JPH01203317A

JPH01203317A - 抗体およびそれを有効成分とする齲蝕予防剤の製造方法

Info

Publication number: JPH01203317A
Application number: JP63028247A
Authority: JP
Inventors: Junichiro Hiraoka; 平岡　淳一郎; Umeji Murakami; 村上　梅司; Isamu Fujita; 勇藤田; Toru Tokoro; 所　透; Yoshikatsu Kodama; 義勝児玉; Hideaki Yokoyama; 英明横山
Original assignee: Ghen Corp; Kanebo Ltd
Current assignee: Ghen Corp; Kanebo Ltd
Priority date: 1988-02-09
Filing date: 1988-02-09
Publication date: 1989-08-16
Anticipated expiration: 2012-10-22
Also published as: JP2666211B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）口腔内に適用し、プラークの形成を抑制して鯖蝕を予防
する事ができる抗体及びそれを有効成分とする鵬蝕予防
剤に関する。

（従来の技術）歯科における２大疾患である鯖蝕と歯周病の大きな誘因
にプラーク（歯垢）の沈着が挙げられる。

即ち、歯面に沈着したプラーク内部に酸が蓄えられ、そ
の酸によって歯、の構成成分であるエナメル質が脱灰さ
れ、鯖蝕を引き起こす。

そのプラークの大部分は細菌によって占められている。

その内、鵬蝕を誘発するものとして、Ｓ　ｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｏｓ　ｍｕｔａｎａやＡｃｔｉｎｏｓｙｃｅｓ
　ｖｉｓｃｏｓｕｓ等が挙げられる。特に、ストレプト
コッカス・ミュータンス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏ
ｓ　＋＊ｕｔａｎｓ　　；以下Ｓ　、５ｕｔａｎｓ　と
略す、）が歯面に吸着し、シｇ糖から多糖を合成するこ
とによってプラーク形成される。具体的には、Ｓ　、ｍ
ｕｔａｎｓがグルコシルトランスフェレース（ＧＴａｓ
ｅ）を産生し、これによりシＷ１糖からデキストラン、
ムタン等の粘着性多糖を合成する。そして、その合成さ
れた多糖は、Ｓ　０ｍｕｔａｎｓをはじめとする他の口
腔内細菌を巻き込み、プラークを形成する。又、Ｓ　、
ｍｕｔａｎｓ等の菌により、種々の糖から酸が産生され
、その酸がプラーク内で滞留され、エナメル質を脱灰す
る。

以上のように鵬触の発生には、Ｓ、ｍｕｔａｎｓの歯面
への付着という第１ステージと不溶性グルカンの合成と
いう第２のステージが重要なステップとなっている。

従って、５）ｕｔａｎｓの歯面への付着の抑制又は、不
溶性グルカン合成の抑制を行うことでより効果の高い顯
触予防が期待される。

（発明が解決しようとする問題点）従来、プラーク形成を抑制する方法として、抗菌剤、　
ＧＴａｓｅ阻害剤、プラーク分解酵素１代用糖等種々の
物質が検討されている。

そのような中で、特定の物質に対して特異的に反応する
抗体が注目されており、抗体を用いた門蝕予防剤の研究
が行われている０例えば、Ｓ、■ｕ　ｔａｎｓ全薗体全
牛体免疫することによって、得られる母乳を使用する方
法が知られている（英国特許第１５０５５１３号明細書
）。

又、Ｓ　、ｍｕｔａｎｓ及びその菌に由来する各種の抗
原をヤギ・ウサギ・ラット等の哺乳動物に免疫して約１
カ月後ぐらいから血清を採取して、Ｓ　、ｍｕｔａｎｓ
　と特異的に反応する抗体を調製し、その抗体を使用す
る方法が提案されている（特開昭６０−３８３２７号公
報）。

しかしながら、母乳については、牛の管理・手間・費用
又、血液については、血液の採取・血液からの抗体の調
製・動物の管理等に手間・時間・費用等がかかり、いま
だ実用化されていない。

