WO2003094964A1 - Composición vacunal contra las alergias, método para su obtención y empleo en el tratamiento de las mismas - Google Patents

Composición vacunal contra las alergias, método para su obtención y empleo en el tratamiento de las mismas Download PDF

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WO2003094964A1
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vaccine composition
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proteoliposome
allergens
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Miriam de San Juan Lastre González
Oliver Germán PÉREZ MARTÍN
Alexis Labrada Rosado
Igor Bidot Martínez
Jorge Ernesto PÉREZ LASTRE
Gustavo Rafael Bracho Granada
Judith Mónica DEL CAMPO ALONSO
Dainerys Aleida PÉREZ LASTRE
Elisa Facenda Ramos
Caridad Zayas Vignier
Claudio Rodríguez Martínez
Victoriano Gustavo SIERRA GONZÁLEZ
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Instituto Finlay, Centro De Investigación- Pruducción De Vacunas Y Sueros
Centro Nacional De Biopreparados
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Definitions

  • the present invention relates to the field of Immunology, specifically with the branch of Immunoalergy and in particular with the use of adjuvants or carriers to modulate the immunological response to allergens, with the aim of inducing changes that reduce or prevent the pathogenic effect of said response towards those compounds.
  • Allergies are a very common pathology, especially in industrialized countries.
  • the most common of them is the so-called hypersensitivity of tlpo-l or anaphylactic.
  • the physiopathogenesis of the same is based on the increased production of IgE, a cytotropic antibody, which is produced against substances called allergens, after a first contact known as sensitization.
  • IgE binds to tissue mast cells and blood basophils, thus prolonging their half-life from hours in blood to months in tissues.
  • asthma In subsequent contacts with the allergen, recognition of them and cross-linking of surface IgE, signal transmission to the cytoplasm and cell degranulation, and release of allergy mediators, including histamine, occur serotonin and kinins.
  • the most common allergic diseases are rhinitis, asthma, and atopic dermatitis.
  • Allergic asthma is a chronic inflammatory disease.
  • the immunopathogenesis of asthma is complex and involves, in addition to the IgE-dependent mechanisms (causes of the immediate anaphylactic response type I), Th2 lymphocytes, which induce and maintain the inflammatory response by recruiting and activating other cells and in particularly through the production of IL-5, which is responsible for the recruitment and activation of eosinophils.
  • Eosinophilia plays an important role in the emergence of bronchial hyperreactivity, which is an essential characteristic of asthma.
  • the most common allergens are pollen, mites, house dust, mold, drugs, food and animal hair.
  • the domestic allergens and first of all mites are the cause of respiratory allergies and asthma.
  • hyposensitization therapy or immunotherapy with allergenic extracts has been widely used in the treatment of allergic diseases.
  • patients are hyposensitized by subcutaneous administration of specific allergens. It begins with the injection of a small dose of said allergen and if allergic reactions do not occur, it is increased on a weekly basis. The doses continue to increase gradually until a monthly or bi-monthly maintenance dose is reached.
  • Th2 cells are pathologically involved not only through their regulatory role (IL-4 induces class change towards IgE in B lymphocytes, mediated by a contact signal provided by Th) but also also more involved direct in the effector phase of the late allergic response and in chronic asthmatic inflammation.
  • the immune mechanism responsible for the clinical improvement of patients during immunotherapy with allergenic extracts is not yet fully elucidated.
  • Th1 / Th2 patterns of immune response they are distinguished first by the typical pattern of cytokines secreted by Th cells, primarily IFN- ⁇ and IL-2 by Th1 and IL-4 and IL-5 by Th2 (Mossman, TR, Cherwinski, H., Bond, MW, Giedlin, M. A, and RL Coffman. 1986. Two types of murine helper T cells clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136: 2348-2357). On the other hand, it is also possible to assess the type of induced response by determining the profiles of classes and subclasses of serum immunoglobulins that they induce.
  • the Th1 pattern preferentially induces antibodies of the lgG2a subclass (IFN- ⁇ dependent), while Th2 induces IgE and lgG1 subclass (IL-4 dependent).
  • Th1 studies with IgG1 / IgG3 antibodies and Th2 with IgE are related to environmental factors, the basic role in the individual's propensity to develop a Th2 / lgE response to environmental antigens is genetic (Holgate ST. Genetic and environmental interaction in allergy and Asthma. J Allergy Clin Immunol 1999; 104: 1139-1 146). This translates into that, the offspring of allergic parents will also be more often than the children of non-allergic parents.
  • liposomes containing allergens have been described in patent application WO 89/10753. Liposomes, in addition to creating a reservoir and reducing the allergenicity of the product, are believed to influence the mechanisms of presentation of the antigens to the immune system, due to their lipid and particulate nature (WHO Position Paper. Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines against Allergic Diseases, Geneva, January 1998). However, this approach has not been extended to clinical practice due to the characteristic instability of these preparations, as well as to problems related to technology for the consistent inclusion of allergens within the liposomes.
  • the fundamental nucleus is the proteoliposome or outer membrane vesicles (VME) derived from Neisser ⁇ a meningitidis serogroup B, whose particulate structure, its traces of lipooligosaccharides (LPS) incorporated in the VME, the polysaccharide C, its characteristic lipid composition and Its adsorption in alumina, are related to its immunogenicity and proven protectogenicity in humans.
  • LPS lipooligosaccharides
  • this vaccine formulation does not cause toxic effects in humans or animals, which is attributed to the peculiar structure and composition of the VME.
  • the vaccine based on this proteoliposome has been applied in more than 50 million doses and has proven to be safe, non-reagenic and effective to protect against N. meningitidis serogupos B and O It is also applied during breastfeeding safely and effectively, where converts the T-independence of Polysaccharide C into a T-dependent antigen.
