DE69925187T2

DE69925187T2 - Antigenkonjugate von konservierten Lipooligosacchariden aus gram-negativen Bakterien

Info

Publication number: DE69925187T2
Application number: DE69925187T
Authority: DE
Inventors: Rasappa G. Arumugham; Maria Webster Fortuna-Nevin; Michael A. Solon Apicella; Bradford W. Berkeley Gibson
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date: 1998-03-10
Filing date: 1999-03-09
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2019-03-10
Also published as: AU2004200060A1; ATE295181T1; DK0941738T3; EP0941738A1; JPH11322793A; SI0941738T1; DE69925187D1; KR100628664B1; CA2264970A1; AU766184B2; KR19990077705A; BR9902008A; AU2004200060B2; ES2241240T3; EP0941738B1; PT941738E; AU1954099A

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft antigene Konjugate des konservierten Teils der Lipopolysaccharide von bestimmten Gram-negativen Bakterien und Impfstoffe, welche solche antigenen Konjugate enthalten. Die Konjugate lösen Antikörper aus, welche Kreuzreaktivität gegenüber heterologen Stämmen von Gram-negativen Bakterien aufweisen, und die Impfstoffe, welche solche Konjugate enthalten, induzieren Antikörper, welche funktionell und schützend gegenüber solchen Gram-negativen bakteriellen Organismen sind.
Hintergrund der Erfindung
Lipopolysaccharide (LPS) sind Hauptoberflächenantigene, welche sich reichlich auf der Oberfläche von Gram-negativen Bakterien befinden. LPS-Moleküle bestehen aus: (1) einem Lipid A Teil, welcher aus einem Glucosamin-Disaccharid besteht, substituiert mit Phosphaten, Phosphoethanolamingruppen und langkettigen Fettsäuren in Ester- und Amid-Bindungen; (2) einem inneren Kernteil (inner core), gebunden an den Lipid A Teil durch einen 8-Kohlenstoff Zucker, Keto-desoxy-octonat (KDO), welcher durch 1 bis 2 zusätzliche KDO-Moleküle und durch bis zu 3 Heptosekomponenten substituiert sein kann; (3) einem äußeren Kernteil (outer core), welcher Hexosen wie Glucose, Galactose, N-Acetylglucosamin und N-Acetylgalactosamin umfasst; und (4) eine O-spezifische Kette, welche sich wiederholende Oligo-Saccharideinheiten umfasst, welche zwischen bakteriellen Stämmen stark variieren. Polymerisation dieser sich wiederholenden Einheiten zu Strukturen über 60000 Dalton ist nicht ungewöhnlich. Die LPS-Moleküle können im strukturellen und antigenen Niveau zwischen bakteriellen Stämmen umfassend variieren, obwohl die Struktur des inneren Kerns größtenteils zwischen Bakterienarten konserviert ist. Eine typische Struktur des inneren Kerns von Lipid A von Salmonella typhimurium LPS wird in 1 veranschaulicht. Von der Immunantwort, welche für die Entwicklung von natürlich schützenden Antikörpern verantwortlich ist, wird angenommen, dass sie durch natürliche Immunisierung dieses Bereichs des LPS entsteht.
In nicht-enterischen Pathogenen fehlen der LPS-Struktur sich wiederholende O-Antigen-Einheiten. Darüber hinaus scheint die vollständige genetische Maschinerie zum Zusammenfügen der sich wiederholenden O-Antigen-Einheit in solchen Pathogenen abwesend zu sein. Dies hat zur Bezeichnung dieser LPS-Strukturen als Li pooligosaccharide (LOS) geführt. Es gibt Ähnlichkeiten zwischen LPS- und LOS-Strukturen in solchen Pathogenen. Zum Beispiel binden alle LPS- und LOS-Strukturen die Lipid A Regionen durch die KDO-Verbindung an die Kerne. Die Anzahl an KDO-Resten kann von einem (z.B. Haemophilus influenzae und Haemophilus ducreyi) bis zwei (z.B. Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae) variieren. Kürzliche Studien zeigen an, dass die verzweigten Oligosaccharide getrennt vom Kernbereich synthetisiert werden und dass das Zusammenfügen der gesamten LOS-Struktur an der Außenseite der zytoplasmischen Membran vervollständigt wird (siehe Preston et al., „The Lipooligosaccharides of Pathogenic Gram-Negative Bacteria", Critical Reviews in Microbiology, 22: 139–180 (1996)).
Entsprechend gibt es einen einzelnen Kernbereich in solchen LOS-Strukturen ohne einen ausgeprägten inneren und äußeren Kernbereich. Die Kernstruktur dieser Pathogene kann von Art zu Art variieren und kann KDO in vollständiger Abwesenheit von Heptose (z.B. Moraxella catarrhalis); KDO in Gegenwart einer Diheptose-Struktur (z.B. Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae); oder KDO in Gegenwart einer Triheptose-Struktur (z.B. Haemophilus influenzae und Haemophilus ducreyi) umfassen. Beispiele für Kernstrukturen von Haemophilus und Neisseria werden in 2 gezeigt. Die Oligosaccharid-Einheiten können sich von jeder der Heptosen erstrecken, und/oder sie können durch Phosphoethanolamingruppen substituiert sein. Typische Beispiele für vollständige LOS-Strukturen vom Haemophilus influenzae Stamm 2019 (siehe Phillips et al., „Structural Characterization of the Cell Surface Lipooligosaccharides from a Non-Typable Strain of Haemophilus Influenzae", Biochemistry, 31: 4515–4526 (1992)) und Neisseria gonorrhoeae Stamm 1291 (siehe John et al., „The Structural Bases for Pyocin Resistance in Neisseria gonorrhoeae lipooligosaccharides", J. Biol. Chem., 266: 1903–1911 (1991)) werden in 3 gezeigt.
Die Verwendung von LPS bei der Entwicklung von Impfstoffen ist nach Stand der Technik bekannt. Es ist längst erkannt worden, dass eine spezifische Antikörperantwort, welche gegen das LPS eines bestimmten bakteriellen Pathogens gerichtet ist, zum Schutz vor diesem spezifischen Stamm beitragen kann. Es ist ferner bekannt, dass Saccharid-Strukturen (z.B. die Saccharid-An teile von LPS) an ein Trägerprotein konjugiert werden können, so dass eine Impfstoffzusammensetzung, welche solch ein Konjugat enthält, die gewünschte T-abhängige Antwort auslösen wird. Ein Beispiel hierfür sind die erfolgreichen Glycokonjugat-Impfstoffe gegen Bakterien mit Typen-spezifischen Kapsel-Sacchariden, siehe Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M. F. und Newman, M. J., 673–694 (1995). Diese Kategorie der Immunantwort ist die Basis für die Wirksamkeit in menschlichen Kindern von einer neuen Generation der Saccharid-Protein-Konjugat Impfstoffe, wie in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M. F. und Newman, M. J., 695–718 (1995) diskutiert.
Da jedoch die LPS von heterologen Stämmen von solchen Pathogenen umfangreiche Variation des Saccharids im äußeren Kern und/oder der O-spezifischen Kette zeigen, sind Anstrengungen, eine Antikörperantwort auf eine Anzahl an heterologen Stämmen oder heterologen Genera von Bakterien unter Verwendung eines Impfstoffs zu erzeugen, welcher ein einzelnes LPS enthält, bis jetzt nicht erfolgreich gewesen.
