WO2005063287A1 - Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes inductores de respuesta citotóxica y las formulaciones resultantes - Google Patents

Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes inductores de respuesta citotóxica y las formulaciones resultantes Download PDF

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WO2005063287A1
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Oliver Germán Pérez Martín
Miriam de San Juan Bosco LASTRE GONZÁLEZ
Tamara RODRÍGUEZ RAMÍREZ
Gustavo Rafael Bracho Granado
Pietro Mastroeni
Judith Mónica Del Campo Alonso
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Instituto Finlay. Centro De Investigación-Producción De Sueros Y Vacunas
Universidad De Cambridge, Facultad Para Las Ciencias Veterinarias
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Definitions

  • the present invention relates to the field of vaccines and their use in medicine. More particularly, this relates to the use of adjuvants and the resulting vaccine formulations.
  • the technical objective pursued is to favor the increase in the immune response against fungal, viral, protozoal, bacterial or carcinogenic antigens, especially to increase the induction of essential cytotoxic T response against these antigens. This work will lead to the development of therapeutic or prophylactic vaccine formulations.
  • Proteoliposomes and their derivatives as adjuvants in formulations with fungal, viral, bacterial, protozoan or carcinogenic antigens, inserted in their structure, conjugated or mixed with them.
  • These formulations would extend the preferential T response type 1 (Thl) induced by Proteoliposomes and their derivatives to the included antigens (Pérez O et al. Infec ⁇ Immun. 2001, 69 (7): 4502-4508), inducing a response of Cytotoxic T lymphocytes (CTL) against these antigens when applied by mucosal, parenteral route or combination thereof.
  • CTL Cytotoxic T lymphocytes
  • MHC Major Histocompatibility System
  • Thl The immune response was phenotypically subdivided into cellular (Thl) and humoral (Th2).
  • the Thl / Th2 patterns are distinguished primarily by the cytokine pattern secreted by CD4 + T cells: primarily, IFN ⁇ and IL12 by Thl and IL4 and IL5 by Th2 (Mossman, TR, Cherwinski, H., Bond, MW, Giedlin, M. A, and RL Coffman. 1986. Two types of murine helper T cells clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136: 2348-2357).
  • Thl pattern preferentially induces antibodies of the IgG2a subclass (IFN ⁇ dependent), while Th2 induces IgE and the IgGl subclass (IL4 dependent).
  • IFN ⁇ dependent antibodies of the IgG2a subclass
  • Th2 induces IgE and the IgGl subclass (IL4 dependent).
  • the Thl pattern leads to the induction of IgG1 and IgG3 subclasses and Th2 induces the IgE class.
  • cytokines produced by non-lymphoid cells have also been associated with these patterns, as is the case with IL12 and IL18 associated with a Thl pattern.
  • IFN ⁇ and IL10 act as inhibitors of the Th2 and Thl response, respectively.
  • CD8 + T lymphocytes which, by similarity in cytokine production, have been classified as Tcl and Tc2.
  • CD8 + T lymphocytes are the fundamental mediators and inducers of CTL activity. These act then, not only as effector cells, but also as regulators producing cytokines that expand one response more than the other. Therefore, the determination of the subset of CD4 + T or CD8 + T cells present in peripheral mononuclear cell lymphoproliferations of immunized subjects or secondary lymphoid organs of immunized animals, re-stimulated by an in vi / ro antigen, is a important measure that these two populations are being stimulated.
  • CTL CD8 + T lymphocytes
  • Successful CTL activity can be determined by any known method, both indirect and direct.
  • indirect and direct methods are combined.
  • the capacity of the Proteoliposome or its derivatives is determined, with antigens inserted in its structure, conjugated or co-administered to be phagocytosed, degraded and presented on the cell surface associated with the MHC-I molecules of cell lines. These then face cytotoxic cell lines against the inserted antigen and cell death is determined by radioactive or non-radioactive methods.
  • Another indirect index is the stimulation, by the Proteoliposome or its derivatives with inserted, conjugated or co-administered antigens, of CD8 + T lymphocytes in peripheral mononuclear cells of immunized humans or from secondary lymphoid organs of immunized animals, re-stimulated in vitro with the antigen of interest.
  • the detection of CD8 + T lymphocytes producing IFN ⁇ and IL2 in mononuclear cells re-stimulated in vitro with the antigen of interest is another indirect index that can be determined by Flow Cytometry or ELISPOT. In this case, the production of IFN ⁇ by CD8 + T cells is fundamentally determined.
  • IL2 The production of IL2 by hybridomas of CD8 + T cells after recognition of the specific antigen in the context of MHC-I molecules on the surface of antigen presenting cells previously incubated with the Proteoliposome or its derivatives containing the specific antigen inserted into its structures, conjugated or co-administered with them, is another indirect way of evidencing CTL activity.
  • Direct mammals are immunized with the Proteoliposome or its derivatives and the antigens of interest, inserted in its structure, conjugated or co-administered and then the secondary lymphoid organs are extracted and the presence of CTL activity against the antigen of interest associated with MHC is determined.
  • the oldest method to detect antigen-specific CTL activity is based on the radioactive chromium release cytotoxicity assay, which has been designed the same for fresh cells (measuring CTL effector activity) as for CTL lines (evaluating CTL reactivity of memory). In both cases the target cells express the specific antigens of interest, which can be achieved by various methods (infection by recombinant viruses, "peptide loading” or transfection genetics). More recently, specific previously determined CTL epitopes tend to be used.
  • TBA tetrameric-binding assay
  • CTLs were considered the main component of the cellular response.
  • adoptive adjuvants are substances that enhance the specific immune response against an antigen causing a faster induction of the antigen and increasing its duration (Vogel FR. Dev. Biol. Stand. 1998,92: 241-248). Its use in vaccine formulations allows reducing the amount of antigen needed, directing the response towards a desired pattern and reducing the number of doses needed.
  • MPL ® Monophosphoryl lipid A
  • LPS non-toxic lipopolysaccharide
  • Adjuvants that currently induce CTL are scarce among which are MF59, CpG Oligonucleotides, QS21, MPL ® , ISCOM ® and lipid derived cochleates (O 'Hagan D., Mackicham M., and Singh M. Recent advance in adyuvants for infection disease. Biomolecular Engineering 2001 and Edelman Robert. The development and use of vaccine adyuvant. Molecular Biothecnology 2002. 21: 2, 129-148.).
  • Proteoliposomes have been described for the preparation of prophylactic vaccines against infectious diseases by Ruegg CL et al. (Preparation of proteosome-based vaccines. J Immunological Methods 1990; 135: 101-109); Lowell et al. (Proteosome-Lipopeptide Vaccines: Enhancement of Immunity for Malaria CS Peptides. Science 1988; 240: 800-2) and also as disclosed in US No. 5,597,572.
  • the fundamental nucleus is the Proteoliposome derived from the outer membrane of Neisseria meningitidis serogroup B, whose particulate structure, its content of native incorporated and non-free LPS, polysaccharide C, its characteristic lipid composition and its adsorption in alumina, are related to its high immunogenicity and proven protectogenicity in humans.
  • This vaccine induces a preferential Thl pattern characterized by induction in human and animal lymphoproliferation; IgG anti-Proteoliposome antibodies; IgG subclasses in humans and IgG2a in mice; IFN ⁇ , IL2 and IL12 in the field of messenger ribonucleic acid (mRNA) and proteins, non-induction of anti-Propteoliposome IgE or increases in total IgE and non-production of IL4, IL5 both in the field of mRNA and protein (Perez) O et al. Infected Immun. 2001, 69 (72001): 4502-4508).
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • Proteoliposomes and derivatives thereof such as VSSPs and Cochlear Structures have also been used as adjuvants as disclosed in (US 6,149,921 of 2000) and in (Method of obtaining cochlear structures.