  • This vaccine induces a preferential Th1 pattern characterized by induction in human and animal lymphoproliferation; IgG anti-VME antibodies; lgG1 subclasses in humans and lgG2a in mice; IFN ⁇ , IL-2 and IL-12 at the level of mRNA and proteins, and the non-induction of anti-VME IgE or increases in total IgE, nor of IL-4, IL-5 at the level of mRNA or protein ( Infect Immun. 2001, 69 (72001): 4502-4508).
  • the vaccine-induced response is specific to the bacterial antigens that make up the product, and therefore, there is no evidence that it induces any response against known allergens.
  • the technical objective of the present invention is to obtain a pharmaceutical preparation for therapeutic or prophylactic use using bacterial proteoliposomes, hereinafter referred to as proteoliposomes, which when applied in a patient suffering from allergies, is capable of transforming the response allergic (Th2) induced by the allergen, towards a Th1 cellular response.
  • the invention also includes the immunization scheme with said vaccine composition. It is also an objective of the present invention to provide a pharmaceutical composition capable of preventing the onset and development of allergic disease in children with atopic family history.
  • This composition may contain one or more allergens which can be coupled or administered together with a proteoliposome, inducing a therapeutic or protective immune response in the allergic individual, to the allergens in question.
  • This response is characterized by lower production of IgE antibodies with respect to traditional immunotherapy, non-induction of IL-5, as well as the induction of lgG1 subclass antibodies (in humans) and lgG2a (in murine) and the cytokines IFN ⁇ and IL-2 (in both), corresponding to a Th1 response, elements that demonstrate the transformation of the allergenic Th2 response to a cell, Th1.
  • the novelty of the invention lies primarily in the use of proteoliposomes derived from outer membrane proteins of Gram-negative bacteria and more particularly from Neisser ⁇ a meningitidis B, which may be alone or linked to a polysaccharide; to be subsequently coupled non-covalently or covalently with one or more allergenic proteins and thus be administered to allergic individuals.
  • the pharmaceutical composition of the present invention induces a modulation of the specific immune response to the allergens included therein, towards a non-pathogenic and protective Th1 pattern, using only 2 injections.
  • Another novel aspect is its prophylactic application in descendants of allergic parents or in atopic individuals diagnosed early.
  • the procedure used for the non-covalent coupling of the components of the formulation and particularly of the proteoliposome and of the allergens, as well as the use of purified allergens for that purpose, is also novel.
  • proteoliposomes or VME purified from the culture of Gram-negative bacteria in particular of N. meningitidis B are used as described in US Patent No. 5,597,572.
  • allergens are preferably used of a protein or glycoprotein nature although it is also possible to use polysaccharide allergens.
  • polypeptides obtained by chemical synthesis whose amino acid sequence corresponds to native allergens can be used.
  • respiratory allergens are used and first of all house dust mites of the Piroglyphidae or Glyciphagidae families, especially of the Dermatophagoides or Blomia genera and specifically of the Dermatophagoides siboney, Dermatophagoides pteronyssinus or Dermatophagoides far ⁇ nae species.
  • the purified allergens of said mite species are obtained from any commercial allergenic extract, which is first subjected to lyophilization or ultrafiltration concentration to a protein concentration of 10 to 100 mg / mL and then to saline precipitation in sulfate solution 50 - 100% ammonium.
  • the precipitate is fractionated by molecular sieve chromatography using as Sephacryl S-100, Sephacryl S-200 or Sephacryl S-300 or Superdex 75 matrices, the peak corresponding to the molecular weights 10-60 kDa being collected.
  • This fraction essentially contains the major Allergens of Group 1 (25 kDa glycoproteins: Der s 1, Der p 1) and Group 2 (15 kDa proteins: Der s 2, Der p 2).
  • a separate purification procedure can be used for each of the allergens separately, based on affinity chromatography with anti-Group 1 and anti-Group 2 monoclonal antibodies, coupled to a resin, with the subsequent formulation of both components important in a single preparation or binding to Proteoliposomes separately.
  • the union of both basic components (allergen and proteoliposome) is carried out by covalent or non-covalent methods, taking into account the properties of each particular allergen.
  • mite allergens are incorporated in allergen concentrations of 0.1 to 1 ⁇ g per 10 ⁇ g of proteoliposome.
  • This incorporation is carried out by stirring for 30 to 90 minutes at 60 to 600 rpm, taking advantage of the hydrophobic or lipophilic interactions between both components.
  • the mixture obtained can be administered directly in aqueous solution or adsorbed in alumina.
  • the allergen is adsorbed to it before or after the proteoliposome.
  • Alumina is used 10 to 25 times the amount of proteoliposome, maintaining the ratio between it and the allergen.
  • the alumina adsorption is carried out by slow stirring between 60 to 600 rpm and pH 6 to 8.
  • the effectiveness of the adsorption of each Alumina allergen can be determined using specific ELISA methods, such as ELISAs for Der s 1 (Sewer et al. Int Arch Allergy Immunol 2000; 123: 242-248) or for Group 2 of the genus Dermatophagoides (Heymann PW, Chapman MD et al J Allergy Clin Immunol 1989; 83: 1055-1067.)
  • the binding of the proteoliposome and the allergen can also be carried out covalently through the binding of a spacer to the proteoliposome by the free amlnes groups present therein and then the binding of the maleimido group to the free sulfhydropyl groups present in the allergen.
  • groups exist in the major allergens of dust mites (group 1 and 2), but they can also be induced in other allergens by reducing disulfide bridges or included by derivatizing proteins by known methods.
