JP2666211B2

JP2666211B2 - 抗体およびそれを有効成分とする齲蝕予防剤の製造方法

Info

Publication number: JP2666211B2
Application number: JP63028247A
Authority: JP
Inventors: 淳一郎平岡; 梅司村上; 勇藤田; 透所; 義勝児玉; 英明横山
Original assignee: 鐘紡株式会社; 株式会社ゲン・コーポレーション
Priority date: 1988-02-09
Filing date: 1988-02-09
Publication date: 1997-10-22
Anticipated expiration: 2012-10-22
Also published as: JPH01203317A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）口腔内に適用し、プラークの形成を抑制して齲蝕を予
防する事ができる抗体及びそれを有効成分とする齲蝕予
防剤の製造方法に関する。

（従来の技術）歯科における２大疾患である齲蝕と歯周病の大きな誘
因にプラーク（歯垢）の沈着が挙げられる。即ち、歯面
に沈着したプラーク内部に酸が蓄えられ、その酸によっ
て歯の構成成分であるエナメル質が脱灰され、齲蝕を引
き起こす。

そのプラークの大部分は細菌によって占められてい
る。その内、齲蝕を誘発するものとして、Streptococcu
s mutansやActinomyces viscosus等が挙げられる。特
に、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcu
s mutans;以下S.mutansと略す。）が歯面に吸着し、シ
ョ糖から多糖を合成することによってプラーク形成され
る。具体的には、S.mutansがグルコシルトランスフェレ
ース（Ｇ Tase）を産生し、これによりショ糖からデキ
ストラン、ムタン等の粘着性多糖を合成する。そして、
この合成された多糖は、S.mutansをはじめとする他の口
腔内細菌を巻き込み、プラークを形成する。又、S.muta
ns等の菌により、種々の糖から酸が産生され、その酸が
プラーク内で滞留され、エナメル質を脱灰する。

以上のように齲蝕の発生には、S.mutansの歯面への付
着という第１ステージと不活性グルカンの合成という第
２のステージが重要なステップとなっている。

従って、S.mutansの歯面への付着の抑制又は、不活性
グルカン合成の抑制を行うことでより効果の高い齲蝕予
防が期待される。

（発明が解決しようとする問題点）従来、プラーク形成を抑制する方法として、抗菌剤,G
Tase阻害剤，プラーク分解酵素，代用糖等種々の物質が
検討されている。

そのような中で、特定の物質に対して特異的に反応す
る抗体が注目されており、抗体を用いた齲蝕予防剤の研
究が行われている。例えば、S.mutans全菌体を牛に免疫
することによって、得られる母乳を使用する方法が知ら
れている（英国特許第1505513号明細書）。

又、S.mutans及びその菌に由来する各種の抗原をヤギ
・ウサギ・ラット等の哺乳動物に免疫して約１カ月後ぐ
らいから血清を採取して、S.mutansと特異的に反応する
抗体を調製し、その抗体を使用する方法が提案されてい
る（特開昭60−36327号広報）。

しかしながら、母乳については、牛の管理・手間・費
用又、血清については、血液の採取・血液からの抗体の
調製・動物の管理等に手間・時間・費用等がかかり、い
まだ実用化されていない。

このような問題点について、本発明者らは、鋭意努力
の研究を行った結果、S.mutansに由来する抗原を鶏に免
疫し、その鶏が産生した卵より抗体を製造すれば、前記
の問題点がことごとく解決され、更に優れたプラーク形
成抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに
至ったのである。

特に、鶏を用いた抗体の製造においては、必ずしも免
疫した抗原に特異的に反応する抗体が十分得られるとは
限らない。例えば、ウイルス抗原を免疫した場合、十分
なる抗体価が得られなかった。

尚、鶏に免疫する際には、抗原・免疫方法等を十分に
吟味し、抗体価の高いものが得られるように検討しなけ
ればならない。

従って、S.mutans菌体で鶏を免疫して、十分に高い抗
体価を有する抗体が得られるという知見は、全く予想さ
れないものであり、本発明者らによって初めて得られた
ものである。

本発明の目的は、S.mutansに対する免疫活性を示し、
S.mutansの歯面への付着に対する十分な阻害効果を有
し、量産性にも優れ、生産コストが低く、安全性にも優
れ、齲蝕予防剤の有効成分として有用な抗体及び該抗体
を含む齲蝕予防剤の製造方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段）即ち、本発明は齲蝕誘発の病原菌としての血清型が
ｃ、ｄ、ｅ、ｆまたはｇであるストレプトコッカス・ミ
ュータンスを免疫した鶏が産出する卵より調製された免
疫グロブリンであって、その齲蝕誘発の病原菌に対して
免疫活性を有する抗体及びそれを有効成分とする齲蝕予
防剤の製造方法に関する。

