JPH03115213A - う蝕予防剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、う蝕・を誘発する病原菌であるストレプトコ
ッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃ見Ｌｗ
ｕｔａｎｓ以下Ｓ　、ｍｕｔａｎｓと略記する）に対し
て免疫活性を有する抗体と、フッ素化合物、クロルヘキ
シジン類、バタテリオシン、グルコシルトランスフェラ
ーゼインヒビター、プロテアーゼ、溶菌酵素及びトロポ
ロン類から選ばれる１種以上とを組み合せて含有するこ
とを特徴とするう蝕予防剤組成物に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題］う蝕の
発生において、Ｓ、１Ｉｕｔａｎｓの歯面への付着過程
が重要な役割を果たしていることが既に知られており、
Ｓ　、＋ｍｕｔａｎｓの口腔内への定着（特に歯面への
付着）を制御して、う蝕を予防しようとする種々の試み
がなされている。

例えば−β−１ロｔａｎｓに対する免疫活性を有する抗
体を用いたう蝕予防方法が知られており、英国特許第１
５０５５１３号明細書には、Ｓ、ｍｕｔａｎｓの菌体で
免疫した牛から得られた母乳を１０口ｔａｎｓの口腔内
への定着の制御に用いる方法が、また特開昭６０−３８
３２７号公報には、盈、■ｕｔａｎｓの培養から得た細
胞壁等の両分を哺乳動物に免疫することによって得られ
た抗血清及び／または乳と、グルコシルトランスフェラ
ーゼインヒビター　プロテアーゼ及びデキストラナーゼ
からなる群より選ばれる１種以上のシネルギストとを組
み合せたう蝕子防剤が記載されている。

しかし、従来の一β−，ｍｕＬａｎｓに対する免疫活性
を有する抗体のう蝕予防効果は必ずしも十分ではなく、
また、従来の抗体は、免疫しだ哺乳動物の乳やその抗血
清から調製されるので量産性にかけ、生産コストも高い
などの欠点を有し２、実用的でない場合が多い。

特開平１−１９０６３５号公報には、従来技術における
問題を解決すべく種々の検討を行ない、鶏を用いた抗体
の調製法に、後述の理化学的特性を有するＳ　、ｍｕｔ
ａｎｓの菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼを抗
原として組合せて用いることによって、Ｓ　、５ｕｔａ
ｎｓが歯面へ付着することをある程度阻害する効果を有
し、上述したような欠点のない抗体を調製し得るとの知
見が提案されている。

しかしながら、その効果は必ずしも十分なものではなく
、更に効果を高めることが望まれた。

このため本発明者らは、鋭意研究した結果、前記抗体に
フン素化合物、クロルヘキシジンＷ４１　バクテリオシ
ン、グルコシルトランスフェラーゼインヒビター、プロ
テアーゼ、溶面酵素及びトロポロン類から選ばれる１種
以上を添加、併用することでストレプトコッカス・ミュ
ータンスの歯面付着に対する阻害効果が著しく高まり、
その結果、う蝕予防に有効であることを見出し、本発明
を完成するに至った。

（課題を解決するための手段〕 即ち、本発明は、う蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ
、ｅまたはｆであるΣ、ｍｕｔａｎｓの下記理化学的特
性を有する菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼを
免疫した鶏が産生ずる卵より調製された免疫グロブリン
であって、前記Ｓ　、ｍｕｔａｎｓに対して免疫活性を
有する抗体と、フン素化合物クロルヘキシジン類、バタ
テリオシン、グルコシルトランスフェラーゼインヒビタ
ー、プロテアーゼ、溶菌酵素及びトロポロン類から選ば
れる１種以上とを組み合せて含有することを特徴とする
う蝕予防剤組成物である。

（菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼの理化学的
特性） ■作用及び基質特異性； スクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成する
。

■至適ｐＨ。

ｐ　Ｈ；ｐＨ６．７〜７．０ ■作用適温の範囲； １５〜５０°Ｃ ■失活の条件 ８０″Ｃ１５分間の処理で失活する。

■分子量； ５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し
た分子量が、１５０に〜１６５にダルトンである。