In einer Anstrengung, einen LPS-basierten Impfstoff gegen Neisseria meningitidis zu entwickeln, ist Tetanustoxoid mit Oligosacchariden, isoliert aus den LPS einer Anzahl an Neisseria meningitidis Stämmen konjugiert worden (siehe Jennings et al., Infect. Immun., 43: 407–412 (1984)). Jedoch waren die durch dieses Konjugat ausgelösten Antikörper Oligosaccharid-spezifisch und wiesen einen hohen Grad serotypischer Spezifität auf.
Verheul et al., Infect. Immun., 61: 187–196 (1993), offenbaren die Konjugation von Oligosacchariden von Meningokokken-LPS an entweder Tetanustoxoid oder Protein der äußeren Membran von Meningokokken. In Mäusen induzierten die Tetanustoxoid-Konjugate Oligosaccharid-spezifische Antikörper, welche gegen Meningokokken nicht bakterizid waren. Die Protein der äußeren Membran-LPS Konjugate induzierten Antikörper gegen das Protein der äußeren Membran, aber nicht gegen LPS. Verheul et al., Infect. Immun., 59: 843–851 (1991) untersuchten auch die Immunogenität der Konjugate von Oligosacchariden von mehreren Neisseria meningitidis Stämmen und Tetanustoxoid in Kaninchen. Die Ergebnisse zeigten, dass die ausgelösten Antikörper nur gegen den Oligosaccharid-Teil der LPS gerichtet sind, welche die Immunotypen-spezifischen Epitope enthalten.
Die Herstellung von Oligosacchariden aus der LPS von Neisseria meningitidis, laboratorisch angepasstem Wild-Stamm A1 und die nachfolgende Konjugation davon an Tetanustoxoid als Trägerprotein wurde in Gu et al., Infect. Immun., 61: 1873–1880 (1993) offenbart. Die Konjugate waren in Mäusen und Kaninchen immunogen und die Mehrheit der Antikörper richtete sich gegen Immunotypen-spezifische LPS-Epitope. Auch zeigten die Konjugat-Antiseren weniger Kreuzreaktivität gegenüber unterschiedlichen Immunotypen von LPS als die LPS-Antiseren. Diese Studien zeigen, dass von LPS abgeleitete Oligosaccharid-Konjugate Antikörper gegen den spezifischen Oligosaccharid-Immunotyp induzieren. Jedoch gab es keinen Nachweis, dass das Konjugat signifikant kreuzreaktive Antikörper gegen eine gewöhnliche Kern-Saccharidstruktur induzierte, welche in der Mehrzahl von Neisseria meningitidis Stämmen vorhanden ist.
Verhaul et al., Microbiological Reviews, 57(1): 34–39 (1993) sieht eine Übersicht der LPS-Oberflächenkomponente von N. meningitidis vor.
Baker et al., Infection and Immunity, 2257–2269, Juni 1994, untersuchen die molekularen Strukturen, die die immun-modulatorischen Eigenschaften des Lipid A und der Oligosaccharide des inneren Kernbereichs von bakteriellen Lipopolysacchariden beeinflussen. Als minimale Struktur, von der gesagt wird, dass sie für die Expression der hinzugefügten beobachteten Immunsuppression erforderlich ist, gilt ein Hexasaccharid, welches einen 2-Keto-3-desoxy-octanatrest, zwei Glucosereste und drei Heptosereste enthält, an welche zwei Pyrophosphorylethanolamingruppen gebunden sind.
Bhattacharjee et al., J. Infect. Dis., 173: 1157–1163 (1996) offenbarten das Gemisch des LPS von Escherichia coli mit dem Protein der äußeren Membran von Neisseria meningitidis Gruppe B, was die Bildung von nicht konjugierten, nicht kovalenten Komplexen davon ergab. Es wurde gefunden, dass diese Komplexe Antikörper auslösten, welche mit einer Anzahl an Gram-negativen Bakterien kreuzreagierten. Jedoch wurde kein Nachweis vorgesehen anzuzeigen, dass diese Komplexe Eigenschaften hatten, welche sich von anderen Präparaten aus nicht-konjugierten Saccharid-Strukturen unterschieden, von welchen bekannt ist, dass sie nicht in der Lage sind, eine T-abhängige Antikörperantwort auszulösen, welche nach Verabreichung von nachfolgenden Dosen verstärkt werden kann. Darüber hinaus ist bekannt, dass solche nicht-konjugierten Saccharide keine angemessene Immunantwort in Kindern auslösen.
Gu et al., Infect. Immun., 64: 4047–4053 (1996) offenbaren die Herstellung von Konjugaten von Oligosacchariden aus nicht-typisierbarer Haemophilus influenzae und Tetanustoxoid. Jedoch zeigten die in Kaninchen induzierten Antiseren nur bakterizide Wirksamkeit gegen homologe Stämme.
Entsprechend bleibt ein Bedarf an antigenen Konjugaten und Impfstoffen, welche solche Konjugate enthalten, welche wirksam eine immunogene Antwort, vorzugsweise eine T-abhängige Antwort, auf eine gegebene Art von Gram-negativen Bakterien induzieren, als auch welche wirksame Kreuzreaktivität gegenüber heterologen Stämmen oder Serotypen von Gram-negativen Bakterien innerhalb einer gegebenen Art aufweisen. Darüber hinaus wäre es für solche Konjugate und Impfstoffe vorteilhaft, Antikörper auszulösen, welche Kreuzreaktivität gegenüber heterologen Arten von Gram-negativen Bakterien aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf antigene Konjugate, welche ein Trägerprotein, kovalent gebunden an den konservierten LOS-Teil eines nicht-enterischen pathogenen Gram-negativen Bakteriums umfassen, wobei der konservierte Teil des LOS GlcNAc-Hept₂phosphoethanolamin-KDO₂-Lipid A umfasst. Das Konjugat löst eine kreuzreaktive Immunantwort auf heterologe Stämme von Gram-negativen Bakterien und vorzugsweise auf heterologe Genera von Gram-negativen Bakterien aus.
Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf Impfstoffe, welche diese antigenen Konjugate umfassen, und Verfahren zum Immunisieren von Individuen mit solchen Impfstoffen, um verschiedene Krankheiten zu verhindern, welche durch Gram-negative Bakterien verursacht werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A zeigt die typische Struktur des Lipid A inneren Kerns von Salmonella typhimurium.
1B zeigt die typischen Strukturen des O-Antigens oder sich wiederholenden Polysaccharids von Salmonella typhimurium.
1C zeigt eine Struktur für das Heptaacyl Lipid A von Salmonella typhimurium.
2A zeigt die Kern LOS-Struktur von Haemophilus Arten.
2B zeigt die Kern LOS-Struktur von Neisseria Arten.
3A zeigt die LOS-Struktur von Haemophilus influenzae Stamm 2019.
3B zeigt die LOS-Struktur von Neisseria gonorrhoeae Stamm 1291.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf antigene Konjugate aus einem Trägerprotein und dem konservierten LOS von nicht-enterischen pathogenen Gram-negativen Bakterien, wobei besagter konservierter Teil des LOS GlcNAc-Hep₂phosphoethanolamin-KDO₂-Lipid A umfasst, besagtes Konjugat eine kreuzreaktive Immunantwort gegenüber heterologen Stämmen von besagten Gram-negativen Bakterien auslöst und Impfstoffe, welche solche Konjugate enthalten. Die vorliegenden Konjugate nutzen das LOS von verschiedenen Gram-negativen Bakterien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, nicht-typisierbarer Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Chlamydia, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Klebsiella und Vibrio cholerae.