  • the conjugates obtained are subsequently purified by dialysis or ultrafiltration and finally by molecular exclusion chromatography (Sephacryl S-300 or Superdex 200) to remove conjugation reagents, as well as allergens not bound to the proteoliposome.
  • the allergenic molecules must constitute between 1 and 10% of the total mass of the conjugate in order to achieve the appropriate immunogenic response.
  • the conjugate is administered by injection into an appropriate aqueous excipient or also adsorbed on Aluminum Hydroxide gel or other reservoir adjuvant.
  • the present invention also comprises the conjugation by the method described above, of lipophilic residues to allergens, such as bipolar fatty acids of 16 to 20 carbons, to facilitate their non-covalent incorporation into the proteollposome.
  • the vaccine composition includes other antigens that do not affect the induced cell pattern and do potentiate the desired response against the allergen, which allows obtaining a polyvalent vaccine.
  • Polysaccharides can be one of these antigens and particularly N. meningitidis C polysaccharide. These are added non-covalently in concentrations of 0.5-4 times with respect to the proteoliposome.
  • the present invention also encompasses the use of allergens of a polysaccharide nature, such as cross-reactive Carbohydrate Determinants (CCD) (Aalberse, RC. Crossreactivity of IgE antibodies to allergens. Allergy 56). (6), 2001, pp478-490), found in some pollens and plant foods. Then they are added to the formulation as well as the polysaccharide C of N. meningitidis.
  • CCD Carbohydrate Determinants
  • this composition parenterally in only two doses produces not only a specific Th1 type response to proteoliposome antigens as previously known, but also a similar Th1 type response directed against allergens. included in the formulation.
  • this Th1 response is also imposed, despite the use in the formulation of Aluminum Hydroxide, however, the deposition effect is preserved.
  • This response is characterized by a cytokine pattern composed preferably of IFN- ⁇ , with no IL-5 response, also by an induction of antibodies of the lgG2a subclass and a reduction of IgE and lgG1 antibodies in mice, allergen-specific .
  • the administration of said composition does not affect a pre-existing response against bacterial antigens, induced by a previous immunization.
  • the immunological effect achieved by this preparation makes it possible to counteract the allergic response of both anaphylactic type (reduction of IgE and lgG1) and the late and chronic inflammatory (reduction of IL-5), which also makes it effective in the treatment of asthma.
  • the therapeutic effect is due to the presentation of allergens to the immune system in a non-allergenic context and is achieved in a reduced number of injections and in a shorter time compared to traditional immunotherapy with allergenic extracts.
  • Such an effect is advantageously used not only in the treatment of allergic patients, but also allows to prevent the worsening of the disease in individuals with an incipient allergic state or to prevent the development of new allergies to different allergens.
  • proteoliposomes as an immunomodulatory adjuvant is effective and safe at an early age during breastfeeding, which enables the administration of the vaccine formulation at that age for prophylactic purposes, before the onset and development of the disease, in children with a history allergic relatives and therefore with a high probability of being too.
  • the adsorption of the active components of the formulation in a reservoir adjuvant, particularly in Aluminum hydroxide gel, allows the reduction of the allergenicity of the preparation (ie the binding capacity of IgE) more than 10 times in relation to a similar dose of allergen in aqueous state, which implies a considerable reduction of the risks of severe anaphylactic reactions during its administration.
  • Adsorption to the Aluminum hydroxide gel also helps to prolong the stability of the preparation during its preservation, by decreasing the kinetics of chemical reactions that may eventually cause degradation of the active components.
  • the use of purified allergens and particularly of purified allergens of Dermatophagoides mites, including allergens of groups 1 and 2, allows to standardize the composition of the products, determining and adjusting precisely their content in the formulation and their incorporation into the proteoliposome or to the aluminum hydroxide gel. Also in the case of covalent coupling, it is possible to easily separate unwanted products (such as allergen-allergen polymers) from active products (proteoliposome-allergen conjugates) thanks to the large mass difference between both components, which is performed using molecular exclusion chromatography methods, commercially available.
  • the technology is applicable to allergens of different nature, being possible to use several allergens in the same formulation.
  • Proteoliposomes also convert T-independent antigens, such as carbohydrates, into T-dependent antigens. This property is also advantageously applied to polysaccharide allergens, such as CCDs.
  • the present invention will be described through the following specific examples.
  • Example 1. Obtaining and purification of mite allergens. These preparations are obtained from the complete cultivation of the mites, which contains dead mites, exhuvias, feces, as well as non-allergenic low molecular weight ingredients from the culture medium. The allergens are extracted in solution of ammonium bicarbonate or sodium bicarbonate or saline or phosphate buffered saline, at a pH close to the physiological one.
  • the crude extract is clarified by centrifugation and filtration and the low molecular weight components are removed by molecular sieve chromatography (Sephadex G-25) or diafiltration (5-10 kD cutoff) or both. This preparation is then concentrated by ultrafiltration and lyophilized to ensure its stability.
  • the freeze-dried extract is resuspended in aqueous solution and subjected to saline precipitation in 50-100% ammonium sulfate solution.
  • the precipitate is fractionated by molecular sieve chromatography using Superdex 75, the intermediate peak corresponding to the molecular weights 10-60 kDa being collected. This fraction basically contains the major Allergens of Group 1 (25 kDa) and Group 2 (15 kDa).
  • the collected fraction is lyophilized again to be reconstituted at an appropriate concentration for conjugation or mixing with the proteoliposome.
  • Example 2 Obtaining the proteoliposome.
  • proteoliposome a culture of N. meningitidis B is carried out and the biomass collected by centrifugation is subjected to an extraction process with detergent, enzymes and ultrasound. The cell debris is removed by centrifugation and the supernatant is then digested with nucleases to remove nucleic acids. The extract is recovered by ultracentrifugation, resuspended in solution with detergent and purified from the rest of the low and medium molecular weight components by molecular exclusion chromatography.
