KR101509456B1 - 리포폴리사카라이드 유사체 및 이를 포함하는 면역보조 조성물 - Google Patents

리포폴리사카라이드 유사체 및 이를 포함하는 면역보조 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 새로운 구조의 당쇄 사슬과 지질 A를 포함하는 LPS 유사체 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 LPS 유사체는 waaD 유전자-코딩 효소의 기능부재로 인하여 O-항원을 갖지 않으며, 야생형 LPS의 코어 올리고사카라이드 보다 더 적은 개수의 당(6-9개)을 갖는다. 본 발명의 리포폴리사카라이드 유사체는 독성이 현저히 감소되어 안전하고, 특정 병원체에 대한 면역반응에서 매우 우수한 면역촉진 효능을 발휘한다.

Description

리포폴리사카라이드 유사체 및 이를 포함하는 면역보조 조성물{Lipopolysaccharide analogue and adjuvant composition comprising the same}
본 발명은 짧은 당쇄 사슬 및 지질 A를 포함하는 새로운 구조의 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS) 유사체 및 이의 용도에 관한 것이다.
리포폴리사카라이드는 그람 음성 박테리아의 외막의 주요 성분이다. LPS는 다양한 면역세포의 유망한 촉진자이고, 선천성 면역 반응을 촉발시킨다. LPS는 양친매성 도메인(지질 A), 코어 올리고사카라이드(core oligosaccharide, OS) 및 O-항원(O-antigen 혹은 O-antigenic polysaccharide)의 세 개의 도메인으로 구성되어 있다. 지질 A는 LPS의 내독소 활성을 담당하고, 다양한 유형의 면역세포의 TLR4(toll-like receptor 4) 신호전달을 통하여 면역촉진 효과를 나타낸다(Raetz CR, Whitfield C, Annu Rev Biochem 71: 635-700(2002)). LPS는 사이토카인 분비, 보조자극인자(costimulatory molecule)의 발현 및 항원 제시의 유도를 통하여 항원제시세포를 활성화시키며, 이는 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 연결한다(Akira S, Uematsu S, Takeuchi O, Cell 124: 783-801(2006); Schnare M, Barton GM, Holt AC, Takeda K, Akira S, et al. Nat Immunol 2: 947-950(2001)).
감소된 독성을 나타내는 지질 A 유도체가 인간 백신 면역보조제(adjuvant) 개발에 타겟이 되어왔다. MPL(Monophosphoryl lipid A)은 살모넬라 미네소타 R형 균주(Salmonella minnesota rough strain)부터 분리된 LPS의 비-독성 유도체이다. 알루미늄 염과 MPL의 조합은 HBV(hepatitis B virus)와 HPV(human papillomavirus) 백신용 면역보조제로서 승인을 받은바 있다.
최근 면역보조제가 주목받고 있으며, 자궁경부암 백신과 더불어 독감 백신 등 다양하게 이용되고 있다.
이러한 면역보조제 중 박테리아 DNA는 1960년대부터 항암제로서 주목 받았으며, 현재까지 계속 연구가 되고 있으나, 효능이 미흡하여 단독으로 항암제로 사용되지는 못하고 있다(Glick, J. L. CancerRes.27:2338, 1967).
1950년대부터 항암효과가 알려진 LPS의 경우, ng 수준의 오염으로도 패혈증에 의한 사망을 초래할 수 있는 독성으로 인해 사용이 어려운 문제가 있었다. 특히, LPS와 DNA의 결합은 심각한 독성을 나타낸다는 것이 일반적인 의견이었고, DNA 관련 의약품에서 LPS의 제거는 매우 중요한 과정으로 이해되었다.
LPS에 대한 약독화 시도는 꾸준히 연구되었으며, 특히 폴리사카라이드 체인의 제거 또는 지질 A의 탈아실화를 통하여 독성을 감소시키는데 성공할 수 있었다(Katz SS et al., J Biol Chem. Dec 17;274(51):36579-84 1999). 특히, LPS의 폴리사카라이드 체인을 제거하여 얻은 지질 A의 인산화를 통하여 얻은 MPL의 경우 LPS의 독성을 제거한 면역항암제로 개발되었으나 그 효과가 미미한 것으로 알려져 있다(http://www.corixa.com).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 기존의 리포폴리사카라이드의 사용 시 문제되었던 독성이 현저하게 감소되었을 뿐만 아니라, 우수한 면역촉진 활성을 나타낼 수 있는 LPS 유사체를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주로부터 O-항원 부위를 갖지 않는 LPS를 분리 정제하고, 이를 탈아실화 시켜 독성이 감소된 형태의 LPS 유사체를 제조하고, 이의 구조적 특징을 분석하여 waaD 유전자 결손에 의하여 야생형 LPS 보다 적은 개수의 당을 포함하고 있음을 규명하고, 우수한 면역촉진 활성을 나타내어 면역보조제로 이용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 LPS 유사체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 면역보조 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 waaD 유전자-코딩 효소가 기능하지 못하는 그람-음성 박테리아로부터 분리된 LPS에 알카리 처리하여 지질 A가 탈아실화 된 LPS 유사체로서, 상기 LPS 유사체는 waaD 유전자-코딩 효소의 기능부재로 인하여 O-항원을 갖지 않으며; 바깥 코어 올리고사카라이드와 내부 코어 올리고사카라이드를 포함하되, 이들의 당의 개수가 야생형 LPS의 당 개수 보다 적은 코어 올리고사카라이드, 및 상기 내부 코어 올리고사카라이드의 당에 연결된 지질 A를 포함하고; 상기 지질 A는 포스페이트를 갖는 글루코사민 디사카라이드(glucosamine disaccharide)와, 상기 글루코사민 디사카라이드에 N-연결된(N-linked) 지방산을 포함하는 것을 특징으로 하는 LPS 유사체를 제공한다.
본 발명자들은 기존의 리포폴리사카라이드의 사용 시 문제되었던 독성이 현저하게 감소되었을 뿐만 아니라, 우수한 면역촉진 활성을 나타낼 수 있는 LPS 유사체를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주로부터 O-항원 부위를 갖지 않는 LPS를 분리 정제하고, 이를 탈아실화 시켜 독성이 감소된 형태의 LPS 유사체를 제조하고, 이의 구조적 특징을 분석하여 waaD 유전자 결손에 의하여 야생형 LPS 보다 적은 개수의 당을 포함하고 있음을 규명하고, 우수한 면역촉진 활성을 나타내어 면역보조제로 이용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 LPS 유사체의 특징은, waaD 유전자-코딩 효소의 기능부재로 인하여 O-항원 분위를 갖지 않으면서, 코어 올리고사카라이드의 당 개수가 야생형 LPS 보다 적다는 것이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, waaD 유전자-코딩 효소의 기능부재는 waaD 유전자 염기서열의 전체 또는 일부의 결실, 치환 또는 상기 염기서열 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 것이다. 하나의 특정예에서, 상기 waaD 유전자-코딩 효소의 기능부재는 waaD 유전자 염기서열의 전체 또는 일부의 결실에 의한 것이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 waaD 유전자-코딩 효소는 UDP-글루코오스:(글루코실) LPS α-1,2-글루코실 트란스페라아제(UDP-glucose:(glucosyl) LPS α-1,2-glucosyltransferase)이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 코어 올리고사카라이드의 당은 헥소오스, N-아세틸 헥소사민, 헵토오스 및 Kdo(2-케토-3-디옥시-옥토네이트)로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "헥소오스(hexose)"는 한 분자 중 6개의 탄소 원자를 함유한 단당류(monosaccharide)를 의미하며, 예컨대 케토헥소오스(프시코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스), 알도헥소오스(알로스, 알트로스, 글루코오스, 만노오스, 굴로스, 이도스, 갈락토오스, 탈로스) 및 데옥시당(푸코스, 푸쿨로스, 람노스)이 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 헥소오스는 알도헥소오스이고, 일특정예에서 상기 알도헥소오스는 글루코오스 또는 갈락토오스이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "헵토오스(heptose)"는 한 분자 중 7개의 탄소원자를 함유한 단당류(monosaccharide)를 의미하며, 기능기(알데하이드기 및 케톤기)의 위치에 따라 알도헵토오스(포지션 1) 및 케토헵토오스(포지션 2)로 구분할 수 있다. 상기 알도헵토오스는 예컨대, L-글리세로-D-만노-헵토오스가 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 케토헵토오스는 예컨대, 세도헵툴로스 및 만노헵툴로스가 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 N-아세틸 헥소사민은 N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토사민 또는 N-아세틸 만노사민이고, 일특정예에서 상기 N-아세틸 헥소사민은 N-아세틸 글루코사민이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 바깥 코어 올리고사카라이드는 당으로서 헥소오스 및 N-아세틸 헥소사민을 포함한다. 일예로, 상기 바깥 코어 올리고사카라이드는 하기 화학식 1로 표현될 수 있다.
화학식 1
Figure 112013090177721-pat00001
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 바깥 코어 올리고사카라이드는 1-4개의 당을 포함한다. 하나의 특정예에서, 상기 바깥 코어 올리고사카라이드의 당 개수는 2-4개이고, 다른 특정예에서는 3-4개이며, 또 다른 특정예에서는 4개이다. 하기 실험예 1에서 규명된 바와 같이, waaD 유전자가 결실된 대장균은 상기 유전자가 코딩하는 효소의 기능부재로 인하여 바깥 코어 올리고사카라이드의 말단 글루코오스가 없는 형태의 LPS를 생산한다. 이에 의하여 LPS는 O-항원 부분을 갖지 않으며, 코어 올리고사카라이드의 당 개수가 9개 이하로 제한된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 내부 코어 올리고사카라이드는 당으로서 헵토오스 및 Kdo를 포함한다. 상기 헵토오스는 포스페이트기를 갖는 형태일 수 있다. 일예로, 상기 내부 코어 올리고사카라이드는 하기 화학식 2로 표현될 수 있다.
화학식 2
Figure 112013090177721-pat00002
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 내부 코어 올리고사카라이드는 1-5개의 당을 포함한다. 하나의 특정예에서, 내부 코어 올리고사카라이드의 당 개수는 2-5개이고, 다른 특정예에서는 3-5개이며, 또 다른 특정예에서는 4-5개이고, 또 다른 특정예에서는 5개이다.
본 발명의 LPS 유사체의 코어 올리고사카라이드는 야생형 LPS 보다 적은 개수의 당을 갖는데, 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 코어 올리고사카라이드의 당 개수는 6-9이다. 하나의 특정예에서, 상기 코어 올리고사카라이드의 당 개수는 7-9이고, 다른 특정예에서는 8-9개이며, 또 다른 특정예에서는 9개이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 코어 올리고사카라이드는 포스페이트를 포함한다. 하나의 특정예에서, 상기 포스페이트의 개수는 1-4개이고, 다른 특정예에서는 2-3개이며, 또 다른 특정예에서는 2개이다. 또한, 상기 포스페이트는 내부 코어 올리고사카라이드에만 존재할 수 있다.
본 발명에서, 상기 지질 A는 포스페이트를 갖는 글루코사민 디사카라이드 및 상기 글루코사민 디사카라이드에 N-연결된 지방산을 포함한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 지질 A는 내부 코어 올리고사카라이드의 Kdo에 연결된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 지질 A는 O-연결된(O-linked) 지방산을 갖지 않는다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 N-연결된 지방산은 C14 지방산이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 지질 A는 하기 화학식 3으로 표현될 수 있다.
화학식 3
Figure 112013090177721-pat00003
상기 화학식 3에서, GlcN은 글루코사민이고, P는 포스페이트이며,
Figure 112013090177721-pat00004
는 C14 지방산이다.
본 발명의 LPS 유사체는 지질 A에서 지방산(예컨대, C14 지방산)이 제거되어(탈아실화) 독성이 현저히 감소된 특징을 갖는다. 지방상은 지질 A의 글루코사민에 -C(O)O- 결합 또는 -C(O)NH- 결합을 통하여 결합되어 있다. 본 발명에서 탈아실화는 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거되는 것을 의미한다.
