KR20070036020A - 세포독성 반응의 어쥬번트 유도물질로서 프로테오리포솜 및그 유도체류와 수득된 제형 - Google Patents

Abstract

본 발명은 곰팡이, 바이러스, 기생충, 박테리아 감염(주로 세포내 감염) 또는 암의 효과적인 치료 및 예방을 위한 백신 조성물의 분야에 관한 것이다. 기술적인 목적은 프로테오리포솜 및 그 유도체류를 사용함에 의해 예방적 또는 치료적 백신으로 사용되어 지는 어쥬번트를 얻는 것으로, 이들 구조에 삽입되고, 이들에 컨쥬게이트되거나 또는 혼합된 항원에 함께 투여되는 것으로 항원에 대해 T 세포독성 림프구에 의해 중개된 반응을 유도한다. 따라서, 비경구로 또는 점막 경로(바람직하기로는 코)로 투여되는 항원을 갖는 프로테오리포솜 또는 그 유도체류의 다수의 제형이 얻어진다. 프로테오리포솜 및 그 유도체류의 이 새로운 용도와 얻어진 항원성 제형은 약학 산업에서 새로운 백신을 얻는데 적용될 수 있다.

CTL 반응, 프로테오리포솜, 백신 어쥬번트, 나이세리아(Neisseria)

Description

세포독성 반응의 어쥬번트 유도물질로서 프로테오리포솜 및 그 유도체류와 수득된 제형{PROTEOLIPOSOMES AND DERIVATIVES THEREOF AS CITOTOXIC RESPONSE-INDUCING ADJUVANTS AND RESULTING FORMULATIONS}

본 발명은 백신 분야 및 의약으로의 그 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 얻어진 백신 제형 및 어쥬번트의 용도에 관한 것이다.

기술적인 목적은 곰팡이, 바이러스, 기생균 또는 암 항원에 대한 면역 반응을 증가하는 것, 특히 이들 항원에 대해 필수적인 세포독성 T-세포 반응의 유도를 증대하는 것이다. 이 접근은 예방 또는 치료적 백신 제형의 개발을 이끈다.

상기 언급된 기술적 목적을 달성하기 위해, 프로테오리포솜 구조에 삽입될 뿐 아니라 이들 구조와 컨쥬게이트되든가 또는 혼합된 곰팡이, 바이러스, 기생균 또는 종양 항원을 포함하는 백신 제형에 어쥬번트로서 프로테오리포솜 및 그 유도체류를 사용하는 것이 제안된다. 이들 제형은 점막 또는 비경구 경로 또는 이들의 조합에 의해 투여되어진 항원에 대해 T 세포독성 림포사이트에 의해 형성된 면역 반응을 유발하는, 유도 항원(Perez O et al. Infect Immun. 2001, 69(7):4502-4508)으로 프로테오리포솜 및 그 유도체류에 의하여 유도된 선택적인 Th1 면역 반응을 확장할 것이다.

세포 내의 곰팡이, 바이러스, 기생충 및 균에 의한 감염은 종종 전 세계에 걸친 병상의 원인이 된다. 암은 또한 인간에게 끔찍한 재앙이다. 이들 감염 및 인간 세포의 암은 세포질의 시토졸에 다량의 항원의 생산을 의미하고, 이들 대부분은 주요 조직적합유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex; MHC) 클래스 I의 분자에 연계된 세포 표면으로 이동된다 (Heemels, M.-T. and H. Ploegh, 1995. Generation, translocation, and presentation of MHC class I-restricted peptides. Annu. Rev. Biochem. 64,463-491; Rock, K.L. 1996. A new foreign policy: MHC class I molecules monitor the outside world. Immunol. Today 17, 131-137; Jondal, M., R. Schirmbeck, and J. Reimann. 1996. MHC class I restricted CTL responses to exogenous antigens. Immunity 5:295-302; and Reimann, J. and S. H. E. Kaufmann. 1997. Alternative antigen processing pathways in anti-infective immunity. Curr. Opin. Immunol. 9:462-469)

면역 반응은 세포성 (Th1) 및 체액성 (Th2)으로 표현형으로 분할되어 왔다. Th1/Th2 패턴은 처음으로는 T CD4⁺ 림포사이트에 의해 분비된 시토킨: 주로는 Th1에 의한 IFNγ 및 IL12와 Th2에 의한 IL4 및 IL5에 의해 구분되어 진다 (Mossman, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A, and R. L. Coffman. 1986. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136:2348-2357). 게다 가, 각 반응 패턴의 혈청 이뮤노글로불린 특징의 클래스 및 서브클래스 프로필을 결정함에 의해 유발된 반응의 타입을 평가하는 것 또한 가능하다. 따라서, 마우스에 있어서 Th1 패턴은 주로 IgG2a 서브클래스의 항원을 유도하고(IFNγ에 의존), 반면에 Th2는 IgE 및 IgG1 서브클래스를 유도한다(IL4에 의존). 인간에 있어서는, Th1 패턴은 주로 IgG1 및 IgG3 서브클래스의 항원을 유도하고, Th2는 IgE 클래스를 유도한다.

비-림프성 세포에 의해 생산된 다른 시토킨은 또한 이들 패턴의 T-세포 반응에 연계된다. 이는 Th1 패턴에 연계된 IL2 및 IL18의 케이스이다. 게다가, IFNγ 및 IL10은 각각 Th2 및 Th1 반응의 저해제로 작용한다.