  • the present invention has as its object the use of natural or genetically modified bacterial Proteoliposomes, especially those derived from N. meningitidis, as well as the cochlear structures derived therefrom, as new CTL inducing adjuvants. These new adjuvants are of particular importance against fungal, viral, bacterial and protozoal infections (particularly intracellular), as well as tumor diseases.
  • Proteoliposome means that these are obtained from bacterial strains using any method known as: isolation without detergent; a process that includes detergent (such as deoxycholate) or the extraction from "bleb” vesicles of crop supernatants and particularly those disclosed in US 5,597,572.
  • Proteoliposomes contain different Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMP), molecular structures conserved between pathogens capable of strongly stimulating the immune system.
  • PAMP Pathogen-Associated Molecular Patterns
  • Cochlear structures means an adjuvant derived from Proteoliposomes that therefore also contain PAMP as referred to in the patent (Method of obtaining cochlear structures. Vaccine compositions and adjuvants based on cochlear structures and their intermediaries. OCPI. 2002- 0292 of 11/27/02).
  • the mechanisms of protection against Neisseria, Gram negative extracellular bacteria, are related to the induction of antibodies that fundamentally mediate opsonophagocytic and bactericidal functions. Therefore, it is not expected that the Proteoliposomes derived from them and the natural infection caused by this bacterium, induce CTL responses.
  • N. meningitidis serogroup B infection by the natural microorganism, N. meningitidis serogroup B, induces both T CD4 + and T CD8 + anti- Proteoliposome response, which was detected in lymphocytes of individuals cured of meningococcal disease caused by N. meningitidis B.
  • mice inoculated with N. meningitidis B also induced CD8 + T cell response.
  • CD4 + T lymphocytes both in cells immunized with VA-ME ⁇ GOC-BC ® and in the case of individuals cured of meningococcal disease, CD4 + T lymphocytes, and surprisingly, CD8 + T secretes IF ⁇ and IL2 and not IL4 or IL5 when evaluated by Flow Cytometry. This result includes CD8 + T lymphocytes within the important cells in the production of the cytokines characteristic of the Thl response pattern.
  • CTL epitopes from Ova were incorporated into the Proteoliposomes or their derivatives and thus the response induced against these epitopes was increased.
  • Proteoliposomes that can express high concentrations of antigens of interest are also part of the present invention, by genetic engineering manipulation of the Proteoliposome producing strain in order to express "more or less” amount of the desired heterologous antigen or antigens.
  • Antigens of interest means those from fungi, viruses, bacteria, protozoa and cancer that have been shown to require a CTL response for efficient elimination by the immune system, without restricting those already identified.
  • the strain expresses more than 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 or 0.1% of the amount of the heterologous antigens or interest.
  • the engineering strain expresses between 0.5% and 10% of the antigen of interest.
  • the antigen coding gene of interest of the invention can be engineered as expressed above by known techniques.
  • Associated tumor antigens, gangliosides or proteins from Leishmania were included in the Proteoliposomes or their derivatives and the induction of CD8 + response and IFN ⁇ production was demonstrated when Balb / c mice were immunized and challenged in vitro with the respective antigens.
  • Vaccine formulations are also shown to be effective, where the antigens are conjugated to part of the Proteoliposomes of the vaccine composition or once conjugated to them they are transformed into cochlear structures.
  • the vaccine formulations of the present invention can be used to protect a mammal susceptible to infection or to treat mineral diseases by administering said vaccine formulation systemically or mucosally. These applications may include injections by intramuscular, intraperitoneal, intradermal or subcutaneous or mucosal administration by oral / food, nasal / respiratory or genitourinary tractus.
  • the amount of Proteoliposome or Cochlear Structures in each formulation is selected as the amount that shows adjuvant function, which is always lower than that used in anti-meningococcal vaccines based on these structures, so the adverse side effects are lower and are not significant. This amount will vary depending on the antigen of interest and how it is incorporated. Generally, the amount of Proteoliposome or Cochlear Structures in each dose will be between 1 and 50 ⁇ g and more typically between 5 and 25 ⁇ g. The amount of the antigen of interest will be in the range of 0.1 to 20% of the Proteoliposome or Cochlear Structures mass and preferably 0.5 to 10%.
  • the number of doses will depend primarily on whether the vaccine formulation is prophylactic or therapeutic. In the first, a maximum of three doses will be applied and in the second, up to 5 doses can be reached. Both can be applied in children under one year, 2 to 5 years, school children, adolescents, adults and the elderly.
  • the novelty of the invention lies primarily in the use of Proteoliposomes or Cochlear Structures derived from proteins of the outer membrane of Gram-negative bacteria and more particularly of N. meningitidis B, as adjuvants inducing CTL activity.
  • Another novel aspect is its prophylactic application in fungal, viral, bacterial or protozoal vaccine formulations and its therapeutic application in subjects affected with malignant tumors in which it is desired to induce a cytotoxic response.
  • the conjugation or insertion of cytotoxic epitopes to Proteoliposomes or Cochlear Structures, which increase the CTL response is particularly novel.
  • Proteoliposomes and cochlear structures are obtained on an industrial scale under conditions of Good Production Practices (GMP) at the Finlay Institute and we have methodologies for the inclusion of heterologous antigens in them.
  • GMP Good Production Practices
  • the immunological effect achieved by this preparation allows inducing CTL responses by the Proteoliposome and Cochlear Structures against the heterologous antigens incorporated therein, which is applicable; but not limited to intracellular microorganisms and tumor diseases.
  • Proteoliposomes as a vaccine and transitively as an adjuvant, where smaller amounts are used, is safe in children under one year of age, 2 to 4 years old, in schoolchildren, adolescents and adults.
  • Proteoliposomes and Cochlear Structures by the preferential induced cellular response also convert to T-independent antigens (conjugated or non-covalently incorporated), such as carbohydrates into T-dependent antigens. This property is also advantageously applied to the antigens of interest of saccharide character.
  • Example 1 Obtaining Proteoliposome.
  • a culture of N. meningitidis B or Salmonella typhi is carried out and the biomass collected by centrifugation is subjected to an extraction process with detergent, enzymes and ultrasound.
  • the cell debris is removed by centrifugation and the supernatant is then digested with nucleases to remove nucleic acids.
  • the extract is recovered by ultracentrifugation, resuspended in solution with detergent and purified from the rest of the low and medium molecular weight components by molecular exclusion chromatography.
  • the Proteoliposome thus obtained contains less than 10% nucleic acids and less than 10% LPS inserted in its structure; But never free.
  • the LPS present is essential in triggering the danger signals to initiate the innate response.
  • the final product is subjected to a set of biological and physical-chemical controls.
  • Example 2 Response of CD4 + and CD8 + T lymphocytes by immunization of mice.
  • Balb / c mice were immunized with two doses of 25 ⁇ g each of Proteoliposome or Cochlear Structures, intramuscularly or nasally and spaced 14 days.
  • Spleen cells were taken 7 days after the second dose and challenged for 4 days with Proteoliposome
  • the expanded cells were treated with anti-CD4 or anti-CD8 monoclonal antibodies and subsequently with a fluorescent anti-IgG and were evaluated by Flow Cytometry.
  • Immunization stimulated both CD4 + and CD8 + T anti-Proteoliposome lymphocytes. 45% of the lymphocytes were CD4 + T and 40% were CD8 + T.
  • Example 3 Example 3
  • CD4 + and CD8 + T lymphocytes by human immunization. Young adults were immunized with two doses of VA-ME ⁇ GOC-BC 'of 50 ⁇ g each intramuscularly, spaced 6 weeks. Seven days after the second dose, blood was taken and peripheral mononuclear cells were purified on a Ficoll-Hipaque gradient. They faced each other for 4 days with Proteoliposome. The expanded cells were treated with anti-CD4 or anti-CD8 monoclonal antibodies and subsequently with a fluorescent anti-IgG and were evaluated by Flow Cytometry. Immunization stimulated both CD4 + T lymphocytes and anti-Proteoliposome CD8 + T lymphocytes. 50% of the lymphocytes were CD4 + T and 42% were CD8 + T.
