CN1840179A - 牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃炎，胃溃疡，修复胃粘膜，减少胃酸分泌病药中的应用。牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染的胃炎和胃溃疡病药中的应用。其用药组成为：牛乳铁蛋白100－250mg、雷贝拉唑10－20mg、克拉霉素300－500、替硝唑300－500mg。其用药组成为：牛乳铁蛋白100－250mg、奥美拉唑100－200mg、阿莫西林0.2－0.5g、甲硝唑0.2－0.4g。作为治疗急性胃炎，慢性胃炎，消化性溃疡，胃粘膜脱落和胃酸度过高的药物，辅助用药及保健食品而无任何副作用。

Description

牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药中的应用

技术领域

本发明涉及牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃炎，胃溃疡，修复胃粘膜，减少胃酸分泌病药中的应用。

背景技术

急性胃炎，慢性胃炎，消化道溃疡及胃粘膜脱垂都涉及到粘膜受损的情况。急性胃炎包括急性腐蚀性胃炎，急性单纯性胃炎，急性感染性胃炎，急性化脓性胃炎及急性出血糜烂性胃炎。大都是由细菌，病毒，幽门螺旋杆菌感染，精神因素，物理因素，化学因素，食物刺激及药物刺激所引起.其病理表现都涉及到胃粘膜损伤。

消化性溃疡包括胃溃疡，十二指肠溃疡。可能是神经紧张，饮食不调，长期进食刺激性食物，药物刺激等引起的胃粘膜损伤，胃酸分泌增多及胃蛋白酶分泌失常。也有人认为因为幽门螺旋杆菌感染有关。治疗药物中要加保护胃粘膜药物。

慢性胃炎包括胃体胃炎，胃窦胃炎及慢性糜烂性胃炎，其起因可能胃酸分泌过多、幽门螺旋杆菌感染、免疫因素、烟、酒等食物刺激及胆汁反流有关。目前治疗尚无特效疗法。

胃粘膜脱垂可能是胃粘膜的慢性炎症以及精神因素，食物刺激等引起。

上面的几种消化道的疾病在目前的治疗过程都需抗幽门螺旋杆菌感染，保护胃粘膜以使其能够收复，减少胃酸分泌使胃液分泌恢复正常。对幽门螺旋杆菌感染者，可用枸橼酸铋钾，红霉素，庆大霉素，阿莫西林(羟氨苄青霉素)及甲硝唑联合治疗。另一种治疗方案是铋剂或质子泵抑制剂联合抗生素的三联或四联疗法，但由于药物的副作用和会导致幽门螺旋杆菌株变异成为有耐药性菌株从而使治疗失败。

在治疗中，对胄粘膜的保护剂主要是硫酸铝。但其并没有对胃粘膜有修复作用，只是保护粘膜不受刺激，让其自然恢复，没有主动修复胃粘膜的功能。

在治疗中，对胃酸过多的患者则是给予服用胃舒平，雷尼替丁，甲氰咪胍及氢氧化铝凝胶，这些药物特别是胃舒平及氢氧化铝主要是起到中和胃酸作用。

从上面的这些众多的治疗药物来看，没有一个是具有又能抑制幽门螺旋杆菌感染及抑制耐药幽门螺旋杆菌感染，又能修复胃粘膜，又能减少胃酸分泌的都只是具有一个治疗功能，不是多功能的药物。同时这些药物都是有副作用的化学药物，特别铋制剂是重金属药物。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供的是一种从牛奶中分离出有抑制耐药菌株，能修复胃粘膜及抑制胃酸过多的生物蛋白-—牛乳铁蛋白的新应用。

牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染的胃炎药中的应用。牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染的胃溃疡病药中的应用。

一种牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药中的应用，其用药组成为：牛乳铁蛋白100-250mg、雷贝拉唑10-20mg、克拉霉素300-500、替硝唑300-500mg。

一种牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药中的应用，其用药组成为：牛乳铁蛋白100-250mg、奥美拉唑100-200mg、阿莫西林0.2-0.5g、甲硝唑0.2-0.4g。

牛乳铁蛋白是牛奶中的一种含铁的糖蛋白，除了在奶中存在外，在唾液，血清，粘膜及生殖器的分泌物中均有存在。国外及国内至今均没有发现及报导牛乳铁蛋白能够对胃粘膜有修复作用，抑制胃酸过多及对耐药的HP菌株有抑制作用。还应该指出，耐药的HP菌株应与非耐药的HP菌株视为不同的菌株，尽管在形态是一样，但生理生化都已经不一样。

本发明介绍的是牛乳铁蛋白(bovine lactofeering，简称牛LF)有能够修复因感染，化学因素，物理因素所造成的胃粘膜损伤的作用，有抑制幽门螺旋杆菌(HP)和临床耐药幽门螺旋杆菌的作用，有抑制胃酸度过高的作用，因此可以作为治疗急性胃炎，慢性胃炎，消化性溃疡，胄粘膜脱落和胃酸度过高的药物，辅助用药及保健食品而无任何副作用。