このような問題点について、本発明者らは、鋭意努力の
研究を行った結果、Ｓ　、ｍｕｔａｎｓに由来する抗原
を鶏に免疫し、その鶏が産生じた卵より抗体を調製すれ
ば、前記の問題点がことごとく解決され、更に優れたプ
ラーク形成抑制効果を有することを見出し、本発明を完
成するに至ったのである。

特に、鶏を用いた抗体の調製においては、必ずしも免疫
した抗原に特異的に反応する抗体が十分量得られるとは
限らない０例えば、ウィルス抗原を免疫した場合、十分
なる抗体価が得られなかった。

尚、鶏に免疫する際には、抗原・免疫方法等を十分に吟
味し、抗体価の高いものが得られるように検討しなけれ
ばならない。

従って、Ｓ　、ｓ＋ｕｔａｎｓ菌体で鶏を免疫して、十
分に高い抗体価を有する抗体が得られるという知見は、
全く予想されないものであり、本発明者らによって始め
て得られたものである。

本発明の目的は、Ｓ　、ｍｕｔａｎｓに対する免疫活性
を示し、Ｓ　、ｍｕｔａｎｓの歯面への付着に対する十
分な阻害効果を有し、量産性にも優れ、生産コストが低
く、安全性にも優れ、顯蝕予防剤のを効成分として有用
な抗体及び該抗体を含む顯蝕予防剤を提供することにあ
る。

〔課題を解決するための手段）即ち、本発明は顯蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、
ｄ、ｅ、ｆ又はｇであるストレプトコッカス・ミュータ
ンスを免疫した鶏が産出する卵より調製された免疫グロ
ブリンであって、その門蝕誘発の病原菌に対して免疫活
性を有する抗体及びそれを有効成分とするｉＪ蝕予防剤
に関する。

以下、本発明につきさらに詳しく説明する。

本発明の抗体及びそれを有効成分とする門蝕予防剤は、
前述のようにＳ　、５ｕｔａｎｓを鶏に免疫し、その鶏
が産生した卵より調製したものである。

Ｓ　、ｍｕｔａｎｓは血清学的にａ〜ｈ型の８種類に分
離されるが、本発明においてはｃ、ｄ、ｅ、ｆ又はｇ型
が利用される。

ここで用いるＣ型面としては、Ｓ　、ｍｕｔａｎｓＩ　
ｎｇｂｒｉｔｔ株、Ｍ７８１４８株、１０４４９株等の
公知で、容易に入手可能な菌を用いることができ、例え
ば、Ｓ　）ｕｔａｎｓ　Ｍ　７８１４８株、　Ｉ　ｎｇ
ｂｒｉｔｔ株は大阪大学歯学部から、１０４４９株はナ
シ甘ナル　コレクション　オプタイプ　カルチャーズ（
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　　Ｔ
ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ（ＮＣＴＣ））から入手でき
る。又、ｅ型面やｆ型苗についても公知の菌株を同様に
入手して用いればよい。

更に、ｇ型面としては、Ｓ、ｍｕｔａｎｓ　６７１５株
。

０Ｍ２６５株等の公知で、容易に入手可能な菌を用いる
ことができ、例えば、Ｓ、ＩＩ＋ｕｔａｎｓ　　６７１
５株、は大阪大学歯学部から入手出来る。ｄ型面につい
ても公知の菌株を同様に入手して用いればよい。

又、培地としては、少なくともグルコースを含む培地が
利用できる。

又、培養温度は、菌体増殖が得られるのに適した範囲内
であれば良いが、良好な菌体増殖いう点からは、通常３
７℃程度とするとよい。

又、培養時間は、培養温度、培地の種類等の培養条件に
よって異なるが、溶菌しない時期を選択して決定すれば
良く、１８〜２４時間程度とすればよい。

又、その他の培養条件についても、上記の観点から適宜
選択すれば良い。

次に本発明の抗体の製造方法について説明する。

即ち、まず結線誘発の病原菌Ｓ　、＋５ｕｔａｎｓを鶏
に免疫する。鶏への免疫に際しては、Ｓ　、ａｕｔａｎ
ｓを精製して用いるのが通常である。その精製方法には
、遠心・吸着・有機溶媒による抽出・電気泳動クロマト
グラフィー等が挙げられ、遠心分画が最も一般的である
。