이들 분류는 또한 주로 시토킨 생산 유사물에 기초된 Tc1 및 Tc2로 분류되어진 T CD8⁺ 림프구로 확장되어 왔다. T CD8⁺ 림프구는 중요한 조정자이고, 세포 독성활성의 유도물질이다. 이들은 그런 다음 이펙터 세포로서 뿐 아니라 다른 것보다 많은 반응 형태로 전개하는 조절 세포로 작용한다. 따라서, 생체 외에서 재-자극 되어 면역된 동물의 이차 림프성 기관 또는 면역된 대상의 주피의 단일핵 세포의 증식에 존재하는 림프구 서브셋트 T CD4⁺ 또는 T CD8⁺ 의 결정은 이들 두 개체군의 자극의 중요한 증거이다.

종양 세포와 세포 내 병원균으로 감염된 세포를 제거하는 것이 필요하다. T CD8+ 림프구의 세포독성 (CTL) 활성은 이런 관점에서 가장 효과적인 면역 메카니즘의 하나이다. 림프구는 MHC-I 컨텍스트에 존재된 항원을 인지하고 퍼포린의 유리, 그랜짐 및 Fas-FasL 상호 작용의 생성을 통하여 감염된 세포를 죽일 수 있다(O'Hagan D., Mackicham M., and Singh M. Recent advance in adyuvants for infection disease Biomolecular Engineering 2001). CTL 활성은 바이러스, 박테리아 또는 프로토조아에 의해 유발된 세포 내의 감염에 대해서 뿐 아니라 종양에 대한 백신의 유효성을 결정하기 위해 보다 일반적으로 승인된 면역 반응이다.

CTL 활성은 공지된 직접 또는 간접 방법의 어느 하나에 의해, 바람직하기로는 이들의 조합에 의해 결정될 수 있다. 간접 방법은 이들 구조에 삽입되고, 이들에 컨쥬게이트되거나 함께 투여된 항원을 포함하는 프로테오리포솜 또는 그 유도체류가 식세포되고 분해되어 MHC-I 분자에 연계된 세포 라인의 세포의 표면에 존재되는지를 결정한다. 이들은 그런 다음 삽입된 항원에 특이적인 세포독성 세포 라인과 함께 배양되고, 세포 사(death)는 방사성 방법 또는 비방사성 방법에 의해 결정된다. 다른 간접 사인은 이들 구조에 삽입되고, 컨쥬게이트되거나 함께 투여된 항원을 포함하는 프로테오리포솜 또는 그 유도체류에 의한, 의도하는 항원으로 생체 외에서 재-자극된 면역된 동물의 이차 림프성 기관 또는 면역된 대상의 주피의 단일핵 세포에서 T CD8+ 림프구의 자극이다. 생체 외에서 재-자극된 단일핵 세포에 존재하는 T CD8+ 림프구에 의한 IFNγ 및 IL2의 생산은 CTL 활성을 입증하기 위한 다른 간접 방법이 될 수 있고 플루오 사이토메트리(Flow Cytometry) 또는 ELISPOT 어세이에 의해 검지될 수 있다. 더욱이, 이들 구조에 삽입되고, 이들에 컨쥬게이트되거나 함께 투여된 특정 항원을 포함하는 프로테오리포솜 또는 그 유도체류와 미리 배양된 세포를 갖는 항원의 세포 표면에 MHC-I 분자의 컨텍스트에 특정 항원의 인 지 후 T CD8+ 하이브리도마(hybridoma) 세포에 의한 IL2 생산은 CTL 활성을 입증하기 위한 다른 간접 방법이다. CTL 반응을 측정하기 위한 직접 방법에서는, 포유동물이 이들 구조에 삽입되고, 이들에 컨쥬게이트되거나 함께 투여된 항원을 포함하는 프로테오리포솜 또는 그 유도체류로 면역된다. 면역화 후에, 이차 림프성 기관이 MHC-I 분자에 연계된 특정 항원에 대한 CTL 활성의 존재를 정하기 위해 적출된다. 항원 특이적 CTL 활성을 측정하기 위한 가장 오래된 방법은 방사성 크롬 유리 세포 독성 어세이(radioactive cromium release cytotoxic assay)이다. 이것은 플래쉬 세포 (이펙터 CTL 활성 측정) 뿐 아니라 CTL 세포 라인 (메모리의 반응성 CTL 측정)에 대해서 디자인되었다. 양자에서, 타겟 세포는 의도하는 특정 항원을 발현한다. 이것은 다른 방법을 통해 달성될 수 있다(재조합 바이러스로 감염, 펩티드 로딩 또는 유전적 형질전환). 최근에는 이미 특성화된 특정 CTL 에피토프가 사용된다.

다른 생체 외의 방법은 테트라머-바인딩 어세이(tetrameric-binding assay; TBA)이다. 특정 에피토프를 갖는 MHC-I 분자의 테트라머 복합체는 그의 작용적 능력과는 별도로 항원 특이적 T CD8+ 세포의 TCRs에 바로 결합한다. HLA-A2 테트라머가 개체군에서 그의 넓은 대표성에 기하여 일반적으로 사용된다.

CTL은 장시간 동안 세포 반응의 주요 요인으로 고려되어 왔다. 오늘날, 모든 Th1 반응이 CTL 림프구의 유도를 엄격하게 의미하지 않는다는 것이 알려져 있다. 따라서, CTL 활성을 포함하는 반응의 Th1 패턴을 유도할 수 있는 어쥬번트를 찾아내는 것이 필요하다.