■免疫原性： 動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体を
生成させ得る。

本発明の抗体（以後抗ＣＡ−ＧＴＦ−１抗体と称する）
を得るために用いるＣＡ−ＧＴＦ−１としては、上記特
性を有する酵素であればどのようなものでも利用でき、
例えば以下のようにして一ミー、口ｔａｎｓの菌体に結
合した状態で生産されたＣＡ−ＧＴＦ−１を菌体から分
離して得ることができる。

すなわち、血清型がｃ、ｅまたはｆ型であるＳ　、ｍｕ
ｔａｎｓを適当な培地で培養し、（）られた菌体を集菌
し、必要に応して洗浄する。

ここで用いるＣ型苗としては、Ｓ　、ｍｕｔａｎｓ　Ｍ
　Ｔ８１４８株、Ｉｎｇｂｒｉｔｔ株、１０４４９株等
の公知で、容易に入手可能な菌を用いることができ、例
えば、Ｓ、ｍｕｔａｎｓＭ　７８１４８株、ＩｎｇｂＢ
ｔＬ株は大阪大学歯学部から、１０４４９株はナショナ
ルコレクション　オブ　タイプ　カルチャーズ（Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ（ＮＣＴＣ））から入手できる。また
、ｅ型閉やｆ型閉についても公知の菌株を同様に入手し
て用いれば良い。

また、培地としては、少なくともグルコースを含む培地
が利用でき、例えばＴＴＹ培地（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ
、、Ｔｒｙｐｔｏｓｅ、　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ
の複合培地）　、Ｂ　ＨＩ　（Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ
　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地、ＦＭＣ培地などを用いるこ
とができる。

また、培養温度は、菌体増殖が得られ、かつＣＡ−ＧＴ
Ｆ−１の生産に適した範囲内であれば良いが、良好な菌
体増殖とＣＡ−ＧＴＦ−１の生産という点からは、通常
３７℃程度とすると良い。

また、培養時間は、培養温度、培地の種類等の培養条件
によって異なるが、ＣＡ−ＧＴＦ暑の最適収量に達する
時期を選択して決定すれば良く、通常１８〜２０時間程
度とすれば良い。

また、その他の培養条件についても、上記の観点から適
宜選択するれば良い。

次に、菌体からＣＡ−ＧＴＦ−１を抽出する。

菌体からのＣＡ−ＧＴＦ−１の抽出は、尿素溶液、グア
ニジン塩酸溶液などの抽出用溶液と菌体とを接触させる
方法などにより行なうことができる。

抽出用溶液中の懸濁菌体濃度、抽出用溶液の濃度、抽出
の温度および時間等の抽出条件は、目的とする酵素の十
分な抽出が可能であるように、用いる抽出用溶液の種類
等に応じて適宜選択して設定すれば良い。

なお、高比活性の抽出物を高回収率で得るという点から
は、好ましくは６〜１０Ｍ、より好ましくは８Ｍの尿素
溶液を用いた、好ましくは２０〜３０℃、より好ましく
は２５゛Ｃで、１５分〜２時間程度の処理を行なうと良
い。

抽出操作が終了したところで、抽出液から菌体等の固形
物を遠心分離法などの方法により除いた後、これを透析
、限外濾過、ゲル濾過等の手段で処理して尿素や低分子
量の不純物等を該抽出液から除去して、ＣＡ−ＧＴＦ−
１粗抽出標品を得ることができる。