  • the proteoliposome thus obtained contain less than 10% nucleic acids and about 10% of LPS inserted in its structure; But never free. Opclonally, capsular polysaccharide of N.
  • meningitidis serogroup C produced according to Gold and Gotschlich (Gold et al., 1969-1970, WHO Bull. 45: 279-282 and Gotschlich et al., 1969, J. Exp. Med. 129 is added. : 1349-1365) 0.5 to 4 times the proteoliposome content.
  • the final pH is 7.0 + 0.4, the adsorption to the alumina gel of the proteollposome-polysaccharide is greater than 80% and an LPS content of less than 6% is guaranteed.
  • the LPS present is inserted in the proteoliposome, so that an adequate presentation to the immune system is achieved and reduces the possibility of inducing undesirable reactions.
  • Thiomersal can be added as a preservative at a concentration between 0.005- 0.02%.
  • the final product is subjected to a set of biological and physical-chemical controls.
  • Example 3 Determination of the allergenicity (binding of human IgE) of the formulation adsorbed on Aluminum hydroxide.
  • the allergenic activity expressed as the binding capacity of human IgE antibodies, was determined by IgE inhibition ELISA which determines the ability of the sample in solution to inhibit the binding of human IgE to the solid phase fixed allergen.
  • the sample formulation is allergen of purified D. siboney according to Ex. 1, mixed with the proteoliposomes according to Ex. 2 and adsorbed on Aluminum hydroxide gel.
  • the allergen concentration higher Der s 1, initial is 4 ⁇ g / mL and the allergenic activity 400 UB / mL (UB: Biological Units according to the definition of the Nordic Guidelines for the Registration of Allergenic Products, 2nd Edition. 10,000 UB equivalent to 10 mg / mL Histamine HCI in the skin prick test)
  • the ELISA is performed according to the following procedure. Polystyrene microplates are coated with the Allergenic Reference Extract. Non-specific binding sites of the plate are blocked with 1% PBS-BSA. The serum IgE inhibition is then carried out from the pool of sera, by incubating the serum with increasing amounts of the allergen sample and the Reference, in parallel. IgE not inhibited by the allergens in solution binds to the allergen attached to the plaque. After carrying out the procedure of washing the unspecifically bound antibodies, the detection of the allergen bound IgE is carried out by means of an anti-IgE-Peroxidase conjugate. The development is carried out by the addition of a chromogenic substrate.
  • the color intensity resulting from the enzymatic reaction is quantified by an ELISA plate reader.
  • the interpretation of the test results is carried out using the straight line statistical method. parallel.
  • Inhibition curves for Reference and samples are constructed separately.
  • a linear regression of the Absorbance vs Inhibition values is carried out, checking the parallelism of each sample with the Reference.
  • the relative power is calculated as the antilogarithm of the horizontal distance between the parallel lines.
  • mice were treated intramuscularly with two immunizations in the weeks: 0 and 2 (short scheme) or 0 and 4 (long scheme) with Allergen (Al) + Alumina (A) in concentrations of 1 or 5 ⁇ g / mouse of allergen.
  • Allergen (Al) + Alumina (A) in concentrations of 1 or 5 ⁇ g / mouse of allergen.
  • the animals were bled at week 0, 2 and 5, and in the long at weeks 0, 4 and 7.
  • the level of total IgE in the sera mixtures was determined by ELISA.
  • the short scheme induces a significantly lower total IgE response than the long scheme.
  • the lowest concentration, 1 ⁇ g of allergen did not induce total IgE response in any of the schemes. Therefore, the following experiments were performed with the short scheme and with concentrations of about 1 ⁇ g / mouse.
  • Balb / c mice were treated intramuscularly with two immunizations at week 0 and 2 and were bleeding at week 0 and 4.
  • Group I received proteollposome + polysaccharide from N. meningitidis of serogroup C + AI (OH) 3 .
  • Groups II, III and IV received AI (OH) 3 + allergen with an allergen concentration of 0.5; 1, 25 or 2.5 ⁇ g / mouse / dose, respectively.
  • the level of total IgE in the sera mixtures was determined by ELISA. As can be seen in Fig. 2, the total IgE did not rise significantly in any of the groups evaluated.
  • Example 5 Absence of the effect of the incorporation of the allergen on the anti-proteoliposome response and modulation of the subclass response of anti-allergen IgG.
  • Balb / c mice were treated intramuscularly with immunizations at week 0 and 2.
  • Group I received proteoliposome + polysaccharide from N. meningitidis of the serogroup C + Al (OH) 3 (Va).
  • Groups II, III and IV received 0.5; 1, 25 and 2.5 ⁇ g of Allergen + Va per mouse.
  • Fig. 3 shows the high titers of anti-proteoliposome IgG detected and surprisingly the non-involvement of the incorporation of the allergen in this response or in the subclasses of stimulated anti-Proteoliposome IgG (Fig. 4).
  • the high titers of lgG2a are the expression of the preferential Th1 response induced by this adjuvant.
  • Example 5 Production of IFN ⁇ and non-IL-5 by spleen cells of mice immunized and challenged in vitro with proteoliposome or allergen and its correlation with IgG and subclasses of anti-allergen-induced IgG: proteoliposome + C + polysaccharide AI (OH) 3 compared to AI (OH) 3 .
  • mice were immunized with two doses at weeks 0 and 2.
  • Group I received proteoliposome + polysaccharide from N. meningitidis serogroup C + AI (OH) 3 (Va).
  • Groups II, III and IV received 0.5; 1, 25 and 2.5 ⁇ g of Allergen + Va per mouse.