免疫される鶏としては、特に制限はないが、抗体の量産
性という点からは、白色レグホーン等の卵用種を用いる
と良い。

又、国体による免疫方法としては、皮下注射。

筋肉注射、腹腔内投与等による通常の方法や、点鼻１点
眼等の方法によって行うことができる。更に、菌体の投
与量は、所望の抗体価が得られ、且つ鶏に対して悪影響
を与えない量を適宜選択すれば良い。

通常、初回免疫から数週間で投与抗原に対して特異的に
反応する抗体が鶏卵（卵黄）中に得られる。

尚、必要に応じて例えばＦＣＡ（フロイント完全アジュ
バント）、ＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント）等
のアジュバントを菌体と共に併用しても良い。

免疫から１力月以上経過した後から鶏が産生ずる卵を集
卵する。

尚、卵黄中の抗体価は、菌体凝集価、酵素免疫吸着法（
ＥＬＩＳＡ）、　ラジオイムノアッセイ等を用いて測定
することができ、免疫後に２週程度の間隔で抗体価を測
定することにより抗体価の推移を追跡することができる
。

後述の実施例においては、凝集抗体価での測定により抗
体価の推移を追跡し、抗体価が十分に上昇した段階の卵
を採取して、本発明の抗体を調製した。

又、通常、約３カ月間にわたって高抗体価を得ることが
できる。

尚、免疫後、抗体価の減少が見られた場合、適当な間隔
で適宜追加免疫することにより抗体価を高くすることが
できる。

得られた卵より目的とする免疫グロブリンを調製する。

この調製方法は、遠心分離、デキストラン硫酸による抽
出・ポリエチレングリコールによる抽出・プロパツール
による抽出・各種クロマトグラフィーによる分離等が挙
げられる。特に、卵黄を集めて、上記の精製を行うこと
で目的とする抗体を効率よく精製・濃縮することができ
る。更に、この卵黄から得られる抗体は、免疫グロブリ
ンのうちＩｇＧである。一方、卵白より調製・濃縮され
る抗体は、免疫グロブリンのうちＩｇＭ及びＩｇＡであ
る。

それら何れの抗体もＳ　、閣ｕｔａｎｓ　と特異的に反
応し、Ｓ　、ｓ＋ｕｔａｎｓに対して免疫活性を有する
。本発明の抗体は、Ｓ　４ｕｔａｎｓ凝集を惹起し、又
Ｓ　、ｔｍｕｔａｎｓの平滑面付着を顕著に抑制するこ
とが示された。

その中でも、特にＩｇＧが優れており、本発明の目的で
はＩｇＧを使用することが好ましい。

以上記載のごとく本発明は、通常の哺乳動物から調製さ
れる製法に比べて、容易に、且つ大量に調製でき、しか
も卵黄から抗体を調製するという簡単な操作により免疫
グロブリンのうちＩｇＧ画分だけを特異的に分離精製す
ることができ、ｍＡ　蝕子防剤の有効成分として有用な
る抗体を提供するものである。

これらの種々の抗体含有画分は、通常の結線予防剤に配
合し、本発明に係る鎖線予防剤を調製することができる
。

即ち、本発明の鎖線予防剤は練り歯磨き・粉歯磨き・液
状歯磨き等の歯磨き類、マウスウォッシュ、口腔用パス
タ、歯肉マツサージクリーム、うがい用錠剤、トローチ
、チューインガム、缶飲料等口腔内商材だけではなく、
その目的においては種々の食品にも適用されるものであ
る。

本発明抗体の顛蝕予防材への配合量は、その投与形態に
応じた投与量に従って適宜選択すれば良く、例えば、１
０２以上の凝集抗体価を有する抗体を０．０００１〜１
０重量％程度とすることができる。