更に、粗抽出標品を、！＃製してＣＡ−ＧＴＦ−１精製
標品を得ることができる。

この精製には、通常酵素の精製に用いられている各種の
精製方法を用いることができる。

本発明の抗ＣＡ−ＧＴＦ−１抗体は、上述０ＣＡ−ＧＴ
Ｆ−１で免疫した鶏の卵から調製することができる。

免疫される鶏としては、特に制限はないが、抗体の量産
性という点からは、白色レグホーン等の卵用種を用いる
と良い。

また、ＣＡ−にＴＦ−１による免疫方法としては、皮下
注射、腹腔内投与、筋肉注射等による通常の方法や、点
鼻、点眼等の方法によって行なうことができる。更に、
ＣＡ−ＧＴＦ−１の投与量は、所望の抗体価が得られ、
かつ鶏に対して悪影響を与えない量を適宜選択して用−
いれば良い。

通常、初回免疫から数週間で投与抗原に対して特異的に
反応する抗体が卵（卵黄）中に得られる。

なお、必要に応じて例えばＦＣ，Ａ（フロイント完全ア
ジュバント）、ＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント
）などのアジュバントをＣＡ−ＧＴＦ−１と併用しても
良い。

本発明に用いられるフッ素化合物としては、例えば、モ
ノフルオロリン酸ナトリウム、モノフルオロリン酸カリ
ウム等のモノフルオロリン酸塩、フッ化ナトリウム、フ
ン化カリウム、フッ化アンモニウム、フッカ第１ｍ、酸
化フッ化第１錫等のフッ化物等を挙げられる。

本発明に用いられるクロルヘキシジン類とじては、例え
ばクロルヘキシジン塩酸塩、クロルヘキシジングルコン
酸塩等が挙げられる。

本発明に用いられるバクテリオシンとしては例えばエン
テロバラター　クロアカニ、大腸菌、プロテウス　ミラ
ビリス、シュードモナス　アエルジノサ、ストレプトコ
ッカス　ミュータンス、スタフィロコッカス　スタフィ
ロコッカス等に由来するもの等が挙げられる。

本発明に用いられるグルコシルトランスフェラーゼイン
ヒビターとしては、例えば、α（１→６）グルカナーゼ
、α（１→３）グルカナーゼ等の酵素、マルトース、イ
ソマルトース、パラチノースパノース、イソマルトシル
フルクトシド、キシロシルフルクトシド、デキス［・ラ
ン等の糖類、ムクスティン。リボシドリン、ノジリマイ
シン、アヵルボース等の微生物産生物質が挙げられる。

本発明に用いられるプロテアーゼとしては、例えばアス
ペルギルス属、バシルス属に由来するもの等が挙げられ
る。

本発明に用いられる溶菌酵素としては、例えばストレプ
トマイセス　グリセウス、ストレプトマイセス　ディア
スタントクロモジエネス５　カラロブシス、フラボバク
テリウム、　Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ、　スタフィロコッ
カス　エピデミデス５マイクロコンカス、シュードモナ
ス　エルギノーザ　アエロモナス、ストレプトマイセス
　アルプス　ストレプトマイセス　グロビスポルス等に
由来するものが￥げられる。

本発明に用いられるトロポロン類としては例えばトロポ
ロン、ヒノキチオール、β−ドラプリン及びヒバ油等が
挙げられる。

尚、フッ素化合物、クロルヘキシジン類１バクテリオン
ン、グルコシルトランスフェラーゼインヒビター、プロ
テアーゼ及び）容菌酵素は、１種を単独で又は、２種以
上を併用し、上記抗体とともにう蝕予防剤組成物に配合
して用いることが出来る。

本発明に用いられる抗体の配合量は、投与状態に応じた
投与量に従って適宜選択すれば良く、例えば、１０’以
ｒの抗体価を有する抗体を０、　ＯＯＯ１−１０重量％
（以下ｗｔ％と略記する）配合することが出来る。

その他の成分の配合量は、それぞれ、フッ素化合物の場
合はフッ素換算で０．０００１　＝　０．１　ｗ　ｔ％
、クロルヘキシジン類は、クロルヘキシジンとしてＯ，
ＯＯＯＯ１〜０．１　ｗ　ｔ％、バクテリオシンは、Ｏ
，ＯＯ０１〜１０ｗｔ％、グルコシルトランスフェラー
ゼインヒビターは、０．０００１〜１０ｗｔ％、プロテ
アーゼは０．　ＯＯ０１〜ｌ　Ｏｗ　ｔ％。