  • Example 4 Response of CD4 + and CD8 + T lymphocytes in convalescents of meningococcal disease.
  • the expanded cells were treated with anti-CD4 or anti-CD8 monoclonal antibodies and subsequently with an anti fluorescent IgG and were evaluated by Flow Cytometry. Proliferation of CD4 + and T CD8 + lymphocytes was evident. 47% of the lymphocytes were CD4 + T and 39% were CD8 + T.
  • Example 5 Signs of activation and production of intracellular cytokines by lymphocytes from immunized humans. Young adults were immunized with two doses of VA-MENGOC-BC ® of 50 ⁇ g each intramuscularly, spaced 6 weeks. Several months after the second dose, blood was taken. These were confronted for 27 hours with Proteoliposome at a concentration of 10 or 20 ⁇ g / ml. Subsequently, the red blood cells were used and the rest of the cell was permeabilized and faced with monoclonal antibodies for the detection of intracellular cytokines (IFN ⁇ , IL2 or IL5) and membrane markers (CD4, CD8 and CD69).
  • IFN ⁇ , IL2 or IL5 monoclonal antibodies
  • CD4 + T lymphocytes 3.28% were activated with 10 ⁇ g / ml Proteoliposome, while 3.86% of CD4 + T and 14.11% of CD8 + T were activated with 20 ⁇ g / ml Proteoliposome.
  • CD8 + T lymphocytes produced IFN ⁇ and IL2, although some production of IL2 was also detected in activated CD4 + T lymphocytes.
  • the percentages of intracellular IFN ⁇ in CD4 + and CD8 + T lymphocytes with 10 ⁇ g / ml were 0.35 and 0.89 and with 20 ⁇ g / ml were 1.54 and 1.29, respectively; but only of the IFN ⁇ producing cells were 0.57% activated with 10 ⁇ g / ml and 0.87% with 20 ⁇ g / ml of the CD8 + T.
  • the percentages of intracellular IL2 in CD4 + and CD8 + T lymphocytes with 10 ⁇ g / ml were 1.19 and 1.07 and with 20 ⁇ g / ml were 1.18 and 1.6, respectively; but only IL2-producing cells were activated 0.68 and 0.7% with 10 and 20 ⁇ g / ml, respectively of CD8 + T cells.
  • CD4 + T lymphocytes only low percentages of IL2 production in activated cells were detected. No production of IL5 was observed by any of the lymphocyte subpopulations.
  • Example 6 Signs of activation and production of intracellular cytokines by convalescent lymphocytes of meningococcal disease. Two months after discharge from patients who had suffered meningococcal disease caused by Neisseria meningitidis B blood was taken. These clashed for 27 hours with Proteo lipo soma 10 ⁇ g / ml. Subsequently the red blood cells were used and the rest of the cell was permeabilized and faced with monoclonal antibodies for the detection of intracellular cytokines (IFN ⁇ , IL2 or IL5) and markers of membrane (CD4, CD8 and CD69). The percentages of T CD4 + and T CD8 + activated were 9.29 and 26.81, respectively.
  • IFN ⁇ , IL2 or IL5 markers of membrane
  • Example 7 Incorporation of exogenous antigens in the Proteoliposome.
  • Ovalbumin (Ova) was incorporated into the Proteoliposome through the use of detergents, particularly deoxycholate, which allowed disassembly of its Proteoliposomal structure. The elimination of the detergent and the reassembly of the structure in the presence of Ova allowed its incorporation into the Proteoliposome.
  • the vesicular structure was checked by molecular exclusion chromatography yielding similar Proteoliposome profiles only and that of the Ova. The presence of Ova was verified by the SDS-PAGE technique and its subsequent Western Blot revealed with a polyclonal anti-Ova antibody which demonstrated the presence of a band corresponding to Ova within the Proteoliposome protein profile.
  • Example 8 Incorporation of exogenous antigens in cochlear structures.
  • the incorporation of promishigote and amastigote proteins from Leishmania was efficiently carried out by including them in the solution during the process of formation of the cochlear structures.
  • the immunization of animals with the Cochlear Structures containing these antigens demonstrated the increase in the axiou-Leishmania response, as well as the reduction of indurations caused by infection with this protozoan.
  • the presence of this protein was also evidenced by the SDS-PAGE technique followed by a Western Blot revealed with anti Leishmania antibodies.
  • Example 9 Conjugation of antigens to Proteoliposomes. This is described in example 1.2 of the patent "Method of obtaining conjugate vaccines. Vaccine compositions" OCPI Patent 2002-0257 of 11/14/02.
  • Example 10 Incorporation of Molecular Patterns Associated with Pathogens. Lipopolysaccharides (LPS) from Neisseria meningitidis B have been incorporated into different amounts, increasing its concentrations normally present in Proteoliposomes up to 12% with an increase in the immune response obtained. Vibrio cholerae LPS have also been incorporated, which has allowed to induce Vibrio anti-LPS response.
  • LPS Lipopolysaccharides
  • Example 12 Incorporation of plasmid DNA in cochlear structures and release of it in the cell cytoplasm.
  • Plasmid pGFP which contains the green fluorescent protein gene under an upper cell expression promoter (CMVp) was efficiently incorporated into cochlear structures.
  • Cochlear structures containing said plasmid were added to a cell culture of the L929 line. The expression of the green fluorescent protein in the cell cytoplasm was checked by fluorescence optical microscopy.
  • Example 13 Dedolitic cells exposed to Proteoliposome (PL) containing Ovalbumin (Ova) may present Ova peptides to T cells.
  • Dedritic cells (CD) were incubated for 2 h with soluble PL-Ova or Ova and then co-cultured with T-cell hybridomas. Supernatants were collected after 24 h and tested to detect IL2 production through the incorporation of [ 3 H] thymidine by the IL2-dependent CTLL cell line.
  • IL2 provides a measure of the activation of T cell hybridomas specific for Ova peptides.
  • Figure 1 shows that CDs incubated with PL-Ova can present Ova peptides to the hybridoma of CD4 + T cells and that of CD8 + T.
  • T-cell hybridomas produced significantly higher levels of IL2 when stimulated with CDs that had previously been incubated with PL-Ova compared to CDs incubated only with Ova.
  • Significant differences between presentation levels of specific peptides of Ova in MHC-I and MHC-II by CD incubated with PL (Ova) or Ova were determined using the Duncan Multiple Comparison Test. In this way, the Proteoliposome can release CD antigens and promote efficient antigen presentation to T cells.
  • FIG. 1 shows the response of the OT4H T cell hybridoma to CD of C57BL / 6 mice co-incubated with Proteoliposome (PL), Ova or PL-Ova;
  • Fig. IB shows the response of the OvaCD8 + T cell hybridoma.
  • the production of IL-2 by hybridomas was quantified by incorporation of [H] thymidine by the IL-2-dependent CTLL cell line. Data are presented as the mean + SD of three different experiments. CPM, scintillation per minute. * significantly different from other groups.

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Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de las composiciones vacunales para el tratamiento efectivo o prevención de infecciones fúngicas, virales, protozoarias o bacterianas (preferiblemente intracelulares) y cáncer. El objetivo técnico que se persigue es obtener adyuvantes para uso en vacunas profilácticas o terapéuticas utilizando Proteoliposomas bacterianos y derivados de estos, que al ser aplicadas junto a antígenos insertados en su estructura, conjugados o mezclados a estos induzcan una respuesta de linfocitos T citotóxica contra dicho antígeno. De esta forma se obtienen formulaciones múltiples del Proteoliposoma o sus derivados con antígenos heterólogos, que al ser aplicados por vía parenteral o mucosal (preferentemente nasal) inducen respuestas citotóxicas. Este nuevo uso de los Proteoliposomas y sus derivados y las formulaciones antigénicas resultantes son aplicables a la obtención de nuevas vacunas en la industria farmacéutica.