  • Group V received an initial dose with Va and another 0.5 ⁇ g of Allergen + Va.
  • the animals were sacrificed 7 days after the last dose, their spleen was processed by routine techniques and the cells were confronted with a propoliposome or allergen.
  • the supernatants were extracted and processed by ELISA for the determination of IFN- ⁇ and IL-5.
  • the proteoliposome induced the production of IFN- ⁇ in all groups, in correspondence with the Th1 pattern induced by this adjuvant.
  • IFN- ⁇ production was enhanced both in two doses and when a previous dose of Va and one with Allergen was used (Fig. 6).
  • the allergen also induced an IFN- ⁇ response at all concentrations used, although unexpectedly, it was higher in the concentration of 0.5 ⁇ g with both doses and a dose and a previous Va (Fig. 7). No response of IL-5 was detected against the proteoliposome or the allergen.
  • the highest response of anti-allergen IgG was with the highest concentration with both adjuvants (Fig. 8).
  • the predominant anti-allergen IgG subclass was lgG1 in all combinations and adjuvants.
  • lgG2a was stimulated in all combinations with Va and were slightly positive with AI (OH) 3 only with the two highest concentrations (2.5 and 1.25 ⁇ g).
  • AI AI
  • the biggest difference of the anti-allergen IgG2a, between the two adjuvants was found with the lowest concentration (0.5 ⁇ g), where it is negative with the adjuvant AI (OH) 3 and positive with Va ( Fig. 9).
  • Example 7 Determination of the induction of anti-allergen IgE, its functionality and modulation in the vaccine preparation.
  • Balb / c mice were immunized with two doses at weeks 0 and 2.
  • Group I received AL (OH) 3 .
  • Group II received proteoliposome + polysaccharide C + AI (OH) 3 (Va).
  • Groups III and IV received 1 and 5 ⁇ g of allergen + AL (OH) 3 , respectively.
  • Groups V and VI they received 0.5; 1, 25 and 2.5 ⁇ g of allergen + Va.
  • the animals were bled at 0, 15 and 35 days after immunization.
  • the IgE response was evaluated in male Wistar rats by the qualitative and semiquantitative passive cutaneous anaphylaxis (PCA) method. The responses were expressed in time and serum dilution that was positive and in densities of the spots.
  • PCA passive cutaneous anaphylaxis
  • the responses were negative.
  • group III response was observed at 35 days, with an intensity of 10660 and detectable up to a dilution of 1: 16.
  • Group IV was positive from the first dose (15 days) with an Intensity of 9345 and detectable until the dilution of 1: 8.
  • a potent response was observed with 39843 intensity and detectable until the dilution of 1: 32.
  • the anti-allergen IgE responses were much lower, only detectable at day 35, with low intensities and always detectable at lower dilutions.
  • Example No. 8 Covalent binding of the allergen to the Proteoliposome.
  • Covalent binding by chemical conjugation can be carried out by any of the known methods, such as those described in US Patent 4,695,694 and in USSN Patent Applications 362,179; 555,558; 555,974; 555,966 and 555,339.
  • Preferred methods employ homobifunctional reagents such as Glutaraldehyde or Succinic Anhydride, achieving binding through the free amino groups, both of the allergen and of the proteoliposome (in particular the amino groups of the Lysines).
  • Heterobifunctional reagents are also used, preferably N-Hydroxysuccinimide-Maleimide esters (such as MBS, MPS, SMPB, GMBS, EMCS).
  • the reaction in this case is first carried out through the binding of the spacer to the Proteoliposome by the free amlnes groups present therein, and then the binding of the Malelmido group to the free Sulfydryl groups present in the allergen.
  • the conjugation of the purified allergen of Dermatophagoides siboney to the proteoliposome is exposed using the Glutaraldehyde method and the immune response obtained in mice with the preparation.
  • the purified allergenic proteins according to Example 1 were mixed at a concentration of 20 ⁇ g / mL with 200 ⁇ g / mL Proteoliposome in Phosphate Buffered Saline solution pH 7.0 (PBS); equal volume of Glutaraldehyde 0.4% was added; It was stirred for 1 hour and the reaction was stopped with 0.25 mol / L of Glycine (final concentration). Then it was adjusted pH at 7.0 - 7.8. Unbound Glutaraldehyde was removed by gel filtration on a Sephadex G25 column.
  • the preparation was passed through a chromatographic column with Sephacryl S-300 with the previous addition of sodium deoxycholate detergent to a final concentration of 1%, collecting the first peak corresponding to the volume of exclusion of the matrix. Subsequently, the detergent was removed by dialysis using PBS. The preparation obtained was concentrated 10 times by Ultrafiltration (Amicon, USA) with a 10,000 KD membrane as the cut-off value.
  • the content of Der s 1 in the conjugate was determined using a sandwich ELISA with monoclonal antibodies specific to said allergen and the concentration was adjusted, by dilution with PBS to an appropriate value for the adjuvation process: 10 ⁇ g / mL. Finally, the preparation was sterilized by 0.2 ⁇ m membrane filtration.
  • Adjuvation Equal amounts of Aluminum Hydroxide at 1.2 mg / mL and sterile Allergen solution were mixed at 10 ⁇ g / mL of Der s 1, both in PBS solution at pH 7.0. The mixture was stirred slightly for 30 min at 200 rpm.
  • the total IgE response was lower for the variant containing the conjugate not adjuvant in Aluminum Hydroxide. Also the results of the PCA (specific IgE ) demonstrated that this variant did not induce a detectable response (greater than the Negative Control), while the free allergen and the adjuvant conjugate in Aluminum did induce detectable responses to dilutions 1: 1 and 1: 10, respectively.