溶菌酵素は、０．０００１〜１０　ｗ　ｔ％、トロポロ
ン類は、０．０００１〜１．　Ｏｗ　ｔ％の範囲内で適
用することが好ましい。

本発明のう蝕予防剤組成物には、本発明の目的を達成す
る範囲で、上記必須成分の他に使用目的、剤型に応じて
他の成分を用いることが出来る。

例えば、練歯磨では、ラウリル硫酸ナトリウムラウロイ
ルサルコシンナトリウム、ショ糖脂肪酸エステル、アル
キルヒドロキシエチルイミダゾリンナ）リウム、２−ウ
ンデシルー１−ハイドロキシエチルイミダシリンナトリ
ウム、石けん等の発泡剤、ソルビット液、ポリエチレン
グリコールグリセリプロピレングリコール等の湿潤剤、
ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシセルロースナト
リウム、カラギーナン、メチルセルロース　ヒドロキシ
エチルセルロース等の粘結剤、無水ケイ酸、炭酸カルシ
ウム、水酸化アルミニウム５　リン酸水素カルシウム、
ヒドロキンアパタイト　カオリン等の研磨剤、サッカリ
ン、Ｄ−ソルビトールグリチルリチン酸ジカリウム等の
甘味剤、１−メントール、オイゲノール、アネトール、
ペパーミント、スペアミント等の香料素材、バラヘン、
安息香酸ナトリウム、塩酸アルキルジアミノエチルグリ
シン等の保存剤１着色剤等の成分を水と混和し、常法に
従って製造する。

また、粉歯磨、液状歯磨、マウスウォッシュトローチ等
信の剤型のものも製品の性状に応して適宜他の成分を配
合することが出来る。

本発明のう蝕予防剤組成物は、練＃Ｊ磨、粉歯磨液状歯
磨等の歯磨類、マウスウォッシュ、歯肉マツサージクリ
ーム、うがい薬、トローチ、チュ−インガム、アイスク
リーム、口腔用パスタ、舌下錠、ホイップクリームなど
、口腔内に適用されるｆ！々の剤型のものに通用出来る
。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。

尚、本発明はこれによって限定されるものではない。

実施例の配合量（％）は、重量％を示す。

実施例１〜７．比較例１〜２ （ｉ）抗原の調製 Ｓ、ｍｕｔａｎｓ　　Ｉｎｇｂｒｔｔｔ株（血清型Ｃ１
大阪大学歯学部から入手）を１５１のＴＴＹ培地で３７
゛Ｃ２１８時間焙養し、得られた培養菌体を生理食塩水
で２度洗浄した。

次に、洗浄菌体を４００ｍｆの８Ｍ尿素溶液に懸濁した
菌体懸濁液を、２５゛Ｃで１時間撹拌処理した。その後
、この菌体懸濁液から遠心分離法により菌体を除去し、
得られた上清液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ；ｐＨ
６．０）に対して透析した。

透析終了後、上清液中に生じた沈澱物を遠心分離法によ
り除去した後、該上清液に対して６０％飽和の硫安沈澱
処理を行ない、得られた沈澱物を遠心分離法により回収
した０次にこの沈澱物を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ
；ｐＨ６．０）に溶解した溶液を同様の緩衝液に対して
透析し、更に該溶液中に住じた沈澱を遠心分離法により
除去して上清液を得た。この上清液を粗精製免疫抗原と
した。

（ｉｉ　）抗体の調製 前述のように得た粗精製免疫抗原標品０．５　ｍ　１（
ＣＢＩ３−Ｂ法で測定した場合の１ｍｇタンパク質量を
含む）とＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）　０．
５　ｍ　ｌをｔｉｔの割合で混合してＷ２Ｏ型のエマル
ジョンとした。

