CN1233837C - 一种雅致放射毛霉用于生产神经酰胺的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种雅致放射毛霉的新用途，特别是涉及雅致放射毛霉Actinomucor elegans用于生产神经酰胺的用途，本发明还提供了神经酰胺的制备方法，它是以米糠为原料通过发酵、提取分离、纯化而成，本发明的另一技术方案是提供了神经酰胺制备方法的副产物—一种酶型饲料添加剂。本发明神经酰胺制备方法的原料米糠来源丰富，经过生物技术生产神经酰胺，成本低，安全性好，神经酰胺纯度高，对污染小，并且实现了废渣的充分利用，本发明制备的酶型饲料添加剂，用量小，能显著提高动物对饲料的吸收利用率，降低料肉比，降低饲养成本，提高生产效益。
Description
技术领域
本发明提供了一种雅致放射毛霉的新用途，特别是涉及生产神经酰胺的用途，本发明还提供了神经酰胺的制备方法，属生物技术领域。
背景技术
菌号为AS3.2778的菌株是雅致放射毛霉Actinomucor elegans的典型株，由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏。它是从发酵豆腐乳中分离得到，主要用于发酵食品的制造，尤其是豆腐乳的生产。该菌种是酿造豆腐乳的一株优良菌种，但是该菌种的其它用途目前尚未相关报道。
神经酰胺具有传递神经指令，促进细胞增殖分化，保护机体免受外界物理(如紫外线)、化学(毒害气体)、生物等因素的伤害，防止包括水分等体内成分损失，维护机体屏障功能，其中最突出的是具有抗肿瘤作用，是防治皮肤癌的重要活性成分。神经酰胺具有抑制黑色素生成的功能，因而能消除皮肤黑褐斑，保持皮肤美白。临床证明，经常补充神经酰胺，能改善全身皮肤水合性，增加皮肤保水量，提高皮肤弹性，减少皱纹和褐黑斑生成。国外已将其作为重要生理活性成分及医药原料，在药品、高档护肤化妆品和食品中使用。
因神经酰胺具有多种生物活性及良好的安全性，大量用于化妆品和功能性食品，需求量大，人工化学合成产品中的副产物可能会给消费者带来不可预测的负面影响，存在局限性。从天然生物原料中提取神经酰胺目前有两类原料，一是动物源神经酰胺；二是植物源神经酰胺。动物源神经酰胺因近年来猪牛感染疯牛病、口蹄疫等人畜共患病，其产品中残留该类病毒而引起消费者普遍忧虑，因疯牛病等的潜在危害性，使动物源神经酰胺的研究开发与应用逐步萎缩，国外是以动物源为主生产。植物源神经酰胺中一方面神经酰胺含量很低，提取无工业价值，另一方面神经酰胺为结合态，用常规的化学方法很难将神经酰胺从植物中提取出来，目前国外还未见以植物源生产神经酰胺的产业化的报导。孙庆杰的“天然神经酰胺的研究与开发”(孙庆杰、天然神经酰胺的研究与开发，中国油脂.2003，28(2).60-61)报道了神经酰胺的工艺路线，即：用米糠经有机溶剂萃取或超临界方法得米糠萃取物，经色谱分离，得神经酰胺类化合物，经纯化即得神经酰胺单体，其缺陷在于米糠中的神经酰胺60％以神经鞘磷脂和神经糖(主要为半乳糖)苷脂的结合态存在，采用常规提取方法，不能提取分离神经酰胺单体，提取率低。虽然已有报道米糠可以生产神经酰胺，但这种可直接分离的神经酰胺在米糠中只占约0.024％，以常规分离、纯化技术，一吨产品要耗用1万吨以上的米糠，没有可利用价值。
目前随着集约化养殖畜牧业的发展，在饲料生产中越来越普遍的添加抗菌药、抗寄生虫药和各种生长促进剂。这些药物或其代谢产物可能残留于动物器官、组织中，通过食物链进入人体危害人类健康。另外，非法使用违禁药物，造成养殖产品中违禁药物残留严重超标，不仅对人民群众的身体健康、乃至生命安全构成严重威胁，而且对人类赖以生存的生态环境造成严重危害，同时严重影响我国饲料和养殖产品的出口创汇，如欧盟、东欧、日本和香港等国家和地区多次退回我国出口的畜产品，欧盟还以中国饲料中用药过滥、残留超标等原因于1996年8月停止进口中国禽肉及其相关产品，给国家造成严重经济损失，也损害了国家形象。目前在饲料中使用违禁药物主要有激素、镇静剂和国家已明令禁止的其它药物或化学药品3大类数10个品种。