어쥬번트는 그의 보다 빠른 유도를 유발하고 그의 존속 기간을 증가하는 항원에 대한 특정 면역 반응을 강력하게 하는 기질이다(Vogel FR. Dev. Biol. Stand. 1998,92:241-248). 백신 제형에서의 이들의 사용은 필요한 항원의 양을 감소하게 할 수 있고, 바람직한 패턴으로 반응을 이끌 뿐 아니라 필요한 복용횟수를 최소화할 수 있게 한다.

Th1 반응을 유도하는 이용할 수 있는 어쥬번트 시스템은 다음과 같다 :

1. 모노포스포릴 리피드(Monophosphoril lipid) A (MPL), 특히 아세틸화 3-D-O (3D-MPL) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)로부터의 다른 비독성의 유도체류 및 MPL의 조합, 바람직하기로는 3D-MPL 또는 알루미늄 염을 갖는 (LPS)로부터의 비독성의 유도체류.

2. 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria)의 면역자극 분획: 면역 자극 복합체 ISCOM 내 콜레스테롤 및 인지질과 합체된 Quil A (Polakos NK, Drane D, Cox J, Ng P, Selby MJ, Chien D, O'Hagan DT, Houghtan M and Paliard X. J Immunol 2001,166:3589-98).

3. 폴리락틸 코-글리콜리도스의 입자 (Putney SD and Burke PA, Nat BIOTECHNOL. 1998, 16:153-157).

4. MPL 및 사포닌, 특히 WO 94/00153에 개시된 것으로 QS21 및 3D-MPL.

5. WO 98/33739에 개시된 것으로 QS21 및 콜레스테롤.

6. WO 95/17210에 개시된 것으로 물과 오일에 유화된 QS21, 33D-MPL 및 토코페롤.

7. WO 96/02555에 개시된 것으로 CpG의 메틸화되지 않은 시퀀스를 포함하는 올로고뉴클레오티드.

오늘날 CTL의 어쥬번트 유도물질은 한정적이다. 이들로는 CpG, QS21, MPL, ISCOM 및 지질로부터 유래된 코클레이트(chocleates)가 있다(O'Hagan D., Mackicham M., and Singh M. Recent advance in adyuvants for infection disease. Biomolecular Engineering 2001 and Edelman Robert. The development and use of vaccine adyuvant. Molecular Biothecnology 2002. 21:2, 129-148.).

프로테오리포솜은 Ruegg CL et al . (Preparation of proteosome-based vaccines. J Immunological Methods 1990;135:101-109); Lowell et al . (Proteosome-Lipopeptide Vaccines: Enhancement of Immunity for Malaria CS Peptides. Science 1988;240:800-2)에 의한 감염성 질병에 대해 예방적 백신의 제조가 기술되어 있고, 이것은 또한 US 5,597,572호에 기재되어 있다. 가장 최근의 것으로는, 중요 핵심이 나이세리아 메닝기티디스 세로그룹(Neisseria meningitidis serogroup) B의 외부 멤브레인으로부터 유래된 프로테오리포솜이고, 그의 미립자 구조, 합체되어 유리되지 않은 천연 LPS의 내용물, 나이세리아 메닝기티디스 세로그룹 C로부터의 폴리사카라이드의 존재, 그의 지질 조성 및 알루미늄으로의 그 흡수가 그의 높은 면역원성과 관련되고 인간에서의 보호가 검증된다.

프로테오리포솜에 기초된 백신인 VA-MENGOC-BC™은 안전하고, 비유전반응적이고 그리고 나이세리아 메닝기티디스 세로그룹 B 및 C에 대한 보호에 효과적이라는 것을 입증하는 5천만 복용 분 이상이 적용되어 왔다. 이것은 또한 폴리사카라이 드 C를 T 비의존성에서 T 의존성 항원으로 전환하여 수유기간에도 안전하고 효과적으로 적용된다 (Perez O. et al. Th1 response induced by the B component of VA-MENGOC-BC™ overcomes the thymus independence of polysaccharide C and primes for memory in toddler. BiotecnologIa Aplicada 2002; 19(1-2):54). 이 백신은 림프구증식의 인간 및 동물에 있어서의 유도; 항-프로테오리포솜 IgG 항체; 인간에서의 IgG1 서브클래스 및 마우스에서의 IgG2a; mRNA에서의 IFNγ, IL-2 및 IL-12와 단백질 준위에 의하여 특징되는 바람직한 Th1 패턴의 반응을 유도한다. 게다가, 이 백신은 IgE 항체 항-프로테오리포솜을 유도하지도 않고 전체 IgE 항체의 준위를 증가하지도 않는다. 또한 이 백신은 단백질로서 뿐 아니라 mRNA의 준위에서도 IL-4 및 IL-5의 생산을 유도하지 않는다 (Perez O et al . Infect Immun. 2001, 69(72001):4502-4508). VSSP 및 AFCo1 같은 프로테오리포솜 및 그 유도체류는 또한 ( Metodo de obtencion de estructuras cocleares. Composiciones vacunales y adyuvantes basados en estructuras cocleares y sus intermediarios. OCPI. 2002-0292, 27/11/02) 에서와 그리고 (US 6,149,921, 2000)에서 각각 개시된 바와 같이 어쥬번트로서도 사용되어 왔다.