상기 탈아실화는 LPS에 알카리를 처리하여 실시할 수 있으며, 상기 알카리로는 NaOH, KOH, Ba(OH)2, CsOH, Sr(OH)2, Ca(OH)2, LiOH, RbOH 및 Mg(OH)2 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 LPS 유사체는 면역촉진(immunostimulatory) 활성을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어, "면역촉진(immunostimulatory)"은 초기 면역반응을 유도하거나 항원에 대한 기존의 면역반응을 측정 가능할 정도로 증가시키는 것을 말한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 리포폴리사카라이드 유사체는 Th1-, Th2- 및 Th17-유형 면역반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 리포폴리사카라이드 유사체는 TNF-α, IL-6, IL-12, IL-5, IFN-γ및 IL-17로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 분비를 촉진시킨다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 리포폴리사카라이드 유사체는 B 세포를 분화시킨다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 리포폴리사카라이드 유사체는 2000-4000 Da의 분자량을 가질 수 있다. 이와 같은 분자량은 천연(natural occurring) LPS와 비교하여 매우 작은 분자량이다. 하나의 특정예에서, 상기 리포폴리사카라이드 유사체는 2000-3800 Da의 분자량을 가지며, 다른 특정예서는 2000-3500 Da의 분자량을 가지며, 또 다른 특정예에서는 2000-3000 Da의 분자량을 갖는다.
상기 그람-음성 박테리아는 waaD 유전자에 대한 자연적인 돌연변이 혹은 인위적인 돌연변이에 의하여 waaD 유전자-코딩 효소가 기능하지 못하게 된 균주이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 그람-음성 박테리아는 대장균(E. coli)이다. 하나의 특정예에서, 상기 대장균은 대장균 EG0023(기탁번호: KCCM11218P)이다. 상기 대장균 EG0023은 인간의 장에서 얻은 대장균에서 수득한 LPS를 과립구대식세포콜로니자극인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)로 분화시킨 인간 림프구 세포주에 처리한 후, TNF-a 분비를 측정하여 가장 낮은 값을 보이는 균주를 선택하는 과정을 통하여 발굴된 균주이다. 상기 균주는 2011년 11월 9일자로 대한민국 서대문구 홍제동 361-221 소재 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM11218P로 기탁되었다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 LPS 유사체를 유효성분으로 포함하는 면역보조(adjuvant) 조성물을 제공한다.
본 발명에서 이용되는 LPS 유사체는 면역촉진 효능이 종래의 면역보조제(예컨대, MPL)와 비교하여 우수할 뿐만 아니라, 독성도 감소되어 있어 면역보조 조성물에 매우 적합하다.
본 발명의 면역보조 조성물은 상기 LPS 유사체만으로도 충분한 면역반응 유도하여 다양한 질환에 대한 예방 효능을 발휘할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 면역보조 조성물은 다른 면역보조성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 예를 들어 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2족 원소 또는 이의 염; Ti, Zr, Hf 및 Rf로 구성된 군으로부터 선택되는 제4족 원소; 알루미늄의 염 또는 그의 수화물; 또는 디메틸옥타데실암모니윰 브로마이드를 포함할 수 있다. 상기 염은, 예를 들면, 옥사이드, 퍼옥사이드, 하이드록사이드, 카보네이트, 포스페이트, 파이로포스페이트, 하이드로겐포스페이트, 다이하이드로겐포스페이트, 설페이트 또는 실리케이트와 함께 형성된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 면역보조 조성물에서 추가적으로 포함될 수 있는 면역보조성분은 마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 카보네이트 하이드독사이드 펜타하이드데이트, 티타듐 다이독사이드, 칼슘포스페이트, 칼슘 카보네이트, 바륨 옥사이드, 바륨 하이이드록사이드, 바륨 퍼옥사이드, 바륨 설페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 파이로포스페이트, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 수화된 알루미늄 포타슘 설페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 면역보조 조성물은 알루미늄 하이드록사이드를 더 포함한다. 이러한 면역보조 조성물은 암 백신에 사용될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 면역보조 조성물은 칼슘포스페이트를 더 포함한다. 이러한 면역보조 조성물은 인플루엔자 백신 또는 결핵 백신에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 항원; 및 (b) 상기 LPS 유사체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항원(antigen)"은 수용자의 면역반응을 유도하는 물질이다. 따라서, 본 발명에서는 이러한 면역반응 유도효능을 나타내는 물질을 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP), 세포 또는 세포 조각일 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 항원은 결핵균 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, Hib(Haemophilus influenzae type b)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코니너박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원 및 바리셀라 바이러스(Varicella virus)의 항원으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
하나의 특정예에서, 상기 결핵균 항원은 65 kD 열충격 단백질(HSP65), 항원 85A(Ag85A), 항원 85B, 항원 85C, ESAT-6, Des 단백질, MPT32, MPT51, MPT63, MPT64, HspX 및 포스페이트 결합 단백질 1(Phosphate binding protein 1)로 구성된 군으로부터 선택되고; 상기 탄저균 항원은 PA(protective antigen), LF(lethal antigen) 또는 EA(edema antigen)이며; 상기 HAV(Hepatitis A virus)의 항원은 생 약독화 HAV, 불활 약독화 HAV, VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C 및 3D 단백질로 구성된 군으로부터 선택되고; 상기 HBV(Hepatitis B virus)의 항원은 HBcAg(core antigen of HBV) 또는 HBsAg(surface antigen of HBV)이고; 상기 HCV(Hepatitis C virus)의 항원은 E1, E2 또는 NS3/4a 항원이며; 상기 HIV의 항원은 Gag(p55gag), Pol, Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu, Env 또는 Nef 항원이고; 상기 인플루엔자 바이러스의 항원은 엔벨로프 당단백질 HA 또는 NA이며; 상기 HSV(Herpes simplex virus)의 항원은 HSV의 당단백질 gB, gD 또는 gH이고; 상기 Hib(Haemophilus influenzae type b)의 항원은 PRP[Haemophilus type b capsular polysaccharide(polyribosyl-ribitol-phosphate)] 또는 그의 컨쥬게이트(예컨대, PRP와 테타너스(tetanus) 독소의 컨쥬게이트)이며; 상기 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원은 PI, PII, PIII, 필린(pilin), 지질다당(lipopolysaccharide), 철결합 단백질 또는 프로테오좀이고; 상기 코니너박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원은 디프테리아 독소이며; 상기 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원은 퍼투시스 독소(Pertusis toxin)이고; 상기 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원은 테타너스 독소(Tetanus toxin)이며; 상기 바리셀라 바이러스(Varicella virus)의 항원은 생 약독화 바리셀라 바이러스, 불활 약독화 바리셀라 바이러스, gpI 또는 gpII이다.
또한, 본 발명에서 이용될 수 있는 암 항원의 예는 전립선 특이 항원(Gattuso et al, Human Pathol., 26:123-126 (1995)), TAG-72 및 CEA(carcinoembryonic antigen) (Guadagni et al, Int. J. Biol. Markers, 9:53-60 (1994)), MAGE-1 및 티로시나아제(Coulie et al, J. Immunothera., 14:104-109 (1993)), p53(WO 94/02167), NY-ESO1(cancer-testis antigen), AFP(α-feto protein) 및 암 항원 125(CA-125), EPCA(Early Prostate Cancer Antigen)를 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 그의 기본적인 조성, 즉 항원과 리포폴리사카라이드 유사체만으로도 충분한 면역반응을 유도하여 특정 질환에 대한 예방 효능을 발휘할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 백신 조성물은 위에서 언급한 추가의 면역보조성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 백신은 암 백신, 독감 백신, 결핵 백신, 탄저균 백신, HAV 백신, HBV 백신, HCV 백신, HIV 백신, 단순포진 백신, 뇌수막염 백신, 디프테리아 백신, 백일해 백신, 파상풍 백신 또는 수두 백신일 수 있다.
상기 암은, 이에 의하여 제한되는 것은 아니나, 섬유육종, 방광암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 백신 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-1 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 백신 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 리포폴리사카라이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 리포폴리사카라이드 유사체를 미성숙 수지세포에 처리하는 포함하는 성숙화 수지상 세포의 제조방법을 제공한다.
수지상 세포 백신을 제조함에 있어서, 생체에서 분리한 수지상 세포를 성숙화 시켜야 한다. 이러한 과정에서 상기 리포폴리사카라이드 유사체는 매우 유용하게 이용될 수 있다.
수지상 세포 백신의 제조방법에 따르면, 미성숙 수지상 세포는 단핵구 또는 조혈 모세포로부터 유래된 것이고, 보다 바람직하게는 단핵구로부터 유래된 것이다. 단핵구로부터 수지상 세포를 유도하는 방법이 보다 바람직한 이유는 다기능성 조혈 모세포(pluripotent hematopoietic stem/progenitor cells)를 사용하는 방법 보다 비교적 짧은 보에 균일한 성질의 수지상 세포를 얻을 수 있기 때문이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단핵구는 말초 혈액으로부터 수득한 것이다. 말초 혈액 내의 선조 세포(progenitor cell, 예: 단핵구 또는 조혈 모세포)로부터 미성숙 수지상 세포를 얻는 방법은 말초 혈액 내 세타 다른 세포들로부터 상기 선조 세포를 분리하여 수지상 세포로 분화 유도시키는 과정으로 실시될 수 있고, 또한 말초 혈액 내 다른 세포들로부터 분리되지 않은 형태로서 상기 선조 세포를 수지상 세포로 분화 유도시키는 과정으로 실시될 수도 있다.
이어, 말초 혈액으로부터 얻은 단핵구를 수지상 세포로 분화 유도한다. 수지상 세포로 분화시키기 위하여 적합한 사이토카인이 포함되어 있는 배양기에서 단핵구를 배양한다. 이용되는 사이토카인은 GM-CSF(Granulocyte macrophage colony stimulating factor), IL-4(interleukin-4), IL-13 또는 이의 조합이다. 첨가되는 사이토카인의 적합한 양은 수지상 세포로의 분화를 하는 데 충분한 양으로서 각 연구자의 실험실에서 경험적으로 선택하여 선호되고 있는 양이다.
단핵구로부터 수지상 세포의 분화를 목적으로 하는 제 1 차 배양 시간은 사이토카인을 사용하여 진행할 경우 통상적으로 5일 이상이고, 바람직하게는 6-7일간이다.
상술한 분화 과정에서 수득한 미성숙 수지상 세포를 이용하여 최종적으로 성숙화 과정을 실시한다. 즉, 본 발명의 상기 리포폴리사카라이드 유사체를 포함하는 배지가 있는 배양기에서 배양하여 수지상 세포를 성숙화시킨다. 제 2 차 배양의 시간은 통상적으로 10시간 이상, 바람직하게는 20시간 이상이며, 예컨대 1-3일이다.
본 발명은 효율적으로 성숙화된 수지상 세포 백신을 제조할 수 있도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 새로운 구조의 당쇄 사슬과 지질 A를 포함하는 LPS 유사체 및 이의 용도를 제공한다.
(ii) 본 발명의 LPS 유사체는 waaD 유전자-코딩 효소의 기능부재로 인하여 O-항원을 갖지 않으며, 야생형 LPS의 코어 올리고사카라이드 보다 더 적은 개수의 당을 갖는다.
(iii) 일반 리포폴리사카라이드는 다양한 전사인자의 유도를 통하여 항암효능을 나타낼 수 있으나, 강한 독성을 가지고 있고, 합성 올리고뉴클레오타이드와 결합한 경우 패혈증과 같은 심각한 부작용을 초래할 수 있으나, 본 발명의 리포폴리사카라이드 유사체는 독성이 현저히 감소되어 안전하다.
(iv) 본 발명의 리포폴리사카라이드 유사체는 특정 병원체에 대한 면역반응에서 매우 우수한 면역촉진 효능을 발휘한다.
(v) 본 발명의 리포폴리사카라이드 유사체는 성숙화된 수지상 세포 백신의 제조를 위하여 사용될 수 있다.
도 1은 균주의 스크리닝 과정 중 독성이 가장 낮은 LPS를 생산하는 균주를 선택하기 위하여 그의 지표인 TNF-α의 분비량을 측정한 것이다.
도 2는 도 1에서 선택된 균주(D)에서 생산된 LPS를 정제하여 그 크기를 전기영동 및 실버염색을 통하여 확인한 결과이다.
도 3은 분리된 LPS를 알칼리 처리하였을 때 지질 A가 분해됨으로써 크기가 작아짐을 보여준다. 레인 1은 정제된 LPS이며, 레인 2는 LPS 유사체이다.