  • the formulation of different allergens in the same vaccine preparation can be carried out both non-covalently, by mixing or adsorption on the Aluminum Hydroxide gel, and covalently, according to Example 8.
  • each allergen it is conjugated separately to the proteoliposome and formulated together by mixing or adsorption on Aluminum Hydroxide
  • the allergens of said mites are prepared separately according to Example 1.
  • Blomia the complete, lyophilized, unfractionated allergenic extract is used.
  • the content of major allergens Der p 1, Der s 1 and Blo t 5 is determined using ELISA assays with specific monoclonal antibodies.
  • Total allergenic activity is determined by human IgE inhibition ELISA, as described in Example 3.
  • Lyophilized allergens are resuspended in PBS pH 7.0 at a concentration of 20 ⁇ g / mL of Der p 1 and Der s1 and at 10 ⁇ g / ml of Blo t 5 and sterilized by 0.2 ⁇ m membrane filtration. Allergenic activity thereof is 4000 UB / mL.
  • Proteoliposome was added to each allergen separately to a final concentration of 200 ⁇ g / mL and homogenized for 30 min with slow stirring at 150 rpm. Finally, equal amounts of -Aluminium Hydroxide were mixed at 2 mg / mL and the Allergen solutions with Proteoliposome separately, in PBS solution at a pH of 7.0. The mixture was stirred slowly for 60 min at 150 rpm. Adsorption of the proteins to the Aluminum gel was checked by monitoring the absorbance at 280 nm of the suspension supernatant. Finally the three were mixed Individual allergen preparations in a single suspension, with slow agitation for 10 minutes.
  • Figure 1 shows that the short scheme (0-14 days) is less inducer of total IgE than long scheme (0-28 days). Bleeding 0, 15 and 35 in short scheme and 0, 28 and 35 days after immunization in long scheme. Va, Proteollposoma + Polysaccharide of Neisseria meningitidis serogroup C + Al (OH) 3 ; A, allergen; Al, Al (OH) 3 ; 1 and 5, ⁇ g of A / mouse. As can be seen, the IgE response is significantly higher (p ⁇ 0.5) in the Immunized group with 5 ⁇ g of long scheme than that of short scheme although it needs two doses. In fact, the secondary response in the group with equal concentration of the short scheme tends to decrease.
  • Figure 2 It is observed that the allergen concentration is less inducing total IgE. Bleeding 0, 15 and 35 days after immunization. Va, Proteoliposome + Polysaccharide of Neisseria meningitidis serogroup C + Al (OH) 3 ; A, allergen; Al, Al (OH) 3 ; 0.5; 1, 25 and 2.5, ⁇ g of A / mouse. As can be seen the induction of total IgE by the concentration of 0.5 ⁇ g of allergen is at the control level with only adjuvant (Va). The other two concentrations increase total IgE levels.
  • Figure 3 Shows how Allergen Inclusion does not affect the anti-proteoliposome IgG (PLS) response.
  • PLS anti-proteoliposome IgG
  • Figure 5 Shows anti-allergen lgG2a induced by low allergen concentrations. Bleeding 0, 15 and 35 days after immunization. Va, Proteoliposome (P) + Neisseria meningitidis serogroup C + Al (OH) 3 Polysaccharide; A, allergen; Al, Al (OH) 3 ; 0.5; 1, 25 and 2.5, ⁇ g of A / mouse. Fig. A, with polysaccharide and Fig. B without polysaccharide. The two lower concentrations of allergen induce anti-allergen lgG2a response.
  • Figure 6 It refers to the determination of IFN ⁇ against proteoliposome (PLS).
  • Spleen cells were taken 7 days after two doses (0 and 2 weeks) of immunization, respectively.
  • Va Proteoliposome + Polysaccharide of Neisseria meningitidis serogroup C + Al (OH) 3 ; A, allergen; Al, Al (OH) 3 ; 0.5; 1, 25 and 2.5, ⁇ g of A / mouse; 1Va + Va-A0.5, previous dose of Va.
  • the inclusion of the lower allergen concentration increases the IFN ⁇ response against the PLS with respect to the control (Va).
  • Figure 7 Shows the production of IFN ⁇ against the allergen and not affecting a previous dose of the adjuvant.
  • Spleen cells were taken 7 days after two immunization doses at 0 and 2 weeks, respectively.
  • Va Proteoliposome (P) + Neisseria meningitidis serogroup C + Al (OH) 3 Polysaccharide; A, allergen; Al, Al (OH) 3 ; 0.5; 1, 25 and 2.5, ⁇ g of A / mouse; 1Va + Va-A0.5, previous dose of Va.
  • Fig. A with polysaccharide and Fig. B without polysaccharide.
  • the anti-allergen IFN ⁇ response was induced by all concentrations, but it was very higher in the lowest concentration. The previous application of the adjuvant did not affect this response.
  • Figure 8 It is observed how the lower doses of Allergens induce greater differences of anti-allergen IgG when comparing vaccine preparation with the alumina adjuvant. The sera were taken 14 days after the second dose. These were applied after 21 days. Va, Proteollposoma + Polysaccharide of Neisseria meningitidis serogroup C + Al (OH) 3 ; A, allergen; Al, Al (OH) 3 ; 0.5; 1, 25 and 2.5, ⁇ g of A / mouse. As can be seen, the lower doses (0.5 and 1,125) induce greater increases in the anti-allergen IgG response than the higher dose.
  • Figure 9 Refers to the induction of lgG2a anti-allergen.
  • Figure 10 Shows the reduction of anti-allergen IgE in the vaccine preparation (Group V to Vil) compared to positive controls (Groups III and IV) evaluated by passive cutaneous anaphylaxis.