酶型饲料添加剂是利用现代发酵工程技术生产的高效能生物活性物质，它可以作为饲料的添加剂，如蛋白酶、脂肪酶、植物酶，多糖酶等，它具有安全高、无毒副作用等特点，除能较好地促进动物生长，提高饲料利用率，提高生产效益之外，还可有效地避免在动物饲料中使用各种不良添加剂带来的负面影响。
发明内容
本发明所要解决的技术方案是提供了一种雅致放射毛霉的新用途，具体地，是涉及生产神经酰胺的用途，本发明还提供了神经酰胺的制备方法，它是以米糠为原料通过发酵、提取分离、纯化而成，本发明的另一技术方案是提供了神经酰胺制备方法的副产物—一种酶型饲料添加剂。
本发明提供了一种雅致放射毛霉Actinomucor elegans用于生产神经酰胺的用途。
本发明还提供了雅致放射毛霉Actinomucor elegans用于生产酶型饲料添加剂的用途。
本发明提供神经酰胺的制备方法，它是以含有神经酰胺的植物性原料通过生物发酵技术提取制备的方法，它包括下列步骤：
a、选择菌种：选用中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏的菌号为AS3.2778的雅致放射毛霉Actinomucor elegans作为发酵菌种；
b、菌种发酵：用a步骤选择的菌种对含有神经酰胺的植物性原料进行固体发酵，得到含神经酰胺的发酵产物；
c、将b步骤的发酵产物经分离、纯化得神经酰胺和剩余产物。
其中步骤b所述的含有神经酰胺的植物性原料是米糠。所述固体发酵的培养基中含有米糠重量比97.6～99.08％，其余为微生物发酵所需的氮源，微量元素；进一步地，固体发酵的培养基为：米糠97.6～99.08％，酵母膏0.4～0.8％，KH2PO4 0.05～0.2％，K2HPO4 0.05～0.2％，MgSO4 0.05～0.1％，CaCl2 0.05～0.2％， ZnSO4 0.02～0.1％，菜籽油0.3～0.8％；以米糠为主要培养基物质，加入不同的无机盐、微量元素，pH值调节剂，可对培养基的物料有不同选择；其中培养温度：15℃～35℃；培养时间：24～84h；培养基pH值：7.0～8.0；培养基含水量：40％～70％；培养基接种量：4％～12％。
进一步地，步骤b所述的菌种固体发酵条件为：
培养基采用变温培养，培养时间72h，前24h培养温度30℃，后48h培养温度25℃，培养基pH值7.0～8.0，培养基含水量65％，接种量8～10％的培养条件下发酵。
其中步骤c所述的分离、纯化方法为：CO2超临界流体萃取分离，得神经酰胺粗品，再将神经酰胺粗品经大孔吸附树脂纯化。除了上述分离、纯化方法外，还可选用微生物工程中可接受的分离、纯化方法达到相同或相似的效果。
进一步地，CO2超临界流体萃取为CO2在超临界流体状态下萃取发酵产物，采用分级萃取，其步骤为：
①将CO2经液化、低温、高压、加热转变成超临界流态；
②将发酵产物置于萃取器中，通入超临界流态CO2，得萃取物和萃取分离所得的剩余产物；其中萃取器可选用单个的萃取器，也可选多个萃取器并联，有利于提高萃取效率。
③将萃取物经减压加热通入分离器，得神经酰胺粗品，除了神经酰胺粗品外，还有剩余萃取物；该分离器是一整套仪器中的一个部分，来自大连光明化工院。所述的萃取器和分离器是整套仪器中的一个部分，整套仪器的型号是：GM32-200×3型超临界CO2萃取工业装置。
另外，可将③步骤所述的剩余萃取物再次减压加热通入另一分离器，得水、精油和气态CO2，该分离器的目的是为了进一步纯化产品，回收CO2溶剂，达到物料的物料的循环利用。
其中各步骤的萃取压力为20Mpa～32Mpa；萃取温度为：32℃～45℃；萃取流量：30公斤CO2/公斤发酵料；步骤③分离压力为7Mpa～8Mpa，分离温度为35℃～38℃；将③步骤所述的剩余萃取物再次减压加热通入另一分离器的分离压力为4Mpa～5Mpa，分离温度为20～25℃；萃取时间：2小时。
进一步地，所述各步骤的条件是：萃取压力为30Mpa；萃取温度为：32℃～35℃；萃取流量：30公斤CO2/公斤发酵料；步骤③分离压力为7Mpa～7.5Mpa，分离温度为35℃～38℃；将③步骤所述的剩余萃取物再次减压加热通入另一分离器的分离压力为4Mpa～5Mpa，分离温度为20～25℃；萃取时间：2小时。