Die vorliegenden Konjugate und die Impfstoffe, welche diese Konjugate enthalten, erzeugen eine funktionelle polyklonale Antikörperantwort auf den konservierten LOS-Teil, welcher in den Konjugaten enthalten ist. Somit sind die Impfstoffe in der Lage, auf eine große Anzahl an heterologen Stämmen von Pathogenen zu reagieren und induzieren dadurch eine kreuzreaktive und kreuzfunktionale Antikörperantwort auf unterschiedliche Stämme von Gram-negativen Bakterien. Diese kreuzreaktive Antwort wird sowohl gegenüber heterologen Stämmen innerhalb einer bestimmten Art gezeigt, als auch gegenüber heterologen Genera von Gram-negativen Bakterien.
Die vorliegende Erfindung richtet sich somit auf antigene Konjugate, welche eine Antikörperantwort auf die üblichen konservierten Teile des LOS eines Gram-negativen Bakteriums erzeugen, also Teile des LOS, welche für eine Anzahl an Gram-negativen Bakterien üblich sind.
Wie oben angemerkt, umfassen die LPS von Gram-negativen Bak terien den inneren Kernteil, den Lipid A Teil, den äußeren Kernteil und das O-spezifische Antigen. Um eine Antwort auf heterologe Stämme oder Genera von Bakterien auszulösen, muss die Struktur der Teile des inneren Kerns und Lipid A konserviert und genutzt werden.
Der Begriff „konservierter Teil" von LOS, wie hierin verwendet, ist so gemeint, dass er mindestens das Glucosamin-Disaccharid, substituiert mit Phosphaten, Phosphoethanolamingruppen und langkettigen Fettsäuren in Ester- und Amidverbindungen (also den Lipid A Teil); und die KDO-Funktion des inneren Kerns und die Heptose-Substituenten, falls vorhanden, einschließt. Die Phosphate, Phosphoethanolamin und Pyrophosphoethanolamingruppen, welche im inneren Kern enthalten sein können, können auch im „konservierten Teil" eingeschlossen sein, obwohl sie nicht notwendig sein mögen. Der Teil des Pathogens, welcher im „konservierten Teil" enthalten ist, ist zwischen bakteriellen Stämmen hochgradig konserviert, und somit können weit reichende kreuzreaktive Antikörper aus diesen Strukturen hervorgehen (siehe z.B. Apicella et al., „The Normal Human Serum Bactericidal Antibody Response to the Lipooligosaccharide of Neisseria gonorrhoeae", J. Infect. Dis., 153: 520–528 (1986).
Es ist ferner innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, dass Oligosaccharide von LOS-tragenden Stämmen als Teil des „konservierten Teils" wie hierin definiert konserviert werden können. Dies ist in vielen Fällen jedoch nicht erforderlich oder gar wünschenswert.
Es ist durch die vorliegenden Erfinder gefunden worden, dass die Erzeugung eines Konjugats, welches solch einen konservierten Teil der LOS-Struktur nutzt, eine verstärkbare, T-Zellen abhängige IgG-Antwort im behandelten Individuum auslöst, und dass die sich ergebenden Antikörper auf die Oberfläche von heterologen Stämmen innerhalb einer bestimmten bakteriellen Art, als auch auf heterologe Genera von Gram-negativen Bakterien kreuzreagieren. Darüber hinaus ist von den durch die vorliegenden Konjugate ausgelösten Oberflächen-reaktiven Antikörpern gefunden worden, dass sie sowohl bakterizid (also eine funktionelle Eigenschaft in Verbindung mit Immunschutz zeigen), als auch schützend sind.
Die konservierten Teile des LOS, welche in den vorliegenden Konjugaten genutzt werden, können durch eine Anzahl an Techniken hergestellt werden, die den Fachleuten bekannt sind. Zum Beispiel kann die konservierte Struktur hergestellt werden durch: (1) die chemische Synthese des Ganzen oder eines Teils der konservierten Kernstruktur, (2) die Selektion von Wild-Typ Stämmen, die LOS herstellen werden, welches überwiegend die konservierte Struktur enthält, (3) die enzymatische Spaltung von nichtreduzierenden Zuckerresten von LOS, synthetisiert durch Wild-Typ Stämme und (4) die Synthese der konservierten Struktur des LOS von einem gegebenen bakteriellen Organismus durch verschiedene Mutanten und Abkömmlinge, abgeleitet von diesen Mutanten, wie in PCT-Anmeldung Veröffentlichungsnummer WO97/19688 beschrieben (z.B. die Herstellung des konservierten Kernteils von Neisseria meningitidis LOS durch Mutantenstämme, welche in der Biosynthese von LOS unzulänglich sind; die Herstellung von Neisseria gonorrhoeae LOS Mutanten durch die Aussetzung von Wild-Typ Stämmen unter Pyocin und die von diesen Mutanten abgeleiteten Abkömmlinge; die Erzeugung von Transposan-induzierten Mutationen von spezifischen Enzymen, welche in der Biosynthese von LOS einbezogen sind; und die Stellen-gerichteten Mutationen von spezifischen Enzymen, welche in LOS-Biosynthese einbezogen sind, und die von jenen Mutantenstämmen abgeleiteten Abkömmlinge).
Das bevorzugte Mittel zum Herstellen der konservierten Teile des LOS zur Verwendung in den vorliegenden Konjugaten ist durch die Synthese des LOS konservierten Teils durch bakterielle Mutantenstämme und ihre Abkömmlinge (Weg 4 oben). Bevorzugter werden die folgenden Mutantenstämme genutzt, um den LOS konservierten Teil zu synthetisieren: Organismen, die nur die konservierten Kern-Saccharide des LOS exprimieren, wie die R_a Kern-Organismen, die keine Glucose zum Kernteil des LOS hinzufügen; Organismen, die keine Galactose zum Kernteil des LOS hinzufügen, wie der Stamm 281.25 Mutant von Haemophilus influenzae Typ b, wie in Biochemistry, 35: 5837–5947 (1996) beschrieben; Organismen, die keine Glucose zum Kernteil des LOS hinzufügen aufgrund von Mutationen im Phosphoglucomutase (PGM) Gen, wie der NMB R6 Stamm von Neisseria meningitidis und 1291-R6 Stamm von Neisseria gonorrhoeae, beschrieben in J. Biol. Chem., 269: 11162–11169 (1994); Organismen, die keine Galactose zum Kernteil des LOS aufgrund von Mutationen im Galactose-Epimerase (GalE) Gen hinzufügen, wie der Mutantenstamm SS3 von Neisseria meningitidis, beschrieben in Infect. Immun., 63: 2508–2515 (1995); und Organismen, die keine Glucose oder Galactose zum Kernteil des LOS aufgrund von Mutationen in den entsprechenden Transferaseenzymen hinzufügen, wie Mutationen im entsprechenden Transferaseenzym, wie Mutationen in den Glucosyl oder Galactosyl Transferasegenen, beschrieben in J. Exp. Med., 180: 2181–2190 (1994).
Studien durch Lee et al., Infect. Immun., 63: 2508–2515 (1995) haben gezeigt, dass eine Mutation in Galactose-Epimerase die Expression von LPS ergibt, welche nach dem äußeren Kern oder verzweigten Bereichen, welche Glucose enthalten, gestutzt ist. Ein Screening von Tn916-erzeugten Mutanten der Gruppe B Neisseria meningitidis zeigte, dass ein stabiler LOS Mutantenstamm (mit der Bezeichnung NMB-R6 Stamm) ein Tief-Kern LOS mit der Struktur: GlcNAc-Hep₂(PEA)-KDO₂-Lipid A exprimierte. Zusätzliche Studien haben gezeigt, dass Transposon in das putative Phospho-Glucomutase-Gen insertiert wird (siehe J. Biol. Chem., 269: 11162–11169 (1994)). Die zellfreien Extrakte des Mutantenstamms zeigten keine Phosphoglucomutase-Wirksamkeit. Ähnlich eliminiert eine weitere Transposon-induzierte Mutation UDP-Glucose-4 Epimerase-Wirksamkeit.