得られたエマルジョンを鶏の左右の胸筋に０１５ｍ１ず
つ注射し、初回免疫を行なった後、下記の方法に従って
、採取した卵から抗体含有画分（後述）を得た。

（卵からの抗体の取得方法） 卵から分離した卵黄とこれと同容量のＰＢＳ（リン酸緩
衝液、ｐ　Ｈ７，４）を混合し、得られた混合溶液に更
にＰＢＳの２倍容量に相当する量のクロロホルムを加え
てこれをよく撹拌した。

攪拌終了後、混合液を室温下で３０分間放置した後、こ
れを３．０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離にかけ、最
上層の透明画分を回収し、抗体含有画分（Ｗａｔｅｒ　
５ｏｌｕｂｌｅ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ、　Ｗ　Ｓ　Ｆ　）
とした。

（ｉｉｉ　）　Ｓ　、ｌ１ｕｔａｎｓの平滑面付着実験
Ｓ　、ｍｕｔａｎｓの歯面への付着のモデル実験として
、ガラス面への付着実験を行なった。

第１表上段の組成のものを、１３ｍｍφ×１００ｍｍの
試験管に１ｍｉ！、分注した後、更に１、５％スクロー
スを含む１．５倍濃度のＢＨＩ培地培地２含ｌれぞれの
試験管に加えた。

更に、各試験管にＢＨＩ培地で前培養したＳ、＋ｗｕｔ
ａｎｓ　　Ｉｎｇｂｒｉｔｔ株の懸濁液０．１　ｍ　ｌ
を加えて、３０°に傾斜させた状態で、３７°Ｃの温度
下で１８時間静置培養した。

静置培養終了後、各試験管を以下の操作に従って処理し
、菌体の試験管壁への付着率を求めた。

静置培養終了後の試験管（この試験管を第１の試験管と
する）を静かに回転させ、試験管壁に付着していない菌
体を含んだ溶液の全量を第２の試験管に移した。次に、
菌体が付着している第１の試験管に５０ｍＭリン酸緩衝
ｌ　（Ｐ　Ｈ；ｐＨ６．８）の３ｍｌを加え、これを再
び回転させ、解離した菌体含む緩衝液の全量を第３の試
験管に移した後、この第１の試験管に、５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ；ｐＨ６．８）の３ｍｊ２を加えた。

更に、第１〜第３の試験管を超音波処理し、各試験管内
に均一な菌体浮遊液を調製し、各浮遊液の吸光度（ＯＤ
ＳＳＯ）を測定し、以下の式に従って付着率を求めた。

第１表の結果より、抗体とフッ素化合物、クロルヘキシ
ジン類、バラテリオシン、グルコシルトランスフェラー
ゼインヒビター９プロテアーゼ及び溶菌酵素との組合せ
により、おのおの単独で用いた場合より著しく　、Ｓ　
、ｎ＋ｕｔａｎｓの平滑面付着を抑制することが判る。

実施例８　　練歯磨 （組成）　　　　　　　　　　　　（％）水酸化アルミ
ニウム　　　　　　　　　４２．０グリセリン　　　　
　　　　　　　　１Ｏ９０ソルビツト液　　　　　　　
　　　　　　１２．０カルボキシメチルセルロース　　
　　　　　１．５香料　　　　　　　　　　　　　　　
　　０．５ラウリル硫酸ナトリウム　　　　　　　　　
１．０フン化ナトリウム　　　　　　　　　　　　０．
１実施例１で用いた抗体（ＷＳＦ）　　　　　０．５上
記、組成のものを通常の製造法により製造して本発明の
練歯磨を得た。