经实验证实牛乳铁蛋白对幽门螺旋杆菌和其临床耐药菌株有抑制作用，有修复胃粘膜及抑制胃酸度过高的功效，对约占全球人口50％的胃幽门螺旋杆菌者感染来说具有特殊意义。

另外，实验还证实牛乳清蛋白粉对幽门螺旋杆菌也有抑制作用，其MIC浓度的是40-80mg/ml。国内外也均没有实验报导牛乳清蛋白对幽门螺旋杆菌有作用。

从我们的整体动物(大鼠，蒙古沙鼠，C57小鼠)实验中，发现牛乳铁蛋白的新功能及新应用。实验不仅证实国外的报导对函门螺旋杆菌有抑制作用，更重要的是5个新的发现，详细实验过程及总结如下：

(1)发现牛乳铁蛋白能够抑制耐药幽门螺旋杆菌株(MIC在0.625-20mg/ml)，牛乳铁蛋白对临床耐药菌株的MIC范围在0.625mg/ml至5mg/ml之间，从而解决治疗由耐药幽门螺旋杆菌株感染而引起的急，慢性胃炎。

(2)发现将牛乳铁蛋白与三联剂合用，能够将治愈率提高到90％以上，三联剂的治愈率最高只有75％，单用丽珠得乐铋剂只有60％。

(3)发现牛乳铁蛋白能修复因感染，乙酸等化学因素所导致的胃粘膜损伤。对胃粘膜损害作用抑制率达44.7％。

(4)发现牛乳铁蛋白能够抑制胃酸分泌过多。

(5)发现牛乳清蛋白粉也对正常及耐药性的幽门螺旋杆菌有抑制作用，其MIC浓度是40-80mg/ml。

附图说明

图1为牛乳铁蛋白、铋剂对HP的杀菌曲线。

具体实施方式

本发明牛乳铁蛋白在治疗急性胃炎，慢性胃炎，消化性溃疡，胃酸度过高和修复胃粘膜药物中的应用；将牛奶，牛初乳，牛乳清蛋白中分离提取出来的或采用基因重组菌经发酵生产的牛乳铁蛋白，以单独或者与其它药物，保健食品，食品一起将其输送到胃中。

牛乳铁蛋白作为药物使用时可以采用任何剂型或形式将其输送到胃中使其发挥作用。

牛乳铁蛋白是指治疗因感染幽门螺旋杆菌和其临床耐药菌株等急性胃炎，慢性胃炎，消化性溃疡，及胃酸度过高症，修复因感染，化学因素，物理因素所造成的胃粘膜损伤，胃粘膜脱落与溃疡面等。

含少量牛乳铁蛋白的牛乳清蛋白粉对幽门螺旋杆菌和其临床耐药菌株也有抑制作用，也可以以任何剂型单独或与其它药物，保健食品，功能性食品一起使用。

一种牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药中的应用，其用药组成为：牛乳铁蛋白100-250mg、雷贝拉唑10-20mg、克拉霉素300-500、替硝唑300-500mg。

另一种牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药中的应用，其用药组成为：牛乳铁蛋白100-250mg、奥美拉唑100-200mg、阿莫西林0.2-0.5g、甲硝唑0.2-0.4g。

按照《新药<西药>临床前研究指导原则汇编(药学药理学毒理学)》中“新药(西药)药理毒理学研究指导原则”，分别进行了

1、“牛乳铁蛋白对耐药幽门螺旋杆菌(HP)的体外抗菌试验”；

2、“牛乳铁蛋白对耐药幽门螺旋杆菌感染动物的治疗实验”；

3、“牛乳铁蛋白对感染耐药幽门螺旋杆菌小鼠的治疗研究”；

4、“牛乳铁蛋白对水浸应激性胃溃疡动物模型的影响”；

5、“牛乳铁蛋白对乙酸灼烧致大鼠胃溃疡的影响”；

6、“牛乳铁蛋白对幽门结扎致大鼠急性胃粘膜损伤的影响”；

7、“牛乳铁蛋白对乙醇致大鼠胃黏膜损伤的影响”；

8、“牛乳铁蛋白对大鼠胃液分泌的影响”等试验，研究牛乳铁蛋白抗溃疡的作用。

实验结果表明，牛乳铁蛋白对30株其中包括6株耐药HP菌的MIC范围在0.625mg/ml至20mg/ml之间，MIC₅₀为2.5mg/ml，证明牛LF对HP确实具有较明显的抑菌作用；对HP有一定的抑制作用，同时对由HP引起的胃粘膜损伤有修复作用；对C₅₇BL/6小鼠感染的HP有一定的抑制作用；能降低大鼠胃粘膜损伤度，对水浸应激致大鼠急性胃粘膜损伤有一定的保护作用；能降低大鼠的溃疡指数，对乙酸灼烧致大鼠胃粘膜损伤、幽门结扎致大鼠急性胃粘膜损伤、乙醇致大鼠急性胃粘膜损伤有一定的保护作用；能抑制大鼠胃液分泌，减少胃液酸度。