LOS wird durch die anfängliche Synthese des Lipid A Teils, gefolgt von der aufeinander folgenden Addition der Zuckerreste des inneren Kerns und dann des äußeren Kerns biosynthetisiert. Es ist bekannt, dass die Zugabe von Hexose-Einheiten wie Glucose und Galactose zum Kern (z.B. GlcNAc-Hep₂(PEA)-KDO₂-Lipid A von Neisseria meningitidis) durch eine Folge von Enzymen katalysiert wird, welche in der Biosynthese einbezogen sind. Zum Beispiel wird Glucose durch Glucokinase in Glucose-6-phosphat umgewandelt. Ein Enzym, Phospho-glucomutase, wandelt Glucose-6-phosphat in Glucose-1-phosphat um, welches dann durch UTP-Glucose-1-phosphat-uridyl-transferase in UDP-Glucose umgewandelt wird. UDP-Glucose wird durch UDP-Glucose-4-Epimerase ebenfalls in UDP-Galactose umgewandelt. Hexose-Einheiten von diesen UDP-Zwischenverbindungen werden dann auf den Kern des LOS übertragen, katalysiert durch die Transferasen. Der Verlust dieser Transferwirksamkeiten oder der Enzyme, welche für die Erzeugung von UDP-Glucose und UDP-Galactose verantwortlich sind, ergibt die Herstellung von LOS-Strukturen, welche nur den inneren Kern enthalten. Der Weg, welcher zum Herstellen des Kern-LOS notwendig ist, würde durch den Verlust von Phospho-glucomutase, UTP-Glucose-1-phosphat-uridyl-transferase, UDP-Glucose-4-epimerase oder den UDP-Glucose oder UDP-Galactose-transferasen nicht beeinflusst. Daher wird jeder Defekt in diesen Enzymen die Kettentermination von LOS ergeben.
Obwohl das LOS eines gegebenen Gram-negativen Bakteriums in jeder Form genutzt werden kann, um die vorliegenden Konjugate herzustellen, wird es bevorzugt, dass die konservierten LOS-Teile der vorliegenden Erfindung vor der Konjugation de-O-acyliert werden. Die LOS-Struktur kann vorteilhafter Weise durch die mild-alkalische Hydrolyse davon mit Natriumhydroxid de-O-acyliert werden, wie in z.B. J. Biol. Chem., 250: 1926–1932 (1975) und J. Biol. Chem., 256: 7305–7310 (1981) beschrieben, oder durch milde Hydrazin-Behandlung, wie in z.B. Eur. J. Biochem., 177: 483–492 (1988) beschrieben. Es ist gefunden worden, dass die De-O-acylierung des LOS seine Immunogenität verbessert und seine Toxizität verringert. Alternativ kann der nicht-toxische LOS-Teil aus nicht-toxischen Mutanten von pathogenen Gram-negativen Bakterien z.B. auf die in WO/97/19688 beschriebene Weise isoliert werden.
Beim Herstellen der antigenen Konjugate der vorliegenden Erfindung wird der konservierte LOS-Teil durch eine passende Linker-Verbindung an ein Trägerprotein gebunden. Die Verwendung solcher Linker-Verbindungen ist nach Stand der Technik bekannt und wird z.B. in Conjugate Vaccines, Cruise et al., 48–114, Karger Publishing (1989) diskutiert.
Zum Beispiel können reaktive Gruppen am Lipid A oder Teilen des inneren Kerns der konservierten LOS-Struktur an bekannte heterobifunktionale und homobifunktionale Verbindungsmittel gebunden werden. Die heterobifunktionalen Verbindungsmittel enthalten heterologe reaktive Enden und erzeugen Zwischenverbindungen mit dem konservierten LOS. Die Zwischenverbindungen werden an einem Ende an das LOS gebunden, während das gegenüber liegende Ende eine reaktive Gruppe enthält. Homobifunktionale Verbindungsmittel enthalten auch zwei reaktive Gruppen, jedoch sind sie identisch. Im Allgemeinen binden die Verbindungsmittel den konservierten LOS-Teil an das Trägerprotein durch Amino-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppen. Die Amino- und Hydroxylgruppenverbindungen werden mit den Sacchariden des Lipid A oder inneren Kerns des konservierten LOS gebildet. Die Carboxylgruppen-Verbindungen werden mit dem KDO des inneren Kerns gebildet. Das gegenüber liegende Ende des Verbindungsmittels enthält vorzugsweise eine Sulfhydrylgruppe für weitere Umsetzung mit dem Trägerprotein.
Geeignete Verbindungsmittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen z.B. Sulfosuccinimidyl-6-(3-[2-pyridyldithio]-propionamido)-hexanoat (Sulfo-LC-SPDP); Succinimidyl-6-(3-[2-pyridyldithio]-propionamido)-hexanoat (LC-SPDP); Traut-Reagens (2-Iminothiolan); N-Succinimidyl-S-acetyl-thioacetat (SATA); N-Succinimidyl-3-(2-pyridyl-dithio)propionat (SPDP), Succinimidylacetyl-thiopropionat (SATP), Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester (MBS), N-Succinimidyl-(4-iodacetyl)aminobenzoat (SIAB), Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (SMPB), Bromessigsäure-N-hydroxy-succinimid(BANS)ester, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC), Adipinsäuredihydrazid (ADH), Cystamin und Dithiobis(succinimidylpropionat) (DTSSP) ein.
Der konservierte Teil des LOS darf sich mit dem Verbindungsmittel in einer Nicht-Amino enthaltenden Pufferlösung (wie Phosphat gepufferter Kochsalzlösung oder Natriumbicarbonat) bei einem neutralen bis leicht alkalischen pH für einen geeigneten Zeitraum (z.B. annähernd eine Stunde bei Raumtemperatur) umsetzen. Die Zwischenverbindung wird dann von dem nicht umgesetzten Reagens durch jedes geeignete Mittel (z.B. Gel-Filtration) entfernt. Das Trägerprotein wird dann durch Umsetzung mit einer geeigneten Verbindungsmittel aktiviert, ausgewählt aus der oben dargestellten Gruppe. Die konservierte LOS-Zwischenverbindung wird dann mit dem aktivierten Trägerprotein unter geeigneten Bedingungen umgesetzt, um die vorliegenden Konjugate herzustellen.
Im Fall von Verbindung durch Sulfhydrylgruppen wird die LOS-Verbindungsmittel-Zwischenverbindung mit einem geeigneten Reduktionsmittel oder Hydroxylamin umgesetzt, um die Disulfidbindung am Verbindungsmittel zu reduzieren, um freie Sulfhydrylgruppen freizulegen. Geeignete Reduktionsmittel schließen Dithiothreitol (DTT) und Mercaptoethanol ein. Die Sulfhydryl freigelegte Zwischenverbindung wird dann mit einem aktivierten Trägerprotein umgesetzt, um ein Thioether-verbundenes, kovalent gebundenes Konjugat vorzusehen.