以下、本発明につきさらに詳しく説明する。

本発明に係る抗体及びそれを有効成分とする齲蝕予防
剤は、前述のようにS.mutansを鶏に免疫し、その鶏が産
生した卵より調製したものである。

S.mutansは血清学的にａ〜ｈ型の８種類に分離される
が、本発明においてはc,d,e,f又はｇ型が利用される。

ここで用いるｃ型菌としては、S.mutans Ingbritt
株,MT8148株,10449株等の公知で、容易に入手可能な菌
を用いることができ、例えばS.mutans MT8148株,Ingbr
itt株は大阪大学歯学部から、10449株はナショナルコ
レクションオブタイプカルチャーズ〔Nationsl
Collection of Type Cultures（NCTC）〕から入手で
きる。又、ｅ型菌やｆ型菌についても公知の菌株を同様
に入手して用いればよい。

更に、ｇ型菌としては、S.mutans 6715株,OMZ65株等
の公知で、容易に入手可能な歯を用いることができ、例
えば、S.mutans 6715株は、大阪大学歯学部から入手で
きる。ｄ型菌についても公知の菌株を同様に入手して用
いればよい。

又、培地としては、少なくともグルコースを含む培地
が利用できる。

又、培養温度は、菌体増殖が得られるのに適した範囲
内であれば良いが、良好な菌体増殖という点からは、通
常37℃程度とするとよい。

又、培養時間は、培養温度，培地の種類等の培養条件
によって異なるが、溶菌しない時期を選択して決定すれ
ば良く、18〜24時間程度とすればよい。

又、その他の培養条件についても、上記の観点から適
宜選択すれば良い。

次に本発明の抗体製造方法について説明する。

即ち、まず齲蝕誘発の病原菌S.mutansを鶏に免疫す
る。鶏への免疫に際しては、S.mutansを精製して用いる
のが通常である。その精製方法には、遠心・吸着・有機
溶媒による抽出・電気泳動・クロマトグラフィー等が挙
げられ、遠心分画が最も一般的である。

免疫される鶏としては、特に制限はないが、抗体の量
産性という点からは、白色レグホーン等の卵用種を用い
ると良い。

又、菌体による免疫方法としては、皮下注射，筋肉注
射，腹腔内投与等による通常の方法や、点鼻，点眼等の
方法によって行うことができる。更に、菌体の投与量
は、所望の抗体価が得られ、且つ鶏に対して悪影響を与
えない量を適宜選択すれば良い。

通常、初回免疫から数週間で投与抗原に対して特異的
に反応する抗体が鶏卵（卵黄）中に得られる。

尚、必要に応じて例えばFCA（フロイント完全アジュ
バント）,FIA（フロイント不完全アジュバント）等のア
ジュバントを菌体と共に併用しても良い。

免疫から１カ月以上経過した後から鶏が産生する卵を
集卵する。

尚、卵黄中の抗体価は、菌体凝集価，酵素免疫吸着法
（ELISA），ラジオイムノアッセイ等を用いて測定する
ことができ、免疫後に２週程度の間隔で抗体価を測定す
ることにより抗体価の推移を追跡することができる。

後述の実施例においては、凝集抗体価での測定により
抗体価の推移を追跡し、抗体価が十分に上昇した段階の
卵を採取して、本発明の抗体を製造した。

又、通常、約３カ月間にわたって高抗体価を得ること
ができる。

尚、免疫後、抗体価の減少が見られた場合、適当な間
隔で適宜追加免疫することにより抗体価を高くすること
ができる。

得られた卵より目的とする免疫グロブリンを製造す
る。この製造方法は、遠心分離，デキストラン硫酸によ
る抽出・ポリエチレングリコールによる抽出・プロパノ
ールによる抽出・各種クロマトグラフィーによる分離等
が挙げられる。特に、卵黄を集めて、上記の精製を行う
ことで目的とする抗体を効率よく精製・凝縮することが
できる。更に、この卵黄から得られる抗体は、免疫グロ
ブリンのうちIgGである。一方、卵白より調製・濃縮さ
れる抗体は、免疫グロブリンのうちIgM及びIgAである。

それら何れの抗体もS.mutansと特異的に反応し、S.mu
tansに対して免疫活性を有する。本発明の抗体は、S.mu
tans凝集を惹起し、又S.mutansの平滑面付着を顕著に抑
制することが示された。その中でも、特にIgGが優れて
おり、本発明の目的ではIgGを使用することが好まし
い。