나이세리아(세포외의 그램 음성균)에 대한 보호의 메카니즘은 주로 살균 및 옵소노파고틱 작용을 조정하는 항체의 유도에 관련된다. 따라서, 이들 균으로부터 유래된 프로테오리포솜은 CTL 반응을 유도할 것 같지는 않다.

본 발명은 박테리아의 프로테오리포솜으로 특히 CTL 반응의 새로운 어쥬번트 유도물질로서, AFCo1과 같은 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis)로부터 유 래된 것을 채택하는 목적을 갖는다. 이들 새로운 어쥬번트는 암 뿐만 아니라 곰팡이, 바이러스, 기생 및 세균성 감염(주로 세포 내의 감염)에 대해 특히 중요한 것이다.

"프로테오리포솜"은 특히 US 5,597,572에 기술된 바와 같이 계면활성제(detergent)없이 그것의 분리, 디터전트(데속시콜레이트 같은 것)를 포함하는 공정 또는 배양 상등액에 존재하는 액포로부터의 추출과 같은 공지된 방법을 사용함에 의해 박테리아 균주로부터 수득된 것을 의미한다. 프로테오리포솜은 면역계를 강력하게 자극할 수 있는 다른 패토젠 연계 분자 패터(patogen associated molecular patter; PAMP)를 포함한다.

"AFCo1"은 특허(Metodo de obtencion de estructuras cocleares. Composiciones vacunales y adyuvantes basados en estructuras cocleares y sus intermediarios. OCPI. 2002-0292, 27/11/02)에 개시된 바와 같이 또한 PAMP를 포함하는 주로 박테리아 유래로부터의 프로테오리포솜으로부터 유래된 어쥬번트를 의미한다.

실험실의 연구에서 VA-MENGOC-BC™ 항- N. 메닝기티디스 B 및 C 백신으로 면역된 인체는 주피 혈액 단일핵 세포 (PBMC)의 생체 외에서 재자극 후 프로테오리포솜에 대한 T CD4⁺ 및 T CD8⁺ 림프구의 활성화 및 증식을 나타낸다는 것이 놀라웁게 입증되었다.

또한, VA-MENGOC-BC™ 또는 프로테오리포솜 또는 AFCo1로 면역된 Balb/c 마 우스는 공지된 T CD4⁺ 반응 외에 증식적인 T CD8⁺ 림프구 반응을 증가한다는 것을 발견한 것은 놀라운 것이다.

또한 미생물 나이세리아 메닝기티디스 세로그룹 B로 자연 감염이 프로테오리포솜에 대해 T CD8⁺ 반응 뿐 아니라 T CD4⁺ 반응을 유도한다는 것은 전혀 예측되지 않은 것이다. 이들 반응은 N. 메닝기티디스 B에 기인된 수막염으로부터 치료된 개개인으로부터의 림프구에서 검지되어 질 수 있다.

또한 N. 메닝기티디스 B로 접종된 마우스가 T CD8⁺ 림프구 반응을 증진한다는 것도 기대되지 않은 것이다.

수막염으로부터 치료된 개개인 뿐 아니라 VA-MENGOC-BC™ 면역된 인간으로부터 T CD4⁺, 및 놀라웁게 T CD8⁺ 림프구는 IFNγ 및 IL-2를 분비하지만 IL-4 뿐 아니라 IL-5도 분비하지 않는다는 것이 입증되었다. 이것은 플로우 사이토메트리에 의해 평가되었다. 이들 결과는, CTL 반응이 기능적으로 유도되어 진다는 것을 입증하는, Th1 패턴의 반응의 시토킨 특징을 생산할 수 있는 세포 중에 T CD8⁺ 림프구를 포함한다.

프로테오리포솜 및 이들의 유래된 물질에 외인성 항원의 합체는 LPS로 오브알부민(OVA), 라이시마니아(Leishmania)의 단백질 및 다른 PAMP의 함입으로 효과적으로 수행된다. 프로테오리포솜 구조에 다른 항원을 합체하는 것도 가능할 것이다. 프로테오리포솜으로부터 유래된 AFCo1은 또한 핵산, 특히 플라스미드를 효과적으로 합체할 수 있다.

원하는 항원을 보다 많은 또는 적은 양을 발현하는 목적으로 생산 세포의 유전적 엔지니어링에 의한 조작을 통해 대상 항원을 변화된 농도로 발현할 수 있는 프로테오리포솜이 또한 본 발명에 의한 목적이 된다.

"대상 항원"은 이미 동정된 항원에 어떠한 제한도 없이, 면역계에 의한 이들의 유효한 제거를 위한 CTL 반응을 요하는 곰팡이, 바이러스, 기생충, 박테리아 및 암 세포로부터의 것을 의미한다. "많은 또는 적은"은 특히 균주가 항원 또는 대상 항원의 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 또는 0.1%의 양보다 많이 발현하는 것을 의미한다. 바람직하기로는 유전공학에 의해 변이된 균주는 0.5 내지 10%의 대상 항원을 발현한다.

본 발명의 대상 항원을 코드하는 유전자는 공지된 기술에 의한 유전공학에 의해 변이될 수 있다. 특히, 수막염 균주는 특허 WO 01/09350호에 개시된 바와 같이 또는 다른 방법으로 유전적으로 개변될 수 있다.

전술되지는 않았지만, CTL 반응을 유도하는 프로테오리포솜 및 AFCo1 능력을 활용하는 다른 백신 제형의 획득도 본 발명의 일부이다.