Die Bildung eines antigenen Konjugats durch die Sulfhydryl gruppen wird in dem unten dargestellten Schema veranschaulicht:

(A)
(B)
(C)

Alternativ können Aldehyde an der LOS-Struktur durch die Periodat-Oxidation von Vicinylhydroxylgruppen an den Saccharid-Strukturen exponiert werden, wie in z.B. Morrison, R. T. und Boyd, R. N., Organic Chemistry, Allyn and Bacon, Inc., 875–905 (1966) offenbart, oder durch die Behandlung von LOS, welches einen nicht-reduzierenden terminalen Galactose- oder N-Acetylgalactosaminrest enthält, mit Galactoseoxidase, um die C-6 Hydroxylgruppe zu einer Aldehydgruppe umzuwandeln, wie z.B. in Avigaeld et al., J. Biol. Chem., 237: 2736 (1962) offenbart. Das Aldehyd-enthaltende LPS kann dann an ein geeignetes Trägerprotein gebunden werden, z.B. durch reduktive Aminierung.
In einem weiteren alternativen Verfahren können die vorliegenden Konjugate durch die Verbindung des konservierten Teils des LOS und des Trägerproteins durch Carboxylgruppen am LOS mit der Verwendung eines Carbodiimid-Reagenses wie 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid (EDAC) gebildet werden. Bei diesem Verfahren wird es bevorzugt, dass die Konjugate durch Binden der Carboxylgruppen des LOS-Saccharids an die Carboxylgruppen des Trägerproteins hergestellt werden. In diesem Fall wird das konservierte LOS zuerst mit einer geeigneten Linker-Verbindung umgesetzt, wie Adipinsäuredihydrazid (ADH) in Gegen wart von EDAC. Das Trägerprotein kann dann mit der ADH-LOS Zwischenverbindung in Gegenwart einer passenden Linker-Verbindung wie EDAC umgesetzt werden. Es wird ein Carboxyl-verbundenes Konjugat erhalten.
Die Bildung eines antigenen Konjugats durch Verbindung der Carboxylgruppen wird in dem unten dargestellten Schema veranschaulicht.

(A)
(B)

In einer weiteren alternativen Ausführungsform können die vorliegenden Konjugate durch Binden der Carboxylgruppen des LOS-Saccharids an die Aminogruppen eines Trägerproteins gebildet werden. In diesem Fall wird das konservierte LOS zuerst mit Cystamin in Gegenwart von EDAC umgesetzt. Die Sulfhydrylgruppe der Cystamin-LOS Zwischenverbindung wird durch ein Reduktionsmittel wie Dithiothreitol freigelegt und zum Schluss mit einem Brom-acetylierten Trägerprotein umgesetzt.
Trägerproteine, welche bei der Herstellung der vorliegenden antigenen Konjugate brauchbar sind, schließen bakterielle Toxine und Toxoide (z.B. Tetanustoxin oder -toxoid, Diphtherietoxin oder -toxoid, nicht-toxische Mutanten von Diphtherietoxin CRM-₁₉₇ (wie z.B. in Immunochem., 9: 891–906 (1972) beschrieben), Pseudomonas-Exotoxin A, Choleratoxin oder -toxoid, Streptokokkentoxine der Gruppe A, Pneumolysin von Streptococcus pneumoniae, usw.); filamentöses Hämagglutinin (FHA), FHA-Fragment(e) von Bordetella pertussis; Pili oder Pilinen von Neisseria gonorrhoese, Pili oder Pilinen von Neisseria meningitidis; bakterielle Proteine der äußeren Membran (z.B. Proteinkomplexe der äußeren Membran von Neisseria meningitidis (z.B. wie Protein der äußeren Membran der Klasse 1 und Protein der äußeren Membran der Klasse 3 von Neisseria meningitidis)); Proteine der äußeren Membran von Neisseria gonorrhoeae; C5A Peptidase von Streptococcus und ubiquitäres Oberflächenprotein von Moraxella catarrhalis ein. Das bevorzugte Trägerprotein ist CRM-₁₉₇.
Impfstoffe, welche die antigenen Konjugate der vorliegenden Erfindung enthalten, können vorteilhafter Weise verschiedene Adjuvanzien enthalten, von welchen bekannt ist, dass sie die Immunantwort auf das Impfstoff-Antigen vergrößern. Es wird angenommen, dass solche Adjuvanzien die Antikörperantwort durch nichtspezifische Stimulation des Immunsystems des Patienten erhöhen. Die Verwendung von Adjuvanzien ist nach Stand der Technik gut bekannt und wird z.B. in „Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", Powell et al., Plenum Press (1995) beschrieben. Beispiele für Adjuvanzien, welche zur Verwendung in Impfstoffen geeignet sind, welche die vorliegenden Konjugate enthalten, schließen ein: Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, Monophosphoryl-Lipid A, 3-deacyliertes Monophosphoryl-Lipid A, QS-21 (wie in J. Immunol., 146: 431–437 (1991) offenbart), als auch verschiedene Detergenzien (z.B. Triton^TMX100, Zwittergenzien und Desoxycholat) in Kombination mit den Aluminiumverbindungen. Im Allgemeinen wird die Antikörperantwort auf die vorliegenden Konjugate durch den Einschluss von einem oder mehreren Adjuvanzien in den Impfstoff wesentlich erhöht.
Es ist von vielen Verfahren bekannt, dass sie zur Verabreichung einer Impfstoffformulierung an Individuen geeignet sind, die jene benötigen. Geeignete Verfahren zur Verabreichung schließen intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, intraarterielle, vaginale, subkutane, okulare, intranasale und orale Verabreichung ein.
Die Impfstoffformulierungen, welche die vorliegenden antigenen Konjugate enthalten, können das Konjugat in einem physiologisch annehmbaren Träger wie isotonischer Lösung, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung usw. umfassen. Die Impfstoffformulierung wird in einer prophylaktisch wirksamen Menge an ein Individuum verabreicht.
Aufgrund ihrer Kreuzreaktivität mit einer Anzahl an unterschiedlichen oder heterologen bakteriellen Arten sind die antigenen Konjugate der vorliegenden Erfindung als Bestandteile von Impfstoffen wirksam, um eine immunologische Reaktion in Menschen auf Krankheiten zu erzeugen, welche durch LPS-produzierende bakterielle Organismen verursacht werden. Impfstoffe, welche die vorliegenden Konjugate enthalten, können durch Verfahren und mit Materialien hergestellt werden, welche den Fachleuten bekannt sind.
Antikörper, welche durch die vorliegenden Konjugate erzeugt werden, können verwendet werden, um zu untersuchen, ob eine Infektion durch einen LOS-produzierenden bakteriellen Organismus verursacht worden ist, durch Testen der Blutproben, Körperflüssigkeiten oder Biopsie-Proben des infizierten Individuums. Therapeutische und prophylaktische Anwendungen schließen die Verwendung von vorliegenden Impfstoffen, als auch der damit erhaltenen Antikörper ein. Wirksame Immunisierung mit den antigenen Konjugaten der vorliegenden Erfindung kann für die Verhinderung von bakterieller Infektion oder Krankheiten brauchbar sein.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung sind auch für die Prophylaxe von septischem Schock brauchbar, verursacht durch verschiedene Gram-negative Bakterien, z.B. Neisseria, Haemophilus, Klebsiella und Pseudomonas. Es ist entdeckt worden, dass in bestimmten Fällen eine signifikante Menge an LOS von den toten Zellen der Bakterien nach Therapie mit herkömmlichen Antibiotika freigesetzt wird, J. Infect. Dis., 157: 567–568 (1988). Dies kann zu Endotoxin-induzierten Komplikationen bei diesen Patienten führen.