一、牛乳铁蛋白对耐药幽门螺旋杆菌(HP)的体外抗菌试验

(一)试验目的

本实验旨在对牛乳铁蛋白进行体外抗耐药幽门螺旋杆菌活性评价，并与丽珠集团丽珠制药厂生产的丽珠得乐(铋剂)进行比较，以正确评价和开发利用牛乳铁蛋白的抗菌功效。

(二)受试药品

1、试验品：牛乳铁蛋白(LF)，总蛋白含量97％，LF纯度95％，批号：20010102由杭州英维康生物工程有限公司提供。

2、对照品：铋剂(丽珠得乐)，批号：0101002，由丽珠集团丽珠制药厂生产，每克药含铋剂110mg。

3、对照品：牛乳蛋白(阿耳法蛋白，贝塔蛋白，牛血清蛋白，免疫球蛋白及小于0.1％牛LF蛋白的混和物)，总蛋白含量90％，由浙江省中医药研究院提供。

(三)细菌：所试细菌为30株幽门螺旋杆菌临床分离株，均为近年来(1997-2001)由浙二医院胃镜室从患者新鲜胃黏膜检材中分离获得，并经尿素酶试验，革兰染色镜检等方法鉴定证实。6株幽门螺旋杆菌为临床耐药株，由北大第一医院消化内科提供。

(四)培养基：采用浙江大学医学院微生物学教研室研制的HP专用培养基和布氏肉汤。

(五)药物配制

1、牛乳铁蛋白和牛乳蛋白的配制

将牛乳铁蛋白和牛乳蛋白直接用无菌HP专用培养基配制成一系列不同浓度的含药平皿。

2、铋剂

先用蒸馏水将铋剂溶解，再用灭菌的培养基作一系列倍比稀释使制成含不同浓度的药物平皿。

(六)试验方法

1、最小抑菌浓度(MIC)：

LF和牛乳蛋白的HP培养基平板(浓度为32μg/mg～0.125μg/mg)。将30株幽门螺旋杆菌(其中包括6株临床耐药性HP菌株)培养物分成A、B两批(每批15株)，各用布氏肉汤配制成浓度为1×10⁶/ml的菌液。以内径为2mm的接种环挑取1环菌液划线接种到不同浓度药物平板的表面，同时接种不含药物的平板上作为对照，划线长度为1cm左右。于37℃微需氧环境中培养48h后观察细菌生长情况。以无细菌生长平皿中所含药物最小的浓度作为最小抑菌浓度(MIC)。

结果见表1-1，表1-2。

                表1-1  牛乳铁蛋白、铋剂及牛乳蛋白对HP菌株的MIC

菌种名(菌株数)	药物	MIC
					MIC范围	MIC50	MIC90
		幽门螺旋杆菌(30)	牛乳铁蛋白铋剂牛乳蛋白	0.625～20mg/ml1～16μg/ml40～80mg/ml				2.5mg/ml2μg/ml80mg/ml	10mg/ml8μg/ml80mg/ml

      表1-2  牛乳铁蛋白对临床耐药HP菌株的MIC

菌种名(菌株数)	药物	MIC范围
			幽门螺旋杆菌(30)	牛乳铁蛋白	0.625～5mg/ml

2、杀菌曲线

(1)将0.1ml浓度为10⁶/ml的HP菌液，分别加入不同牛乳铁蛋白浓度(2.5mg/ml，5mg/ml，10mg/ml)的溶液中，混匀，于37℃的摇床中培养，分别于0.5h、1h、1.5h和2h时吸取0.1ml样品涂布于HP专用培养基平板表面，37℃微氧环境中孵育48h后计数活菌数，并绘制出时间—杀菌曲线。

(2)将0.1ml浓度为10⁶/ml的HP菌液加入0.9ml含4μg的铋剂溶液中，按上法同样绘制出铋剂的时间-杀菌曲线作为已知药物的对照试验。

时间(h)	牛乳铁蛋白	乳蛋白	铋剂
				00.511.52	53330	54333	53320

(3)同时设置不含药物的空白对照管。

    表2  不同药物在各时间计数活菌数的对数值

时间(h)	牛乳铁蛋白	乳蛋白	铋剂
				00.511.52	53330	54333	53320

3、培养条件对MIC的影响

(1)pH值对MIC的影响

将各浓度的含药培养基的HP分别调整至5、7、9三种状态，测定该药物平板对2株HP试验菌株的MIC变化，结果见表3

                表3  不同PH值对MIC的影响

PH值	牛乳铁蛋白MIC(mg/ml)		铋剂MIC(μg/ml)
					菌株1	菌株2	菌株1	菌株2
	579	2.52.55	2.52.55	111					111