이들의 구조에 트랩되거나 또는 지질의 이중 층에 끼워지는 프로테오리포솜 또는 AFCo1 내에 합체된 항원으로 이들 제형의 유효성이 입증되었다. 또한 항원이 프로테오리포솜의 일부에 컨쥬게이트될 때 효과적인 백신 제형이 되는 것이 나타났다. 또 다른 효과적인 가능성은 컨쥬게이션 후 AFCo1와 같은 초클리어(choclear) 구조로 이들을 변형하는 것이다.

본 발명의 백신 제형은 이들을 조직적으로 또는 점막으로 투여함에 의해 감염에 민감한 포유동물을 보호하거나 또는 종양성 질병을 치료하기 위해 사용되어 질 수 있다. 이들 적용은 경구/음식공급 또는 코/호흡계 경로 또는 비뇨생식기 관에 의해 근육내, 복막내, 피하, 또는 피하주사 또는 점막투여를 포함한다.

각 제형 내의 프로테오리포솜 또는 AFCo1의 양은 이들 구조에 기한 항-수막염 백신에 사용된 것보다 항상 적은, 어쥬번트 작용을 나타내는 양으로 선택되는데, 이는 이차 효과가 미약하거나 또는 중요하지 않다는 것을 의미한다. 이 양은 대상 항원과 그 합체의 방법에 의존하여 변화될 수 있다. 일반적으로, 프로테오리포솜 또는 AFCo1의 양은 복용 당 1과 50㎍사이 그리고 보다 전형적으로는 5와 25㎍ 사이가 될 것이다. 대상 항원의 양은 프로테오리포솜 또는 AFCo1 전체의 0.1 내지 20% 그리고 바람직하기로는 0.5 내지 10%로 될 것이다.

복용 횟수는 일차적으로 제형의 타입, 예방적 또는 치료적 타입에 의존할 것이다. 처음에는, 최대 3 복용이 적용될 것이고, 이 회째에는 5회 복용까지 적용될 수 있을 것이다. 양자는 1년 이하의 영아, 2 내지 5살, 학생, 청소년, 성인, 노인에 적용될 수 있다. 본 발명의 혁신적인 것은 CTL 활성의 어쥬번트 유도물질로, 그램-네가티브 박테리아의 아웃터 멤브레인 특히 나이세리아 메닝기티디스 B로부터 유래된 프로테오리포솜 또는 AFCo1의 사용이다.

나이세리아 메닝기티디스 B, 세포외 박테리아로 자연적인 감염은 T CD8⁺ 세포, 세포독성 활성과 연계된 림프구의 반응을 유도하는 것은 특히 신규한 것이고, 또한 이들이 CTL 활성의 유도를 입증하는, IFNγ 및 IL-2를 생산한다는 것은 놀라 운 것이다. 따라서, 림프구는 상술된 Th1 반응을 증가한다.

다른 신규한 측면은 곰팡이, 바이러스, 기생충 및 균의 감염에 대한 예방적 제형으로 이의 적용과 세포독성 반응을 유도하기 위해 악성 종양에 의해 감염된 대상의 치료에서의 이들의 적용이다.

CTL 반응을 증가하는 프로테오리포솜 또는 AFCo1에서 세포독성 에피토프의 컨쥬게이션 또는 삽입은 특히 신규한 것이다.

미립자 항원, 특히 DNA를 포함하는 AFCo1의 적용성은 신규하다.

점막의 경로, 게다가 비경구 경로 및 이들의 조합에 의해 이들 제형을 사용하는 가능성 또한 신규하다.

세포독성 항원을 발현하는 프로테오리포솜 또는 그 유도체류를 생산하기 위해 수막염 균주의 유전공학에 의한 변이는 본 발명의 다른 신규한 측면이다.

제안된 해결책은 다음의 이점을 갖는다:

이들 제형에 의해 달성된 면역학적 효과는 포함된 대상 항원에 대해 프로테오리포솜 또는 AFCo1에 의한 CTL 반응의 유도를 가능하게 했다. 이것은 세포내 미생물 및 종양 질환에 적용될 수 있지만 여기에 한정되는 것은 아니다.

백신으로서 그리고 전이하여 어쥬번트로서 프로테오리포솜의 면역학적 효과는, 낮은 농도로 사용되는 경우, 1년 이하의 영아, 2 내지 4살, 학생, 청소년, 성인에 있어서 안전하다.

프로테오리포솜 및 AFCo1은 또한 카보하이드레이트(컨쥬게이트되거나 또는 공유결합으로 포함됨)로서 T-비의존성 항원에서 이들에 의해 유도된 바람직한 세포 반응 (Th1)에 기하여 T-의존형 항원으로 전환된다. 이 특성은 또한 자연특성의 대상 항원에 적용될 수 있다.

본 발명은 다음의 특정 실시예를 통하여 자세히 기술된다.

실시예 1. 프로테오리포솜 수득.

프로테오리포솜을 수득하기 위해, 나이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) B 또는 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)의 배양이 수행되고, 원심분리에 의해 수집된 바이오매스(biomass)가 디터전트, 효소 및 초음파로 추출되어 진다. 세포 찌꺼기(debris)는 원심분리를 통해 제거되고, 그런 다음 상등액은 핵산을 제거하기 위해 뉴클레아제로 단리의 대상이 된다. 추출물은 초원심분리를 통해 회수되고, 디터전트를갖는 용액에 재현탁되어 분자 배제의 크로마토그라피를 통해 저분자량 및 중분자량의 잔여 성분으로부터 정제된다. 수득된 프로테오리포솜은 10% 이하의 핵산과 10% 이하의 삽입된 LPS를 그 구조에 포함하지만 전혀 없지는 않다. LPS는 본질적 면역 반응을 시발하는 위험 신호로서 필수적이다. 최종 산물은 생물학적 및 물리-화학적 조절 군이 된다.

