB培养基中扩大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为抗原；
(2)制备抗体：
①、佐剂的选用和产卵母鸡的免疫及取卵：
初次免疫选用弗氏完全佐剂与所述抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为初次免疫抗原，加强免疫均选用弗氏不完全佐剂与所述抗原按照重量比为1∶1混合乳化后作为加强免疫抗原；选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述初次免疫抗原，此为初次免疫；隔2周后开始加强免疫，对初次免疫的母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述加强免疫抗原，以后每隔一周加强免疫一次，其初次免疫和加强免疫共三次，从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃条件下储存备用；
②、卵黄抗体的提取：将鸡卵中的卵黄抗体提取，冷冻干燥，即得抗体；
二、溶液的配制：
A溶液
木糖醇 0.1-5.0％
甘油 1.0-15.0％
阿斯巴甜 0.01-0.2％
安赛蜜 0.01-0.2％
山梨酸钾 0.01-0.05％
抗龋齿卵黄抗体 0.04-1.0％
去离子水 70.0-50.0％
B溶液
丙二醇 1.0-15.0％
香精 0.2-1.5％
聚山梨醇酯20 0.1-2.0％
C溶液
色素 0.01-1.0％
D溶液
去离子水 27.52-9.05％
上述各组分均为重量百分比；
三、先将所述A溶液充分混合溶解，然后将所述B溶液在搅拌机搅拌所述A溶液的情况下添加到所述A溶液中，得到的混合溶液通过0.22uM的滤膜进行过滤后，在无菌的条件下加入所述C溶液，然后再将所述D溶液加入到所述混合溶液，使上述各组分相加为百分之百，在无菌的条件下分装到不同规格的喷雾器罐内，即可。
3、根据权利要求2所述的抗龋齿口腔喷雾剂的制备方法，其特征在于，所述的卵黄抗体的提取采用水稀释法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，用所述去离子水稀释，调节PH值在4.0-5.0范围内，在4℃条件下搅拌4小时，用离心机加工后弃去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥，即可。
4、根据权利要求2所述的抗龋齿口腔喷雾剂的制备方法，其特征在于，所述的卵黄抗体的提取采用PEG沉淀法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，加入体积为所述蛋黄3倍体积的浓度为4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，取上清，然后向所述上清内逐滴滴加1/6所述上清体积的浓度为40％的PEG，充分搅拌混匀后在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即可。
5、根据权利要求2所述的抗龋齿口腔喷雾剂的制备方法，其特征在于，所述的卵黄抗体的提取采用膜过滤法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，用所述去离子水稀释，在温度为4℃条件下静置12小时后，用分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD-200KD的蛋白物质，冷冻干燥，即可。
6、根据权利要求2所述的抗龋齿口腔喷雾剂的制备方法，其特征在于，所述的卵黄抗体的提取采用硫酸铵沉淀法：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，重复提取3次：第一次，取所述蛋黄等体积的生理盐水稀释并混合均匀后，缓慢滴加2倍蛋黄体积且浓度为50％的饱和硫酸铵，在温度为4℃条件下作用3小时，并在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，弃上清，留沉淀；第二次，用所述生理盐水溶解沉淀，然后加入2/3所述生理盐水体积且浓度为40％的饱和硫酸铵，在温度为4℃条件下作用3小时，并在温度为4℃、离心机转数为每分钟1300转条件下离心10分钟，弃上清，留沉淀；第三次，用所述生理盐水溶解沉淀，然后加入1/2所述生理盐水体积且浓度为33％的饱和硫酸铵，在温度为4℃条件作用3小时，将沉淀直接冷冻干燥，即可。
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