(2)细菌接种量对MIC的影响

在其他条件不变的前提下，改变细菌接种量(10³、10⁶、10⁹/ml)比较不同菌量对MIC的影响，结果见表4。

                表4  细菌接种量对MIC的影响

接种菌量	牛乳铁蛋白MIC(mg/ml)	铋剂MIC(μg/ml)
			103/ml106/ml109/ml	0.6252.55	122

(七)讨论

实验结果表明，牛乳铁蛋白对30株HP菌的MIC范围在0.625mg/ml至20mg/ml之间，MIC₅₀为2.5mg/ml，证明牛LF对HP确实具有较明显的抑菌作用。同时，牛乳铁蛋白对临床耐药菌株的MIC范围在0.625mg/ml至5mg/ml之间，说明牛LF对耐药HP也有较明显的抑菌作用。

乳清蛋白粉也对正常及耐药性的幽门螺旋杆菌有抑制作用，其的MIC浓度是40-80mg/ml。

二、牛乳铁蛋白对幽门螺旋杆菌感染动物的治疗实验

(一)材料与方法：

1、实验动物：Wistar大鼠，体重160±10g，月龄2～3与雌雄兼用，健康无腹泻，分笼普通饲料喂养。

2、实验药物：

(1)牛乳铁蛋白，由杭州英维康生物工程有限公司提供。批号：20010102；

(2)食醋，恒顺牌镇江陈醋，瓶装500ml，PH：4～5

(3)丽珠得乐(铋剂)批号：0101002，由丽珠集团丽珠制药厂生产，每克药含铋剂110mg。

(4)安必仙，批号：0101088，香港联邦制药厂生产。

3、实验方法：

(1)脾虚大鼠幽门螺旋杆菌感染模型的复制

参考彭氏法加以改良，造模大鼠每天空腹灌胃食醋2ml/100g，形成嗜酸偏食，共10天，单日禁食，双日不限食，自由饮水，形成饥饱失常，以致饮食不节。第11天采用空腹束缚水浴(温室29±15℃，水温23±0.5℃)6小时形成倦冷刺激，使大鼠在上述因素共同作用下产生脾虚证侯。第12天起空腹灌胃1×10⁹cfu/ml的HP混悬液，剂量1.5ml/隔日一次，共三次，并继续隔日禁食饲。

(2)实验分组

大鼠随机分为10组：

①不用药脾虚感染组，每日冷开水4ml灌胃。

②阳性用药对照I组用丽朱得乐治疗10天，阳性II组用安必仙治疗3天。

③Lf治疗分A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组共七组。

(3)方法

第17天予以治疗用药，脾虚感染组喂蒸馏水。阳性对照I组喂丽珠得乐0.35g/kg，阳性II组用安必仙0.53g/kg，牛乳铁蛋白大剂量A组2.8g/kg鼠，中剂量B组0.55g/kg鼠，小剂量C组0.09g/kg，连续用药10天。D组0.55g/kg鼠，用药3天，E组0.55g/kg鼠，用药5天，F组0.55g/kg，用药7天，G组0.55g/kg，用药10天，阳性对照II组治疗3天后处死，取胃粘膜组织作检查。

(4)检测指标：

1、HP培养：大鼠胃粘膜活检标本45份，分别取自大鼠胃窦部，将大鼠胃粘膜组织放入20％GS运用液中，4℃3h内送至实验室，将灭菌组织粘膜研成匀浆，涂布于ECY培养基，在微需氧环境中37℃培养3-6天，3日后逐日观察菌落。其可疑菌落作涂片染色、镜检，并作快速尿素酶试验，如具有典型的菌、菌体形态和染色特征，快速尿素酶试验阳性者鉴定为HP。

2、快速尿素酶试验。

3、常规HE染色观察组织形态学变化。

4、W-S银染观察HP感染程度，HP检查按Marshall标准分级。

5、电镜观察胃粘膜修复及HP感染情况。

(二)结果：

1、各检测方法对幽门螺旋杆菌的检出情况，见表5

                        表5  各组HP检出情况

组别	动物数	细菌学检(查阳性率)	尿素酶阳性率	W-S银染
					造模组阳性I组阳性II组A组(0.71)B组(0.11)C组(0.014)D组(3T)E组(5T)F组(7T)G组(10T)	252410710710101010	84％58％50％71％30％100％70％60％40％30％	96％67％50％43％40％57％80％50％30％30％	92％76％40％71％50％100％80％70％50％40％

2、常规HE染色观察组织形态学变化。

主要观察胃粘膜炎症反应。炎症细胞以淋巴细胞及嗜酸性细胞为主，多分布于胃粘膜的底部及胃粘膜下层结缔组织中，以炎症细胞的数量为标准，将炎症分为四级，“0”，为基本无炎症细胞出现，“1”可见少量炎症细胞，“2”为中等炎症细胞，“3”可见大量炎症细胞。结果见表6

        表6  HE染色观察炎症情况表

组别	动物数	HE炎症情况
			造模组阳性I组A组(0.71)B组(0.11)C组(0.014)	10107107	1.9±0.90.3±0.9**0.8±1.1*1.0±0.91.6±1.3