以上記載のごとく本発明は、通常の哺乳動物から調製
される製法に比べて、容易に且つ大量に調製でき、しか
も卵黄から抗体を調製するという簡単な操作により免疫
グロブリンのうちIgG画分だけを特異的に分離精製する
ことができ、齲蝕予防剤の有効成分として有用なる抗体
の製造方法を提供するものである。

これらの種々の抗体含有画分は、通常の齲蝕予防剤に
配合し、本発明に係る齲蝕予防剤を製造することができ
る。

即ち、本発明に係る齲蝕予防剤は練り歯磨き・粉歯磨
き・液状歯磨き等の歯磨き類、マウスウォッシュ，口腔
用パスタ，歯肉マッサージクリーム，うがい用錠剤，ト
ローチ，チューインガム，缶飲料等口腔内商材だけでは
なく、その目的においては種々の食品にも適用されるも
のである。

本発明抗体に係る齲蝕予防材への配合量は、その投与
形態に応じた投与量に従って適宜選択すれば良く、例え
ば、10³以上の凝集抗体価を有する抗体を0.0001〜10重
量％程度とすることができる。

尚、本発明に係る齲蝕予防剤の他の成分としては、使
用目的、使用形態等に応じた適当な成分が用いられる。
例えば練り歯磨きの場合では、炭酸カルシウム，燐酸水
素カルシウム，ピロリン酸カルシウム，不溶性メタリン
酸ソーダ，水化アルミナ，無水ケイ酸等の研磨材，グリ
セリン，ソルビット，プロピレングリコール等の保湿
剤、ラウリル硫酸ナトリウム，ラウロイルサルコシンナ
トリウム，石鹸末等の発泡剤，カルボキシメチルセルロ
ースナトリウム，カラギーナン等のバンイダー、さらに
適当なる香料成分、甘味料，保存剤等の成分を水と混合
し、常法に従って製造する。又、マウスウォッシュ等の
口腔洗浄剤その他においても、製品の性状に応じた慣用
の成分が適宜配合される。

尚、本発明においては、歯牙着色除去剤、口臭予防
剤、フッ素等の虫歯予防剤，抗酵素予防剤等の種々の薬
効成分を配合することも可能である。

よって、本発明に係る齲蝕予防剤は、前記免疫卵より
調製した卵黄抗体を用いることにより、ストレプトコッ
カス・ミュータンスによるプラークの形成を効果的に抑
制し、齲蝕の発生を良好に防止する。しかも、前記卵黄
抗体は安全性が高いため、本発明に係る齲蝕予防剤は使
用上の安全性が高いものである。

（実施例）以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。尚、
以下における％表示は、特に、指定されていない場合に
は、重量／容量％を示す。

実施例１（抗体の製造方法）（ａ）抗原の調製 S.mutans Ingbritt株（血清型c,大阪大学歯学部から
入手）を4.8lのBHI培地で37℃,18時間静置培養した。培
養液を遠心分離により菌体と培養上清とに分離した。集
めた菌体をリン酸緩衝液（PBS）で２度洗浄した。次に
洗浄菌体に対して0.3％ホルマリン溶液50mlを加え、37
℃で一晩インキュベートした。この段階で６×10¹⁰cell
s/mlの濃度となった。

このホルマリン処理菌体は死菌であることを無菌テス
トによって確認した。

（ｂ）抗原の鶏への免疫（ａ）で得たホルマリン処理S.mutans Ingbritt株
（血清型ｃ）３×10¹⁰個をリン酸緩衝液0.5mlに懸濁さ
れたものとFCA（フロイント完全アジュバント）0.5mlを
1:1混合してW/O型のエマルジョンとした。

得られたエマルジョンを鶏の胸筋に0.5mlずつ注射
し、初回免疫を行った後、下記の方法に従って、採取し
た卵から得たWSP（後述）の凝集抗体価を測定し、その
推移を観察した。

次に、第１図に示すように初回免疫後８週後に卵黄中
の抗体価が下がり始めたのを確認して、前回と同様にし
て２次免疫を行った。

２次免疫終了後、約１カ月経過した後から鶏が産生す
る卵を集卵した。

（ｃ）抗体の製造方法卵黄を卵より分離し、13mlの卵黄を取り、これと等量
のPBS（リン産緩衝液,ph7.4）を混合し、更に等量（26m
l）のクロロホルムを加え、よく撹拌した後、30分室温
に放置した。その後、3,000rpmにて20分間遠心した。遠
心後の最上層の透明な画分13mlを目的の抗体を含む画分
として得た（以下WSF:water soluble fractionと略記
する）。