  • A Allergen; Va, VA-MENGOC-BC ® and Al, AL (OH) 3 .
  • the sera were evaluated before To, after 1 ra, T15 and 14 days after 2nd dose, T35.
  • the responses in the vaccine groups (V-VII) are lower than in the groups immunized with alumina allergen (III and IV). No response was observed in the negative controls (I and II).
  • - absent; +, present;
  • A Allergen; Va, Proteoliposome + pollsaccharide C of N. meningitidis + Alumina (Al).
  • FIG 11 Antibody response to allergen formulations covalently bound (conjugated) to Proteoliposome.
  • the mice were immunized with 2 doses of 5 ⁇ g of Der s 1, in different variants: Ds (free allergen); Ds-PLS (conjugated with Proteoliposome); [Ds-PLS] Alum (Conjugate adjuvant in Aluminum Hydroxide.
  • Ds free allergen
  • Ds-PLS conjuggated with Proteoliposome
  • [Ds-PLS] Alum Conjugate adjuvant in Aluminum Hydroxide.
  • the response was evaluated at week 8 after the first immunization. Vertical bars indicate the standard deviation.

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Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la Inmunología, la Inmunoalergia y en particular con el empleo de adyuvantes o portadores para modular la respuesta inmunológica hacia los alergenos. El objetivo técnico que se persigue es obtener una preparación farmacéutica de uso terapéutico o profiláctico utilizando proteoliposomas bacterianos, la cual al ser aplicada en individuos alérgicos transforma la respuesta alérgica Th2 e IgE dependiente, hacia una respuesta Th1 protectora; así como logre prevenir la aparición y el desarrollo de alergias en individuos aún no alérgicos. La composición vacunal consiste en proteoliposomas de bacterias Gram-negativas acoplados a alergenos y opcionalmente otros antígenos o adyuvantes. Se provee el método para su obtención y se incluye el esquema de 2 dosis para la inmunización con dicha composición vacunal.

Description

COMPOSICIÓN VACUNAL CONTRA LAS ALERGIAS, MÉTODO PARA SU OBTENCIÓN Y EMPLEO EN EL TRATAMIENTO DE LAS MISMAS.
Sector Técnico La presente invención se relaciona con el campo de la Inmunología, específicamente con la rama de la Inmunoalergia y en particular con el empleo de adyuvantes o portadores para modular la respuesta inmunológlca hacia los alérgenos, con el objetivo de inducir cambios que reduzcan o prevengan el efecto patogénico de dicha respuesta hacia esos compuestos. Técnica Anterior
Las alergias son una patología muy frecuente, sobre todo en los países industrializados. En la alergia intervienen una serie de mecanismos inmunopatológicos, el más común de ellos es la denominada hipersensibilidad de tlpo-l o anafiláctica. La flsiopatogenia de la misma está basada en la producción incrementada de IgE, un anticuerpo citotrópico, que se produce frente a sustancias denominadas alérgenos, tras un primer contacto que se conoce como sensibilización. La IgE se une a los mastocitos tisulares y basófllos sanguíneos logrando así prolongar su vida media de horas en sangre a meses en los tejidos. En contactos posteriores con el alérgeno se produce el reconocimiento de los mismos y el entrecruzamiento de las IgE de superficie, la transmisión de señales hacia el citoplasma y la degranulación celular y liberación de los mediadores de las alergias entre los que se encuentran la histamina, la serotonina y las kininas. Las enfermedades alérgicas más comunes son la rinitis, el asma, y la dermatitis atópica. El asma alérgica es una enfermedad inflamatoria crónica. La inmunopatogénesls del asma es compleja y en ella participan, además de los mecanismos IgE dependientes (causantes de la respuesta anafiláctica inmediata tipo I), los linfocitos Th2, los cuales inducen y mantienen la respuesta inflamatoria mediante el reclutamiento y activación de otras células y en particular a través de la producción de IL-5, la cual es responsable del reclutamiento y activación de los eosinófilos. La eosinofília juega un papel importante en el surgimiento de la hiperreactividad bronquial, la cual es una característica esencial del asma. Los alérgenos más comunes son el polen, los ácaros, el polvo de las casas, el moho, las drogas, los alimentos y los pelos de los animales. En particular los alérgenos domésticos y en primer lugar los ácaros, son causantes de alergias respiratorias y asma.
Las manifestaciones clínicas son tratadas fundamentalmente con antihistamínicos, simpaticomiméticos, cromoglicato de sodio y esteroides. Estos tratamientos son generalmente inadecuados, pues tratan los signos y síntomas y no su etiopatogenla, por lo que en la actualidad se va en busca de otros procedimientos más efectivos entre los que se encuentran la ¡nmunoterapia o vacunas terapéuticas. Tradicionalmente la terapia de hiposensibilización o inmunoterapia con extractos alergénicos ha sido ampliamente utilizada en el tratamiento de las enfermedades alérgicas. En este tipo de tratamiento los pacientes son hiposensibilizados mediante la administración por vía subcutánea de los alérgenos específicos. Se comienza con la inyección de una pequeña dosis de dicho alérgeno y si no ocurren reacciones alérgicas, se va aumentando la misma con una frecuencia semanal. Las dosis se continúan incrementando gradualmente hasta alcanzar una dosis de mantenimiento mensual o bimensual. Este tratamiento se puede prolongar varios años (WHO Position Paper. Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines against Allergic Dlseases. Geneva, January 1998). A pesar de considerarse un método relativamente eficaz en ciertas alergias, la inmunoterapia ha sido cuestionada debido a su falta de seguridad, pues se expone al paciente a reacciones anafilácticas que eventualmente puede incluso causar su muerte. También el elevado número de inyecciones a administrar, que pueden alcanzar hasta unas 100 ó 200 en un tratamiento de 3 años, constituye un serio inconveniente en su aplicación práctica, lo cual causa frecuentemente el abandono prematuro del mismo sin lograr la eficacia esperada.