도 4는 LPS 유사체의 구조를 보여준다. (A) 및 (B) 코어 OS 부위에 특이적인 단일클론항체에 대한 LPS, LPS 유사체 및 4개의 지질 A 유도체의 반응을 면역블랏 및 ELISA로 확인하였다. 면역블랏의 레인은 다음과 같다: 1, LPS 2.5 ㎍; 2, LPS 유사체 1 ㎍; 3, MPL 4 ㎍; 4, Kdo2-지질 A 4 ㎍; 5, GLA 4 ㎍; 6, S. minnesota R595 유래의 탈독성화 지질 A 4 ㎍; 7, LPS 유사체 1 ㎍. 단백질 사이즈 마커의 위치는 겔의 왼쪽이다. A와 B의 데이터는 각각 비슷한 결과를 나타낸 2번 및 4번의 독립적인 실험결과이다. (C) LPS 유사체의 예측된 화학구조를 나타낸다. 화살표 표시는 waaD 유전자 돌연변이에 의하여 바깥 코어 상의 말달 글루코오스의 이동이 차단된 위치를 나타낸다.
도 5는 LPS, MPL 및 LPS 유사체에 대한 마우스 대식세포와 인간 단핵구의 반응을 보여준다. (A) 마우스 복막 대식세포를 LPS, MPL 또는 LPS 유사체와 함께 24시간 동안 배양하였다. TNF-α, IL-6 및 IL-12의 수준을 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 데이터는 세 번 배양의 평균 ± SD로 표시하였고, 비슷한 결과를 나타낸 두 번의 독립적 실험결과를 나타낸다. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001(MPL-처리 세포와 비교하여). (B) 인간 PBMC 및 단핵구를 LPS, MPL 또는 LPS 유사체와 함께 배양하였다. 배양 상청액을 12시간 또는 24시간에 모으고, TNF 또는 IL-12 생산을 분석하였다. 데이터는 비슷한 결과를 나타낸 세 번의 독립적인 실험결과를 나타낸다.
도 6은 마우스 B 세포 증식에 대한 LPS 유사체의 촉진을 보여준다. B220-양성 세포로부터 히스토그램을 얻었다. 비-자극 비장세포(■).
도 7은 LPS 유사체에 의한 TLR4-매개 B 세포 활성화의 표면 마커 발현을 보여준다. 비-자극 비장세포(■). 데이터는 비슷한 결과를 나타낸 세 번의 독립적인 실혐결과를 나타낸다. 마우스 IL-4(500 U/ml)를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 8은 마우스 BMDC에서 세포 표면 보조자극 분자(cell surface co-stimulatory molecule)와 사이토카인의 증가된 발현을 보여준다. (A) 마우스 BMDC를 LPS, MPL 또는 LPS 유사체의 존재 하에서 24시간 동안 배양하고, CD11c-양성군에서의 CD40, CD80 또는 CD86의 발현을 유세포 분석으로 확인하였다(□). 비교를 위하여 자극받지 않은 비장세포를 나타내었다(■). (B) 각 분자의 MFI(Mean fluorescence intensity)를 히스토그램으로 나타내었다. (C) 배양 상청액에서 TNF-α, IL-6 및 IL-12의 수준을 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 값은 세 번 배양의 평균 ± SD이다. ** 및 ***, 각각 P<0.01 및 P<0.001(MPL-처리 세포와 비교하여). 데이터는 비슷한 결과를 나타낸 네 번의 독립적인 실험결과이다.
도 9는 인간 MDDC에서 보조자극 분자의 상향-조절을 보여준다. (A) 인간 MDDC를 LPS, MPL 또는 LPS 유사체로 24시간 동안 자극하고, CD14-음성군에서 HLA-DR, CD80 또는 CD86의 발현을 유세포 분석기로 확인하였다(□). 자극받지 않은 비장세포(■). (B) MFI 결과를 나타낸다. 데이터는 비슷한 결과를 나타낸 두 번의 독립적인 실험결과를 나타낸다.
도 10은 LPS 유사체로 작극된 동종이계 DC에 대한 T 세포 반응의 활성화를 보여준다. C57BL/6 마우스로부터 분리한 BMDC를 다양한 농도의 LPS 유사체(●) 또는 MPL(○)로 24시간 동안 자극하고, BALB/c 마우스로부터 분리한 naㅿve CD-양성 T 세포와 함께 5일간 공동배양 하였다. 배양 상청액을 모으고, 활성화된 T 세포가 생산한 IFN-γ, IL-5 및 IL-17을 분석하였다. 데이터는 세 번의 반응으로부터 얻은 값의 평균 ± SD로 표현하였다.
도 11은 LPS 유사체 및 MPL을 처리한 C57BL/6 마우스로부터 분리된 BMDC로부터 분비된 IL-12를 보여준다. BMDC를 다양한 농도의 LPS 유사체(●) 및 MPL(○)로 24시간 동안 자극된 C57BL/6 마우스로부터 분리하고, 샌드위치 ELISA를 통하여 IL-12의 수준을 측정하였다.
도 12는 마우스 BMDC 성숙화에 대한 LPS 유사체 활성의 TLR4 의존을 나타낸다. TLR4+/+ 및 TLR4-/- BALB/c 마우스로부터 분리한 BMDC를 LPS, MPL LPS 유사체 또는 배지 단독으로 24시간 동안 자극하였다. CD11c-양성군에서의 CD40, CD80 또는 CD86의 발현을 유세포 분석으로 확인하였다. CpG 올리고뉴클레오타이드(10 ㎍/ml)를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 13은 혈청 사이토카인 프로파일을 보여준다. BALB/c 마우스에 LPS(1 ㎍), MPL(1 또는 5 ㎍) 또는 LPS 유사체(1 또는 5 ㎍) 단독, 또는 알륨과 1:50의 비율로 조합하여 근육 내 투여하였다. 대조군 및 알륨 그룹에는 각각 식염수 및 250 ㎍의 알륨을 투여하였다. 혈액을 투여 1시간 또는 4시간 후에 모으고, 각 혈청 샘플을 가지고 사이토카인 수준을 측정하였다. 데이터는 세 마리의 마우스로부터 얻은 값의 평균 ± SD로 표현하였다.
도 14는 마우스에서의 LPS 유사체의 급성 독성 테스트 결과를 보여준다. 다섯 마리의 수컷(A) 및 암컷(B) ICR 마우스 그룹에 PBS 또는 LPS 유사체를 단일 근육 내 투여하였다. 체중 변화와 사망률을 2주 동안 모니터링 하였다. 데이터는 다섯 마리 마우스의 평균 ± SD로 표현하였다. *, P<0.05; **,P<0.01; ***,P<0.001(PBS 대조군 그룹과 비교하여)
도 15는 백신 바이러스 주에 대한 혈청 전체 IgG 및 아이소타입 항체 타이터를 보여준다. 마우스를 0.3 ㎍의 3가 인플루엔자 분할 백신 항원 단독 또는 면역보조제와 함께 2주 간격으로 두 번 면역화하였다. 대조군 마우스에는 PBS를 투여하였다. 각 그룹에서 6마리의 마우스로부터 마지막 면역화 4주 후에 혈청을 채취하였다. A/California/07/2009(A), A/Perth/16/2009(B) 또는 B/Brisbane/60/2008(C)에 특이적인 혈청 IgG 항체 타이터를 결정하기 위하여, 종점 희석 ELISA(End-point dilution ELISA)를 실시하였다. 값은 각 그룹의 6마리 마우스의 종점 타이터의 기하 평균 ± SD로 나타내었다.
도 16은 인플루엔자 바이러스주에 대한 혈청 HI 항체 타이터를 보여준다. 마우스를 3가 인플루엔자 분할 백신 항원 단독 또는 면역보조제와 함께 두 번 면역화하였다. 값은 각 그룹의 6마리 마우스로부터 얻은 값의 기하 평균 ± SD로 나타내었다.
도 17은 비장세포에서 3가 인플루엔자 분할 백신 항원 특이적 IgG 항체 분비 B 세포의 생산의 유도를 보여준다. 인플루엔자 백신 항원 단독 또는 면역보조제와 함께 두 번 면역화 된 마우스로부터 비장세포를 분리하였다. ELISpot 분석으로 IgG 항체 분비 비장세포를 분석하였다. 결과를 각 두 개의 비장을 이용한 세 번의 분석으로부터 얻은 값의 평균 ± SD로 나타내었다.
도 18은 비장에서에서의 사이토카인 분비 수준을 보여준다. 인플루엔자 백신 항원 단독 또는 면역보조제와 함께 두 번 면역화 된 마우스로부터 분리된 비장에서 IFN-γ(A) 및 IL-5(B) 생산 유도를 보여준다. 4주 후, 2 ㎍/ml의 각 인플루엔자 바이러스 백신 항원으로 3일간 비장세포를 자극하고, 배지의 사이토카인 수준을 ELISA로 측정하였다.
도 19는 백신 바이러스 주에 대한 혈청 전체 IgG 항체 타이터를 보여준다. 마우스를 0.05 ㎍의 인플루엔자 분할 백신 항원 단독 또는 면역보조제와 함께 2주 간격으로 두 번 면역화하였다. 각 그룹에서 5마리의 마우스로부터 마지막 면역화 2주 후에 혈청을 채취하였다. A/California/04/2009에 특이적인 혈청 IgG 항체 타이터를 결정하기 위하여, 종점 희석 ELISA(End-point dilution ELISA)를 실시하였다. 혈청 샘플을 세 번 분석하고, 값을 각 그룹의 종점 타이터의 기하 평균 ㅁ SD로 나타내었다.
도 20은 면역화가 이루어진 마우스에서 동질 바이러스 치사 접종에 대한 보호(homologous virus lethal challenge)를 보여준다. 면역화 된 마우스 및 대조군 마우스에 A/California/04/2009 (H1N1) mouse adapted influenza virus의 치사량(10 LD50)을 2차 백신접종 4주후에 비 내(intranasally) 접종하였다. 체중 변화(A) 및 생존율(B)을 접종 후 14일간 기록하였다.
도 21은 백신 항원에 대한 혈청 전체 IgG 및 IgG1 항체 타이터를 보여준다. 마우스를 2 ㎍의 3종의 재조합 결핵 백신 항원 단독 또는 면역보조제와 함께 2주 간격으로 세 번 면역화하였다. 각 그룹에서 6마리의 마우스로부터 마지막 면역화 3주후에 혈청을 채취하였다. 결핵 백신 항원인 Ag85A(A), HspX(B) 또는 ESAT-6 (C)에 특이적인 혈청 IgG 항체 타이터를 결정하기 위하여, 종점 희석 ELISA를 실시하였다. 값은 각 그룹의 6마리 마우스의 종점 타이터의 기하 평균 ± SD로 나타내었다.
도 22는 비장세포에서 재조합 결핵 항원 특이적 IFN-γ 사이토카인 분비 세포 생산의 유도를 보여준다. 마우스를 2주 간격으로 결핵 백신 항원 단독 또는 면역보조제와 함께 세 번 면역화하였다. 마지막 면역화 3주 후, 비장세포를 각 결핵 백신 항원으로 24시간 동안 자극하였다. IFN-γ 분비 비장세포를 SLISpot 분석으로 확인하였다. (A) IFN-γ 양성 스팟 이미지. (B) IFN-γ 양성 스팟의 평균 ㅁ SD로 표현된 그래프. 결과는 각 두 개의 비장을 사용한 세 번의 분석으로부터 얻은 값의 평균 ± SD로 표현하였다.
도 23은 비장세포에서 IFN-γ 사이토카인 분비 수준을 보여준다. 결핵 백신 항원 단독 또는 면역보조제와 조합하여 세 번 면역화한 마우스로부터 분리한 비장세포에서의 IFN-γ 사이토카인 생산의 유도. 마지막 면역화 3주 후, 비장세포를 각 결핵 백신 항원 1 ㎍/ml로 자극하였다. 항 CD4 또는/및 항 CD8 항체를 3일간 처리하여 CD4- 또는/및 CD8-T 세포를 대폭 감소시켰다. (A) Ag85A 특이적 IFN-γ 사이토카인 수준. (B) HspX 특이적 IFN-γ 사이토카인 수준. (C) ESAT-6 특이적 IFN-γ 사이토카인 수준. 배지의 사이토카인 수준을 ELISA로 확인하였다.
도 24는 비장세포에서 IL-17 사이토카인의 분비 수준을 보여준다. 결핵 백신 항원 단독 또는 면역보조제와 조합하여 세 번 면역화한 마우스로부터 분리한 비장세포에서의 IL-17 사이토카인 생산의 유도. 마지막 면역화 3주 후, 비장세포를 각 결핵 백신 항원 1 ㎍/ml로 3일 동안 자극하였다. 배지의 사이토카인 수준을 ELISA로 확인하였다.