Description

PROTEOLIPOSOMAS Y SUS DERIVADOS COMO ADYUVANTES INDUCTORES DE RESPUESTA CITOTOXICA Y LAS FORMULACIONES RESULTANTES
MEMORIA DESCRIPTIVA
La presente invención se relaciona con el campo de las vacunas y su uso en medicina. Más particularmente, ésta se relaciona con el empleo de adyuvantes y las formulaciones vacunales resultantes.
El objetivo técnico que se persigue es favorecer el incremento en la respuesta inmune frente a antígenos fúngicos, virales, protozoarios, bacterianos o cancerigenos, especialmente aumentar la inducción de respuesta T citotóxica esencial contra estos antígenos. Este trabajo conducirá al desarrollo de formulaciones vacunales terapéuticas o profilácticas.
En este sentido se plantea el uso de Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes en formulaciones con antígenos fúngicos, virales, bacterianos, protozoarios o cancerigenos, insertados en su estructura, conjugados o mezclados con éstos. Estas formulaciones extenderían la respuesta preferencial T auxiliadora de tipo 1 (Thl) inducida por los Proteoliposomas y sus derivados a los antígenos incluidos (Pérez O et al. Infecí Immun. 2001, 69(7):4502-4508), induciendo una respuesta de linfocitos T citotóxica (CTL) contra dichos antígenos al ser aplicados por vía mucosal, parenteral o la combinación de éstas. ESTADO DEL ARTE
Las infecciones por hongos, virus, bacterias o protozoos intracelulares causan patologías frecuentes en todo el mundo. Las enfermedades cancerosas son también, un terrible azote de la humanidad. Estas infecciones y el cáncer de células humanas implican la producción de gran cantidad de antígenos en el citosol celular, muchos de los cuales son acarreados hacia la superficie celular asociados a moléculas del Sistema Mayor de Histocompatibilidad (MHC) de clase I (Heemels, M.-T. and H. Ploegh, 1995. Generation, translocation, and presentation of MHC class I-restricted peptides. Annu. Rev. Biochem. 64,463-491; Rock, K.L. 1996. A new foreign policy: MHC class I molecules monitor the outside woi d. Immunol. Today 17, 131-137; Jondal, M., R. Schirmbeck, and J. Reimann. 1996. MHC class I restricted CTL responses to exogenous antigens. Immunity 5:295-302; and Reimann, J. and S. H. E. Kaufmami. 1997. Alternative antigen processing pathways in anti-infective immunity. Curr. Opin. Immunol. 9:462-469)
La respuesta inmune fue subdividida fenotípicamente en celular (Thl) y humoral (Th2). Los patrones Thl/Th2 se distinguen primeramente por el patrón de citoquinas que secretan los linfocitos T CD4+: fundamentalmente, IFNγ e IL12 por las Thl e IL4 e IL5 por las Th2 (Mossman, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A, and R. L. Coffman. 1986. Two types of murine helper T cells clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136:2348-2357). Por otra parte, también es posible valorar el tipo de respuesta inducida determinando los perfiles de clases y subclases de inmunoglobulinas séricas característicos de cada tipo de respuesta. Así, en ratones el patrón Thl induce preferentemente anticuerpos de la subclase IgG2a (dependiente de IFNγ), mientras que el Th2 induce IgE y la subclase IgGl (dependientes de IL4). En humanos el patrón Thl cursa con la inducción de subclases IgGl e IgG3 y el Th2 induce la clase IgE.
Otras citocinas producidas por células no linfoides se han asociado también a estos patrones, como ocurre con la IL12 e IL18 asociada con un patrón Thl. Por otro lado, el IFNγ y la IL10 actúan como inhibidores de la respuesta Th2 y Thl, respectivamente.
Hoy en día se ha extendido esta clasificación también a los linfocitos T CD8+ los que por semejanza en la producción de citocinas se han clasificado como Tcl y Tc2. Los linfocitos T CD8+ son los mediadores e inductores fundamentales de actividad CTL. Estos actúan entonces, no sólo como células efectoras, sino también como reguladoras produciendo citocinas que expanden más una respuesta que la otra. Por lo que, la determinación de los subset de linfocitos T CD4+ o T CD8+ presentes en linfoproliferaciones de células mononucleares periféricas de sujetos inmunizados o de órganos linfoides secundarios de animales inmunizados, re-estimulados por un antígeno in vi/ro, es una medida importante de que estas dos poblaciones están siendo estimuladas.
Es necesario eliminar las células infectadas con patógenos intracelulares o las células tumorales. La actividad citotóxica de los linfocitos T CD8+ (CTL) es uno de los mecanismos inmunes más eficientes para ello. Estos reconocen antígenos presentados en el contexto del MHC-I y son capaces de matar las células infectadas a través de la liberación de perforinas, producción de "granzymes" e interacción de los mediadores Fas-FasL (O 'Hagan D., Mackicham M., and Singh M. Recent advance in adyuvants for infection disease Biomolecular Engineering 2001.). La actividad de los CTL es la respuesta inmune más comúnmente aceptada para determinar la efectividad de las vacunas contra las infecciones intracelulares causadas por virus, bacterias o protozoos, así como frente a minoraciones.
La actividad CTL satisfactoria puede ser determinada por cualquier método conocido, tanto indirectos como directos. Preferiblemente, se combinan los métodos indirectos y directos. En los indirectos, se determina la capacidad del Proteoliposoma o sus derivados, con antígenos insertados en su estructura, conjugados o coadministrados de ser fagocitados, degradados y presentados en la superficie celular asociados a las moléculas MHC-I de líneas celulares. Estos se enfrentan entonces a líneas celulares citotóxicas contra el antígeno insertado y se determina la muerte celular por métodos radioactivos o no radioactivos. Otro índice indirecto es la estimulación, por el Proteoliposoma o sus derivados con antígenos insertados, conjugados o coadministrados, de linfocitos T CD8+ en células mononucleares periféricas de humanos inmunizados o provenientes de órganos linfoides secundarios de animales inmunizados, re-estimuladas in vitro con el antígeno de interés. La detección de linfocitos T CD8+ productores de IFNγ e IL2 en células mononucleares re-estimuladas in vitro con el antígeno de interés es otro índice indirecto que puede ser determinado por Citometría de Flujo o ELISPOT. En este caso se determina fundamentalmente la producción de IFNγ por los linfocitos T CD8+. La producción de IL2 por hibridomas de células T CD8+ luego del reconocimiento del antígeno específico en el contexto de moléculas MHC-I en la superficie de células presentadoras de antígeno previamente incubadas con el Proteoliposoma o sus derivados conteniendo el antígeno específico insertado en sus estructuras, conjugado o coadministrado con ellos, es otra forma indirecta de evidenciar actividad CTL.
En los directos se inmuniza mamíferos con el Proteoliposoma o sus derivados y los antígenos de interés, insertados en su estructura, conjugados o coadministrados y posteriormente se extraen los órganos linfoides secundarios y se determina la presencia de actividad CTL contra el antígeno de interés asociado a MHC-I. El método más antiguo para detectar actividad CTL antígeno-específica esta basado en el ensayo de citotoxicidad por liberación de cromo radiactivo, el cual ha sido diseñado lo mismo para células frescas (midiendo la actividad efectora CTL) que para líneas CTL (evaluando reactividad CTL de memoria). En ambos casos las células dianas expresan los antígenos específicos de interés, lo cual puede lograrse por varias métodos (infección por virus recombinantes, "peptide loading" o transfección genética). Más recientemente tienden a utilizarse epítopes CTL específicos previamente determinados.