3、鼠胃粘膜电镜观察：

高剂量组(0.71g/ml)电镜下可见粘膜上皮结构完整，微绒毛可见，内质网清晰、丰富，分泌颗粒丰富。

中剂量组(0.11g/ml)电镜下可见粘膜上皮结构基本完整，微绒毛可见，分泌颗粒较多。

低剂量组(0.01g/ml)电镜下可见大部分粘膜上皮结构完整，微绒毛可见，分泌颗粒较少。

阳性对照组电镜下可见表层粘膜上皮细胞结构完整，微绒毛可见，充满分泌颗粒。

模型组电镜下可见大部分表层粘膜上皮细胞坏死，不完整，微绒毛较少，分泌颗粒少。

(三)、结论

牛乳铁蛋白对HP有一定的抑制作用，同时对由HP引起的胃粘膜损伤有修复作用。

三、牛乳铁蛋白对感染幽门螺旋杆菌小鼠的治疗研究

(一)材料与方法：

1、实验动物：C₅₇BL/6小鼠，体重17±20g，7周龄，均为雌性，健康无腹泻，分笼普通饲料喂养。

2、实验药物：

(1)牛乳铁蛋白，由杭州英维康生物工程有限公司提供。批号：20010102

(2)丽珠得乐(铋剂)批号：0101002，由丽珠集团丽珠制药厂生产，每克药含铋剂110mg

(3)菌株：HP菌株由浙大医学院提供

3、实验方法：

所有动物灌胃前禁食12小时，将用布氏肉汤洗脱的HP菌灌喂小鼠，0.4ml/只(约10⁹/ml)，连续5次，1周完成；从最后一次灌胃HP液计算4周以后喂牛乳铁蛋白，小鼠分大剂量组(0.1875g/kg体重)，中剂量组(0.0938g/kg体重)、低剂量(0.0469g/kg体重)，丽珠得乐对照组(0.148g/kg体重)，模型组，每组10只。共给药10天。末次给药后一天，处死小鼠，取胃粘膜组织，HE染色和W-S银染观察HP感染程度，同时进行尿素酶试验及HP培养(取小鼠胃黏膜标本，置于标本保存液中-70℃保存。取标本于研磨器中，滴加约0.2ml的标本研磨液进行研磨，将研磨液涂布在ECY选择性培养基上，5％ O₂，15％ CO₂，80％ N₂微需氧培养5天，观察菌落形态，典型的HP菌落形态为针尖样大小，无色透明，表面光滑，湿润，有光泽，挑取部分细菌进行快速尿素酶实验和革兰氏染色镜检，典型HP应为快速尿素酶实验强阳性，镜检为革兰氏阴性，形态呈飞鸟状或螺旋杆状)

(二)结果：

1、各检测方法对幽门螺旋杆菌的检出情况，见表7

                    表7  各检测方法对幽门螺旋杆菌的检出情况

组别	动物数	细菌学检(查阳性率)	尿素酶阳性率	W-S银染HP阳性率
					模型组高剂量组中剂量组低剂量组丽珠得乐组	1010101010	90％40％50％60％60％	100％50％50％60％60％	100％50％60％70％30％

(三)结论

牛乳铁蛋白对C57BL/6小鼠感染的HP有一定的抑制作用。其中的细菌学检(查阳性率)和尿素酶阳性率结果与丽珠得乐的结果还低10个百分点。

四、牛乳铁蛋白对水浸应激性胃溃疡动物模型的影响

(一)试验目的：

研究牛乳铁蛋白对水浸大鼠应激性胃溃疡的影响。

(二)药物和实验方法

1、牛乳铁蛋白：由杭州英维康生物工程有限公司提供，批号：20010102

2、丽珠得乐(铋剂)批号：0101002，由丽珠集团丽珠制药厂生产，每克药含铋剂110mg。

3、动物

SD大鼠，体重(200～250g)，雌雄各半，由浙江省中医药研究院动物房提供，合格证号：医动字第220810017号。

4、试验方法：

取SD大鼠50只，体重(200～250g)，雌雄各半，随机分为5组，10只/组，设立空白对照，三个剂量的牛乳铁蛋白组(1.4g/kg，0.7g/kg，0.28g/kg)和丽珠得乐阳性对照组(0.8g/kg)，喂药十天后，禁食24h，自由饮水，然后将动物装入特制笼内，垂直浸入23±0.5℃水中。浸入深度平动物剑突水平，24h后取出，颈椎脱位处死。打开腹腔，结扎胃贲门和幽门并经胃壁向胃腔内注入1％的甲醛溶液8ml，将胃取出浸入甲醛溶液中，30分钟后沿胃大弯剖开，计数腺胃部出现的溃疡点数及溃疡指数。解剖显微镜下测量胃粘膜损伤长度(mm)，以其总和作为溃疡指数，在组间进行比较。