尚、本発明の鎖線予防材の他の成分としては、使用目的
、使用形態等−に応じた適当な成分が用いられる０例え
ば練り歯磨きの場合では、炭酸カルシウム、燐酸水素カ
ルシウム、ピロリン酸カルシウム、不溶性メタリン酸ソ
ーダ、水化アルミナ。

無水ケイ酸等の研磨材、グリセリン、ソルビット。

プロピレングリコール等の保湿剤、ラウリル硫酸ナトリ
ウム、ラウロイルサルコシンナトリウム。

石鹸末等の発泡剤、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、カラギーナン等のバインダー、さらに適当なる香
料成分、甘味剤、保存剤等の成分を水と混合し、常法に
従って製造する。又、マウスウォッシュ等の口腔洗浄剤
その他においても、製品の性状に応じた慣用の成分が適
宜配合される。

尚、本発明においては、歯牙着色除去剤、口臭予防剤、
フッ素等の虫歯予防剤、抗酵素予防剤等の種々の薬効成
分を配合することも可能である。

よって、本発明の門蝕予防剤は、前記免疫卵より調製し
た卵黄抗体を用いることにより、ストレプトコッカス・
ミュータンスによるプラークの形成を効果的に抑制し、
鎖線の発生を良好に防止する。しかも、前記卵黄抗体は
安全性が高いため、本発明の鎖線予防剤は使用上の安全
性が高いものである。

（実施例）以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。

尚、以下における％表示は、特に、指定されていない場
合には、重量／容量％を示す。

実施例１（ａ）抗原の調製Ｓ　、ｍｕｔａｎｓ　　Ｉ　ｎｇｂｒｉｔｔ株（血清型
Ｃ５大阪大学歯学部から入手）を４．８１のＢＨＩ培地
で３７℃。

１８時間静置培養した。培養液を遠心分離により菌体と
培養上清とに分離した。集めた菌体をリン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ）で２度洗浄した０次に洗浄菌体に対して０．３％
ホルマリン溶液５０ｍＪ！を加え、３７℃で一晩インキ
ユベートした。この段階で６Ｘ　１０　”　ｃｅｌｌｓ
／　ｍ　ｊ！の濃度となった。

このホルマリン処理菌体は死菌であることを無菌テスト
によって確認した。

（ロ）抗原の鶏への免疫（ａ）で得たホルマリン処理Ｓ　、ｍ１ａｎｓ　　Ｔ　
ｎｇｂｒｉｔｔ株（血清型ｃ）３×１□＋ｓ個をリン酸
緩衝液０．５ｍｌに懸濁させたものとＦＣＡ（フロイン
ト完全アジェバント）０．５ｍｊ！をｌ：１混合してＷ
２Ｏ型のエマルジョンとした。

得られたエマルジョンを鶏の胸筋に０．５　ｍ　ｉ！ず
つ注射し、初回免疫を行った後、下記の方法に従って、
採取した卵から得たＷＳＦ（後述）の凝集抗体価を測定
し、その推移を観察した。

次に、第１図に示すように初回免疫後８週後に卵黄中の
抗体価が下がり始めたのを確認して、前回と同様にして
２次免疫を行った。

２次免疫終了後、約１カ月経過した後から鶏が産生ずる
卵を集卵した。

（Ｃ）抗体の調製卵黄を卵より分離し、１３ｍｊ！の卵黄を取り、これと
等量のＰＢＳ　（リン酸緩衝液、ｐＨ７，４）を混合し
、更に等量（３６ｍｊりのクロロホルムを加え、よく撹
拌した後、３０分室温に放置した。

その後、３．００Ｏｒｐｍにて２０分間遠心した。

遠心後の最上層の透明な百分１３ｍ／！を目的の抗体を
含む両分として得た（以下Ｗ　Ｓ　Ｆ　：　ｗａｔｅｒ
ｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｒａｃｔｏｎと略記する）。

この画分を常法の免疫電気泳動分析した所、ＩｇＧを確
認した。なお、このＷＳＦ中の総蛋白量をビューレット
法により測定したところ約２６ｍｇであった（約２．０
　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　Ｘ　１３　ｍ　ｌ　）。