Otro método ex vivo es el ensayo de unión a tetrámeros, '"tetrameric-binding assay" (TBA). Los complejos tetraméricos de moléculas MHC-I cargados con epítopes óptimos unen directamente los receptores de células T CD8+ (TCRs) antígeno-especificas independientemente de su capacidad funcional. Se utilizan generalmente tetrámeros HLA-A2 unidos al epítope CTL de interés. El TBA es más exacto y preciso para reflejar el número de células T CD8 antígeno específicas movilizadas in vivo pero su capacidad para cuantificar células T CD8+ antígeno-especificas funcionales es limitada.
Por mucho tiempo se consideró a los CTL como el principal componente de la respuesta celular. Hoy se sabe que a pesar de que estos son inducidos durante la respuesta Thl, no todas las respuestas Thl cursan con la inducción de CTL. Por ello, la necesidad de buscar adyuvantes que induzcan, además de un patrón Thl, actividad CTL. Los adyuvantes son sustancias que potencian la respuesta inmune específica contra un antígeno provocando una inducción más rápida de esta y aumentando su duración (Vogel FR. Dev. Biol. Stand. 1998,92:241-248). Su uso en las formulaciones vacunales permite reducir la cantidad de antígeno necesaria, dirigir la respuesta hacia un patrón deseado y disminuir el número de dosis necesarias.
Entre los sistemas de adyuvantes disponibles que inducen respuesta Thl se encuentran:
1. MF59 (emulsión de aceite en agua micro fluidizada de aceite de escualeno). Podda A, Del Giudice G. Expert Rev Vaccines. 2003 Apr;2(2): 197-203.
2. Monofosforil lípido A (MPL®), derivado lipopolisacarídico proveniente de Salmonella minnesota, que contiene 6 ácidos grasos, particularmente el MPL 3-D-O-acetilado (3D- MPL) u otros derivados no tóxicos del lipopolisacárido (LPS) y combinaciones del MPL, preferiblemente el 3D-MPL o derivados no tóxicos del LPS con sales de aluminio. 3. Fracciones inmunoestimulatorias de Quillaja saponaria: Quil A, incorporada en complejos inmunoestimulatorios (ISCOM®), Complejos de saponinas, colesterol y fosfolípidos (Polakos NK, Drane D, Cox J, Ng P, Selby MJ, Chien D, O 'Hagan DT, Houghtan M and Palian! X. J Immunol 2001,166:3589-98).
4. Partículas de polilactil co-glicolidos (Putney SD and Burke PA, Nat BIOTECHNOL. 1998, 16:153-157). 5. MPL y saponina, particularmente Saponina glicósido triterpénico aislada de la corteza del árbol Quillaja saponaria Molina (QS21) y 3D-MPL como es revelado en WO 94/00153.
6. QS21 y colesterol como es revelado en WO 98/33739.
7. QS21, 33D-MPL y tocoferol emulsionados en agua en aceite como se revela en WO 95/17210 y 8. Oligonucleótidos CpG, secuencias de dinucleótidos citocina-guanina con citocinas no metiladas, característica sólo del ácido desoxirribonucleico (ADN) bacteriano, como es revelado en WO 96/02555.
Los adyuvantes que inducen CTL en la actualidad son escasos entre los que se encuentran el MF59, los Oligonucleótidos CpG, el QS21, el MPL®, los ISCOM® y cocleatos derivados de lípidos (O 'Hagan D., Mackicham M., and Singh M. Recent advance in adyuvants for infection disease. Biomolecular Engineering 2001 and Edelman Robert. The development and use of vaccine adyuvant. Molecular Biothecnology 2002. 21:2, 129-148.).
Los Proteoliposomas se han descrito para la preparación de vacunas profilácticas contra enfermedades infecciosas por Ruegg CL et al. (Preparation of proteosome-based vaccines. J Immunological Methods 1990;135:101-109); Lowell et al. (Proteosome-Lipopeptide Vaccines: Enhancement of Immunity for Malaria CS Peptides. Science 1988;240:800-2) y también como es revelado en US No. 5,597,572. En esta última, el núcleo fundamental es el Proteoliposoma derivado de la membrana externa de Neisseria meningitidis serogrupo B, cuya estructura particulada, su contenido de LPS nativos incorporados y no libres, el polisacárido C, su composición lipídica característica y su adsorción en alúmina, están relacionadas con su elevada inmunogenicidad y probada protectogenicidad en humanos.
La vacuna basada en este Proteoliposoma, VA-MENGOC-BC®, ha sido aplicada en más de
50 millones de dosis y ha demostrado ser segura, no reactogénica y eficaz para proteger contra N. meningitidis serogrupos B y C. Es además, aplicada durante la lactancia de forma segura y efectiva, donde convierte la T-independencia del Polisacárido C en un antígeno T- dependiente (Pérez O. et al. Thl response induced by the B component of VA-MENGOC- BC™ overcomes the thymus independence of polysaccharide C and primes for memory in toddler. Biotecnología Aplicada 2002; 19(l-2):54). Esta vacuna induce un patrón preferencial Thl caracterizado por la inducción en humanos y animales de linfoproliferación; anticuerpos IgG anti-Proteoliposoma; subclases IgGl en humanos e IgG2a en ratones; IFNγ, IL2 e IL12 en el ámbito de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y proteínas, no-inducción de IgE anti- Propteoliposoma ni incrementos en la IgE total y no-producción de IL4, IL5 tanto en el ámbito de ARNm como proteico (Pérez O et al. Infecí Immun. 2001, 69(72001):4502-4508). Los Proteoliposomas y derivados de estos como las VSSP y las Estructuras cocleares, también se han empleado como adyuvantes como es revelado en (US 6,149,921 del 2000) y en (Método de obtención de estructuras cocleares. Composiciones vacunales y adyuvantes basados en estructuras cocleares y sus intermediarios. OCPI. 2002-0292 del 27/11/02), respectivamente.
La presente invención tiene como objeto el empleo de los Proteoliposomas bacterianos naturales o modificados genéticamente, en especial aquellos derivados de N. meningitidis, así como las Estructuras cocleares derivadas de éste, como nuevos adyuvantes inductores de CTL. Estos nuevos adyuvantes resultan de particular importancia contra infecciones fúngicas, virales, bacterianas y protozoarias (particularmente las intracelulares), así como enfermedades tumorales. Por "Proteoliposoma" se entiende que estos son obtenidos de cepas bacterianas usando cualquier método conocido como puede ser: su aislamiento sin detergente; un proceso que incluya detergente (como desoxicolato) o la extracción a partir de vesículas "bleb" de sobrenadantes de cultivos y particularmente los revelados en US 5,597,572. Los Proteoliposomas contienen diferentes Patrones Moleculares Asociados a Patógenos (PAMP), estructuras moleculares conservadas entre patógenos capaces de estimular fuertemente al sistema inmunitario.
Por "Estructuras cocleares" se entiende un adyuvante derivado de los Proteoliposomas que por lo tanto también contienen PAMP según se refiere en la patente (Método de obtención de estructuras cocleares. Composiciones vacunales y adyuvantes basados en estructuras cocleares y sus intermediarios. OCPI. 2002-0292 del 27/11/02). Los mecanismos de protección contra Neisseria, bacteria Gram negativa extracelular, están relacionados con la inducción de anticuerpos que median fundamentalmente las funciones opsonofagocíticas y bactericidas. Por lo que, no es de esperar que los Proteoliposomas derivadas de ellas y la infección natural producida por esta bacteria, induzcan respuestas CTL. Sin embargo, estudios de laboratorio han demostrado, sorpresivamente, que humanos inmunizados con NA-MENGOC-BC®, vacuna anti-N. meningitidis B y C, muestran una respuesta con activación y proliferación de linfocitos tanto T CD4 como T CD8 específicos contra el Proteoliposoma, al ser evaluada en células mononucleares periféricas re-estimuladas in vitro. También sorprendente ha sido encontrar que ratones Balb/c inmunizados con VA-MEΝGOC- BC ', con Proteoliposomas o Estructuras cocleares inducen T CD8+ específicos, además de los conocidos T CD4+.