5、统计方法

实验数据表示为平均值±标准差( X±s)，组间差异的显著性用t-检验进行。

(三)、试验结果

结果表明，牛乳铁蛋白0.7g/kg、2.8g/kg能明显降低大鼠的溃疡指数。与空白组比较，有显著差异(P＜0.05或P＜0.01)。

结果见表8

        表8  牛乳铁蛋白对水浴应激致大鼠急性胃粘膜损伤的影响

                            ( X±s，N＝10)

组别	剂量(g/kg)	动物数(n)	溃疡指数	抑制率(％)
					空白对照组牛乳铁蛋白牛乳铁蛋白牛乳铁蛋白丽珠得乐	(1.4g/kg)(0.7g/kg)(0.28g/kg)(0.8g/kg)	1010101010	26.94±19.905.73±6.46**10.81±9.74*19.25±14.0811.12±5.92*	78.7359.8728.5458.72

**P＜0.01，*P＜0.05，与空白对照组比较

(四)、结论

本试验采用水浸应激致大鼠急性胃粘膜损伤，以胃粘膜损伤长度为指标，研究牛乳铁蛋白对水浸应激致大鼠胃粘膜损伤的影响。结果表明，牛乳铁蛋白能降低大鼠的溃疡指数(降低78％，比丽珠得乐高48％，)，抑制率在28-78％之间，比丽珠得乐的抑制率多高出20个百分点。牛乳铁蛋白能降低大鼠胃粘膜损伤长度，对水浸应激致大鼠急性胃粘膜损伤有一定的保护作用。

五、牛乳铁蛋白对乙酸灼烧致大鼠胃溃疡的影响。

(一)试验目的

研究牛乳铁蛋白对乙酸灼烧致大鼠胃溃疡的影响。

(二)药物

1、牛乳铁蛋白，批号：20010102，由杭州英维康生物工程有限公司提供。

2、丽珠得乐(铋剂)批号：0101002，由丽珠集团丽珠制药厂生产，每克药含铋剂110mg。

3、胃动素(MTL)试剂盒：由苏州大学医学院血栓研究室提供。

4、前列腺素(PEG₂)试剂盒：由北京福瑞公司提供。

(三)动物：

SD大鼠，体重(200～250g)，雌雄各半，由浙江省中医药研究院动物房提供，合格证号：医动字第220810017号。

(四)试验方法

取SD大鼠50只，体重(200～250g)，雌雄各半，试验前禁食24h，自由饮水，在乙醚麻醉下打开腹腔，将内径5mm长30mm的玻璃管垂直放置于胃体部浆膜面上，向管腔内加入冰乙酸0.2ml，1.5分钟后用棉签蘸出冰乙酸，缝合手术切口。术后正常饮食，第二天随机分为5组，10只/组，设立空白对照，三个剂量的牛乳铁蛋白组(1.4g/kg，0.7g/kg，0.28g/kg)和丽珠得乐阳性对照组(0.8g/kg)，连续喂药十天。解剖取出胃，并用甲醛固定，测量溃疡面积(mm²)，各组间进行比较。同时取血，分离血清，测胃动素(MTL)及前列腺素(PGE2)。

(五)、统计方法

实验数据表示为平均值±标准差( X±s)，组间差异的显著性用t-检验进行。

(六)、试验结果

结果见表9

                      表9  牛乳铁蛋白对乙酸灼烧型溃疡的影响

组别	剂量(g/kg)	动物数(n)	溃疡面积	抑制率(％)
					空白模型对照组牛乳铁蛋白牛乳铁蛋白牛乳铁蛋白丽珠得乐	(1.4g/kg)(0.7g/kg)(0.28g/kg)(0.8g/kg)	1010101010	41.20±10.0213.93±9.79**26.57±8.19**35.81±9.6529.40±8.13*	66.1935.5113.0828.64

**P＜0.01，*P＜0.05，与空白对照组比较

表10  牛乳铁蛋白对乙酸灼烧型大鼠胃动素(MTL)及前列腺素(PGE2)的影响

组别	剂量(g/kg)	动物数(n)	MTL(Pg/ml)	PGE2(Pg/ml)
					空白模型对照组牛乳铁蛋白牛乳铁蛋白牛乳铁蛋白丽珠得乐	(1.4g/kg)(0.7g/kg)(0.28g/kg)(0.8g/kg)	1010101010	139.62±53.08217.99±77.12*198.24±63.43145.05±79.55219.78±56.95*	225.84±71.31130.22±22.38152.07±33.77181.82±33.19156.20±33.94

*P＜0.05，与空白对照组比较

(七)结论

本试验采用乙酸灼烧致大鼠胃粘膜损伤，以溃疡面积为指标，研究牛乳铁蛋白对乙酸灼烧致大鼠胃粘膜损伤的影响。结果表明，牛乳铁蛋白能降低大鼠的溃疡指数(降低65％，比丽珠得乐高52％，)，抑制率在13-66％之间，比丽珠得乐的抑制率多高出37个百分点。对乙酸灼烧致大鼠胃粘膜损伤有一定的保护作用。