도 25는 백신 항원에 대한 혈청 전체 IgG 및 아이소타입 항체 타이터를 보여준다. 마우스를 2 또는 1 ㎍의 3종의 재조합 결핵 백신 항원 단독 또는 면역보조제와 함께 2주 간격으로 세 번 면역화하였다. 각 그룹에서 6마리의 마우스로부터 마지막 면역화 3주후에 혈청을 채취하였다. 결핵 백신 항원인 Ag85A(A), HspX(B) 또는 ESAT-6(C)에 특이적인 혈청 IgG 항체 타이터를 결정하기 위하여, 종점 희석 ELISA를 실시하였다. 값은 각 그룹의 6마리 마우스의 종점 타이터의 기하 평균 ㅁ SD로 나타내었다.
도 26은 비장세포에서의 IFN-γ 사이토카인 분비 수준을 보여준다. 결핵 백신 항원 단독 또는 면역보조제와 조합하여 세 번 면역화한 마우스로부터 분리한 비장세포에서의 IFN-γ 사이토카인 생산의 유도. 마지막 면역화 3주 후, 비장세포를 각 결핵 백신 항원 1 ug/ml로 3일간 자극하였다. 배지의 사이토카인 수준을 ELISA로 확인하였다.
상기 도면에서 본 발명의 LPS 유사체를 ★로 나타내었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
제조예. LPS 유사체의 제조
1. 매우 짧은 LPS를 생산하는 변이 대장균 스크리닝
건강한 사람의 장에 사는 대장균으로부터 LPS 당 사슬의 길이가 매우 짧은 LPS를 생산하는 균주(E.coli EG0023)를 발굴하였으며 스크리닝 방법은 다음과 같다. 건강한 성인 남성의 장에서 얻은 대장균의 단일 콜로니를 액체 배양하여 선별하는 과정을 5회 반복하였고, 이 후 50종의 균주를 1차 선별하였다. 선별된 50종의 균주는 플레이트에서 콜로니 하나를 따서 0.9% 생리식염수 4 ㎖ 에 충분히 현탁시킨 후, 그 중 1 ㎖을 에펜도르프 튜브에 옮겨서 DNA 분해효소 1(DNase 1)을 2 ㎕ 처리하고m 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시켰다. DNA 분해효소 1 처리 후 반응이 종료된 균액은 10 mg/㎖의 RNA 분해효소(RNase)를 50 ㎕ 처리한 후 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 20 mg/㎖의 단백질분해효소(proteinase) K를 100 ㎕ 첨가한 후, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 이와 같은 과정을 거쳐 얻은 각 균주의 LPS를 과립구대식세포콜로니자극인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)로 분화시킨 인간 림프구 세포주에 처리한 후, TNF-a 분비를 측정하여 가장 낮은 값을 보이는 균주 5개를 2차 선택하였고, 2차 선별된 5개의 균주를 재배양 하여 위의 방법으로 TNF-a 값을 확인하여 가장 낮은 수치를 보이는 균주(D)를 선택하였다(도 1). 또한, 선택된 균주의 LPS를 전기영동 및 실버염색 하여 LPS의 분자량을 확인하였다. 이 균주는 형태학적이나 균 자체의 특성은 전혀 변함이 없고, 단지 5-10만의 분자량을 갖는 LPS 래더(ladder)가 없고, 2-7천 달톤(Da)의 분자량을 갖는 LPS를 생산함을 확인하였으며(도 2), 균주명을 EG0023으로 명명하였다.
2. 변이 대장균으로부터 LPS의 정제
대장균 EG-0023을 37℃ TSB(Triptic soy broth; Difco) 30 g/ℓ 배지에서 20시간 동안 정치배양한 후, 원심분리기를 이용하여 세포를 회수하였다. 준비된 균체에 두 배 부피의 에탄올을 잘 섞은 후 4,000g에서 원심분리 하여 침전물을 수득하였다. 이후, 수득한 침전물에 1.5배 부피의 아세톤을 첨가해 충분히 섞은 후 4,000g에서 원심분리 하였다.
수득한 침전물에 동량의 에틸에테르를 가해 잘 섞은 후, 4,000g에서 원심 분리하였다. 원심분리 하여 얻은 세포 침전물을 알루미늄 호일을 덮고 구멍을 낸 뒤 말린 다음, 균체 중량을 측정한 후 건조 중량 1g 당 7.5 ㎖씩 추출혼합액(90% 페놀 : 클로로포름 : 정유(Petroleum)에테르 = 2 : 5 : 8)을 첨가하였다.
상기 대장균 및 추출혼합액의 혼합물을 유리 원심관에 분주하고, 25℃, 3000 rpm(1,200g)으로 20분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 후드에 12시간 동안 방치하여 가라앉힌 후, 유리 원심관에 분주하였다. 상기 유리 원심관을 25℃, 3000 rpm (1,200g)으로 20분간 원심분리 하여 얻은 LPS를 에틸에테르에 녹인 다음, LPS를 에펜도르프 튜브로 옮긴 후 후드에서 건조시키고, 케미컬 밸런스를 이용하여 건조중량을 측정한 후 에탄올을 첨가하여 사용직전까지 보관하였다.
에탄올에 보관된 정제 대장균 LPS는 완전히 에탄올을 제거한 후 LPS 스탠다드(List Biological Lab.)를 이용하여 LPS 내에 KDO(2-케토-3-디옥시옥토네이트)의 양을 측정하고, 농도를 측정한 후 SDS-PAGE로 크기에 따라 분리하여 실버 염색으로 확인하였다. LPS의 크기는 약 2천에서 6천 사이의 크기로 일반 대장균 LPS에 비해 매우 작은 크기임을 확인하였다(도 3, 레인 A).
3. LPS의 독성 제거
정제한 대장균 LPS를 3 mg/㎖ 농도로 맞춘 후 0.2N NaOH를 1:1 볼륨으로 섞은 후, 60℃에서 10분마다 한 번씩 흔들어주며 140분간 탈아실화 시켰다. 이후, 초기 0.2N NaOH 양의 약 1/5정도의 1N 아세트산을 첨가하여 pH 7.0으로 적정하였다. pH 적정 후 에탄올 침전법을 이용하여 비독성 LPS를 수득하였다. 비독성 LPS는 KDO 방법으로 농도를 측정한 후 SDS-PAGE로 처리 전 LPS와 비교하여 크기의 변화를 실버 염색으로 확인하였다. 실버 염색 결과 알카리 처리에 의해 LPS의 지질 A가 분해되어 알카리 처리 전 LPS에 비해 크기가 작아졌음을 확인하였다(도 3, 레인 B). 본 명세서에서는 상기 탈아실화를 통하여 독성이 제거된 LPS를 LPS 유사체로 명명한다.
실험예 1. LPS 유사체의 구조적 특성 및 면역촉진 효능 확인
1. 실험재료 및 실험방법
균주의 염기서열 분석
EG0023 균주와 야생형(wild type) E. coli의 염색체 DNA 염기서열을 분석하기 위해 우선 두 가지 균주를 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지에서 배양을 실시하였다. 균의 생장이 확인된 후 염기서열 분석 전문업체인 제노텍(genotech)에 염색체 DNA 전체 서열 분석 서비스를 의뢰하여 분석하였다. DNA 서열 분석 방법을 간략히 설명하면 다음과 같다. 균주에서 염색체 DNA를 정제한 후, PRISM 3730xl(Applied Biosystem)을 이용하여 서열분석을 실시하였다. 사이클 시퀀싱(Cycle sequencing) 방법으로 Bigdye terminator 키트(Applied Biosystem)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 96℃에서 10초, 50℃에서 10초, 60℃에서 3분을 1 사이클로 하여 총 30 사이클를 실시하였다. PCR을 마친 후, 반응에 참여하지 않은 형광물질을 EtOH 침전법으로 제거한 후, PCR 산물을 멸균수에 녹인 다음 모세관 전기영동을 실시하여 염기서열을 분석하였다. 얻어진 결과는 데이터베이스화하여 두 균주간의 유전자적 차이점을 제노텍에서 제공하는 NewGAS 서비스를 이용하여 비교하였다.
MALDI-TOF 분석
샘플을 증류수(5 mg/ml)에 녹이고, 매트릭스(2,5-디하이드록시벤조산, Sigma)와 혼합하였다. Axima-LNR V2.1.0 질량분석계(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 MALDI-TOF 분석을 수행하였다.
면역블랏 분석
샘플을 X-cell IITM Mini-Cell(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 SDS-그래디언트 폴리아크릴아미드 겔(EzWay PAG Pre-cast gel, 4-12%, Koma Biotech, Seoul, Korea) 상에서 분리하고, 이동 버퍼(25 mM TrisㅧCl, pH 8.3, 192 mM 글라이신, 20% v/v 메탄올)에서 100V에서 1시간 동안 PVDF(polyvinylidene difluoride)막 상으로 블롯팅 하였다. 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS(PBST, pH 7.3)와 5% 탈지유를 사용하여 하룻밤 동안 막을 블록하고, 상온에서 두 시간 동안 항-LPS 코어 mAb를 처리하였다. 결합된 항체를 HRP(horseradish peroxidase; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)-결합 염소 항-마우스 IgG 항체와 함께 인큐베이션하여 검출한 다음, peroxidase substrate DAB 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 현상하였다. LPS 유도체를 SDS 폴리아크릴아미드 겔의 은 염색법(silver-staining)을 통하여 확인하였다.
ELISA
LPS, LPS 유사체 및 지질 A 유도체에 대한 항-LPS 코어 mAb의 반응성을 ELISA로 확인하였다. PBS로 단계 희석된 샘플 100 ㅅl로 4℃에서 하룻밤 동안 96-웰 면역플레이트(ThermoFisher Scientific)를 코팅하였다. PBST로 웰을 네 번 세척하고 상온에서 두 시간 동안 PBS에서 1% BSA로 블록하였다. 플레이트를 상온에서 두 시간 동안 항-LPS 코어 mAb로 인큐베이션 하였다. 결합 항체를 HRP-결합 염소 항-마우스 IgG로 검출하고, 발색기질(chromogenic substrate)로서 o-phenylenediamine dihydrochloride 용액(SIGMAFASTTM OPD, Sigma-Aldrich)과 함께 인큐베이션 하였다. 1N H2SO4(100 ml)의 용량을 반응종결을 위하여 첨가하고, 492 nm에서의 흡광도를 EL800 유니버셜 마이크로플레이트 리더(Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 측정하였다.
복막 대식세포에 의한 사이토카인 생산 측정
각 6주령 BALB/c 마우스에 3% 타이오글리콜레이트 배지(thioglycollate medium, 2 ml)를 복강 내 투여하였다. 투여 3일 후, 대식세포를 모으기 위하여 복막강을 10 ml의 차가운 배양배지로 씻어내었다. 세포를 100 mm 배양 디쉬에 분주하고, 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 비-부착 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척하여 제거하였다. 부착세포를 96-웰 플레이트에서 2.5 X 105 세포/웰의 밀도로 배양하고, LPS, MPL, LPS 유사체 또는 배지 단독으로 24시간 동안 자극하였다. 분비된 사이토카인은 샌드위치 ELISA을 이용하여 평가하였다.
인간 PBMC 및 단핵구의 배양과 분리
건강한 기증자로부터 분리한 인간 혈액을 헤파린 처리한 튜브에서 모았다. PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)를 Ficoll-PaqueTM density gradient(GE HealthCare, Uppsala, Sweden) 상에서 분리하였다. PBMC를 완전배지(L-글루타민, 10% FBS 및 25 mM HEPES가 첨가된 RPMI1640)가 담긴 24-웰 플레이트에서 5 X 106 세포/ml의 밀도로 배양하였다. CD14 마이크로비드와 자기 분리기(MACS; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용한 양성선택으로 PBMC로부터 단핵구를 분리하였다. 분리된 CD14-양성 단핵구의 순도는 >85%였다(FACSCalibur flow cytometer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). 인간 PBMC 및 단핵구를 LPS, MPL 또는 LPS 유사체로 12 및 24시간 동안 자극하였다. 무-세포 배양 상청액을 모으고, 방출된 사이토카인을 Duoset assay 또는 OptEIATM Set을 사용하여 측정하였다.