실시예 2. 면역된 마우스에 T CD4 ⁺ 및 T CD8 ⁺ 림프구 반응

Balb/c 마우스가 14일 간격으로 근육내 또는 코의 경로로 각 1회 25 mg의 이회 복용량의 프로테오리포솜 또는 AFCo1로 면역된다. 지라 세포가 2차 복용 7일 후 분리되고, 프로테오리포솜으로 배양된다. 팽창된 세포는 항-CD4 또는 항-CD8 모노 크로날 항체로 처리되고 이어서 항-IgG로 표지되어 플로우 사이토메트리에 의해 평가된다. 이 면역화는 양 T CD4⁺ 및 T CD8⁺ 림프구 항-프로테오리포솜을 자극한다. 림프구의 45%는 T CD4⁺이고 40%는 T CD8⁺ 이다.

실시예 3. 면역화된 인체에서의 T CD4 ⁺ 및 T CD8 ⁺ 림프구 반응.

젊은 성인이 6주 간격으로 각 1회 50 mg의 이회 복용량의 VA-MENGOC-BC™ 로 면역된다. PBMC는 이차 복용 7일 후 취해진 혈액 샘플로부터 Ficoll-Hipaque 상에서 정제된다. 팽창된 세포는 모노크로날 항체 항-CD4 또는 항-CD8로 처리되고 이어서 항-IgG로 표지되어 플로우 사이토메트리에 의해 평가된다. 이 면역화는 양 T CD4⁺ 및 T CD8⁺ 림프구 항-프로테오리포솜을 자극한다. 림프구의 50%는 T CD4⁺이고 42%는 T CD8⁺ 이다.

실시예 4. 수막염 질병으로부터 회복기에의 T CD4 ⁺ 및 T CD8 ⁺ 림프구 반응.

PBMC는 퇴원 2개월 후 나이세리아 메닝기티디스 B에 기인된 수막염 질병으로부터 회복기의 개인으로부터 취해진 혈액 샘플로부터 Ficoll-Hipaque 상에서 정제된다. 이것은 프로테오리포솜으로 4일 배양된다. 팽창된 세포는 항-CD4 또는 항-CD8 모노크로날 항체로 처리되고 이어서 항-IgG로 표지되어 플로우 사이토메트리에 의해 평가된다. 이 면역화는 양 T CD4⁺ 및 T CD8⁺ 림프구 항-프로테오리포솜을 자극한다. 림프구의 47%는 T CD4⁺이고 39%는 T CD8⁺ 이다.

실시예 5. N. 메닝기티디스 를 갖는 인체에서의 T CD4 ⁺ 및 T CD8 ⁺ 림프구 반응.

PBMC는 나소파링지의(nasopharingeal) 삼출물에 의해 미리 동정된, 나이세리아 메닝기티디스 B를 갖는 개인으로부터 취해진 혈액 샘플로부터 Ficoll-Hipaque 상에서 정제된다. 이것은 프로테오리포솜으로 4일 배양된다. 팽창된 세포는 항-CD4 또는 항-CD8 모노크로날 항체로 처리되고 이어서 항-IgG로 표지되어 플로우 사이토메트리에 의해 평가된다. 이 면역화는 양 T CD4⁺ 및 T CD8⁺ 림프구 항-프로테오리포솜을 자극한다. 림프구의 35%는 T CD4⁺이고 32%는 T CD8⁺ 이다.

실시예 6. 면역된 인간으로부터 림프구에 의해 활성화 신호 및 세포내 시토 킨 생산.

젊은 성인이 6주 간격으로 각 1회 50 ㎍의 이회 근육내 복용의 VA-MENGOC-BC™로 면역된다. PBMC는 이차 복용 7일 후 취해진 혈액 샘플로부터 Ficoll-Hipaque 상에서 정제된다. 혈액 샘플이 이차 복용 후 몇 개월에 취해진다. 이것은 27시간 동안 10 또는 20 ㎍/ml에서의 프로테오리포솜으로 배양된다. 그 후, 적혈구는 용혈되고, 다른 세포는 세포내 시토킨(IFN-γ, IL2 또는 IL5) 및 서페이서 메이커 (CD4, CD8 또는 CD69)의 검출을 위해 모노크로날 항체에 투과될 수 있도록 처리된다. 3.28%의 T CD4⁺ 및 20.65% T CD8⁺ 림프구가 프로테오리포솜 10 ㎍/ml으로 활성화되고, 반면 3.86% T CD4⁺ 및 14.11% T CD8⁺ 림프구 프로테오리포솜 20 ㎍/ml으로 활성화되었다. 그럼에도 불구하고, 비록 IL-2의 완만한 생산이 활성화된 T CD4⁺에서 또한 검출되었지만, 활성화된 T CD8⁺는 IFN-γ 및 IL-2을 생산했다. 0.35% T CD4⁺ 및 0.89% T CD8⁺ 림프구는 프로테오리포솜 10 ㎍/ml로 배양 후 세포내 IFN-γ를 생산했고 반면 1.54% T CD4⁺ 및 1.29% T CD8⁺ 림프구는 프로테오리포솜 20 ㎍/ml로 배양 후 이것을 생산했다. 그러나, 단지 IFN-γ 림프구를 생산하는 0.57% T CD8⁺ 만이 프로테오리포솜 10 ㎍/ml로 자극 후 활성화되고 0.87%는 프로테오리포솜 20 ㎍/ml로 배양 후 활성화되었다. 세포내 IL-2를 생산하는 림프구의 백분율은 10 ㎍/ml의 프로테오리포솜으로 자극 후는 1.19% T CD4⁺ 및 1.07% T CD8⁺ 이고 프로테오리포솜 20 ㎍/ml로 자극 후는 1.18 % T CD4⁺ 및 1.6% T CD8⁺ 이다. 그러나, 단지 IL-2 림프구를 생산하는 0.68%의 T CD8⁺ 만이 프로테오리포솜 10 ㎍/ml로 자극 후 활성화되고 0.7%는 프로테오리포솜 20 ㎍/ml로 배양 후 활성화되었다. T CD4⁺ 림프구의 경우에서는 단지 낮은 백분율의 IL-2를 생산하는 활성화된 세포가 검지되었다.