六、牛乳铁蛋白对幽门结扎致大鼠急性胃粘膜损伤的影响

(一)试验目的

观察牛乳铁蛋白对幽门结扎致大鼠急性胃粘膜损伤的影响。

(二)药物

1、牛乳铁蛋白，批号：20010102，由杭州英维康生物工程有限公司提供。

2、丽珠得乐(铋剂)批号：0101002，由丽珠集团丽珠制药厂生产，每克药含铋剂110mg。

(三)动物

SD大鼠，体重(200～250g)，雌雄各半，由浙江省中医药研究院动物房提供，合格证号：医动字第220810017号。

(四)试验方法

取SD大鼠50只，体重(200～250g)，雌雄各半，随机分为5组，10只/组，设立空白对照，三个剂量的牛乳铁蛋白组(1.4g/kg，0.7g/kg，0.28g/kg)和丽珠得乐阳性对照组(0.8g/kg)，喂药十天。禁食36小时，自由饮水，在乙醚麻醉下固定大鼠，沿腹中线剪开一小口，找出胃并结扎幽门。术后18小时解剖胃，向胃腔内注入1％甲醛溶液8ml。将胃浸入1％福尔马林溶液中，10min后，沿胃大弯剪开胃，观察前胃部溃疡的发生情况。溃疡程度的评价，可以计数前胃部溃疡的面积，以其总和作为溃疡指数。也常用okabe法，在解剖显微镜下测量溃疡面积，将每只鼠溃疡面积的总和分为5个等级，作为溃疡指数。

溃疡面积(mm2)：溃疡指数：

1-121

13-252

26-373

38-504

50或穿孔5

根据溃疡指数可进一步计算：

(五)统计方法

实验数据表示为平均值±标准差( X±s)，组间差异的显著性用t-检验进行。

(六)试验结果

结果见表11

                    表11  牛乳铁蛋白对幽门结扎溃疡的影响

组别	剂量(g/kg)	动物数(n)	溃疡指数	抑制率(％)
					空白模型对照组牛乳铁蛋白牛乳铁蛋白牛乳铁蛋白丽珠得乐	(1.4g/kg)(0.7g/kg)(0.28g/kg)(0.8g/kg)	1010101010	3.8±0.921.86±1.14**2.10±1.00*2.60±1.432.30±1.06*	51.0544.7331.5839.47

**P＜0.01，*P＜0.05，与空白对照组比较

(七)结论

本试验采用幽门结扎致大鼠急性胃粘膜损伤，以溃疡指数为指标，研究牛乳铁蛋白对幽门结扎致大鼠胃粘膜损伤的影响。结果表明，牛乳铁蛋白能降低大鼠的溃疡指数，抑制率在31-51％之间，比丽珠得乐的抑制率多高出12个百分点。对幽门结扎致大鼠急性胃粘膜损伤有一定的保护作用。

七、牛乳铁蛋白对乙醇致大鼠胃黏膜损伤的影响

(一)实验目的

研究牛乳铁蛋白对乙醇致大鼠急性胃黏膜损伤的影响。

(二)药物

1、牛乳铁蛋白：批号：20010102，由杭州英维康生物工程有限公司提供，临用前将牛乳铁蛋白用蒸馏水配成0.14g/ml，0.07g/ml，0.028g/ml的浓度，大鼠ig(灌胃)上述溶液1ml/100g。相当于人临床用药15g，7.5g，3g。

2、丽珠得乐：批号：0101002，由丽株集团丽株制药厂生产，临用前用蒸馏水配制，2包加水25ml，每100g大鼠灌胃1ml。

(三)动物：SD大鼠，体重(200±20)g，♀♂兼用，由浙江省中医药研究院动物房提供，合格证号：医动字第220810017号。

(四)实验方法

取SD大鼠50只，体重(200±20)g，♀♂兼用，随机分成5组，10只/组，设立空白对照组，三个剂量的牛乳铁蛋白组(1.4g，0.7g，0.28g)和丽珠得乐组阳性对照组(0.8g/kg)连续喂药10天，末次给药后，禁食48小时，自由饮水，实验时灌服无水乙醇(1ml/只)，一小时后解剖取胃，以1％的甲醛溶液固定。损伤程度以溃疡指数表示。条索状损伤的长度大余1mm者测量其长度，每mm计1分，若其宽度大于1mm者将其分加倍，计分总数为该动物的溃疡指数，各组间进行比较。

(五)统计方法

实验数据表示为平均值±标准差( X±s)，组间差异的显著性用t-检验进行。

(六)试验结果

结果见表12

                    表12  牛乳铁蛋白对乙醇型溃疡的影响

组别	剂量(g/kg)	动物数(n)	溃疡指数	抑制率(％)
					空白对照组牛乳铁蛋白牛乳铁蛋白牛乳铁蛋白丽珠得乐	(1.4g/kg)(0.7g/kg)(0.28g/kg)(0.8g/kg)	1010101010	76.9±20.4040.7±26.02**41.9±20.25**47.1±23.6648.2±25.88	47.0745.5138.7537.32