Eine Herangehensweise zum Verhindern von septischem Schock und seinen verwandten Komplikationen ist die Verabreichung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern zur gewöhnlichen Kernregion des LOS der potentiell einbezogenen Bakterien an den Patienten. Solches Antiserum kann die toxischen Wirkungen von übermäßig erzeugtem LOS durch den bakteriellen Organismus verhindern.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden spezifischen, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele
Selektion von Bakterien und Wachstumsbedingungen:
Eine Tn916 induzierte LOS-Mutante von Neisseria meningitidis Stamm NMB-R6 wurde gemäß dem in Zhou et al., J. Biol. Chem., 269: 11162–11169 (1994) dargestellten Verfahren konstruiert. Dieser Stamm ist eine phenotypisch stabile Mutante, welche LOS mit einer molekularen Masse von annähernd 3,1–3,2 KDa exprimiert. Es ist gezeigt worden, dass die Unfähigkeit dieses Mutantenstamms, Glucose-6-phosphat zu Glucose-1-phosphat umzuwandeln, einen gestutzten LOS-Teil ergibt, welcher nur die konservierte Kern-LOS-Struktur von Neisseria meningitidis enthält. Die Struktur des durch diesen Mutantenstamm erzeugten LOS ist als GlcNAc-Hep₂phosphoethanolamin-KDO₂-Lipid A identifiziert worden.
Dieser Mutantenstamm wurde an GC Agarplattenmedium für 6 Std. bei 35°C in 5% CO₂ wachsen gelassen. Zellen von dieser festen Agar-Kultur wurden dann für 18 Stunden in einem ergänzten flüssigen Medium wachsen gelassen, welches 0,2% Hefeextraktdialysat enthielt. Die Kultur wurde dann auf Fernbach-Kolben übertragen und für zusätzliche 18–24 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann durch Hitze getötet und durch Zentrifugation für die Reinigung der LOS-Struktur geerntet.
LOS-Reinigung:
LOS wurde aus den NMB-R6 Zellen durch das in Wu et al., Anal. Chem., 160: 298–289 (1987) beschriebene heiße Phenol-Wasser Extraktionsverfahren extrahiert und durch Ultrazentrifugation gereinigt. Spezieller wurden Zellpellets in 3 Volumina (3 ml Puffer/g Nassgewicht) Phosphatpuffer (pH 7,1) suspendiert, welcher 5 mM EDTA und 0,02% Natriumazid enthielt. Lysazym (erhältlich von Sigma Chemical Co.) wurde bei einer Konzentration von 2 mg/ml dann zur Suspension zugegeben. Dieses Gemisch wurde dann über Nacht bei 4°C verdaut. Die Suspension wurde auf 37°C gebracht und mit RNAse und DNAse bei einer Konzentration von 100 μg/ml für 3 Stunden weiter verdaut. Das verdaute Material wurde dann auf 70°C gebracht und ein gleiches Volumen Phenol bei 70°C wurde dazugegeben. Dieses Gemisch wurde für einen Zeitraum von 15 Minuten extrahiert und die Suspension wurde dann auf 4°C gekühlt und bei 10000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Die wässerige Phase wurde zurückgewonnen und die Phenolphase wurde mit einem gleichen Volumen Wasser bei 70°C für 15 Minuten rückextrahiert. Diese Phase wurde dann bei 10000 g für 30 Minuten zentrifugiert und die wässerige Phase wurde dann abgetrennt. Natriumacetat wurde zu den vereinigten wässerigen Flüssigkeitsüberstän den bei einer Konzentration von 5 mg/ml zugegeben. Zwei Volumina eiskaltes Aceton wurden dann zu diesem Gemisch zugegeben und das LOS durfte über Nacht bei 4°C ausfällen. Das ausgefällte LOS wurde durch Zentrifugation bei 10000 g für 30 Minuten abgetrennt. Das gewonnene LOS wurde in sterilem Wasser suspendiert und drei Runden Ultrazentrifugation bei 105000 g für drei Stunden unterworfen. Das endgültige Pellet wurde in einem kleinen Volumen von sterilem Wasser für die nachfolgenden Versuche suspendiert. Typischerweise wurden 3 mg LOS aus 1 g Nassgewicht der NMB-R6 Zellen gereinigt.
Konjugation an Trägerprotein CRM₁₉₇:
Das auf die oben beschriebene Weise gereinigte LOS wurde dann durch die Umsetzung davon mit 45 mM NaOH bei 80°C für 20 Minuten de-O-acyliert. Das de-O-acylierte Material wurde dann mit HCl neutralisiert und durch Gelfiltration an einer Biogel P6 Säule unter Verwendung von 0,1 M NaHCO₃ als Eluent gereinigt. Das de-O-acylierte LOS (hiernach als „DeA-LOS" bezeichnet) wurde dann durch Binden der Aminogruppen der Saccharide an der konservierten LOS-Struktur an die Aminogruppen des Trägerproteins unter Nutzung des unten beschriebenen Verfahrens an das Trägerprotein CRM₁₉₇ konjugiert. CRM₁₉₇ ist ein nicht toxisches Mutantenprotein von Diphtherietoxin und ist als Trägerprotein für die kommerzielle Herstellung von Glycokonjugat-Impfstoffen zur humanen Verwendung verwendet worden.
Langkettiges Sulfo-N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (Sulfo LC-SPDP, erhältlich von der Pierce Chemical Company) wurde verwendet, um die primäre(n) Aminogruppe(n) des DeA-LOS zu thiolieren. Das Sulfo LC-SPDP wurde zu 15 mg des LOS in 0,1 M NaHCO₃ (pH 7,9) bei einem Verhältnis von 1:1 (Gew./Gew.) zugegeben. Das Gemisch wurde dann für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende der Umsetzung wurde das Gemisch an einer Biogel P6 Säule, äquilibriert in 0,1 M NaHCO₃, gereinigt. Die gewonnenen Fraktionen wurden gemäß dem in Keleti und Lederer, Biochem., Biophys., 74: 443–450 (1974) dargestellten Verfahren bezüglich KDO bewertet und die Fraktionen, die KDO enthielten, wurden gepoolt. Die in den SPDP-Derivaten des LOS vorhandenen N-Pyridyl-disulfide wurden mit 50–100 mM Dithiothreitol (DTT) reduziert und an einer Biogel P6 Säule wie oben beschrie ben Gel-filtriert. Das thiolierte Material, welches die KDO-positiven Fraktionen enthielt, wurde wieder gepoolt. Thiolierung der Oligosaccharide des DeA-LOS wurde gemäß der in Ellman, G. L., Arch. Biochem. Biophys., 74: 443–450 (1958) beschriebenen Umsetzung überwacht. 0,1 ml des Materials wurden mit 0,1 ml Ellman-Reagens (also 40 mg von 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoe)säure in 10 ml von pH 8,0 Phosphatpuffer) gemischt. Nach 15 Minuten Inkubation betrug die Extinktion 412 nm. Cystein wurde als Standard-Sulfhydryl-Reagens verwendet.
Das CRM₁₉₇ Trägerprotein wurde gemäß dem in Bernatowitz und Matsueda, Anal. Biochem., 155: 95–102 (1986) beschriebenen Verfahren bromacetyliert. Bromessigsäure-N-hydroxy-succinimidester (erhältlich von Sigma Chemical Co.) in 100 mg/ml Dimethylformamid wurde tropfenweise zu 3 ml des Proteins (in 0,1 M NaHCO₃) bei einem Verhältnis von 1:1 (Gew./Gew.) bei 4°C zugegeben. Die Lösung wurde gemischt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Umsetzungsgemisch wurde dann an einer Biogel P6 Säule wie oben beschrieben Gel-filtriert und die Leervolumenanteile, welche das bromacetylierte Protein enthielten, wurden gepoolt. Derivatisierung von Aminogruppen an dem Trägerprotein zu den Bromacetylgruppen wurde durch eine Verringerung der Menge an freien Aminogruppen überwacht.