其中步骤c中神经酰胺粗品，经大孔吸附树脂纯化条件为：大孔树脂型号：D140、D141、D180、LD605(中国蓝星集团晨光化工研究院)，洗脱液为乙醇∶乙酸＝7∶1～9∶1，洗脱速度6～10L/h，收集洗脱液、浓缩、结晶，即得神经酰胺。
进一步地，大孔树脂为D140，洗脱液为乙醇∶乙酸＝8∶1，洗脱速度8L/h。
本发明还提供了一种酶型饲料添加剂，它是用神经酰胺的制备方法中步骤c将发酵产物分离所得的剩余产物制备而成，即由CO2超临界流体萃取步骤②中所述的萃取分离所得的剩余产物。该酶型饲料添加剂含高活性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、植酸酶、β-葡聚糖苷酶、纤维素酶等系列生物酶。其中加入了生物稳定剂，该酶型饲料添加剂的的重量配比为：萃取分离所得的剩余产物98.2～99.6％，乳酸钙0.2～0.8％，山梨醇0.2～1.0％；进一步地，该酶型饲料添加剂的重量配比为：萃取分离所得的剩余产物98.9％，乳酸钙0.5％、山梨醇0.6％。
本发明还提供了该酶型饲料添加剂的各重量配比的原料用于饲料添加剂中的用途。
其中本发明酶型饲料添加剂的用量是饲料总重量的0.5％～2％。
所述的酶型饲料添加剂用于饲养猪、奶牛、羊、兔、鹅、鸡、鲤鱼、鲫鱼等动物。
酶型饲料添加剂是利用现代发酵工程技术生产的高效能生物活性物质。通过动物功效学实验，证明本发明酶型饲料添加剂作为生物催化剂，它具有安全、无毒、无副作用等特点。酶型饲料添加剂能将动物难以消化吸收的蛋白质、脂肪、碳水化合物等分解为葡萄糖、氨基酸、游离脂肪酸等易吸收的成分，并降解或排除饲料中抗营养因子，降低其在肠道中产生的黏度而提高饲料效益。此外，酶型饲料添加剂能有效地防治动物结肠炎和腹泻等消化性疾病，并能与抗生素协同作用而有利于动物健康。作为全蛋白质的饲料酶能随同饲料中的营养物质一起被消化吸收，而不会残留在畜产品中，也不会造成环境污染。使用该酶型饲料添加剂可降低料肉比，降低饲养成本，提高生产效益。
通过分析化学试验检测证明：米糠中的神经酰胺(Ceramide)，其中40％以游离状态存在。另有60％以神经鞘磷脂和神经糖(主要为半乳糖)苷脂的结合态存在于谷胚和细胞膜中。(神经鞘磷脂和神经糖苷脂的结构与酶解位点如图1所示)除了米糠中的神经酰胺含量较高外，其它植物，比如魔芋、小麦，微生物如酵母细胞等同样含有较高的神经酰胺，也适用于本发明神经酰胺的制备方法。
提取试验证明，呈结合状态的神经酰胺不易被抽提浸取，严重影响神经酰胺的收率和产量。本发明神经酰胺的制备方法选用的菌种能合成并分泌大量的神经酰胺酶(Ceramidase)，能定向地作用于神经鞘磷脂的磷脂键和神经酰胺糖苷脂的糖苷键，使米糠在发酵过程中，呈结合状态的神经酰胺水解率达到94％，发酵产物中，神经酰胺的得率，提高1.91倍，经济效益提高54％。基于本发明神经酰胺制备方法的原理，选用能合成并分泌大量的神经酰胺酶是本发明神经酰胺制备方法的关键，这种菌种的选择包括与本发明菌种雅致放射毛霉Actinomucorelegans AS3.2778同属的其它菌种。
本发明神经酰胺制备方法的原料米糠来源丰富，经过生物技术生产神经酰胺，成本低，安全性好，生产的神经酰胺生理活性和应用价值高，含量高(95％以上)、纯度高(可达99.2％～101.8％)，产量高且本方法生产神经酰胺污染小，对环境有益，并且实现了废渣的充分利用。
本发明制备的酶型饲料添加剂，是由米糠经菌种发酵并分离神经酰胺后的米糠残渣，经测定含蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、植酸酶、β-葡聚糖苷酶、纤维素酶等多种生物酶，在萃取残渣中加入适量的稳定剂，可使酶活性保存90～95％，延长产品的货架期(即产品从生产出来到农户购买之间的间隔时间)和储存期，且用量小，能显著提高动物对饲料的吸收利用率，降低料肉比，降低饲养成本，提高生产效益。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1神经鞘磷脂和神经糖苷脂化学结构与酶切位点