마우스 BMDC ( Bone marrow - derived dendritic cells ) 활성화 확인
BALB/c 마우스의 뒷다리 장골로부터 골수를 분리하였다. 적혈구 용해(lysis) 후, 10% FBS, 글루타민(2 mM), β-머캅토에탄올(5 μM), GM-CSF(10 ng/ ml) 및 IL-4(1 ng/ml)가 첨가된 RPMI1640에서 1 X 106 세포/ml의 밀도로 현탁하였다. 세포를 모으기 전 7일간 배양하였다. CD11c 마이크로비드를 사용한 양성선택을 통하여 BMDC를 분리하고, LPS(Sigma-Aldrich), MPL(Sigma-Aldrich), LPS 유사체 또는 배지 단독으로 24시간 동안 자극하였다. 이후, CD11c-FITC, CD40-PE, CD80-PE 및 CD86-PE 항체를 사용하여 세포 표면 마커를 염색한 다음, 유세포 분석(flow cytometry; FACSCaliburTM flow cytometer, Becton Dickinson)을 실시하였다. 샘플 분석은 CELLQuestPro 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 실시하였다. CD11c-양성 세포의 CD40, CD80 또는 CD86의 발현을 분석하였다. 활성화된 BMDC를 함유하는 배양 배지를 이용하여 샌드위치 ELISA를 통하여 사이토카인 수준을 측정하였다.
B 세포 증식 확인
B 세포 증식을 확인하기 위하여, 마우스 비장세포를 CFSE(5 μM)로 염색하고, LPS, MPL 또는 LPS 유사체의 존재 하에서 3일간 배양하였다. 세포를 모으고, 항-B220-PerCP mAb로 염색한 다음, 유세포 분석하였다. B220-양성 세포를 통과시키고, CFSE의 강도를 분석하였다.
TLR4 +/+ 및 TLR4 -/- 마우스에서의 B 세포 표면 분자 발현의 측정
TLR4+/+ 및 TLR4-/- BALB/c 마우스로부터 비장세포를 분리하였다. RBC 용해 후, 비장세포를 1 X 106 세포/ml의 밀도로 분주하고, LPS. MPL 또는 LPS 유사체의 존재 하에서 48시간 동안 배양하였다. 양성 대조군 세포에 마우스 IL-4(500 U/ml)를 처리하였다. 세포를 모으고, 항-B220-PerCP mAb와, 항-I-A-FITC mAb,항-CD80-PE mAb 또는 항-CD86-PE mAb로 염색한 다음, 유세포 분석을 실시하였다. B220-양성 세포를 통과시키고, I-A, CD80 및 CD86의 발현을 분석하였다.
인간 MDDC 성숙의 확인
MDDC(monocyte-derived DC)를 얻기 위하여, CD14-양성 인간 단핵구를 1 X 106 세포/ml의 밀도로 24-웰 플레이트에 분주하고, IL-4(1000 U/ml), GM-CSF(500 U/ml) 및 1% 비-필수 아미노산 보충 배지에서 배양하였다. 배지의 반을 매 2일마다 교체하였다. 6일 후, LPS, MPL 또는 LPS 유사체로 24시간 동안 인큐베이션 하여 미성숙 DC의 성숙을 유도하였다. HLA-DR-PE, CD80-FITC 또는 CD86-PE 항체를 사용하여 세포 표면 마커의 발현을 알아보기 위하여 염색하였다. MDDC를 항-CD14-FITC mAb로 이중 염색한 다음, 유세포 분석을 하였다. CD14-음성 세포를 통과시키고, HLA-DR, CD80 또는 CD86의 발현을 분석하였다.
동종이계 T 세포 반응 분석
C57BL/6 마우스로부터 얻은 BMDC를 MPL 또는 LPS 유사체로 24시간 동안 자극하였다. 신선한 배지로 세척한 후, 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트로 접종하였다. Naㅿve CD4-양성 T 세포를 BALB/c 마우스(CD4+ T cell isolation kit II, Miltenyi Biotec)의 비장으로부터 정제하였다. 자극받은 BMDC를 1:10 또는 1:20(BMDC : T 세포)의 비율로 CD4-양성 T 세포(2 X 105 세포)가 담긴 웰에 첨가하고, 5일간 배양하였다. 배양 상청액에서의 IFN-γ, IL-5 및 IL-17의 분비는 샌드위치 ELISA로 확인하였다.
마우스 혈청 사이토카인 수준의 분석
LPS(1 μg), MPL(1 또는 5 μg) 또는 LPS 유사체(1 또는 5 μg) 단독, 또는 알륨(Alhydrogelⓡ)과 조합하여(1:50 비율) BALB/c 마우스(n=3)에 투여(I.M.)하였다. 대조군 마우스에는 식염수를 투여하였다. 투여 1 및 4시간 후 혈액을 채취하고, 2시간 동안 상온에서 응고시킨 다음, 원심분리 하였다. 각 혈청 샘플을 대상으로 멀티플렉스 사이토카인 분석(Milliplex MAP assay kit, Millipore, Billerica, MA, USA)을 실시하여 사이토카인 및 케모카인의 수준을 측정하였다.
급성 독성 테스트
8주령의 SPF(specific pathogen-free) ICR 마우스(n=5)에 PBS 또는 LPS 유사체(0.25, 0.5 또는 1.0 mg/kg 체중)를 주사(I.M.)하였다. 각 마우스의 체중과 사망률을 모니터링 하였다. 14일 째, 각 마우스를 마취시키고 안락사 시킨 다음, 부검을 실시하였다.
발열성(Pyrogenicity) 테스트
수컷 뉴질랜드 흰 토끼(>3 kg)를 사용하여 알륨과 LPS 유사체 조합의 발열성을 확인하였다. 본 테스트는 우수실험실관리기준(good laboratory practice) 조건 하의 European Pharmacopoeia 7판 가이드라인을 따르는 Harlan Laboratories(Indianapolis, Indiana, USA)에서 실시하였다. 각 토끼의 무게를 재었다. 시험물질을 투여하기 전에 적어도 90분 동안 30분 간격으로 각 토끼의 내부 체온을 기록하였다. 각 토끼에 귀 정맥을 통하여 LPS 유사체와 알륨을 인간 투여량(1 ml/kg 체중)의 1/60을 투여하였다. 각 토끼의 온도를 투여 후 3시간 동안 30분 간격으로 기록하였다. 투여 후 최고 온도와 평균 초기 온도 사이의 차이를 계산하였다.
통계분석
실험그룹 사이의 차이의 통계적 유의성을 결정하기 위하여, 일원배치 분산분석을 이용하였다(SPSS 12.0, IBM, New York, USA). 0.05 미만의 p 값을 통계적으로 유의성 있는 것으로 고려하였다. 두 실험그룹을 비교하기 위하여, two-tailed Student's t-test를 사용하였다.
2. 실험결과
LPS 유사체의 화학구조(LPS 유사체를 생산하는 균주의 WaaD 유전자 결손)
LPS 유사체의 분자 질량을 측정하기 위하여 MALDI-TOF 분석을 실시하였다. LPS 유사체의 질량스펙트럼 프로파일은 몇몇 피크를 나타내었다: 2826.67 m/z에서 높은(predominant) 피크와 2405.90 m/z, 1801.16 m/z, 1455.59 m/z 및 1233.16 m/z에서 복수의 작은(minor) 피크. 주 피크 주위에, 복수의 피크가 m/z22 보다 낮은 또는 높은 질량으로 나타났으며, 이는 Na+의 연속적인 첨가를 나타낸다. 이 클러스터에서 가장 작은 분자 종은 2804 m/z에서 나타났으며, 이는 LPS 유사체의 분자 질량이다. 탈아실화 전과 후의 분자 질량 차이는 633.23 m/z였으며, 이는 세 개의 C14 지방산과 상응하였다.
GC-질량 분석을 통하여 LPS 유사체의 지질 성분을 분석하였다. 지방산의 가수분해 및 에스터화 후, 유도 산(derivatized acid)을 헥산으로 추출하고, 건조 피리딘으로 분해한 다음 BSTFA-TMCS를 처리하였다. 최종 생성물의 분석 결과, LPS 유사체는 C14 지방산은 포함하고 있었으나, C12 지방산을 가지고 있지 않았다.
LPS 유사체의 탄수화물 코어 길이를 측정하기 위하여, E. coli LPS 변이주 및 모균주의 전체 지놈 시퀀싱(genome squencing)을 실시하였다. 그 결과, 두 균주의 유전적 차이 중 LPS와 관련된 유전자는 21개로 파악되며, 특히 당의 합성에 관여하여 LPS 길이에 영향을 주는 WaaD 유전자가 결손되어 있는 것으로 확인되었다(표 1). 두 균주의 지놈 서열 비교 결과, 변이균주는 조면 콜로니 균주(rough strain)에서 완전히 삭제된 waaD 유전자를 포함하고 있었다. 상기 waaD 유전자는 UDP-글루코오스:(글루코실) LPS α-1,2-글루코실 트란스페라아제를 코딩한다. 상기 유전자의 결함은 바깥 코어 상의 말단 글루코오스의 손실을 유도하며, 이는 O-폴리사카라이드의 연결(ligate)의 불능을 초래한다. 그러므로, LPS 돌연변이주는 말단 글루코오스가 결실된 코어 OS(말단 글루코오스의 결실에 의하여 O-항원이 없으며, 코어 OS의 당의 개수가 야생형 LPS에 비하여 적음) 및 지질 A를 포함할 것으로 예상된다.
Figure 112013090177721-pat00005
LPS 코어 부위에 특이적인 mAb WN1 222-5(Muller-Loennies S, Brade L, Brade H. Int J Med Microbiol 297: 321-340(2007))를 사용한 면역블랏 분석을 통하여 코어 OS 잔기의 존재를 확인하였다. WN1 225-5는 LPS와 LPS 유사체에는 결합하였으나, 4개의 지질 A 유도체에는 결합하지 않았다(도 4의 A). 겔 결과 또한 LPS 유사체가 LPS의 지질 A-코어 OS 보다 크기가 작음을 분명히 보여주었다. WN1 225-5와 LPS, LPS 유사체 또는 지질 A 유도체 사이의 반응성을 비교하기 위하여 ELISA를 실시하였고, 그 결과 항체는 LPS 및 LPS 유사체와 잘 반응하였으나, 다른 지질 A 유도체와는 반응하지 않았다(도 4의 B). LPS 유사체의 높은 OD(optical density)는 LPS와 비교한 LPS 유사체의 보다 큰 몰비에서 기인한 것일 것이다. 이러한 결과는, LPS 유사체가 코어 OS 잔기를 보유하고 있음을 확인시켜 준다.
이상의 데이터에 기초하여, LPS 유사체의 화학 구조를 예측하였다(도 4의 C). 그 결과, LPS 유사체는 헵토오스-포스페이트 에피토프 및 두 개의 Kdo 잔기를 포함하는 말단 글루코오스 잔기가 없는 코어 OS, 및 오직 두 개의 N-연결 아실 그룹과 두 개의 포스페이트 그룹을 포함하는 지질 A를 포함한다.
Endosafeⓡ-포터블 테스트 시스템(PTS)을 사용하여 측정한 LPS 유사체의 내독소 활성은 5.4 X 103 EU/mg이었으며, 이는 MPL에 맞먹는 값이다.
마우스와 인간 면역세포에서 LPS 유사체와 MPL의 면역촉진 활성 비교
LPS 유사체의 면역촉진 활성을 확인하기 위하여, LPS, LPS 유사체 및 MPL의 마우스 및 인간 1차 면역세포에 대한 활성을 알아보았다. 마우스 복막 대식세포를 다양한 농도의 LPS, LPS 유사체 및 MPL로 자극하였다. 분비된 TNF-α, IL-6 및 IL-12의 수준을 측정하였다(도 5의 A). LPS-자극된 대식세포에서, 1 ㎍/ml까지 농도-의존적으로 상기 세 사이토카인의 수준이 증가하였고, LPS 유사체 또는 MPL로 자극된 것 보다 유의성 있게 높았다. LPS 유사체 및 MPL에 대한 면역반응은 0.01 또는 0.1 ㎍/ml에서 정체기에 도달하였다. LPS 유사체에 대한 반응은 저농도에서 MPL 보다 높았다. 사이토카인 분비를 유도하는 능력에 있어서, 반응은 >0.1 ㎍/ml의 농도에서 더 낮았다.
LPS, LPS 유사체 및 MPL의 생물학적 기능을 인간 면역세포에서 조사하였다(도 5의 B). 0.01 ㎍/ml로 PBMC에 처리한 경우, LPS와 LPS 유사체는 TNF 및 IL-12 유도에서 서로 유사하였으며, MPL 보다 높았다. 증가된 LPS 유사체의 농도는 세포 반응을 증가시키지 못하였다. 정제된 단핵구에서는 두 사이토카인의 유도에서 LPS 유사체가 MPL 보다 더 활성이라는 패턴을 보여주었다. 이러한 결과는, LPS 유사체의 면역자극 활성이 마우스 대식세포에서는 MPL과 비슷하나, 인간 면역세포에서는 더 우수함을 보여준다.