De igual forma se ha encontrado, inesperadamente, que la infección por el microorganismo natural, N. meningitidis serogrupo B, induce respuesta tanto T CD4+ como T CD8+ anti- Proteoliposoma, la cual fue detectada en linfocitos de individuos curados de enfermedad meningocócica causada por N. meningitidis B.
Fue inesperado que también los ratones inoculados con N. meningitidis B indujeran respuesta de células T CD8+.
Se ha encontrado, que tanto en células de inmunizados con VA-MEΝGOC-BC® como prevenientes de individuos curados de enfermedad meningocócica, los linfocitos T CD4+, y sorprendentemente los T CD8+ secretan IFΝγ e IL2 y no IL4 ni IL5 al ser evaluados por Citometría de Flujo. Este resultado incluye a los linfocitos T CD8+ dentro de las células importantes en la producción de las citocinas características del patrón de respuesta Thl.
Todas estas evidencias fenotípicas y moleculares, apuntan hacia la inducción de una respuesta CTL luego de la infección natural o la inmunización con un Proteoliposoma proveniente de una bacteria extracelular, lo cual resulta extremadamente sorprendente.
Otras experiencias sorprendentes se obtuvieron a partir de la incorporación eficiente de antígenos exógenos como la Ovalbúmina (Ova) en el Proteoliposoma y sus derivados, aunque sus capacidades no se restringen a este antígeno. La incorporación de Ova en el Proteoliposoma indujo, en células dendrí ticas, presentación a nivel de MHC clase I y su reconocimiento y activación por hibridomas de células T CD8+. Estos resultados evidencian la inducción de una respuesta CTL contra antígenos heterólogos que puede ser empleada para el desarrollo de nuevas preparaciones vacunales.
La inserción o conjugación de epitopes CTL provenientes de Ova fueron incorporados en los Proteoliposomas o sus derivados y de esta forma se incrementó la respuesta inducida contra estos epitopes.
También forman parte de la presente invención Proteoliposomas que pueden expresar altas concentraciones de antígenos de interés, mediante la manipulación por ingeniería genética de la cepa productora del Proteoliposoma con el fin de que exprese "más o menos" cantidad del o de los antígenos heterólogos deseados. Por "antígenos de interés" se entiende aquellos provenientes de hongos, virus, bacterias, protozoos y cáncer que han demostrado requerir de respuesta CTL para su eficiente eliminación por el sistema inmune, sin restringirse a los ya identificados.
Por "más o menos" se entiende en particular que la cepa exprese más de un 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 ó 0.1% de la cantidad del o los antígenos heterólogos de interés. Preferiblemente la cepa ingenierizada expresa entre 0.5% y 10% del antígeno de interés.
El gen codificante del antígeno de interés de la invención puede ser ingenierizado según lo expresado anteriormente por técnicas conocidas.
También forma parte de la presente invención la obtención de diferentes formulaciones vacunales que aprovechan la capacidad de los Proteoliposomas y las Estructuras cocleares de inducir respuestas CTL, no descrita con anterioridad.
Antígenos tumor asociados, gangliósidos o proteínas provenientes de Leishmania fueron incluidos en los Proteoliposomas o en sus derivados y se demostró la inducción de respuesta CD8+ y producción de IFNγ cuando ratones Balb/c fueron inmunizados y desafiados in vitro con los respectivos antígenos. También muestran ser efectivas formulaciones vacunales, donde los antígenos son conjugados a parte de los Proteoliposomas de la composición vacunal o una vez conjugados a éstos son transformados en Estructuras cocleares.
Las formulaciones vacunales de la presente invención pueden ser usadas para proteger un mamífero susceptible a la infección o tratar enfermedades minórales por medio de la administración de dicha formulación vacunal por vía sistémica o mucosal. Estas aplicaciones pueden incluir inyecciones por rutas intramusculares, intraperitoneales, intradérmica o subcutánea o administración mucosal por vía oral/alimentaria, nasal/respiratoria o tractus genitourinario.
La cantidad de Proteoliposoma o Estructuras cocleares en cada formulación es seleccionada como la cantidad que muestra función adyuvante, que siempre es inferior a la empleada en las vacunas anti-meningocócicas basadas en estas estructuras, por lo que los efectos secundarios adversos son inferiores y no son significativos. Esta cantidad variará en dependencia del antígeno de interés y como éste es incorporado. Generalmente la cantidad de Proteoliposoma o Estructuras cocleares en cada dosis estará entre 1 y 50 μg y más típicamente entre 5 y 25 μg. La cantidad del antígeno de interés estará en el rango de 0.1 a 20% de la masa de Proteoliposoma o Estructuras cocleares y preferiblemente 0.5 a 10%.
El número de dosis dependerá primariamente de si la formulación vacunal es profiláctica o terapéutica. En la primera, se aplicarán como máximo tres dosis y en la segunda se puede llegar hasta 5 dosis. Ambas pueden ser aplicadas en niños menores de un año, de 2 a 5 años, escolares, adolescentes, adultos y en la tercera edad. La novedad de la invención radica primeramente, en el uso de Proteoliposomas o Estructuras cocleares derivados de proteínas de la membrana externa de bacterias Gram-negativas y más particularmente de N. meningitidis B, como adyuvantes inductores de actividad CTL.
Es particularmente novedoso, que la infección natural con N. meningitidis B, bacteria extracelular, induzca respuesta de células T CD8+, linfocitos más asociados a la respuesta citotóxica y que estos produzcan IFΝγ e IL2, evidenciando la inducción de actividad CTL, por lo que estos linfocitos también están potenciando la respuesta Thl previamente demostrada.
Otro aspecto novedoso es su aplicación profiláctica en formulaciones vacunales fúngicas, virales, bacterianas o protozoarias y su aplicación terapéuticas en sujetos afectados con tumoraciones malignas en que se desea inducir una respuesta citotóxica. Es particularmente novedoso además, la conjugación o inserción de epítopos citotóxicos a los Proteoliposomas o Estructuras cocleares, los que incrementan la respuesta CTL.
Es también novedoso, la posibilidad de empleo de estas formulaciones por vía mucosal además de por vía parenteral, o la combinación de estas vías.
Es también novedoso, la ingenierización de las cepas meningocócicas para producir Proteoliposomas o sus derivados que expresen antígenos citotóxicos. De forma inesperada se obtiene respuesta CTL contra Proteo lipo somas provenientes de bacterias extracelulares y sus derivados, las estructuras cocleares, cuando la inducción de actividad citotóxica sólo estaba circunscrita a gérmenes intracelulares, tumores o determinados adyuvantes que permitan una presentación cruzada (cross priming). También fue inesperado el hallazgo de inducción de actividad CTL en convalecientes de enfermedad meningocócica o en portadores de Neisseria, germen extracelular que no debiera inducir actividad CTL.
Estas actividades se manifestaron por la inducción de linfocitos CD8+, por la presencia de IFNγ e IL2 en ellos, la presentación de antígenos heterólogos en MHC clase I de células dendríticas y su reconocimiento y activación de hibridomas CD8+ y la lisis de células que expresan antígenos heterólogos.
Los Proteoliposomas y las Estructuras cocleares son obtenidos a escala industrial en condiciones de Buenas Prácticas de Producción (GMP, Good Manufacture Practices) en el Instituto Finlay y contamos con metodologías para la inclusión de antígenos heterólogos en los mismos.
La solución propuesta tiene las siguientes ventajas:
El efecto inmunológico logrado por este preparado permite inducir respuestas CTL por el Proteoliposoma y las Estructuras cocleares contra los antígenos heterólogos incorporados en estos, lo que es aplicable; pero no limitado, a microorganismos intracelulares y a enfermedades tumorales.