图2本发明神经酰胺的工艺流程图
图3本发明神经酰胺的HPLC色谱图：c为神经酰胺特征峰
具体实施方式
实施例1神经酰胺的制备
本发明提供神经酰胺的制备方法，它是由米糠为原料通过生物发酵技术提取制备的方法，它包括下列步骤：
a、选择菌种：选用中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的菌号：AS3.2778的雅致放射毛霉Actinomucor elegans；菌种用量为4～12g；
b、菌种发酵：将选择的菌种进行固体发酵，固体发酵条件为：
固体培养基：米糠98.43％，酵母膏0.7％，KH2PO4 0.1％，K2HPO4 0.1％，MgSO4 0.05％，CaCl2 0.05％，ZnSO4 0.02％，菜籽油0.55％；
培养温度：15℃～35℃；
培养时间：24～84h；
培养基pH值：7.0～8.0；
培养基含水量：40％～70％；
培养基接种量：4％～12％。
其中培养基采用变温培养，培养时间72h，前24h培养温度30℃，后48h培养温度25℃，培养基pH值7.0～8.0，培养基含水量40％～70％，接种量4％～12％的培养条件下发酵。
c、将b步骤的发酵产物经CO2超临界流体萃取，得神经酰胺粗品，经大孔吸附树脂纯化，即得神经酰胺。
其中步骤c所述的CO2超临界流体萃取为CO2在超临界流体状态下萃取发酵产物，采用分级萃取，其步骤为：
①将CO2经液化、低温、高压、加热转变成超临界流态(超临界流体兼有气、液两态特点，密度接近于液体，粘度和扩散系数接近于气体，它不仅具有与液体溶剂相当的溶解能力，而且具有优良的传质性能。超临界流体萃取技术就是利用上述超临界流体的特殊性质，在高压条件下与待分离的固体或液体混合物接触，调节系统的操作压力和温度，萃取出所需要的物质，随后通过减压或升温的方法，降低超临界流体的密度，使萃取物得到分离)。
②将发酵产物置于萃取器中，通入超临界流态CO2，得萃取物和剩余产物；
③将萃取物经减压加热通入分离器A(该分离器是一整套仪器中的一个部分，设计来自大连光明化工院)，得神经酰胺粗品和剩余萃取物；其中一级分离压力为7Mpa～8Mpa，分离温度为35℃～38℃；
④、将③步骤所述的剩余萃取物再次减压加热通入分离器B，得水、精油和气态CO2，二级分离压力为4Mpa～5Mpa，分离温度为20～25℃；
其中各步骤的萃取压力为20Mpa～32Mpa；萃取温度为：32℃～45℃；萃取流量：30公斤CO2/公斤发酵料；萃取时间：2小时。
在此基础上各步骤的条件可以选择：萃取压力为30Mpa；萃取温度为：32℃～35℃；萃取流量：30公斤CO2/公斤发酵料；步骤③一级分离压力为7Mpa～7.5Mpa，分离温度为35℃～38℃；步骤④二级分离压力为4Mpa～5Mpa，分离温度为20～25℃；萃取时间：2小时。
其中步骤c中神经酰胺粗品，经大孔吸附树脂纯化条件为：大孔树脂型号：D140洗脱液为乙醇∶乙酸＝8∶1，洗脱速度6～10L/h，收集洗脱液、浓缩、结晶，即得神经酰胺。
选择上述不同条件，都可生产出纯度较高的神经酰胺。(见图2)
实施例2 产物神经酰胺的定性定量分析
1、本发明方法制备的神经酰胺经四川省疾病预防控制中心检测，检验依据：GB/T5009.11-1996和GB4789-94，卫生指标如下：
产品重金属残量：见表1
表1.本发明方法制备的产品神经酰胺重金属残量
| 项目 单位 测定结果 |
| 铅(以Pb计) mg/kg 0.22砷(以As计) mg/kg ＜0.21汞(以Hg计) mg/kg 0.026水分 ％ 0.96 |
产品微生物指标：见表2
表2.本发明方法制备的产品神经酰胺微生物指标
| 项目 单位 测定结果 |
| 菌落总数 cfu/g ＜10霉菌计数 cfu/g ＜10酵母计数 cfu/g ＜10大肠菌群 MPN/100g ＜10沙门氏菌 未检出志贺氏菌 未检出金黄色葡萄球菌 未检出溶血性链球菌 未检出 |