LPS는 B 세포의 강력한 자극원이기 때문에, LPS 유사체가 B 세포를 활성화할 수 있는지 조사하였다. CFSE로 염색된 마우스 지라세포를 LPS, LPS 유사체 또는 MPL로 자극시켰다. B220-양성 세포에서 CFSE 발현의 강도를 분석하였다. LPS 유사체에 의하여 유도된 B 세포의 증식은 LPS-처리 세포와 유사하였으나, MPL-처리 세포 보다는 높았다(도 6). B220+ 세포 상의 표면 항원의 증가된 발현 역시 상기 세포에서 관찰되었다(도 7).
LPS 유사체에 의한 DC 성숙 및 활성화
LPS는 TLR4 신호전달경로를 통하여 DC 활성화와 성숙의 유도자로서 기능한다. 이러한 특성은 백신 항원에 대한 선천성 면역 반응을 적응 반응에 연결하는 면역보조제의 능력에 있어 중요하다. 이전의 연구는, 지질 A 상에 적어도 5개의 아실 그룹으로 구성된 경우 TLR4 아고니스트가 생물학적 활성을 보유하는 것으로 보고하였다. LPS 유사체는 오직 두 개의 아실 그룹을 가지기 때문에, LPS 유사체가 DC 활성화를 유도할 수 있는지 조사하였다. 마우스 BMDC를 LPS, MPL 또는 LPS 유사체로 자극하였다. BMDC 성숙 상태를 CD11c-양성 세포 상의 세포 표면 분자(CD40, CD80 및 CD86)의 발현을 측정하여 확인하였다. 상기 표면 보조자극성(co-stimulatory) 분자의 발현을 증진시키는 능력에 있어서, LPS 유사체는 LPS와 유사하였으며, MPL 보다 더 효과적이었다(도 8의 A 및 B).
DC 활성화 및 성숙을 알아보기 위하여, 사이토카인 분비를 측정하였다. LPS, MPL 또는 LPS 유사체로 자극된 BMDC의 상청액에서의 TNF-α, IL-6 및 IL-12의 수준을 측정하였다(도 8의 C). 모든 사이토카인 반응은 0.01 mg/ml의 LPS를 처리한 BMDC에서 가장 높았다. LPS 유사체(0.01 ㎍/ml)에 의하여 유도된 TNF-α 생산은 MPL에 의하여 유도된 TNF-α 생산 보다 1.4배 높았다. LPS 유사체(0.01 ㎍/ml)에 반응한 IL-6 및 IL-12의 분비는 동량의 MPL에 비하여 10배 이상이었으며, 1 ㎍/ml에서 정체기에 도달하였다. IL-12는 전형적인 Th1 유형의 사이토카인이고, IL-6은 기능성 CTL 분화에서 중대한 역할을 한다. 따라서, 이러한 결과는 LPS 유사체는 Th1 유형 면역 반응, 특히 기능성 CTL 활성을 유도하는데 효과적이나, 제한된 수준으로 염증 반응을 유도함을 보여준다.
LPS 유사체가 인간 MDDC 성숙에 영향을 미칠 수 있는지 확인하기 위하여, LPS, LPS 유사체 또는 MPL로 세포를 자극하고, CD14-음성 세포에서 HLA-DR, CD80 및 CD86의 표면 마커의 발현을 분석하였다(도 9). LPS 유사체는 보조자극 분자 MHC 클래스 II, CD80 및 CD86의 발현을 LPS와 유사한 수준으로 상향-조절하였으며, MPL 보다는 높았다. LPS 유사체 처리된 세포로부터 분비된 높은 사이토카인 IL-12 역시 MPS와 비교하여 LPS 유사체에 대하여 강력한 활성을 나타내었다. 이러한 결과들은, LPS 유사체가 마우스 및 인간 DC의 성숙을 유도하는데 있어 더 효과적임을 뒷받침한다.
LPS 유사체에 의하여 유도된 T 세포 반응의 극성(polarization) 확인
LPS 유사체에 의하여 유도된 T 세포 반응의 극성을 알아보기 위하여, LPS 유사체에 의하여 활성화된 DC에 대한 동종이계 T 세포의 반응을 조사하였다. BALB/c 마우스로부터 분리된 Naㅿve CD4 T 세포를 LPS 유사체 또는 MPL로 활성화된 BMDC(C57BL/6 마우스)와 공동 배양하였다. IFN-γ, IL-5 및 IL-17의 분비 수준을 측정하였다(도 10). 낮은 농도(0.001 ㎍/ml)에서, LPS 유사체는 대표적인 Th2 유형 사이토카인인 IL-5의 분비를 촉진하였다. Th1 유형 사이토카인인 IFN-γ의 분비는 0.01 ㎍/ml의 LPS 유사체까지 증가한 다음 감소하였다. Th17 유형 사이토카인인 IL-17의 분비는 LPS 유사체의 가장 많은 용량(1 ㎍/ml)까지 용량 의존적으로 증가하였다. MPL에 의하여 유도된 세 종류의 사이토카인의 패턴은 LPS 유사체를 처리하여 얻은 패턴과 유사하였으나, MPL의 경우 IFN-γ 및 IL-5의 최고 반응이 LPS 유사체 보다 높은 농도에서 나타났다는 점에서 차이가 있었다. C57BL/6 BMDC로부터 분비된 IL-12는 LPS 유사체-처리 세포에서 10배 이상 높았으며, 이는 T 세포 사이토카인의 차이를 설명해준다(도 11). 이상의 결과는, LPS 유사체가 Th1, Th2 및 Th17 반응을 유도함을 보여준다. T 세포 반응의 극성 정도는 LPS 유사체의 농도에 영향을 받는다.
LPS 유사체 면역자극 활성의 TLR4 의존
LPS와 지질 A 유도체는 TLR4 신호전달경로를 통하여 활성을 나타낸다. LPS 유사체는 TLR4-매개 활성을 방해할 수 있는 두 개의 아실 그룹을 포함한다. 따라서, LPS 유사체의 생물학적 활성이 TLR4 의존적인지 조사하였다. TLR4-야생형 또는 TLR4-/- 마우스로부터 분리된 BMDC를 LPS, MPL 또는 LPS 유사체로 자극하고, CD11c-양성 세포에서의 CD40, CD80 및 CD86의 세포 표면 발현을 확인하였다(도 12). 도 6에 나타난 것과 일치하게, LPS, MPL 및 LPS 유사체는 야생형 마우스에서 BMDC 상의 보조자극성 분자의 발현을 증가시켰다. TLR-/- 마우스 유래의 BMDC에서는 표면 분자 발현이 유도되지 않았다. TLR9 아고니스트인 CpG는 두 세포 유형에서 강력한 활성을 나타내었다. DC 활성화를 확인하기 위하여 사이토카인 분비를 측정하였다. TNF-α 및 IL-12의 증가된 분비가 LPS, MPL 또는 LPS 유사체로 자극된 야생형 BMDC의 상청액에서 관찰되었다. TLR4-결핍 BMDC의 상청액에서는 사이토카인이 검출되지 않았다. CpG-처리 세포는 TLR4 발현과 상관없이 두 사이토카인의 분비를 유도하였다.
TLR4-의존적 LPS 유사체 활성을 TLR4-결핍 마우스로부터 분리한 B 세포에서 조사하였다. MHC 클래스 II 분자 및 CD86의 세포 표면 발현은 LPS, MPL 또는 LPS 유사체 노출에 의하여 용량 의존적으로 증가하였다(도 7). TLR4 -/- B 세포에서, MHC 클래스 II 분자 또는 CD86의 발현이 없었다. 양성 대조군으로 사용된 IL-4의 발현은 두 세포 유형에서 증가하였다. 반면, LPS는 심지어 TLR4-결핍 B 세포에서도 낮은 활성을 보였다. 이러한 결과는, 대체적인 LPS에 의하여 활성화된 경로(LPS-activated pathway), 아마도 LPS O-항원에 의한 다중클론성 활성화가 존재함을 시사한다(Kim ML, Slauch JM. FEMS Immunol Med Microbiol 26:83-92(1999)). LPS 유사체에 의한 TLR4-매개 자극을 마우스 복막 대식세포에서 다시 한 번 확인하였다. 이상의 결과는, LPS 유사체가 면역세포에서 TLR4 발현에 기능적으로 의존하고 있음을 보여준다.
LPS 유사체에 의한 인 비보 사이토카인 분비 유도
LPS 유사체 면역자극 활성을 인 비보에서 더 조사하였다. LPS 유사체 투여(I.M.)는 염증유발 사이토카인인 TNF-α와 IL-6, Th1-유형 사이토카인인 IFN-γ와 IL-12, 및 케모카인인 IP-10, MIG-1, MCP-1 및 RANTES의 분비를 유도하였다(도 13). LPS 유사체-유도 사이토카인 수준은 MPL에 의하여 유도된 수준보다 높았다. LPS 유사체와 알륨의 병용투여는 사이토카인 및 케모카인의 분비를 상당히 감소시켰다. IL-6은 예외였으나, 유도는 알륨의 존재 하에서 지연되었다. 이러한 결과는, LPS 유사체 면역자극 활성이 인 비보에서 MPL 보다 더 우수함을 보여준다. LPS 유사체와 알륨의 병용은 염증유발 사이토카인 및 케모카인의 유도를 상당히 감소시켰으며, 불필요하게 높은 염증반응 없이 백신 효능에서 필요한 선천 및 획득 면역반응을 촉진시키는데 충분하였다.
LPS 유사체의 안전성
LPS 유사체 급성 독성 테스트에서, 모든 실험동물에서 일반적인 외형과 행동에서의 비정상적인 변화가 관찰되지 않았다. 모든 LPS 유사체 용량에서, 투여 1일 후 수컷과 암컷 마우스에서 대조군에 비하여 체중이 감소하였다. 암컷 마우스에서, 체중은 3일후부터 대조군과 비슷하였다(도 14). 암컷 마우스와 비교하여, 수컷 마우스에서 체중의 감소가 더 현저하였으나, 모든 LPS 유사체-처리 그룹에서 7일째 체중이 회복되었다. 부검에서 모든 처리된 동물에서 중대한 변화가 관찰되지 않았는데, 이는 상기 감소가 LPS 유사체와 관련 없음을 보여준다. 이상의 결과를 기초로, LPS 유사체의 치사량을 1 mg/kg 체중 초과로 결론내릴 수 있었다.
LPS 유사체를 알륨과 조합하여 인간 백신 어쥬번트로 사용할 수 있음을 고려하여, LPS 유사체와 알륨 조합의 발열성 테스트를 하였다. 세 마리의 토끼에 LPS 유사체와 알륨을 투여하고, 처리 후의 각 토끼의 반응을 측정하였다. 발열성 테스트 결과는 0.25℃, 0.10℃ 및 0.00℃였다. 세 마리 토끼의 총 반응은 0.35℃였으며, 이는 양성 발열성 테스트의 역치 기준온도(1.15℃) 보다 낮은 값이었다. 이러한 결과는 알륨과 조합하여 사용한 LPS 유사체는 정맥 투여에 발열성이 아님을 보여준다.
실험예 2. 인플루엔자 백신으로서의 LPS 유사체의 면역촉진 효능 확인
1. LPS 유사체의 면역촉진 효능 확인 ①
마우스 면역화
2010년 계절인플루엔자 3가 백신 항원(A/California/07/2009 (H1N1), A/Victoria/210/2008 (H3N2), B/Brisbane/60/2008 분할 백신 항원)에 표 2의 조합으로 마우스를 면역화하였다. 각 인플루엔자 바이러스 주 항원 0.1 μg (HA 기준)을 혼합하여 총 0.3 μg의 백신 항원과 면역증강제를 표 1과 같은 조성으로 혼합하고 마우스 당 100 μl를 주사하였다. BALB/c 마우스를 2주 간격으로 2회 근육 주사하여 면역화하고 마지막 면역화 4주 후 마우스의 혈청 및 비장세포 등을 추출해 면역 반응 지표들을 분석하였다.