この画分を常法の免疫電気泳動分析した所、IgGを確
認した。なお、このWSF中の総蛋白量をビューレット法
により測定したところ約26mgであった（約2.0mg/ml×13
ml）。

（ｄ）抗体価の測定方法（ｃ）で得られた抗体含有画分WSFについてS.mutans
凝集テストを行った。

まず、（ａ）で得たホルマリン処理S.mutans Ingbri
tt株菌体をマクファーランド指数５（OD₁₅₀≒2.0）とな
るように調製し、試験管に1mlとなるように分注した。

ここで、（ｃ）で得られたWSFのPBSによる２段階希釈
液の1mlを各試験管に加え、37℃で一晩反応させた。

反応終了後、菌体の凝集の有無を目視にて判断した。

凝集抗体価はエンドポイントタイター法により求め、
凝集が確認される最終希釈倍率とした。

（ｅ）S.mutansの平滑面への付着抑制テスト S.mutansの歯面への付着のモデル実験として、ガラス
面への付着実験を行った。

即ち、（ｃ）で得た抗体を加えることで、S.mutans
Ingbritt株のガラフ面への付着がどの程度阻害されるか
を評価するものであり、その詳細を以下に述べる。

まず、（ｃ）で得た512の凝集抗体価を有するWSF及び
その10倍希釈液を試験溶液とした。

これとは別に、免疫をしていない鶏［（ｂ）と同様の
鶏］の卵から（ｃ）と同様にしてWSFを調製し試験溶液
とした。尚、該WSFがS.mutans Ingbritt株に対して特
異的に反応しないことを確認した。

次に、これらの各試験溶液を13mmφ×100mm試験管に1
ml分注した後、更に、1.5％スクロースを含む1.5倍濃度
のBHI培地2mlをそれぞれの試験管に加えた。

更に、各試験管にBHI培地で前培養したS.mutans Ing
britt株の懸濁液を0.1mlを加えて、30゜に傾斜させた状
態で、37℃の温度下で12時間静置培養した。

表１に各試験管内に調製した調製物の組成を示す。

静置培養終了後、各試験管を以下の操作に従って処理
し、菌体の試験管壁への付着率を求めた。

静置培養終了後の試験管（この試験管を第１の試験管
とする）を静かに回転させ、試験管壁に付着していない
菌体を含んだ溶液の全量を第２の試験管に移した。次
に、菌体が付着している第１の試験管に50mMリン酸緩衝
液（pH6.8）の3mlを加え、これを再び回転させ、解離し
た菌体を含む緩衝液の全量を第３の試験管に移した後、
この第１の試験管に、50mMリン酸緩衝液（pH6.8）の3ml
を加えた。

更に、第１〜第３の試験管を超音波処理し、各試験管
内に均一な菌体浮遊液を調製し、各浮遊液の吸光度（OD
₅₅₀）を測定し、以下の式に従って付着率を求めた。

得られた結果を表１に示す。

実施例２（抗体の製造方法） S.mutans 6715株（血清型g,大阪大学歯学部から入
手）で実施例１の（ａ）と同様に培養し、同様の方法に
て、６×10¹⁰cells/mlの濃度の菌体を得た。これを用い
て実施例１の（ｂ），（ｃ）と同様にして抗体の調製を
行ったところ、同様にS.mutans 6715株（血清型ｇ）全
菌体と特異的に反応する抗体が得られた。凝集抗体価は
512であった。

更に、得られた抗体の菌体付着阻害効果を実施例１の
（ｅ）と同様の方法で試験した結果、同様に優れた効果
が認められた。

次に本発明の齲蝕予防剤の実施例を記載する。

（実施例３）練り歯磨きの製造方法ピロリン酸カルシウム 42 ％グリセリン 15 ％ソルビット70％ 10 ％カルボキシメチルセルロース 12 ％サッカリンナトリウム 0.1％ラウリル硫酸ナトリウム 2.0％香料 1.0％水残量 100 ％以上の成分に実施例１〜３の各種抗体含有画分0.5％
（凝集抗体価512のもの）を配合して製造する。

（実施例４）マウシュウォッシュの製造方法エタノール 22.5 ％サッカリンナトリウム 0.05％ラウリルジエタノールアミド 0.3 ％香料 1.0 ％水残量 100 ％以上の成分に実施例１〜２の各種抗体含有画分0.5％
（凝集抗体価512のもの）を配合して製造する。

（発明の効果）本発明により、S.mutansの歯面への付着に対する十分
な阻害効果を有し、量産性にも優れ、生産コストが低
く、安全性にも優れ、齲蝕予防剤の有効成分として有用
な抗体及び該抗体を含む齲蝕予防剤の製造方法が提供さ
れた。