**P＜0.01，*P＜0.05，与空白对照组比较

(七)结论

本试验用乙醇致大鼠急性胃粘膜损伤，以溃疡指数为指标，研究牛乳铁蛋白对乙醇致大鼠胃粘膜损伤的影响。结果表明，牛乳铁蛋白能降低大鼠的溃疡指数，比丽珠得乐降低大鼠的溃疡指数还多15％，比丽珠得乐的抑制率多高出10个百分点。对乙醇致大鼠急性胃粘膜损伤有一定的保护作用。

八、牛乳铁蛋白对大鼠胃液分泌的影响

(一)实验目的：观察牛乳铁蛋白对大鼠胃液量、胃液酸度和胃蛋白的影响。

(二)药物

牛乳铁蛋白，批号：20010102，由杭州英维康生物工程有限公司提供。

阳性对照药：丽珠得乐(铋剂)批号：0101002，由丽珠集团丽珠制药厂生产，每克药含铋剂110mg。

(三)动物

SD大鼠，体重(200±20)g，♀♂兼用，由浙江省中医药研究院动物房提供，合格证号：医动字第220810017号。

(四)试验方法：

把SD大鼠随机分为5组，每组10只，分别设立高剂量组(LF0.28g/200g大鼠)、中剂量组(LF为0.134g/200g大鼠)、低剂量(LF为0.056g/200g大鼠)，空白对照组(LF为0.053g/200g大鼠)、阳性对照(折合人剂量，每日4包)、空白对照组(喂蒸馏水)，连续喂药10天，末次给药后均禁食24小时，不禁水。在乙醚麻醉下，沿腹正中线剪开小口，轻轻找出胃，结扎幽门，缝合腹壁切口，4～6小时后拆线找开腹腔结扎贲门，摘取全胃，用滤纸擦净血迹，沿大弯侧剪开胃腔，倾出胃内容物收集于刻度离心管中，记录胃液量，再以1，000～2,000g离心约5分钟，去除食物残渣等胃内容物(以酸度计测胃液的酸度)用酸碱滴定法测胃液总酸度。利用胃蛋白酶分解血红蛋白生成酪氨酸，再用酚红试剂的显色反应测定酪氨酸的量，从而间接计算胃蛋白酶的活性。

(1)胃液总酸度的测定：取上清胃液1ml，加酚红指示剂1滴，用0.01mol/L的NaoH滴定，直至胃液先呈黄色后转为红色2秒内不消失为终点，记录用去NaoH溶液量。

总酸度mmol/L＝耗去的NaoH溶液量。

(2)胃蛋白酶活性测定

取上清胃液0.1ml，加入1％牛血清白蛋白(0.1N HCL配制)1ml37℃温孵20分钟，加入2％三氯乙酸，并在沸水中加热5分钟，冷却后过滤。取滤出液0.2ml，加入0.8ml 0.125N Na₂CO₃溶液，同时加入Folin-Ciocalte试剂(5ml甲液和0.5ml乙液)，混匀后静置30分钟后比色(700mn)。以酪氨酸标准曲线计算胃蛋白酶活性。以mmol/h酪氨酸表示胃蛋白酶排出量。

五、结果

结果见表13。

结果表明，牛乳铁蛋白能抑制大鼠胃液分泌，抑制胃液酸度。

                          表13  牛乳铁蛋白对胃液的影响

组别	n	PH值	胃液量(ml)	总酸(mmol/l)	胃蛋白酶活性(mmol/h)
						空白对照组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组	1010101010	1.62±0.091.73±0.921.88±0.28*1.81±0.321.51±0.18*	15.7±4.7910.45±1.86**10.56±2.92**9.5±2.17*10±2.98*	8.56±2.217.87±1.506.08±1.99**7.70±2.967.53±1.65	17.82±3.3119.12±2.5017.14±1.9017.91±1.6917.57±0.8

六、结论

结果显示，1.4g/kg牛乳铁蛋白能抑制大鼠胃液分泌，减少胃液酸度。其中低剂量组(0.23g/kg)与空白对照组相比，能降低胃液36％，降低胃总酸度12％。

Claims (4)

1、一种牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染的胃炎药中的应用。

2、一种牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染的胃溃疡病药中的应用。

3、一种牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药中的应用，其用药组成为：牛乳铁蛋白100-250mg、雷贝拉唑10-20mg、克拉霉素300-500、替硝唑300-500mg。

4、一种牛乳铁蛋白在制备治疗幽门螺旋杆菌感染性胃病药中的应用，其用药组成为：牛乳铁蛋白100-250mg、奥美拉唑100-200mg、阿莫西林0.2-0.5g、甲硝唑0.2-0.4g。

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