（ロ）抗体価の測定方法（Ｃ）で得られた抗体含有画分ＷＳＦについてＳ　、５
ｕｔａｎｓ凝集テストを行った。

まず、（ａ）で得たホルマリン処理Ｓ　、ｍｕｔａｎｓ
ＩｎｇｂｒｉｔＬ株菌体をマクファーランド指数５（Ｏ
ＤＳ、。ζ２．０）となるように調製し、試験　管に１
ｍｆｆ１となるように分注した。

ここで、（Ｃ）で得られたＷＳＦのＰＢＳによる２段階
希釈液の１ｍｊ！を各試験管に加え、３７℃で一晩反応
させた。

反応終了後、菌体の凝集の有無を目視にて判断した。

凝集抗体価はエンドポイントタイター法により求め、凝
集が確認される最終希釈倍率とした。

（ｅ）　Ｓ　、ｍｕｔａｎｓの平滑面への付着抑制テス
トＳ　、ｓ＋ｕｔａｎｓの歯面への付着のモデル実験と
して、ガラス面への付着実験を行った。

即ち、（Ｃ）で得た抗体を加えることで、Ｓ　、ｅ＋ｕ
ｔａｎｓＩｎｇｂｒｉｔｔ株のガラス面への付着がどの
程度阻害されるかを評価するものであり、その詳細を以
下に述べる。

まず、（Ｃ）で得た５１２の凝集抗体価を有するＷＳＦ
及びその１０倍希釈液を試験溶液とした。

これとは別に、免疫をしていない鶏（（ｂ）と同様の鶏
）の卵から（Ｃ）と同様にしてＷＳＦを調製し試験溶液
とした。尚、該ＷＳＦがＳ　、ｔｓｕｔａｎｓＩｎｇｂ
ｒｉｔｔ株に対して特異的に反応しないことを確認した
。

次に、これらの各試験溶液を１３ｍｍφ×１００ｍｍ試
験管に１ｍ１分注した後、更に、１、５％スクロースを
含む１．５倍濃度のＢＨＩ培地２ｍｊ！をそれぞれの試
験管に加えた。

更に、各試験管にＢＨＩ培地で前培養したＳ、ｍｕｔａ
ｎｓ　Ｉｎｇｂｒｉｔｔ株の懸濁液０．１　ｍ　Ｉｔを
加えて、３０”に傾斜させた状態で、３７℃の温度下で
１８時間静置培養した。

表１に各試験管内に調製した調製物の組成を示す。

静置培養終了後、各試験管を以下の操作に従って処理し
、菌体の試験管壁への付着率を求めた。

静置培養終了後の試験管（この試験管を第１の試験管と
する〕を静かに回転させ、試験管壁に付着していない菌
体を含んだ溶液の全量を第２の試験管に移した０次に、
菌体が付着している第１の試験管に５０ｍＭＩＪン酸緩
衝液（ｐ　Ｈ６，８）の３ｍ２を加え、これを再び回転
させ、解離した菌体を含む緩衝液の全量を第３の試験管
に移した後、この第１の試験管に、５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐ　Ｈ６，８）の３ｍｌを加えた。

更に、第１〜第３の試験管を超音波処理し、各試験管内
に均一な菌体浮遊液を調製し、各浮遊液の吸光度（ＯＤ
　ｓｓｓ　）を測定し、以下の式に従って付着率を求め
た。

得られた結果を表１に示す。

表　　１実施例２Ｓ、ｍｕｔａｎｓ　６７１５株（血清型ｇ、大阪大学歯
学部から入手）を実施例１の（ａ）と同様に培養し、同
様の方法にて、６　Ｘ　１０　”　ｃｅｌｌｓ／　ｍ　
ｌ！の濃度の菌体を得た。これを用いて実施例１の（ハ
）、　（Ｃ）と同様にして抗体の調製を行ったところ、
同様にＳ、５ｕｔａｎｓ　６７１５株（血清型ｇ）全菌
体と特異的に反応する抗体が得られた。凝集抗体価は５
１２であった。