Das bromacetylierte CRM₁₉₇ in 0,1 M NaHCO₃ wurde dann zum thiolierten DeA-LOS bei einem 1:1,5 Verhältnis von Protein zu LOS (Gew./Gew.) in 0,1 M NaHCO₃ zugegeben. Das Umsetzungsgemisch wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Das endgültige Konjugat (hiernach als „DeA-LOS-SPDP-CRM" bezeichnet) wurde durch Gel-Filtration an einer Biogel P30 (Bio-Rad) Säule gereinigt, äquilibriert in 0,1 M NaHCO₃/1 mM EDTA, pH 7–9.
Immunogenitätsbestimmung:
Die Immunogenität des oben hergestellten DeA-LOS-SPDP-CRM Konjugats wurde in Swiss Webster Mäusen gemäß dem folgenden Verfahren bestimmt. Gruppen aus 6–8 Wochen alten weiblichen Mäusen, 10 pro Gruppe, wurden subkutan mit 10 μg LOS, 10 μg DeA-LOS, 10 μg DeA-LPS-SPDP (also die nicht konjugierte Zwischenverbindung) und 10 μg des DeA-LOS-SPDP-CRM Konjugats immunisiert. 10 μg CRM₁₉₇ wurden den Mäusen ebenfalls verabreicht, um als Kontrolle zu dienen. Jedes dieser Immunogene enthielt ferner 20 μg QS-21 (er hältlich von Aquila) als Adjuvans in einem Endvolumen von 0,1 ml, welches Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthielt, pro Dosis. Eine zusätzliche Gruppe wurde mit 10 μg LOS ohne das QS21 Adjuvans immunisiert. Die Tiere wurden bei Wochen 0, 3 und 6 immunisiert und Blutproben wurden vor jeder Immunisierung zur Antikörperbestimmung entnommen. Blutproben wurden ferner bei Woche 8 zur Antikörperbestimmung entnommen.
LOS-Antikörpergehalte wurden durch das Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Verfahren gegenüber gereinigtem LOS von R6 und dem anderen Wild-Typ und Immunotyp-spezifischen, unten identifizierten Neisseria meningitidis Stämmen bestimmt. Die Immuntyp-spezifischen Stämme wurden von Walter Reed Army Medical Center, Washington erhalten. LOS wurde von diesen Stämmen durch das oben beschriebene heiße Phenol-Wasser Extraktionsverfahren gereinigt.
Das gereinigte LOS wurde in Endotoxin-freiem PBS zu den folgenden Konzentrationen verdünnt: 10 μg/ml für Neisseria meningitidis Stämme A1, H44/76, 2996 und Immunotypen L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L10, L11 und L12; und 2,5 μg/ml für den R6-Stamm. Polystyrol-Mikrotiterplatten wurden mit 100 μl pro Mulde von den verdünnten LOS-enthaltenden Gemischen überzogen und für 3 Stunden bei 37°C inkubiert, gefolgt von Lagerung über Nacht bei 4°C. Das nicht gebundene LOS wurde dann durch Absaugen unter Nutzung eines automatischen Plattenwäschers von den Platten entfernt. 150 μl pro Mulde von PBS/0,1% Gelatine wurden dann zu den Platten zugegeben und die Platten wurden dann für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubation und zwischen allen nachfolgenden Schritten wurden die Platten mit einem Gemisch aus PBS und 0,1% Tween 20 unter Verwendung eines automatischen Plattenwäschers gewaschen.
Testmausseren wurden in einem Gemisch aus PBS, 0,05 Tween 20 und 0,1% Gelatine seriell verdünnt. 100 μl pro Mulde der Verdünnung wurden zu den Platten zugegeben. Die Platten wurden für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Ziege-Anti-Maus IgG alkalische Phosphatase (von Southern Biotechnology), verdünnt in einem Gemisch aus PBS und 0,5% Tween 20, wurde dann in einer Menge von 100 μl pro Mulde zugegeben und für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Farbe wurde unter Verwendung von 100 μl einer 1 mg/ml Lösung aus p-Nitrophenolphosphat in einem Diethanolaminpuffer entwickelt. Diese Materialien durften sich für 60 Minuten bei Raumtemperatur umsetzen, wonach die Umsetzung durch Zugabe von 50 μl pro Mulde von 3 N NaOH gestoppt wurde. Extinktionswerte wurden unter Verwendung eines automatisierten ELISA-Lesegeräts mit einem 405 nm Test und 690 nm Referenzfilter bestimmt.
Die Daten, welche die Immunogenität des DeA-LOS-SPDP-CRM Konjugats gegenüber homologer LOS des R6-Stamms bei Wochen 0, 3, 6 und 8 zeigen, werden in Tabelle 1 gezeigt. Wie aus diesen Daten ersichtlich ist, erzeugte das Konjugat eine signifikante, verstärkbare IgG-Antikörperantwort. Tabelle 1

DeA-LOS:: De-O-acyliertes LOS, nicht konjugiert
DeA-LOS-SPDP:: Aktiviertes de-O-acyliertes LOS, nicht konjugiert
DeA-LOS-SPDP-CRM:: De-O-acyliertes LOS, konjugiert an CRM₁₉₇ durch SPDP
ND: = nicht durchgeführt

Die kreuzreaktive Immunogenität des Konjugats, hergestellt in den vorliegenden Beispielen gegenüber heterologem LOS von verschiedenen Stämmen von Neisseria meningitidis wurde ebenfalls gemäß dem oben beschriebenen Verfahren untersucht und die erhaltenen Daten werden in Tabelle 2 dargestellt. Die untersuchten Stämme waren: A1, R6, H44/76, 2996, Immunotypen L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L10, L11 und L12. Wie in Tabelle 2 gesehen werden kann, produzierte das LOS-Protein-Konjugat eine signifikante Antikörperantwort, insbesondere im Vergleich mit nicht konjugiertem LOS.
Tabelle 2
Die Kreuzreaktivität von Anti-LOS-Konjugat Antiseren (die Antiseren gegen DeA-LOS-SPDP-CRM) wurde durch Western-Blot Analyse gegenüber gereinigtem LOS von verschiedenen Stämmen von mehreren Gram-negativen Bakterien weiter untersucht. Gereinigte LOS-Proben von Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis und Helicobacter pylori wurden zuerst mit Protease verdaut und einem SDS-PAGE (18%) Standardtrennverfahren unterworfen. Die Proben wurden dann durch Western-Blot Standardverfahren auf Nitrocellulosemembran übertragen. Die Membran wurde mit 3% Rinderserum Albumin (BSA) in einem Gemisch aus PBS/0,05% Tween 20 für 30 Min. geblockt und mit 1:100 Verdünnung von Testmausseren umgesetzt. Die Blots wurden dann mit einem Gemisch aus PBS/0,05% Tween 20 gewaschen und mit Ziege-Anti-Maus Ig alkalischer Phosphatase, verdünnt in einem Gemisch aus PBS/0,05% Tween 20 inkubiert. Nach dem Waschverfahren wurden die Blots unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)/Nitroblau-Tetrazoliumkonzentrat (NBT) Phosphatasesubstratsystem wie durch den Hersteller (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., MD) beschrieben entwickelt. Das Entwicklungsverfahren bestand aus Mischen eines Teils von jeweils den BCIP und NBT Konzentraten mit zehn Teilen Tris-Pufferlösung in einem Glasbehälter und Zugeben dieser Gemische zu den Blots. Nach Farbentwicklung wurde die Umsetzung durch Spülen der Blots mit Wasser in Reagensqualität gestoppt.