実施例９　　口腔用パスタ （組成） ワセリン プロピレングリコール ステアリルアルコール ポリエチレングリコール１５００ 実施例１で用いた抗体（ＷＳＦ） クロルヘキシジングルコン酸塩 （％） １０．０ ７．０ １０．０ ３０．０ ０．１ ０．０１ 実施例１０　マウスウォッシュ （組成） エチルアルコール サッカリンナトリウム バシルス属由来プロテアーゼ 香料 グリセリン ポリオキシエチレン（６０）硬化 しマシ油 実施例１で用いた抗体（ＷＳＦ） （％） １０．０ ０．０３ ０．１ ０．５ ５．０ ０．５ ０、　１ 実施例１１　チューインガム （組成） ガムベース 炭酸カルシウム 香ネ４ パラチノース 実施例１で用いた抗体（ＷＳＦ） （％） ２５．０ ２．０ １．０ ８．０ ＋、　　０ ツルピントわ〕末 総量を１００ とする残量 実施例１２　アイスクリーム （組成） 砂糖 クリーム 卵黄 バニラエツセンス 実施例１で用いた抗体（ＷＳＦ） （％） ５．０ １５．０ １０．０ ０、Ｏ Ｏ，２ 牛乳 総量を１００ とする残量 実施例１ トローチ （組成） アラビアゴム ブドウ糖 ゼラチン 香料 ｐ−メントール 実施例１で用いた抗体（ＷＳＦ） フン化第１錫 クロルヘキシジングルコン酸塩 （％） ６．０ ７０．０ ２．５ ０、　１ ０．１ ０．２ ０゜　１ ０．０１ 水 実施例１４　練歯磨 （組成） リン酸水素カルシウム グリセリン ソルビトール液 カラギーナン 香料 ラウロイルサルコシンナトリウム 総量を１００ とする残量 （％） ０３０ １０．８ ８．０ １．１ ０．５ １．０ β−ドラプリン　　　　　　　　　　　　　０．１エデ
ト酸２ナトリウム　　　　　　　　　０．２実施例１で
用いた抗体（Ｗ　Ｓ　Ｆ　＞　　　　　　０．５水　　
　　　　　　　　　　　　　　総量を１００とする残量 比較例３　　練歯磨 抗体を用いない他は、実施例１４と同一の組成で通常の
製造法により製造した。

比較例４　　練歯磨 β−ドラプリンを用いない他は、実施例１４と同一の組
成で、通常の製造法により製造した。

実施例１と同様の方法にて、実施例Ｉ４と比較例３〜４
のＭＩ歯慶による、Σ、　＃ｌＬＩ　ｔａｎｓの平滑面
付着抑制効果を比較した。

その結果、実施例１４を用いたものは、付着率１６．３
％、比較例３を用いたものは、付着率６６．１％、比較
例４を用いたものは、付着率３５．２％であった。

この結果は、実施例１〜７及び比較例１〜２と同様のも
のであり、単純系のみでなく、製品レベルでも、抗体と
他の物質の組合せにより、おのおの単独の場合よりも優
れた効果を示すことがわかる。

〔発明の効果］ 本発明のう蝕予防剤組成物は、Σ、ＩＩｕｔａｎｓの口
腔内への定着（特に歯面への付着）を抑制し、う蝕を予
防する顕著な効果を有するう蝕子防剤である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 う蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、ｅまたはｆであ
   るストレプトコッカス・ミュータンスの下記理化学的特
   性を有する菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼを
   免疫した鶏が産生する卵より調製された免疫グロブリン
   であって、前記ストレプトコッカス・ミュータンスに対
   して免疫活性を有する抗体と、フッ素化合物、クロルヘ
   キシジン類、バクテリオシン、グルコシルトランスフェ
   ラーゼインヒビター、プロテアーゼ、溶菌酵素及びトロ
   ポロン類から選ばれる一種以上とを組み合せて含有する
   ことを特徴とするう蝕予防剤組成物。 （菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼの理化学的
   特性） （１）作用及び基質特異性； スクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成する
   。 （２）至適ｐＨ； ｐＨ６．７〜７．０ （３）作用適温の範囲； １５〜５０℃ （４）失活の条件 ８０℃、５分間の処理で失活する。 （５）分子量； ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 により測定した分子量が、１５０ｋ〜１６５にダルトン
   である。 （６）免疫原性； 動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体を
   生成させ得る。