更に、得られた抗体の菌体付着阻害効果を実施例１の（
ｅ）と同様の方法で試験した結果、同様に優れた効果が
認められた。

次に本発明の鎖線予防剤の実施例を記載する。

（実施例３）　練り歯磨きピロリン酸カルシウム　　　　４２％グリセリン　　　　　　　　　１５％ソルビット７０％　　　　　　　１０％カルボキシメチ
ルセルロース　１２％サッカリンナトリウム　　　　０．１％ラウリル硫酸ナ
トリウム　　　２０％香　　料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．
０　％水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　残
　　量１００　％以上の成分に実施例１〜３の各種抗体含有画分０．５％
（凝集抗体価５１２のもの）を配合する。

（実施例４）　マウシェウォッシュエタノール　　　　　　　　２２．５％サッカリンナト
リウム　　　０．０５％ラウリルジェタノールアミド　
０．３％香　　料　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１．０　％水　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　残　　量１００％以上の成分に実施例１〜２の各種抗体含有画分０．５％
（凝集抗体価５１２のもの）を配合する。

（発明の効果）本発明により、Ｓ、■ｕｔａｎｓの歯面への付着に対す
る十分な阻害効果を有し、量産性にも優れ、生産コスト
が低く、安全性にも優れ、う蝕子防剤の有効成分として
有用な抗体及び該抗体を含むう蝕子防剤が提供された。

特に、本発明のＳ　、ＩＩｕｔａｎｓに対する免疫活性
を有する抗体は、従来の哺乳動物を免疫して得る抗体と
比較して以下のような利点を有する。

（１）本発明の抗体は、免疫した鶏の卵中に得られ、採
卵、卵の取り扱いおよび卵からの抗体の取得に特別な、
あるいは熟練した技術を必要としない。

しかも、卵黄には免疫グロブリンのうちＩｇＧクラスし
か移行しないので、ＩｇＧのみを容易に得ることができ
る。

これに対して、免疫した哺乳動物から採血により抗体を
得る場合には、採血に熟練した技術が必要とされ、しか
も血清から大量のＩｇＧを分離・精製することは非常に
困難である。

（２）本発明の抗体の調製に用いられる鶏は、管理が容
易であり、例えばラット等と比較してもその管理費用が
安い。

しかも、哺乳動物から継続的に多量の血液や乳を得るこ
とは困難であり、哺乳動物を用いる方法は抗体の量産に
は適さないが、鶏は長期間にわたって安定して卵を生み
続けるので、本発明の抗体は量産可能であり、かつ生産
コストが低い。

（３）免疫した哺乳動物の血液や乳から調製した抗体の
安定性は必ずしも良好でなく、血清中で、あるいは精製
した状態でも一８０℃程度の温度条件下′での保存が必
要とされる。

本発明の抗体は、良好な安定性を有し、また保存性も良
く、例えば卵の状態で４°Ｃで１〜２箇月間保存できる
。

最後に、鶏を用いた抗体を調製する場合、必ずしも免疫
した抗原に特異的に反応する抗体が十分型骨られるとは
限らない０例えば、ウィルス抗原を免疫しても、十分な
抗体価が得られなかった。

従って、Ｓ　、ｗｕｔａｎｓ菌体で鶏を免疫しても、実
用的レベルの抗体価を有する抗体が得られるかどうかは
全（予想されないものであり、本発明者らによって始め
て達成されたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１．２において、免疫した鶏の抗体価
の推移を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）齲蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、ｄ、ｅ、
ｆ又はｇであるストレプトコッカス・ミュータンスを免
疫した鶏が産生する卵より調製された免疫グロブリンで
あって、その齲蝕誘発の病原菌に対して免疫活性を有す
る抗体。
（２）齲蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、ｄ、ｅ、
ｆ又はｇであるストレプトコッカス・ミュータンスを免
疫した鶏が産生する卵より調製された免疫グロブリンで
あって、その齲蝕誘発の病原菌に対して免疫活性を有す
る抗体を有効成分とする齲蝕予防剤。