2、本发明方法制备的神经酰胺(ceramide)经中国科学院成都分院分析测试中心用Waters液相色谱仪检测，其中神经酰胺对照品为Sigma公司产品，通过与该对照品比较，神经酰胺含量为101.8％，纯度及HPLC波谱与美国Sigma公司标准品基本一致。(见图2)
本发明方法制备的产品神经酰胺经成都市药检所检测，检测依据：JISK0124-83液相色谱分析方法通则；主要仪器Waters液相色谱仪。结果：纯度为99.2％，与中国科学院成都分院分析测试中心检测结果基本一致。
3、本发明方法制备的产品神经酰胺与美国部分公司产品质量对照
A.美国Questamide H公司的神经酰胺产品标准：见表3
表3.Questamide H公司神经酰胺产品标准
| Appearance(外观) waxy powder(暗白色粉末) |
| Odor(气味) Characetristics(无味) |
| Color(颜色) Off white(暗白色) |
| Purity(％)(纯度) ＞98.0％ |
| Melting point(熔点) 73.0-81.00C |
| Bacteria(细菌) 300opg max.(最大300opg) |
| Fungi/Yeast(真菌) 100opg max.(最大100opg) |
| No pathogens(无病原体) |
B.美国Biopharm Solutions，Inc.公司的神经酰胺产品标准：见表4
表4.Biopharm Solutions，Inc.公司神经酰胺产品标准
| Appearance(外观) waxypowder(暗白色粉末) |
| Odor(气味) Bland，Characetristics(无味) |
| Color(颜色) Pale/offwhite(暗白色) |
| Purity(％)(纯度) ＞95.0％ |
| Moisture(湿度) ＜1.0％ |
| Melting point(熔点) 90.0-1 00.00C |
| Microbial Content(微生物含量) 500 opg max.(最大500 opg) |
| No pathogens(无病原体) |
C.本发明方法制备的产品质量标准(企业标准)：见表5
表5.本发明方法制备的产品神经酰胺质量标准
| 外观(Appearance) 微黄色粉末(light yellow powder) |
| 气味(Odor) 无味(Bland) |
| 颜色(Color) 微黄色(light yellow) |
| 纯度(Purity)(％) ＞99.0％ |
| 熔点(Melting point) 78.0-87.00C |
| 菌落总数(Bacteria Content) ＜10cfu/g |
| 病原体(Pathogens) 未检出(No) |
从以上质量指标可见，本发明方法制备的产品神经酰胺纯度略高于Questamide H公司和Biopharm Solutions，Inc.公司产品，其余指标与其相近，产品质量达到美国同类产品水平。
实施例3 本发明方法副产物酶型饲料添加剂制备
将实施例1分离所得的剩余产物98.2～99.6％加入如下稳定剂：乳酸钙、山梨醇作酶型饲料添加剂稳定剂，乳酸钙的用量范围0.2～0.8％，最佳用量0.5％；山梨醇的用量范围0.2～1.0％，最佳用量0.6％。
制备方法：取发酵前固体发酵原料的投入量98.9公斤，计算出乳酸钙和山梨醇的分别加入量，按乳酸钙0.5公斤和山梨醇0.6公斤总量计，加入10倍量沸水，将其溶解后，喷洒在提取神经酰胺后的残渣中，拌和均匀后，30℃～50℃条件下鼓风干燥，粉碎、包装、检测，即为成品。
以下通过具体功效学试验说明本发明制备方法制备的副产物酶型饲料添加剂作为饲料添加剂的有益效果。
实验例1断奶仔猪实验
通过添加本发明酶型饲料添加剂，弥补断奶仔猪消化的不足，促进饲料消化吸收，提高经济效益。
1、材料和方法
1.1酶型饲料添加剂本发明实施例3制备的酶型饲料添加剂。
1.2日粮组成及营养水平：试验日粮配方及营养水平见表6。