El efecto inmunológico de los Proteoliposomas como vacuna y transitivamente como adyuvante, donde se emplea menores cantidades, es seguro en niños menores de un año, de 2 a 4 años, en escolares, adolescentes y adultos.
Los Proteoliposomas y las Estructuras cocleares por la preferencial respuesta celular (Thl) inducida, también convierten a antí genos T-independientes (conjugados o incorporados no covalentemente), tales como carbohidratos en antígenos T-dependientes. Esta propiedad se aplica también de forma ventajosa a los antígenos de interés de carácter sacarídicos.
Es útil la flexibilidad de las Estructuras cocleares para incorporan antígenos particulados, especialmente ADN induciendo respuesta CTL contra ellos La presente invención será descrita a través de los siguientes ejemplos específicos. Ejemplo 1. Obtención del Proteoliposoma. Para la obtención del Proteoliposoma se realiza un cultivo de N. meningitidis B o Salmonella typhi y la biomasa colectada mediante centrifugación se somete a un proceso de extracción con detergente, enzimas y ultrasonido. El debris celular es removido mediante centrifugación y el sobrenadante es sometido entonces a digestión con nucleasas para eliminar los ácidos nucleicos. El extracto es recuperado mediante ultracentrifugación, resuspendido en solución con detergente y purificado del resto de los componentes de bajo y mediano peso molecular mediante cromatografía de exclusión molecular. El Proteoliposoma así obtenido contiene menos del 10% de ácidos nucleicos y menos del 10% de LPS insertado en su estructura; pero nunca libres. El LPS presente es esencial en desencadenar las señales de peligro para iniciar la respuesta innata. El producto final es sometido a un conjunto de controles biológicos y físico-químicos.
Ejemplo 2. Respuesta de Linfocitos T CD4+ y T CD8+ por inmunización de ratones. Ratones Balb/c fueron inmunizados con dos dosis de 25 μg cada una de Proteoliposoma o Estructuras cocleares, por vía intramuscular o nasal y espaciadas 14 días, Las células de bazo fueron tomadas a los 7 días de la segunda dosis y desafiadas por 4 días con Proteoliposoma. Las células expandidas fueron tratadas con anticuerpos monoclonales anti-CD4 o anti-CD8 y posteriormente con una anti-IgG fluorescente y fueron evaluados por Citometría de Flujo. La inmunización estimuló tanto los linfocitos T CD4+ como T CD8+ anti-Proteoliposoma. 45% de los linfocitos fueron T CD4+ y 40% fueron T CD8+. Ejemplo 3. Respuesta de Linfocitos T CD4+ y T CD8+ por inmunización de humanos. Adultos jóvenes frieron inmunizados con dos dosis de VA-MEΝGOC-BC ' de 50 μg cada una por vía intramuscular, espaciadas 6 semanas. Siete días después de la segunda dosis se tomó sangre y se purificaron, sobre gradiente de Ficoll-Hipaque, las células mononucleares periféricas. Estas se enfrentaron por 4 días con Proteoliposoma. Las células expandidas fueron tratadas con anticuerpos monoclonales anti-CD4 o anti-CD8 y posteriormente con una anti- IgG fluorescente y fueron evaluados por Citometría de Flujo. La inmunización estimuló tanto los linfocitos T CD4+ como los linfocitos T CD8+ anti-Proteoliposoma. 50% de los linfocitos fueron T CD4+ y 42% fueron T CD8+.
Ejemplo 4. Respuesta de Linfocitos T CD4+ y T CD8+ en convalecientes de enfermedad meningocócica. Dos meses después del alta de pacientes que habían padecido enfermedad meningocócica causada por Neisseria meningitidis B se tomó sangre y se purificaron, sobre gradiente de Ficoll-Hipaque, las células mononucleares periféricas. Estas se enfrentaron por 4 días con Proteoliposoma. Las células expandidas fueron tratadas con anticuerpos monoclonales anti-CD4 o anti-CD8 y posteriormente con una anti IgG fluorescente y fueron evaluados por Citometría de Flujo. Se evidenció proliferación de linfocitos T CD4+ y T CD8+. 47% de los linfocitos fueron T CD4+ y 39% fueron T CD8+.
Ejemplo 5. Señales de activación y producción de citocinas intracelulares por linfocitos de humanos inmunizados. Adultos jóvenes fueron inmunizados con dos dosis de VA-MENGOC- BC® de 50 μg cada una por vía intramuscular, espaciadas 6 semanas. Varios meses después de la segunda dosis se tomó sangre. Estas se enfrentaron por 27 horas con Proteoliposoma a una concentración de 10 ó 20 μg/ml. Posteriormente los glóbulos rojos fueron Usados y el resto celular fue permeabilizado y enfrentado a anticuerpos monoclonales para la detección de citocinas intracelulares (IFNγ, IL2 o IL5) y marcadores de membrana (CD4, CD8 y CD69). 3.28% de linfocitos T CD4+ y 20.65% de linfocitos T CD8+ fueron activados con 10 μg/ml de Proteoliposoma, mientras que 3.86 % de T CD4+ y 14.11% de T CD8+ fueron activados con 20 μg/ml de Proteoliposoma. Sin embargo, sólo los linfocitos T CD8+ activados produjeron IFNγ e IL2, aunque en los linfocitos T CD4+ activados se detectó también cierta producción de IL2. Los porcentajes de IFNγ intracelular en los linfocitos T CD4+ y T CD8+ con 10 μg/ml fueron 0.35 y 0.89 y con 20 μg/ml fueron 1.54 y 1.29, respectivamente; pero sólo de las células productoras de IFNγ estaban activadas el 0.57% con 10 μg/ml y el 0.87% con 20 μg/ml de los T CD8+. Los porcentajes de IL2 intracelular en los linfocitos T CD4+ y T CD8+ con 10 μg/ml fueron 1.19 y 1.07 y con 20 μg/ml fueron 1.18 y 1.6, respectivamente; pero sólo las células productoras de IL2 estaban activadas el 0.68 y el 0.7% con 10 y 20 μg/ml, respectivamente de los linfocitos T CD8+. En el caso de los linfocitos T CD4+ sólo bajos porcientos de producción de IL2 en las células activadas se detectaron. No se observó producción de IL5 por ninguna de las subpoblaciones linfocitarias.
Ejemplo 6. Señales de activación y producción de citocinas intracelulares por linfocitos de convalecientes de enfermedad meningocócica. Dos meses después del alta de pacientes que habían padecido la enfermedad meningocócica causada por Neisseria meningitidis B se tomó sangre. Estas se enfrentaron por 27 horas con Proteo lipo soma 10 μg/ml. Posteriormente los glóbulos rojos fueron Usados y el resto celular fue permeabilizado y enfrentado a anticuerpos monoclonales para la detección de citocinas intracelulares (IFNγ, IL2 o IL5) y marcadores de membrana (CD4, CD8 y CD69). Los porcentajes de T CD4+ y T CD8+ activados fueron 9.29 y 26.81, respectivamente. Ambos subset de linfocitos, T CD4+ y T CD8+, activados produjeron IFNγ y solo los linfocitos T CD8+ produjeron IL2. Los porcentajes de IFNγ intracelular fueron en los linfocitos T CD4+ y T CD8+ de 3.46 y 1.36, respectivamente; pero de éstos solo eran células activadas el 0,65 y el 0.95%, respectivamente. Los porcentajes de IL2 intracelular fueron en los T CD4 y T CD8+ de 0.73 y 0.93, respectivamente; pero de éstos solo eran células activadas el 0.27 y el 0.73%, respectivamente. No se observó producción de IL5.