그룹 백신 조성 (per dose)
대조군 PBS
Ag Ag 0.3 ug
Ag + Alum Ag 0.3 ug, Alum 12.5 ug
Ag + LPS 유사체 + Alum Ag 0.3 ug, LPS 유사체 0.25 ug, Alum 12.5 ug
Ag + CAP Ag 0.3 ug, CAP 25 ug
Ag + LPS 유사체 + CAP Ag 0.3 ug, LPS 유사체 0.5 ug, CAP 25 ug
Ag + AddaVax Ag 0.3 ug + AddaVax 50 μl [1:1 (v/v)]
인플루엔자 바이러스 특이적 혈중 IgG 항체역가 측정
면역증강제 시스템을 적용한 인플루엔자 백신의 체액성 면역반응 증강 효과를 분석하기 위하여 면역화한 마우스의 혈청을 분리하여 항원 특이적 혈중 전체 IgG 항체 역가를 ELISA법으로 측정하였다. A/California/07/2009 (H1N1), A/Perth/16/2009 (H3N2), B/Brisbane/60/2008 바이러스를 각각 16 HAU/웰로 코팅하여 ELISA를 수행하였으며, ELISA 플레이트 간의 편차를 보정하기 위하여 각 플레이트에 고 역가 혈청을 포함시켰다. 백신 항원이 코팅된 플레이트에 1% BSA-PBS 용액을 상온에서 한 시간 가하여 블록킹 한 후 세척하고 2배 계열 희석한 마우스 혈청을 100 μl 씩 가하여 37℃에서 두 시간 반응시켰다. 반응이 종료된 플레이트를 0.05%-PBST 용액으로 세척하고 HRP가 붙은 2차 항체를 가하여 상온에서 한 시간 반응시켰다. 세척 후 TMB 기질용액을 사용하여 5 분간 발색하고 1 N H2SO4 용액으로 반응을 종료한 후 OD450에서 흡광도를 측정하였다. OD 0.1을 나타내는 혈청 희석 배수를 IgG 항체역가로 정하고 그룹 당 마우스의 항체역가를 기하평균으로 계산하였다. 실험결과는 도 15에 나타내었다.
면역화 된 마우스 혈청의 HI 역가 분석
면역화 된 마우스 항체의 HI 역가를 측정하기 위하여 면역화 된 마우스의 혈청을 Receptor destroying enzyme (RDE)과 1:3 비율로 섞어 37℃에서 18-20시간가량 반응시킨 후 56℃에서 30분간 반응시켜 열-불활성화 시켜 비특이적인 반응을 제거하였다. 반응이 종료된 혈청은 2배 계열희석한 후 8 HAU의 A/CAlifornia/07/2009 (H1N1), A/Perth/16/2009 (H3N2), B/Brisbane/60/2008 바이러스와 각각 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 1% turkey RBC 용액을 가하고 3 시간동안 정치 반응시켜 면역화 된 마우스혈청의 HI 역가를 측정하였다. 적혈구 응집반응(Hemagglutination)을 억제하는 혈청 희석 배수를 HI 역가로 정하고 그룹 당 마우스의 항체역가를 기하평균으로 계산하였다. 실험결과는 도 16에 나타내었다.
비장 세포에서의 항원 특이적 항체 분비능을 가진 기억 B 세포 생성능 분석
비장 세포에 존재하는 항원 특이적 항체 분비능을 가진 B 세포 생성 정도를 분석하였다. 인플루엔자 백신 항원과 면역증강제를 사용하여 2회 면역화한 후 최종 면역화로부터 4주 뒤 마우스의 비장 조직 세포를 적출한 후 항원 특이적인 IgG 항체를 분비하는 B 세포를 ELISPOT 시험법으로 검출하였다. 마지막 면역화 후 4주 뒤 마우스의 비장 조직 세포를 적출한 후 3일간 두었다. 3일 뒤 세포 수를 측정한 후 LPS 1 μg/1x106 세포로 2일간 비장세포를 자극하였다. 2일 뒤 세포 수를 측정하여 1x106 세포부터 두 단계씩 계열 희석한 후 각각의 항원 1 μg이 코팅 된 ELISPOT 플레이트에 비장 세포를 심고 1일간 배양하였다. 이후, 세포를 제거하고 항-IgG 항체를 처리하여 상온에서 2시간 반응한 후 세척하고 스트렙타아비딘-HRP 용액을 가하여 상온에서 한 시간 반응시킨 후 발색용액을 가하였다. 검출된 항원특이적인 항체를 분비하는 B 세포 스팟을 ELISPOT 판독기로 읽어 분석하였다. 실험결과는 도 17에 나타내었다.
인플루엔자 항원 특이적 사이토카인 유도 활성 분석
인플루엔자 항원 특이적 사이토카인 분비를 분석하기 위하여 인플루엔자 백신 항원과 면역증강제를 사용하여 2회 면역화한 후 최종 면역화로부터 2주 후 마우스의 비장세포를 분리하였다. 비장세포를 인플루엔자 항원 2 μg으로 자극시키고, 3일간 배양 후 상층액을 분리하여 IFN-γ 및 IL-5 사이토카인 유도 활성을 ELISA법으로 분석하였다. 분리한 상층액 및 각 사이토카인 표준품을 사이토카인에 대한 항체가 코팅된 플레이트에 각각 100 μl 씩 가하여 30℃에서 두 시간 반응시켰다. 반응이 종료된 플레이트를 0.5%-PBST 용액으로 세척하고 2차 항체를 가하여 30℃에서 반응 후 세척하였다. HRP 용액을 가하여 반응시킨 후 세척하고 TMB 기질용액을 사용하여 발색한 후 반응을 종료시키고 OD450에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과는 도 18에 나타내었다.
2. LPS 유사체의 면역촉진 효능 확인 ②
마우스 면역화
A/California/07/2009 (H1N1) 분할 백신 항원 0.05 ug에 하기 표 3의 조합으로 마우스를 면역화 하였다. 마우스 당 100 μl를 주사하였다. BALB/c 마우스를 2주 간격으로 2회 근육 주사하여 면역화하고 2주 후 마우스의 혈청을 추출해 면역 반응 지표들을 분석하였다. 마지막 면역화 4주 후 A/California/04/2009 (H1N1) mouse adpated 바이러스를 10 LD50로 마우스에 감염시켜 몸무게 변화율과 생존율을 관찰하였다.
그룹 백신 조성 (per dose)
대조군 PBS
Adjuvant 대조군 Alum 25 ug + LPS 유사체 0.5 ug
Ag Ag 0.05 ug
Ag + LPS 유사체 Ag 0.05 ug, LPS 유사체 0.5 ug
Ag + Alum Ag 0.05 ug, Alum 12.5 ug
Ag + LPS 유사체 +Alum Ag 0.05 ug, LPS 유사체 0.25 ug, Alum 12.5 ug
Ag + CAP Ag 0.05 ug, CAP 25 ug
Ag + CAP+ LPS 유사체 Ag 0.05 ug, LPS 유사체 0.5 ug, CAP 25 ug
Ag + AddaVax Ag 0.05 ug, AddaVax 50 μl [1:1 (v/v)]
인플루엔자 바이러스 특이적 혈중 IgG 항체역가 측정
면역증강제 시스템을 적용한 인플루엔자 백신의 체액성 면역반응 증강 효과를 분석하기 위하여 면역화한 마우스의 혈청을 분리하여 항원 특이적 혈중 전체 IgG 항체 역가를 ELISA법으로 측정하였다. A/California/04/2009 (H1N1) 바이러스를 16 HAU/웰로 코팅하여 ELISA를 수행하였다. 백신 항원이 코팅된 플레이트에 1% BSA-PBS 용액을 상온에서 한 시간 가하여 블록킹 한 후 세척하고 2배 계열 희석한 마우스 혈청을 100 μl 씩 가하여 37℃에서 두 시간 반응시켰다. 반응이 종료된 플레이트를 0.05%-PBST 용액으로 세척하고 HRP가 붙은 2차 항체를 가하여 상온에서 한 시간 반응시켰다. 세척 후 TMB 기질용액을 사용하여 5-15 분간 발색하고 0.5 N HCl 용액으로 반응을 종료한 후 OD450에서 흡광도를 측정하였다. OD 0.1을 나타내는 혈청 희석 배수를 IgG 항체역가로 정하고 그룹 당 마우스의 항체역가를 기하평균으로 계산하였다. 실험결과는 도 19에 나타내었다.
면역화 된 마우스 혈청의 HI 역가 분석
면역화 된 마우스 항체의 HI 역가를 측정하기 위하여 면역화 된 마우스의 혈청을 Receptor destroying enzyme (RDE)과 1:3 비율로 섞어 37℃에서 18-20시간가량 반응시킨 후 56℃에서 30분간 반응시켜 열-불활성화 시켜 비특이적인 반응을 제거하였다. 반응이 종료된 혈청은 2배 계열희석한 후 8 HAU의 A/CAlifornia/07/2009 (H1N1) 바이러스와 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 0.5% chicken RBC 용액을 가하고 3 시간동안 정치 반응시켜 면역화 된 마우스혈청의 HI 역가를 측정하였다. 적혈구 응집반응을 억제하는 혈청 희석 배수를 HI 역가로 정하였다. 실험결과는 표 4에 나타내었다.
Figure 112013090177721-pat00006
인플루엔자 바이러스 중화 항체 생성능 평가
면역화된 마우스 혈청 내의 바이러스 중화 항체 생성능을 평가하기 위해, 면역화 된 마우스의 혈청을 Receptor destroying enzyme (RDE)과 1:3 비율로 섞어 37℃에서 18-20시간가량 반응시킨 후 56℃에서 30분간 반응시켜 열-불활성화 시켜 비특이적인 반응을 제거하였다. 반응이 종료된 혈청은 2배 계열희석한 후 100 TCID50의 A/California/04/2009 (H1N1) 바이러스와 반응시켰다. 96 웰플레이트에 MDCK 세포주를 1.5 X 105 세포/ml로 심고, 바이러스와 혈청 반응액을 가한 후 1시간 동안 세포배양기에서 배양하였다. 배양 후 반응액을 제거한 후 새로운 배양배지를 넣어 세포를 18-20시간 동안 세포배양기에서 배양하였다. 배양액을 제거한 후 PBS로 세포를 세척한 후 차가운 아세톤으로 세포를 10분간 고정하였다. 아세톤을 버리고 세포를 상온에서 15분간 건조시켰다. 0.05%-PBST 용액으로 세척한 후 비오틴이 붙은 인플루엔자 NP 단클론 항체를 넣어 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 종료된 플레이트를 0.05%-PBST 용액으로 세척하고 HRP가 붙은 2차 항체를 가하여 상온에서 한 시간 반응시켰다. 세척 후 OPD 기질용액을 사용하여 5-15 분간 발색하고 1 N H2SO4 용액으로 반응을 종료한 후 OD490에서 흡광도를 측정하였다. OD 0.1 이상을 나타내는 혈청 희석 배수를 바이러스 중화 항체역가로 정하였다. 실험결과는 표 5에 나타내었다.
Figure 112013090177721-pat00007
마우스 모델에서의 면역증강제에 의한 인플루엔자 바이러스 감염방어력 증강효과 평가
면역증강제를 이용한 인플루엔자 백신의 인플루엔자 바이러스에 대한 감염방어력 증강효과를 평가하기 위해 A/California/07/09 split 백신항원 0.05 μg을 면역증강제와 혼합하여 2주 간격으로 2회 면역화 하였다. 마지막 주사 4주 후 A/California/04/09, mouse adapted 인플루엔자 바이러스 주를 10 LD50 사용하여 마우스 비강에 감염시켰다. 그 후 2주간 마우스의 생존율과 체중변화를 조사하였다. 실험결과는 도 20에 나타내었다.
실험예 3. 결핵 백신으로서의 LPS 유사체의 면역촉진 효능 확인
1. LPS 유사체의 면역촉진 효능 확인 ①
마우스 면역화
마우스에서 Ag85A/HspX/ESAT-6를 혼합한 결핵백신에서의 면역보조제 시스템의 면역 활성을 평가하기 위하여 Ag85A, HspX, ESAT-6 각 2 μg을 혼합하여 혼합백신항원으로 사용하고 이에 면역보조제시스템을 표 6과 같은 조성으로 혼합하여 결핵백신을 제조하였다.
6 주령의 자성 C57BL/6 마우스 대퇴부에 조합한 결핵백신을 2주 간격으로 3회 주사하여 면역화하고 최종 접종일로부터 3주 후에 마우스로부터 혈액, 비장을 채취하였다. 마우스를 케타민과 럼푼으로 마취한 후 심장채혈하고, 혈액을 4℃에서 12시간 이상 방치한 후 원심 분리하여 혈청을 분리하고 -70℃에 보관하였다. 비장 조직은 단일세포로 분리한 후 실험에 사용하였다.