表6 日粮组成及营养水平
日粮％ 试验组 对照组
玉米 60.2 60.7
豆粕 28 28
次粉 6.3 6.3
预混料 5 5
本发明酶型饲料
添加剂 0.5 -
合计 100 100
试验组添加5‰的本发明酶型饲料添加剂，对照组不加。
1.3试验条件和方法
1.3.1试验时间：共20天。
1.3.2试验组的选择及分组
从10窝PIC断奶仔猪中选择60头，体重相近，按窝别、性别随机分成两组，每组30头，分为两圈，每圈15头。试验组平均始重8.85kg，对照组平均始重9.03kg。
1.3.3饲养管理：投喂量以投料后半小时吃完为原则，自由饮水。
1.3.4测定指标：记录两组初始重，每天记录各组饲料用量，20天后早晨空腹称重，记录末重，计算饲料用量，平均日增重，饲料转化率。
2试验结果
2.1试验期增重结果见表7。
表7试验期增重结果
指标 试验头 试验天 平均璔重
初始重(kg) 末重(kg) 比较
数 数 (kg)
试验组 30 20 265 525 0.433 111
对照组 30 20 270 270 0.390 100
2.2采食量和饲料转化见表8。
表8采食量和饲料转化表
采食量(元 增重耗(元/kg
料肉比 比较
/kg) 体重)
试验组 504 260 1.94 93.7
对照组 495 239 2.07 100
从表8可以看出，因其添加本发明酶型饲料添加剂，试验组采食量稍大，饲料转化率提高6.3％。
2.3饲料成本分析
表9饲料成本
增重一公斤(耗料元
料价(元/kg) 比较
/g体重)
试验组 1.76 3.41 947
对照组 1.74 3.60 100
从表9可以看出，每公斤增重所需的饲料成本，试验组比对照组下降了5.3％。
3、分析
仔猪消化机能不健全，消化酶分泌不足，断奶使消化酶的分泌减少，通过添加本发明酶型饲料添加剂，弥补仔猪消化酶的不足，提高消化功能，促进营养物质吸收。
4、结论
试验选用60头29-30日龄PIC断奶仔猪，分为两组，试验组添加千分之五的本发明酶型饲料添加剂，以观察本发明酶型饲料添加剂的饲养效果。试验表明：试验组日增重较对照组提高11％，饲料转化率改善6.3％，饲养成本降低5.4％。说明该本发明酶型饲料添加剂可在畜牧生产中推广运用。
实验例2本发明对生长猪的实验
1、材料和方法
1.1酶型饲料添加剂本发明实施例3制备的酶型饲料添加剂。
1.2试猪的选择和分组
供试猪为PIC生长猪(PIC是优秀的配套系猪种)，体重、月龄相近，公母各半，全部去势，随机分成试验组、对照组各20头，每组分2栏饲养。试验组平均始重25.33kg，对照组平均始重25.53kg。
1.3试验时间：共30天。
1.4饲料配方
表10饲料配方
| 本发明酶玉米 次粉 麦麸 豆粕 预混料 型饲料添加剂 |
| 试验组 43.5 20 18 18 4 0.5对照组 44.0 20 18 18 4 / |
饲料配方见表10，试验组添加5‰本发明酶型饲料添加剂，对照组以玉米代替。次数、麦麸总用量为38％。
1.5饲养管理：试验前进行常规驱虫、免疫。供试猪分别在同一栋猪舍相对四圈内，由同一饲养员管理，粉料湿饲，每日二次，每次以半小时内吃完为原则，自由饮水。
1.6测定指标
在试验期内观察猪的采食及健康状况，记录每天每组饲料用量。二十天后早晨空腹称猪重，计算饲料总量，平均日增重，饲料转化率和饲料成本。
2试验结果
2.1试验猪增重情况
表11试验猪增重结果
| 试验头数 试验天数 平均始重 平均末重 平均日增重(g) 比较 |
| 试验组20 30 25.33 47.92 753 107对照组20 30 25.53 46.65 704 100 |
供试猪增重结果见表11，由表可以看出，试验组平均日增重较对照组提高7％。
2.2饲料采食量和转化率
供试猪饲料采食量和转化率见表12。试验组采食量稍大，但饲料转化率提高4.9％，料肉比下降。
表12饲料采食量和转化率
| 总耗料(kg) 日采食量 日增重 料肉比 比较 |
| 试验组 1026 1.63 753 2.17 95.1对照组 960 1.60 704 2.28 100 |