실시예 7. 수막염 질병으로부터의 회복기의 환자로부터 림프구에 의한 활성화 신호 및 세포내 시토킨 생산.

혈액 샘플은 환자 퇴원 2개월 후 나이세리아 메닝기티디스 B에 기인된 수막염 질병으로부터 회복기의 개인으로부터 취해진 혈액 샘플로부터 Ficoll-Hipaque 상에서 정제된다. 이것은 27시간 동안 10 ㎍/ml에서의 프로테오리포솜으로 배양된다. 그 후, 적혈구는 용혈되고, 다른 세포는 세포내 시토킨(IFN-γ, IL2 또는 IL5) 및 서페이서 메이커 (CD4, CD8 또는 CD69)의 검출을 위해 모노크로날 항체에 투과될 수 있도록 처리된다. 9.29%의 T CD4⁺ 및 26.28% T CD8⁺ 림프구가 활성화된다. 활성화된 림프구의 양 서브셋트는 IFN-γ를 생산했고, 단지 T CD8⁺ 이 IL-2를 생산했다. 3.46% T CD4⁺ 및 1.39% T CD8⁺ 림프구는 프로테오리포솜 10 ㎍/ml로 배양 후 세포내 IFN-γ를 생산했으나, IFN-γ 림프구를 생산하는 단지 0.65% T CD8⁺ 및 0.95% T CD4⁺ 만이 활성화되었다. 세포내 IL-2를 생산하는 림프구의 백분율은 10 ㎍/ml의 프로테오리포솜으로 자극 후는 0.73% T CD4⁺ 및 0.93% T CD8⁺ 이지만, 단지 IL-2 림프구를 생산하는 0.73% T CD4⁺ 및 0.27% T CD8⁺ 만이 프로테오리포솜 10 ㎍/ml로 자극 후 활성화되었다. IL-5의 생산은 검지되지 않았다.

실시예 8. 프로테오리포솜 내 외인성 항원의 함입.

난자는 디터전트, 특히 데옥시콜레이트의 사용을 통해 프로테오리포솜에 포함되어져, 프로테오리포솜의 구조의 분열을 가능하게 한다. 계면활성제의 제거로 100:11.2의 비율로 난자가 존재하는 프로테오리포솜의 구조의 재합을 초래한다. 난자를 포획한 프로테오리포솜은 겔 여과 크로마토그라피에 의해 정제되었다. 프로테오리포솜의 구조는 비처리된 프로테오리포솜에 유사한 이들의 크로마토그라피 프로 필에 의해 확인되었다. 또한, 난자 특이적 폴리크로날 혈청을 사용한 웨스턴 블럿 및 SDS-PAGE가 프로테오리포솜 내에 난자의 존재를 확인했다. 캡슐화된 난자의 양은 ImageMaster^®VDS를 사용하여 쿠마지 블루(Coommassie blue)로 염색된 폴리아크릴아미드 겔 상에서 농도계 (densitometry) 분석에 의해 측정되었다.

실시예 9. AFCo1 내 외인성 항원의 함입.

라이쉬마니아(Leishmania)의 프로마스티고트(promastigotes)와 아마스티고트(amastigotes)로부터 단백질의 함입은 AFCo1의 형성 과정 중에 효과적으로 수행된다. 이들 항원을 포함하는 AFCo1의 동물에의 면역화는 항-라이쉬마니아 면역 반응의 증가 및 이 프로토조아로 감염에 의해 생산된 경화의 감소를 입증했다. AFCo1에 포함된 이들 단백질의 존재는 항 라이쉬마니아 항체로 밝혀진 웨스턴 블럿에 따른 SDS-PAGE에 의해 입증되었다.

실시예 10. 프로테오리포솜에 항원의 컨쥬게이션 .

이것은 특허 "Metodo de obtencion de vacunas conjugadas. Composiciones vacunales" 특허 OCPI 2002-0257, 14/11/02의 실시예 1, 2에 기술되어 있다.

실시예 11. PAMPs 의 함입.

나이세리아 메닝기티디스 B로부터 LPS는, 12%까지 프로테오리포솜 내에서 그 정상 농도를 증가하는, 다른 양으로 포함된다. 이것은 프로테오리포솜에 대해 얻어진 면역 반응을 증가했다. 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)로부터 LPS는 또한 이들 항원에 대해 증가된 면역 반응을 유도하는 프로테오리포솜에 포함한다.