실험군 백신 조성
Adjuvant 대조군 LPS 유사체 0.5 μg + Alum 25 μg
Ag Ag85A 2 μg + HspX 2 μg + ESAT-6 2 μg
Ag + LPS 유사체 Ag85A 2 μg + HspX 2 μg + ESAT-6 2 μg + LPS 유사체 0.5 μg
Ag + LPS 유사체/Alum Ag85A 2 μg + HspX 2 μg + ESAT-6 2 μg + LPS 유사체 0.5 μg + Alum 25 μg
Ag + LPS 유사체/DDA Ag85A 2 μg + HspX 2 μg + ESAT-6 2 μg + LPS 유사체 0.5 μg + DDA 250 μg
결핵백신항원 특이적 혈중 IgG 역가 분석
Ag85A, HspX, ESAT-6를 혼합하여 제조한 결핵백신의 면역보조제시스템에 의한 체액성 면역반응 증강효과를 ELISA 법으로 분석하였다. 면역플레이트에 재조합단백질항원 Ag85A, HspX, ESAT-6를 각각 1 μg/ml로 코팅하여 수행하였으며, ELISA 플레이트 간의 편차를 보정하기 위하여 각 플레이트에 고 역가 혈청을 포함시켰다. 백신 항원이 코팅된 플레이트에 1% BSA-PBS 용액을 37℃에서 한 시간 가하여 블록킹한 후 세척하고 2배 계열 희석한 마우스 혈청을 100 μl 씩 가하여 37℃에서 두 시간 반응시켰다. 반응이 종료된 플레이트를 0.5%-PBST 용액으로 세척하고 HRP가 붙은 2차 항체를 가하여 상온에서 한 시간 반응시켰다. 세척 후 TMB 기질용액을 사용하여 5 분간 발색하고 1 N H2SO4 용액으로 반응을 종료하고 OD450에서 흡광도를 측정하였다. OD 0.1을 나타내는 혈청 희석 배수를 IgG 항체역가로 정하고 그룹 당 마우스의 항체역가를 기하평균으로 계산하였다. 실험결과는 도 21에 나타내었다.
결핵백신항원 특이적 IFN-γ 사이토카인 분비 세포 분석
면역보조제시스템을 조합한 결핵백신의 항원 특이적인 T 세포 활성을 분석하기 위해 결핵 백신 항원과 면역보조제시스템을 사용하여 3회 면역화한 후 최종 면역화로부터 3주 후 마우스의 비장세포를 사용하여 IFN-γ ELISpot을 수행하였다. 항-마우스 IFN-γ 항체를 코팅한 플레이트에 면역화 한 마우스로부터 분리한 비장세포를 5 x 106 세포/ml 부터 두단계 씩 계열 희석하여 100 μl/웰로 심었다. 세포를 2 μg 항원으로 처리하여 자극하고 37℃ 세포배양기에서 24 시간동안 배양하였다. 세포를 제거하고 스트렙타아비딘-HRP 결합 이차항체를 처리한 후, AEC 기질을 가하여 발색하였다. CTL ELISpot 리더를 사용하여 생성된 면역스팟을 분석하였다. 실험결과는 도 22에 나타내었다.
결핵백신항원 특이적인 사이토카인 분비활성 분석
결핵백신항원 특이적 사이토카인 분비를 분석하기 위하여 결핵 백신 항원과 면역보조제시스템을 사용하여 3회 면역화한 후 최종 면역화로부터 3주 후 마우스의 비장세포를 채취하였다. 채취한 비장세포를 1 x 107 세포/ml 농도로 96 웰 플레이트에 100 ul/웰로 심은 후 Ag85A, HspX, ESAT-6 항원을 1 ug/웰로 처리하였다. 비장세포를 37℃ 세포배양기에서 72시간 동안 배양한 후 배지로 분비된 IFN-γ, IL-17 등의 사이토카인 농도를 샌드위치 ELISA법으로 측정하였다. 실험결과는 도 23 및 24에 나타내었다.
T 세포 subset 의존적인 IFN-γ분비활성
면역보조제 시스템에 의해 활성화되는 결핵백신 항원 특이적인 IFN-γ 분비가 어떠한 T 세포 subset 의존적으로 나타나는 현상인지 분석하기 위하여 결핵 백신 항원과 면역보조제시스템을 사용하여 3회 면역화한 후 최종 면역화로부터 3주 후 마우스의 비장세포를 채취하였다. 비장세포에 항-마우스 CD4 항체 또는 항-마우스 CD8 항체를 처리하고, 결핵 항원 1 μg/웰로 세포를 자극시킨 후 3일간 배양하였다. 이후 상층액을 분리하여 IFN-γ 농도를 ELISA법으로 분석하여 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비를 비교 분석하였다. 실험결과는 도 23에 나타내었다.
2. LPS 유사체의 면역촉진 효능 확인 ②
마우스 면역화
마우스에서 Ag85A/HspX/ESAT-6를 혼합한 결핵백신에서의 면역보조제시스템의 면역 활성을 평가하기 위하여 Ag85A, HspX, ESAT-6 각 2 μg 또는 1 μg을 혼합하여 혼합백신항원으로 사용하고 이에 면역보조제시스템을 혼합하여 혼합물을 표 7과 같은 조성으로 결핵백신을 제조하였다.
6 주령의 자성 C57BL/6 마우스 대퇴부에 조합한 결핵백신을 2주 간격으로 3회 주사하여 면역화하고 최종 접종일로부터 3주 후에 마우스로부터 혈액, 비장을 채취하였다. 마우스를 케타민과 럼푼으로 마취한 후 심장채혈하고, 혈액을 4℃에서 12시간 이상 방치한 후 원심 분리하여 혈청을 분리하고 -70℃에 보관하였다. 비장 조직은 단일세포로 분리한 후 실험에 사용하였다.
실험군 백신 조성
대조군 PBS
Ag Ag85A 2 μg + HspX 2 μg + ESAT-6 1 μg
Ag + CAP Ag85A 2 μg + HspX 2 μg + ESAT-6 1 μg
Ag + LPS 유사체 Ag85A 2 μg + HspX 2 μg + ESAT-6 1 μg + LPS 유사체 0.5 μg
Ag + LPS 유사체 + CAP Ag85A 2 μg + HspX 2 μg + ESAT-6 1 μg + LPS 유사체 0.5 μg + CAP 25 μg
Ag + LPS 유사체 + DDA Ag85A 2 μg + HspX 2 μg + ESAT-6 1 μg + LPS 유사체 0.5 μg + DDA 250 μg
결핵백신항원 특이적 혈중 IgG 역가 분석
Ag85A, HspX, ESAT-6를 혼합하여 제조한 결핵백신의 면역보조제시스템에 의한 체액성 면역반응 증강효과를 ELISA 법으로 분석하였다. 면역플레이트에 재조합단백질항원 Ag85A, HspX, ESAT-6를 각각 1 μg/ml로 코팅하여 수행하였으며, ELISA 플레이트 간의 편차를 보정하기 위하여 각 플레이트에 고 역가 혈청을 포함시켰다. 백신 항원이 코팅된 플레이트에 1% BSA-PBS 용액을 37℃에서 한 시간 가하여 블록킹 한 후 세척하고 2배 계열 희석한 마우스 혈청을 100 μl 씩 가하여 37℃에서 두 시간 반응시켰다. 반응이 종료된 플레이트를 0.5%-PBST 용액으로 세척하고 HRP가 붙은 2차 항체를 가하여 상온에서 한 시간 반응시켰다. 세척 후 TMB 기질용액을 사용하여 5 분간 발색하고 1 N H2SO4 용액으로 반응을 종료하고 OD450에서 흡광도를 측정하였다. OD 0.1을 나타내는 혈청 희석 배수를 IgG 항체역가로 정하고 그룹 당 마우스의 항체역가를 기하평균으로 계산하였다. 실험결과는 도 25에 나타내었다.
결핵백신항원 특이적인 IFN-γ 사이토카인 분비활성 분석
결핵백신항원 특이적 사이토카인 분비를 분석하기 위하여 결핵 백신 항원과 면역보조제시스템을 사용하여 3회 면역화한 후 최종 면역화로부터 3주 후 마우스의 비장세포를 채취하였다. 채취한 비장세포를 1 x 107 세포/ml 농도로 96 웰 플레이트에 100 μl/웰로 심은 후 Ag85A, HspX, ESAT-6 항원을 1 ug/웰로 처리하였다. 비장세포를 37℃ 세포배양기에서 72시간 동안 배양한 후 배지로 분비된 IFN-γ 사이토카인 농도를 샌드위치 ELISA법으로 측정하였다. 실험결과는 도 26에 나타내었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11218P 20111109

Claims (23)

  1. waaD 유전자-코딩 효소가 기능하지 못하는 그람-음성 박테리아로부터 분리된 LPS에 알카리 처리하여 지질 A가 탈아실화 된 LPS 유사체로서,
    상기 LPS 유사체는 waaD 유전자-코딩 효소의 기능부재로 인하여 O-항원을 갖지 않으며; 바깥 코어 올리고사카라이드와 내부 코어 올리고사카라이드를 포함하되, 이들의 당의 개수가 야생형 LPS의 당 개수 보다 적은 코어 올리고사카라이드, 및 상기 내부 코어 올리고사카라이드의 당에 연결된 지질 A를 포함하고; 상기 지질 A는 포스페이트를 갖는 글루코사민 디사카라이드(glucosamine disaccharide)와, 상기 글루코사민 디사카라이드에 N-연결된(N-linked) 지방산을 포함하는 것을 특징으로 하는 LPS 유사체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 waaD 유전자-코딩 효소의 기능부재는 waaD 유전자 염기서열의 전체 또는 일부의 결실, 치환 또는 삽입에 의한 것을 특징으로 하는 유사체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 코어 올리고사카라이드의 당은 헥소오스, N-아세틸 헥소사민, 헵토오스 및 Kdo(2-케토-3-디옥시-옥토네이트)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유사체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 바깥 코어 올리고사카라이드는 당으로서 헥소오스 및 N-아세틸 헥소사민을 포함하는 것을 특징으로 하는 유사체.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 내부 코어 올리고사카라이드는 당으로서 헵토오스 및 Kdo를 포함하는 것을 특징으로 하는 유사체.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 지질 A가 연결된 내부 코어 올리고사카라이드의 당은 Kdo인 것을 특징으로 하는 유사체.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 지질 A는 O-연결된(O-linked) 지방산을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 유사체.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 LPS 유사체는 2000-4000 Da의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 유사체.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 그람-음성 박테리아는 대장균인 것을 특징으로 하는 유사체.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 LPS 유사체는 면역촉진(immunostimulatory) 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 유사체.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 LPS 유사체는 Th1-, Th2- 및 Th17-유형 면역반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 유사체.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 코어 올리고사카라이드의 당 개수는 6-9개인 것을 특징으로 하는 유사체
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 LPS 유사체를 유효성분으로 포함하는 면역보조(adjuvant) 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 면역보조 조성물은 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2족 원소 또는 이의 염; Ti, Zr, Hf 및 Rf로 구성된 군으로부터 선택되는 제4족 원소; 알루미늄의 염과 그의 수화물; 및 디메틸옥타데실암모니윰 브로마이드로 구성된 군으로부터 선택된 면역보조성분을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 면역보조 조성물은 알루미늄 하이드록사이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 면역보조 조성물은 암 백신용 면역보조 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 13 항에 있어서, 상기 면역보조 조성물은 칼슘포스페이트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 면역보조 조성물은 인플루엔자 백신용 또는 결핵 백신용 면역보조 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. (a) 항원; 및
    (b) 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 LPS 유사체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 항원은 펩티드, 단백질, 핵산, 당(sugar), 병원균, 약독화된 병원균, 비활성화된 병원균, 바이러스, 바이러스-유사 입자(VLP), 세포 또는 세포 조각인 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 항원은 결핵균 항원, 탄저균 항원, HAV(Hepatitis A virus)의 항원, HBV(Hepatitis B virus)의 항원, HCV(Hepatitis C virus)의 항원, HIV(human immunodeficiency virus)의 항원, 인플루엔자 바이러스의 항원, HSV(Herpes simplex virus)의 항원, Hib(Haemophilus influenzae type b)의 항원, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 항원, 코니너박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 항원, 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)의 항원, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 항원, HPV(human papilloma virus)의 항원 및 바리셀라 바이러스(Varicella virus)의 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 19 항에 있어서, 상기 백신은 암 백신, 독감 백신, 결핵 백신, 탄저균 백신, HAV 백신, HBV 백신, HCV 백신, HIV 백신, 단순포진 백신, 뇌수막염 백신, 디프테리아 백신, 백일해 백신, 파상풍 백신 또는 수두 백신인 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 LPS 유사체를 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
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