2.3饲料成本分析
饲料成本分析见表13。
表13饲料成本分析
| 饲料成本(元/kg) 饲料成本(元/kg) 比较 |
| 试验组 1.64 3.56 96.5对照组 1.62 3.69 100 |
从表四可以看出，试验组每增重一公斤活重，降低饲料成本0.13元，饲料成本下降3.5％。
2.4试验组皮毛光亮，食欲旺盛，采食速度快。
麦麸、次粉的主要抗营养物质是非淀粉多糖，在小肠内增加内容物粘性，延长食糜在小肠内停留时间，减少消化酶同底物的接触。饲料中添加本发明酶型饲料添加剂，如木聚糖酶，β-葡聚糖酶在肠道中分解非淀粉多糖，降低其粘性，消除其抗营养作用。同时添加本发明酶型饲料添加剂，帮助消化，提高饲料利用率。其次，添加酶制剂，营养成分吸收更完全，减少了消化道内有害微生物的过度繁殖，减少畜的免疫应答反应，从而提高生产性能。
结论：本试验表明，麦麸、次粉是小麦的副产物之一，因其蛋白含量较高，广泛用于饲养业，但其非淀粉多糖，有抗营养作用。添加本发明酶型饲料添加剂，生长猪日增重提高7％，饲料利用率改善4.9％，降低饲料成本3.5％，经济效益明显，能提高利用率添加本发明酶型饲料添加剂。
实验例3奶牛实验
1.材料与方法
1.1试牛
选择本场的健康泌乳母牛，按照年龄、胎次、泌乳月份、泌乳量基本一致的原则，选出20头，随机均分成试验组和对照组。
1.2材料
1.2.1日粮
混合精料成份(％)：玉米面46，麦麸19，豆饼28.5，磷酸三钙2，盐1，贝壳粉1，糠粕转化高活性酶2.5。粗饲料为当地收购的饲草秸杆，自由采食。其它成份按常规饲喂。
1.2.2试样
本发明实施例3制备的酶型饲料添加剂，只在试验组日粮中，按精料喂给量的2.3％加入，对照组不加，按常规饲喂。
1.3方法
采取对比试验法。两组先分别预试30天，再正试30天。两组均采用手工挤奶，每日挤奶3次。挤出鲜奶，分期、分组、分头按日称重记录数据，最后统计分析。
日粮喂给量，两组均按日投入量称重记录数据，最后分别统计分析。
1.4时间：30天。
2.结果
2.1参试奶牛产乳量及产值对比
表14参试奶牛产乳量及产值对比
| 预试期产奶量平均日增产/头 | 正试期产奶量平均日增产/头 | 正试期比预试期增产平均日增产/头 | 平均料奶化(日·头) | 提高产奶率(％) | ||||
| 奶量(kg) | 产值(元) | 奶量(kg) | 产值(元) | 奶量(kg) | 产值(元) | |||
| 试验组 | 24.6 | 39.36 | 27.8 | 44.48 | 3.2 | 5.12 | 0.306∶1 | 13.0 |
| 对照组 | 24.3 | 38.88 | 24.25 | 38.80 | 0.05 | 0.08 | 0.351∶1 | 0.21 |
| 差额 | +0.3 | +0.48 | +3.55 | +5.68 | +3.15 | +5.04 | -0.045∶1 | 12.79 |
注：表中，每公斤鲜牛奶单价按1.6元计算。
从表14可知，在奶牛日粮中添加23％的糠粕转化酶型饲料添加剂(平均每头奶牛日粮采食量8.5kg，约采食高活性酶添加剂100克)，试验组奶牛比对照组平均日增产牛奶3.15kg/头，产奶率提高12.79％，日平均产值增加5.04元/头。料奶比下降12.8％。除去高活性酶添加剂成本(每头奶牛日添加100克，增加日粮成本0.8元，每公斤售价8元)，每头奶牛日增利润4.24元。
2.2饲喂本发明酶型饲料添加剂对奶牛乳脂与乳蛋白质的影响
表15饲喂添加剂对牛奶乳脂和乳蛋白质的影响
| 试验分 奶牛 平均乳脂率(％) 乳蛋白质(％) |
| 组 头数 试验前 试验期间 试验前 试验期间 |
| 对照组 10 3.79±0.37 3.18±0.45 3.34±0.35 3.35±0.32试验组 10 3.81±0.41 3.97±0.46 3.87±0.43 3.93±0.45 |
从表15可见，在日粮中添加糠粕转化高活性酶试验期间，平均乳脂率试验组比对照组提高4.2％。乳蛋白质试验期间试验组比对照组平均提高17.3％。