Ejemplo 7. Incorporación de antígenos exógenos en el Proteoliposoma. Ovalbúmina (Ova) fue incorporada en el Proteoliposoma mediante el empleo de detergentes, particularmente desoxicolato, el cual permitió el desensamblaje de su estructura Proteoliposomal. La eliminación del detergente y el re-ensamblaje de la estructura en presencia de Ova permitieron su incorporación en el Proteoliposoma. La proporción final de Proteoliposoma:Ova fue de 100:11.2. La estructura vesicular fue comprobada mediante cromatografía de exclusión molecular rindiendo perfiles similares del Proteoliposoma sólo y el del que contenía la Ova. La presencia de Ova fue comprobada por la técnica SDS-PAGE y su posterior Western Blot revelado con un anticuerpo policlonal anti-Ova el cual demostró la presencia de una banda correspondiente a Ova dentro del perfil proteico del Proteoliposoma.
Ejemplo 8. Incorporación de antígenos exógenos en Estructuras cocleares. La incorporación de proteínas de promastigotes y amastigotes de Leishmania fue eficientemente realizada mediante la inclusión de estas en la solución durante el proceso de formación de las Estructuras cocleares. La inmunización de animales con las Estructuras cocleares conteniendo estos antígenos demostró el incremento de la respuesta axiú-Leishmania, así como la reducción de las induraciones producidas por la infección con este protozoo. La presencia de esta proteína también fue evidenciada por la técnica SDS-PAGE seguido de un Western Blot revelado con anticuerpos anti Leishmania.
Ejemplo 9. Conjugación de antígenos a los Proteoliposomas. Este es descrito en el ejemplo 1.2 de la patente "Método de obtención de vacunas conjugadas. Composiciones vacunales" Patente OCPI 2002-0257 de 14/11/02. Ejemplo 10. Incorporación de Patrones Moleculares Asociados a Patógenos. Lipopolisacáridos (LPS) de Neisseria meningitidis B han sido incorporado en diferentes cantidades, incrementando las concentraciones de éste presentes normalmente en los Proteoliposomas hasta un 12% con un incremento en la respuesta inmune obtenida. También se han incorporado LPS de Vibrio cholerae lo que ha permitido inducir respuesta anti-LPS de Vibrio. Ejemplo 11. Producción de IFNγ por linfocitos T CD8+ contra antígenos heterólogos incorporados o conjugados en Proteoliposomas y Estructuras cocleares. Células de bazo de animales inmunizados con Proteoliposomas contendiendo Ova o proteínas de Leishmania en Estructuras cocleares indujeron respuesta T CD8+ y estos expresaron IFNγ al ser evaluados por la técnica de ELISPOT T. Los conjugados de Polisacárido C a Proteoliposomas indujeron respuesta de IFNγ al ser evaluados por ELISA.
Ejemplo 12. Incorporación de ADN plasmídico en las Estructuras cocleares y liberación de este en el citoplasma celular. El plásmido pGFP, que contiene el gen de la proteína verde fluorescente bajo un promotor de expresión en células superiores (CMVp), fue eficientemente incorporado en Estructuras cocleares. Las Estructuras cocleares conteniendo dicho plásmido fueron adicionado a un cultivo de células de la línea L929. La expresión de la proteína verde fluorescente en el citoplasma celular fue comprobada mediante microscopía óptica de florescencia.
Ejemplo 13. Células Dedríticas expuestas al Proteoliposoma (PL) conteniendo Ovalbúmina (Ova) pueden presentar péptidos de Ova a células T. Fueron empleados hibridomas de células T CD4+ (OT4H) restringidas para MHC clase II y de células T CD8+ (CD8OVA) restringidas para MHC clase I específicos para los péptidos de Ova (257-264) y (265-277), respectivamente. Células Dedríticas (CD) fueron incubadas por 2 h con PL-Ova o Ova soluble y luego co-cultivadas con los hibridomas de células T. Los sobrenadantes fueron colectados luego de 24 h y testados para detectar producción de IL2 a través de la incorporación de [3H] timidina por la línea celular CTLL dependiente de IL2. La producción de IL2 brinda una medida de la activación de los hibridomas de células T específicos para péptidos de Ova. La Figura 1 muestra que las CD incubadas con PL-Ova pueden presentar los péptidos de Ova al hibridoma de células T CD4+ y al de T CD8+. Los hibridomas de células T produjeron niveles de IL2 significativamente mayores cuando fueron estimulados con CD que habían sido previamente incubadas con PL-Ova en comparación con CD incubadas sólo con Ova. Las diferencias significativas entre los niveles de presentación de los péptidos específicos de Ova en MHC-I y MHC-II por CD incubadas con PL(Ova) o Ova fueron determinados usando la Prueba de comparación múltiple de Duncan. De esta forma, el Proteoliposoma puede liberar antígenos a CD y propiciar una eficiente presentación antigénica a células T.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 : Figura 1. Células dendríticas pueden procesar péptidos de Ova incluidos en el Proteoliposoma (PL-Ova) y presentarlos en MHC-I y MHC-II DC. Fig. 1A muestra la respuesta del hibridoma de células T OT4H a CD de ratones C57BL/6 co-incubadas con el Proteoliposoma (PL), Ova o PL-Ova; Fig. IB muestra la respuesta del hibridoma de células T OvaCD8+. La producción de IL-2 por los hibridomas fue cuantificada por incorporación de [ H] timidina por la línea celular CTLL dependiente de IL-2. Los datos se presentan como la media + DS de tres experimentos diferentes. CPM, centelleo por minuto. * significativamente diferente de otros grupos.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Adyuvantes vacunales caracterizados por ser un Proteoliposoma o derivados de este que inducen respuesta CTL.
2. Adyuvantes vacunales según reivindicación 1, caracterizados porque el Proteoliposoma o sus derivados son de origen bacteriano.
3. Adyuvantes vacunales según reivindicación 2, caracterizados porque provienen del género Neisseria o Salmonella.
4. Adyuvantes vacunales según reivindicación 1, caracterizados porque el Proteoliposoma o sus derivados expresan antígenos heterólogos de interés a partir de una cepa modificada genéticamente.
5. Formulación vacunal caracterizada porque comprende el o los adyuvantes según las reivindicaciones de la 1 a la 4, uno o más antígenos, así como excipientes adecuados.
6. Formulación vacunal según reivindicación 5, caracterizado porque el antígeno(s) es insertado en la bicapa lipídica de los Proteoliposomas, estando así presente en sus derivados.
7. Formulación vacunal según reivindicación 5, caracterizado porque el antígeno(s) es conjugado al Proteoliposoma, estando así presente en sus derivados.
8. Formulación vacunal según reivindicación 5, caracterizado porque el antígeno(s) es co-administrado con el Proteoliposoma o sus derivados.
9. Formulación vacunal según reivindicación 5, caracterizado porque el antígeno(s) se puede seleccionar del grupo de antígenos provenientes de hongos, virus, bacterias, protozoos y cáncer y que han demostrado requerir de respuesta CTL para su eficiente eliminación por el sistema inmune.
10. Formulación vacunal según reivindicación 5, caracterizado porque el Proteoliposoma o sus derivados se encuentran en un rango entre 1 y 50 μg y particularmente entre 5 y 25 μg.
11. Formulación vacunal según reivindicación 5, caracterizado porque el o los antígenos se encuentran en un rango entre 0.1 a 20% de la masa de Proteoliposoma o sus derivados y particularmente entre 0.5 a 10%.
12. Formulación vacunal según reivindicaciones de la 5 a la 11, caracterizado porque la vía de administración puede seleccionarse del grupo de intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea o vía mucosal por oral/alimentaria, nasal o tractos genitourinario.
13. Uso de la formulación vacunal según reivindicaciones de la 5 a la 11 para la protección de mamíferos susceptibles a infecciones y para el tratamiento de enfermedades tumorales.
14. Esquema de inmunización empleando las formulaciones según reivindicaciones de la 5 a la 11 , caracterizado porque para lograr un efecto profiláctico se aplicarán como máximo tres dosis y para lograr un efecto terapéutico se aplicarán como máximo cinco dosis.
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