特に、本発明に係るS.mutansに対する免疫活性を有す
る抗体は、従来の哺乳動物を免疫して得る抗体と比較し
て以下のような利点を有する。

（１）本発明により得られる抗体は、免疫した鶏の卵中
に得られ、採卵、卵の取り扱いおよび卵からの抗体の取
得に特別な、あるいは熟練した技術を必要としない。し
かも、卵黄には免疫グロブリンのうちIgGクラスしか移
行しないので、IgGのみを容易に得ることができる。

これに対して、免疫した哺乳動物から採血により抗体
を得る場合には、採血に熟練した技術が必要とされ、し
かも血清から大量のIgGを分離・精製することは非常に
困難である。

（２）本発明の抗体製造に用いられる鶏は、管理が容易
であり、例えばラット等と比較してもその管理費用が安
い。

しかも、哺乳動物から継続的に多量の血液や乳を得る
ことは困難であり、哺乳動物を用いる方法は抗体の量産
には適さないが、鶏は長期間にわたって安定して卵を生
み続けるので、本発明の抗体は量産可能であり、かつ生
産コストが低い。

（３）免疫した哺乳動物の血液や乳から製造した抗体の
安定性は必ずしも良好でなく、血清中で、あるいは精製
した状態でも−80℃程度の温度条件下での保存が必要と
される。

本発明により得られた抗体は、良好な安定性を有し、
また保存性も良く、例えば卵の状態で４℃で１〜２箇月
間保存できる。

最後に、鶏を用いた抗体を製造する場合、必ずしも免
疫した抗原に特異的に反応する抗体が十分量得られると
は限らない。例えば、ウイルス抗原を免疫しても、十分
な抗体価が得られなかった。従って、S.mutans菌体で鶏
を免疫しても、実用的レベルの抗体価を有する抗体が得
られるかどうかは全く予想されないものであり、本発明
者らによって初めて達成されたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例1,2において、免疫した鶏の抗体価の
推移を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者横山英明岐阜県各務原市蘇原宮代町２丁目115番２審査官瀬下浩一 (56)参考文献英国特許1505513（ＧＢ，Ｂ) う蝕と歯周病−研究の進歩、浜田茂幸編集、日本歯科評論社1985年刊、３巻、第119−141ページＲｅｓｅｏｓｃｈｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｓｙＳｃｉｅｎｃｅ，1975，Ｖｏｌ．18，ｐｐ．117−120

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】齲蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、
ｄ、ｅ、ｆまたはｇであるストレプトコッカス・ミュー
タンスに対する抗体の製造方法において、ａ）前記ストレプトコッカス・ミュータンスを鶏に免疫
する工程と、ｂ）該免疫された鶏が産生する卵から卵黄を分離する工
程と、ｃ）該卵黄から、前記ストレプトコッカス・ミュータン
スに対して誘導され、かつ該、ストレプトコッカス・ミ
ュータンスに対する免疫活性を有する抗体を含む免疫グ
ロブリンを抽出する工程とを有することを特徴とする抗
体の製造方法。
【請求項２】前記工程ｃ）が、前記卵黄とリン酸緩衝液
とを混合し、更にクロロホルムを加え、得られた混合液
を所定時間放置した後、遠心分離処理し、最上層の透明
画分を前記抗体を含む画分として回収することにより行
われる請求項１に記載の抗体の製造方法。
【請求項３】齲蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、
ｄ、ｅ、ｆまたはｇであるストレプトコッカス・ミュー
タンスに対する抗体を有効成分とする齲蝕予防剤の製造
方法において、ａ）前記ストレプトコッカス・ミュータンスを鶏に免疫
する工程と、ｂ）該免疫された鶏が産生する卵から卵黄を分離する工
程と、ｃ）該卵黄から、前記ストレプトコッカス・ミュータン
スに対して誘導され、かつ該、ストレプトコッカス・ミ
ュータンスに対する免疫活性を有する抗体を含む免疫グ
ロブリンを抽出する工程とｄ）該ストレプトコッカス・ミュータンスに対して誘導
された抗体を有効成分として齲蝕予防剤を製剤する工程
とを有することを特徴とする齲蝕予防剤の製造方法。
【請求項４】前記工程ｃ）が、前記卵黄とリン酸緩衝液
とを混合し、更にクロロホルムを加え、得られた混合液
を所定時間放置した後、遠心分離処理し、最上層の透明
画分を前記抗体を含む画分として回収することにより行
われる請求項３に記載の齲蝕予防剤の製造方法。