2.3在日粮中添加本发明酶型饲料添加剂对牛奶乳糖与乳干物质含量的影响：
表16饲喂添加剂对牛奶乳糖与乳干物质的影响
| 试验分 奶牛 平均乳糖(％) 平均乳干物质(％)组 头数 试验前 试验期间 试验前 试验期间 |
| 对照组 10 4.81±0.24 4.84±0.22 12.80±0.61 12.85±0.73试验组 10 4.29±0.21 4.94±0.19 13.10±0.49 13.07±0.71 |
从表16可见，在奶牛日粮中加入本发明酶型饲料添加剂后，试验期间试验组牛奶中平均乳糖量比对照组增加2.1％，平均乳干物质含量增加1.7％。
在奶牛日粮中添加糠粕转化酶型饲料添加剂，不仅可增加牛奶产量，也使牛奶中乳脂、乳蛋白质、乳糖、乳干物质等营养素含量有所提高。
经检验，本发明酶型饲料添加剂不含抗生素和动物激素。产品重金属残量及微生物指标经检测均符合饲料添加剂标准，急性毒性实验结果：小鼠染毒后未见各剂量组动物出现中毒症状及死亡。观察1周后称体重处死，大体解剖亦未见异常病理改变。结论：糠粕转化酶型饲料添加剂对雌雄小鼠LD50值均大于10.0g/kg，参照化学物质毒性分级标准评价属实际无毒级。
通过上述的动物功效学试验说明，通过添加本发明酶型饲料添加剂，对仔猪消化机能不健全，消化酶分泌不足，断奶使消化酶的分泌减少，弥补仔猪消化酶的不足，提高消化功能，促进营养物质吸收。能使生长猪日增重明显提高，且用量小，能提高饲料利用率，降低饲料成本，增加奶牛牛奶产量，使牛奶中乳脂、乳蛋白质、乳糖、乳干物质等营养素含量提高，以上实验充分说明本发明酶型饲料添加剂优质安全，适应工业大生产使用，为畜牧业提供一种新的饲料添加剂选择。
Claims (9)
1、一种雅致放射毛霉Actinomucor elegans用于生产神经酰胺的用途。
2、神经酰胺的制备方法，其特征在于：它是以含有神经酰胺的植物性原料通过生物发酵技术提取制备的方法，它包括下列步骤：
a、选择菌种：选用中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏的菌号为AS3.2778的雅致放射毛霉Actinomucor elegans作为发酵菌种；
b、菌种发酵：用a步骤选择的菌种对含有神经酰胺的植物性原料进行固体发酵，得到含神经酰胺的发酵产物；
c、将b步骤的发酵产物经分离、纯化得神经酰胺和剩余产物。
3、根据权利要求2所述的神经酰胺的制备方法，其特征在于：步骤b所述的含有神经酰胺的植物性原料是米糠。
4、根据权利要求3所述的神经酰胺的制备方法，其特征在于：所述固体发酵的培养基中含有米糠重量比97.6～99.08％。
5、根据权利要求4所述的神经酰胺的制备方法，其特征在于：步骤c所述的分离、纯化方法为：CO2超临界流体萃取分离，得神经酰胺粗品，再将神经酰胺粗品经大孔吸附树脂纯化。
6、根据权利要求2所述的神经酰胺的制备方法，其特征在于：所述的CO2超临界流体萃取为CO2在超临界流体状态下萃取发酵产物，采用分级萃取，其步骤为：
①、将CO2经液化、低温、高压、加热转变成超临界流态；
②、将发酵产物置于萃取器中，通入超临界流态CO2，得萃取物和萃取分离所得的剩余产物；
③、将萃取物经减压加热通入分离器，得神经酰胺粗品。
7、根据权利要求6所述的神经酰胺的制备方法，其特征在于：步骤c所述的CO2超临界流体萃取中步骤②萃取压力为20Mpa～32Mpa；萃取温度为：32℃～45℃；萃取流量：30公斤CO2/公斤发酵料；步骤③中分离压力为7Mpa～8Mpa，分离温度为35℃～38℃。
8、根据权利要求5所述的神经酰胺的制备方法，其特征在于：所述的大孔吸附树脂纯化条件为：大孔树脂型号：D140、D141、D180、LD605中的一种，洗脱液为乙醇∶乙酸＝7∶1～9∶1，洗脱速度6～10L/h，收集洗脱液、浓缩、结晶，即得神经酰胺。
9、根据权利要求8所述的神经酰胺的制备方法，其特征在于：大孔树脂为D140，洗脱液为乙醇∶乙酸＝8∶1，洗脱速度8L/h。
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