Wie in 4 gesehen werden kann, reagierte mit Ausnahme von Helicobacter pylori das LOS von jedem der Organismen stark mit den Antiseren. Obwohl weniger intensiv scheint es, dass es auch eine leichte Kreuzreaktivität auf das LOS von Helicobacter pylori gab. Diese Ergebnisse zeigen deutlich an, dass die Antikörper, erzeugt von dem LOS-Konjugat von Neisseria meningitidis, mit einer Anzahl an anderen Gram-negativen Organismen kreuzreagierten.
Die bakteriziden Wirksamkeiten der Antiseren wurden unter Verwendung des R6-Stamms, des Gruppe A Stamms (A1) und zwei Gruppe B Stämmen: H44/76 und 2996 weiter untersucht. Serumproben wurden in 5 μl PCM (PBS, welches Ca und Mg enthielt) verdünnt und diese Verdünnung wurde zu Umsetzungsgemischen zugegeben, welche 2–5 × 10³ Neisseria meningitidis (10 μl), humanes Serum-Komplement (10 μl) und PCM (25 μl) enthielten. Dieses Gemisch wurde dann für 45 Min. bei 36°C in 5% CO₂ inkubiert. Die Umsetzung wurde dann durch Verdünnung mit 200 μl von PBS beendet. Zwei Aliquoten (50 μl) des Gemisches wurden dann auf GC-Agar-Platten plattiert und in 5% CO₂ bei 36°C weiter inkubiert. Die bakteriziden Titer (BC50) wurden dann bestimmt. Bakterizide Titer stellen den Kehrwert der Verdünnung von Antiserum dar, das 50% der Kolonie bildenden Neisseria meningitidis in diesem Test tötet. Die Daten werden unten in Tabelle 3 dargestellt.
Wie in Tabelle 3 gesehen werden kann, waren die Konjugat-Antiseren in der Lage, Bakterien zu töten, welche unterschiedliche LOS-Immunotypen exprimierten. Solche Konjugate induzierten verstärkbare T-Zellen abhängige IgG-Antwort.
Tabelle 3 BC₅₀-Titer
Entsprechend kann aus den oben dargestellten Daten leicht gesehen werden, dass die antigenen Konjugate der vorliegenden. Erfindung eine signifikante Immunantwort auf das LOS eines gegebenen bakteriellen Organismus erzeugen. Darüber hinaus zeigen diese Daten, dass die vorliegenden Konjugate eine kreuzreaktive Antwort auf unterschiedliche Stämme des bakteriellen Organismus, als auch auf unterschiedliche Arten von bakteriellem Organismus induzieren.

Claims

Antigenes Konjugat, umfassend ein Trägerprotein, kovalent gebunden an den konservierten Teil eines Lipooligosaccharids (LOS) eines nicht-enterischen pathogenen Gram-negativen Bakteriums, wobei besagter konservierter Teil des LOS GlcNAc-Hep₂phosphoethanolamin-KDO₂-Lipid A umfasst, besagtes Konjugat eine kreuzreaktive Immunantwort gegenüber heterologen Stämmen von besagten Gram-negativen Bakterien auslöst.
Antigenes Konjugat wie nach Anspruch 1, wobei besagtes Konjugat eine kreuzreaktive Immunantwort gegenüber heterologen Genera von Gram-negativen Bakterien auslöst.
Antigenes Konjugat wie nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei besagtes LOS de-O-acyliert ist.
Antigenes Konjugat wie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei besagtes Trägerprotein ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Tetanustoxin oder -toxoid, Diphtherietoxin oder -toxoid, Mutante von Diphtherietoxin CRM₁₉₇, Pseudomonas-Exotoxin A, Choleratoxin oder -toxoid, Streptokokkentoxinen der Gruppe A, Pneumolysin von Streptococcus pneumoneae, filamentösem Hämagglutinin (FHA), FHA-Fragmenten von Bordetella pertussis; Pili oder Pilinen von Neisseria gonorrhoeae, Pili oder Pilinen von Neisseria meningitidis; Proteinen der äußeren Membran von Neisseria meningitis, Proteine der äußeren Membran von Neisseria gonorrhoeae; C5A Peptidase von Streptococcus und Oberflächenprotein von Moraxella catarrhalis.
Antigenes Konjugat wie nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei besagtes Trägerprotein an den konservierten Teil des LOS mit einer Verbindung gebunden ist, ausgewählt aus den Folgenden: Sulfosuccinimidyl-6-(3-[2-pyridyldithio]-propionamido)-hexanoat (Sulfo-LC-SPDP); Succinimidyl-6-(3-[2-pyridyldithio]-propionamido)-hexanoat (LC-SPDP); Traut-Reagens (2-Iminothiolan); N-Succinimidyl-S-acetyl-thioacetat (SATA); N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), Succinimidylacetyl-thiopropionat (SATP), Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester (MBS), N-Succinimidyl-(4-iodacetyl)aminobenzoat (SIAB), Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (SMPB), Bromessigsäure-N-hydroxy-suc cinimid(BANS)ester, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC), Adipinsäuredihydrazid (ADH), Cystamin und Dithiobis (succinimidylpropionat) (DTSSP).
Antigenes Konjugat wie nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei besagtes Gram-negatives Bakterium ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, nicht-typisierbarer Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicabacter pylori, Chlamydia, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Klebsiella und Vibrio cholerae.
Antigenes Konjugat wie nach Anspruch 6, wobei besagtes Gram-negatives Bakterium Neisseria meningitidis ist.
Antigenes Konjugat gemäß Anspruch 4, umfassend das Trägerprotein Diphtherietoxin CRM₁₉₇, kovalent gebunden an den konservierten Teil eines LOS von Neisseria meningitidis mit langkettigem N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat und Bromessigsäure-N-hydroxysuccinimidester, wobei besagter konservierter Teil GlcNAc-Hep₂phosphoethanolamin-KDO₂-Lipid A umfasst, besagtes Konjugat eine kreuzreaktive Immunantwort gegenüber heterologen Stämmen innerhalb des Genus Neisseria meningitidis auslöst.
Antigenes Konjugat wie in Anspruch 8, wobei besagtes Konjugat eine kreuzreaktive Immunantwort gegenüber heterologen Genera von Gram-negativen Bakterien auslöst.
Impfstoffformulierung, welche eine wirksame Menge des antigenen Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.
Impfstoffformulierung wie in Anspruch 10 beansprucht, welche ferner einen physiologischen Träger und ein Adjuvans umfasst.
Verwendung einer wirksamen Menge eines antigenen Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 9 bei der Herstellung einer Impfstoffformulierung zum Immunisieren eines Individuums, um durch ein Gram-negatives Pathogen verursachte Krankheit zu verhindern.
Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei die Impfstoffformulierung auf einem Verabreichungsweg an das Individuum verabreicht wird, welcher ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus intradermaler, intramuskulärer, intraperitonealer, intravenöser, vaginaler, subkutaner, okularer, intranasaler und oraler Verabreichung.
Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei besagte Impfstoffformulierung ferner einen physiologischen Träger und ein Adjuvans um fasst.
Verwendung einer wirksamen Menge eines antigenen Konjugats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 bei der Herstellung eines Medikaments zum Verhindern von bakterieller Sepsis in einem Säuger, der dessen bedarf, wobei besagtes Konjugat eine kreuzreaktive Immunantwort gegenüber heterologen Stämmen von besagten Gram-negativen Bakterien auslöst.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei besagtes Konjugat eine kreuzreaktive Immunantwort gegenüber heterologen Genera von besagten Gram-negativen Bakterien auslöst.
Antigenes Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung als Medikament.