실시예 12. 프로테오리포솜 또는 AFCo1 과 컨쥬게이트되거나 또는 여기에 포 함된 항원에 대한 T CD8 ⁺ 림프구에 의한 IFN -γ 생산.

Ova(오브알부민)를 포함하는 프로테오리포솜 또는 라이쉬마니아 단백질을 포함하는 AFCo1로 면역된 동물로부터 비장 세포가 분리된다. T CD8⁺ 림프구 개체군의 유도가 평가될 뿐 아니라 IFN-γ을 생산하는 이들의 능력이 ELISPOT T 어세이에 의해 결정된다. 프로테오리포솜 유도 IFN-γ에 폴리사카라이드 C의 컨쥬게이트는 ELISA에 의해 결정되었다.

실시예 13. 세포의 사이토플라즘 내 AFCo1 및 그의 전달에서 플 라스미드 DNA 의 함입.

슈페리어 세포 (CMVp)로부터 발현 프로모터 하에서 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)을 코드하는 플라스미드 pGFP는 AFCo1에 효과적으로 함입되어졌다. 이 플라스미드를 포함하는 AFCo1은 L929 세포 라인의 배양조에 부가되었다. 세포의 사이토플라즘 내의 녹색 형광 단백질의 발현은 옵틱 플루오르센스 마이크로스코피(optic fluorescence microscopi)를 통해 입증되었다.

실시예 14. 오브알부민(Ova)을 포함하는 프로테오리포솜 ( PL )에 노출된 수 상돌기 세포는 T-세포에 Ova 펩티드가 존재할 수 있음.

Ova (257-264) 및 Ova (265-277) 펩티드에 특이적인 MHC 클래스 II 제한 CD4⁺ 또는 MHC 클래스 I 제한 CD8⁺ T-하이브리도마 세포가 각각 사용되었다. 수상돌기 세포 (DC)는 PL-OVA 또는 가용성 OVA와 함께 두 시간 동안 펄스되어지고, 그리고 나서 T-세포 하이브리도마로 함께 배양되었다. 상등액은 24시간 후 수집되고 IL2-의존성 CTLL 세포 라인에 의한 [³H]티미딘 합체를 사용하여 IL2 생산에 대해 시험되었다. IL2 생산은 Ova-특이성 세포 하이브리도마의 활성화의 척도로 사용되었다. 도 1은 PL-Ova와 펄스된 DC는 양 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포 하이브리도마에 대한 Ova 항원이 존재할 수 있다는 것을 보여준다. T-세포 하이브리도마는 Ova 단독으로 펄스된 DC에 비하여 PL-Ova와 펄스되어진 DC로 자극될 때 IL2의 유의적으로 보다 높은 준위를 생산했다. PL(Ova) 또는 Ova로 배양된 DC에 의한 MHC-I 및 MHC-II 내 특이적 Ova 펩티드의 제공 준위 간의 유의성 있는 차이점은 듀칸의 복합 비교시험(Duncan'sㄴ multiple comparison test)에 의해 95% 신뢰 수준으로 결정되었다. 따라서, 프로테오리포솜은 T-세포에 효과적인 항원 제공을 위해 DC에 항원을 전달할 수 있다.

Claims (13)

1. CTL 반응을 유도할 수 있는 프로테오리포솜 구조 또는 이의 유도체류에 의해 특징되어 지는 백신 어쥬번트.
2. 제 1항에 있어서, 박테리아성 기원(origin)임을 특징으로 하는 백신 어쥬번트.
3. 제 2항에 있어서, 나이세리아(Neisseria) 또는 살모넬라(Salmonella) 속으로부터 유래된 백신 어쥬번트.
4. 제 1항에 있어서, 유전공학에 의해 변이된 균주로부터 대상 항원을 발현하는 백신 어쥬번트
5. 제 1 항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기술된 어쥬번트, 하나 또는 그 이상의 대상 항원 뿐 아니라 적절한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 제형.
6. 제 5항에 있어서, 프로테오리포솜 또는 이의 유도체류의 지질 이중 층에 대상 항원을 함입함을 특징으로 하는 백신 제형.
7. 제 5항에 있어서, 프로테오리포솜 또는 이의 유도체류에 대상 항원을 컨쥬게이션함을 특징으로 하는 백신 제형.
8. 제 5항에 있어서, 프로테오리포솜 또는 그 유도체류와 대상 항원의 공동-투여함을 특징으로 하는 백신 제형.
9. 제 5항에 있어서, 1 내지 50㎍, 바람직하기로는 5 내지 25㎍의 프로테오리포솜 또는 그 유도체류의 농도 범위임을 특징으로 하는 백신 제형.
10. 제 5항에 있어서, 프로테오리포솜 또는 그 유도체류의 총량의 0.1 내지 20%, 바람직하기로는 0.5 내지 10%의 대상 항원의 농도 범위임을 특징으로 하는 백신 제형.
11. 제 5항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 경구/음식공급 또는 코/호흡계 경로 또는 비뇨생식기 관에 의해 근육내, 복막내, 피내, 피하 또는 점막으로 투여되는 백신 제형.
12. 감염에 민감한 포유동물을 보호하고 종양 질병을 치료하기 위한 제 5항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 백신 제형의 용도.
13. 예방 효과를 달성하기 위한 최대 3회 투여와 치료 효과를 달성하기 위한 최대 5회 투여를 적용함을 특징으로 하는 제 5항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 백신 제형을 사용한 면역화 스케쥴.

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