Cada vez se conoce más sobre los mecanismos de inducción de los altos niveles de IgE en los alérgicos. Estos son inducidos a través de mecanismos inmunológlcos propios de la respuesta de tipo Th2 y en particular por una sobreproducción de IL-4. Las células Th2 están involucradas patológicamente no sólo a través de su papel regulatorio (la IL-4 induce el cambio de clase hacia IgE en los linfocitos B, mediado por una señal de contacto provista por las Th) sino también que participan también de modo más directo en la fase efectora de la respuesta alérgica tardía y en la inflamación crónica asmática. La exposición a alérgenos ambientales, además de la predisposición genética propia del individuo, constituye el fenómeno desencadenante de la sensibilización alérgica, en primer lugar y de las reacciones alérgicas posteriores en los individuos previamente sensibilizados. El mecanismo inmunológico responsable de la mejoría clínica de los pacientes durante la inmunoterapia con extractos alergénicos no está aún totalmente dilucidado. Sin embargo, se conoce que se producen cambios inmunológicos vinculados con la disminución a largo plazo de los anticuerpos IgE específicos al alérgeno, la disminución de la secreción de IL-4 e IL-5 y el incremento de anticuerpos IgG e IFN-γ. Estos cambios indican una disminución del patrón de respuesta Th2 como posible consecuencia de la inducción de un patrón Th1 concurrente no patogénico (WHO Position Paper. Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines Against Allergic Diseases. Geneva, January 1998) Los patrones Th1/Th2 de respuesta inmunológica se distinguen primeramente por el patrón típico de citoquinas que secretan las células Th, fundamentalmente, IFN- γ e IL-2 por las Th1 e IL-4 e IL-5 por las Th2 (Mossman, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A, and R. L. Coffman. 1986. Two types of murine helper T cells clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136:2348-2357). Por otra parte, también es posible valorar el tipo de respuesta inducida determinando los perfiles de clases y subclases de inmunoglobulinas séricas que estos inducen. Así en los murinos, el patrón Th1 induce preferentemente anticuerpos de la subclase lgG2a (dependiente de IFN-γ), mientras que el Th2 induce IgE y subclase lgG1 (dependientes de IL-4). En los humanos el Th1 cursa con anticuerpos lgG1/lgG3 y el Th2 con IgE. Aunque la aparición y desarrollo de las alergias está relacionada con factores de tipo ambiental, el papel básico en la propensión del individuo a desarrollar una respuesta Th2/lgE hacia antígenos ambientales, es de orden genético (Holgate ST. Genetic and environmental interaction in allergy and Asthma. J Allergy Clin Immunol 1999; 104:1139-1 146). Esto se traduce en que, la descendencia de padres alérgicos lo serán también con una mayor frecuencia que los hijos de padres no alérgicos. Esta frecuencia se ha estimado en 75, 50 y 25% si ambos parentales, la madre o el padre son alérgicos, respectivamente, lo que significa que existe una alta probabilidad de predecir el comportamiento de un individuo dentro de la población y por tanto de ésta, si se tiene un sistema de detección a nivel parental. También es conocido que el afianzamiento del patrón patológico Th2 ocurre en los primeros 6-24 meses de vida del niño y que factores ambientales como la exposición a infecciones bacterianas pueden influir de forma positiva en la enfermedad induciendo un patrón Th1 , que contraregula el Th2 alérgico (Holt PG, Programing of Allergen Specific Th-memory during Childhood. Proceedlngs XVII International Congress of Allergology and Clinical Immunology. Sydney 2000. Allergy Clin Immunol International Suppl. 1 , 2000 pp 83-85). Estos hallazgos dejan entrever la posibilidad de diseñar vacunas anti-alérgicas profilácticas, que prevengan el afianzamiento del patrón Th2 hacia los alérgenos, en la temprana infancia. Estas vacunas podrían estar basadas en el empleo de adyuvantes Th1 que fueran efectivos durante la lactancia.
Se han intentado varias formas de mejorar la inmunoterapia con alérgenos, tratando de reducir sus aspectos negativos, preservando o ampliando sus beneficios. En particular, se conoce que existen varios métodos para modificar los alérgenos de modo que se reduzca su alergenicidad (es decir, su afinidad por los anticuerpos IgE) y su capacidad para inducir IgE tras la inmunización, así como incrementar su inmunogenicidad (es decir, su capacidad para inducir una respuesta eventualmente terapéutica o protectora). Entre ellos se encuentran métodos físicos por adsorción o inclusión de los alérgenos para crear un efecto de depósito (adyuvantes) o métodos químicos que modifican las moléculas alergénicas mediante enlaces covalentes con otros compuestos o entre ellas mismas. Como agentes físicos se han empleado la tirosina (Patente No. GB 1 ,377,074), el éster de tirosina (Patente No. US 4,428,932); los liposomas (Solicitud de patente WO 89/10753); el monofosforil lípido A (MLA) y el MLA 3 desacilado (Patente No. US. 5,762,943); la saponina (Patente No. US. 4,432,969) y los tradicionales hidróxido de aluminio y fosfato de calcio. Entre los agentes químicos que se han empleado para la polimerización de los alérgenos está el formaldehído (Marsch DG et al. Studies on allergolds from naturally occurring allergens. III. Preparation of Ragweed pollen allergoids by aldehyde modification. J. Allergy Clin. Immunol. 1981 ;68:449-59); Alginato (Corrado OJ et al. Allergy 1989;44:108-5) y glutaraldehído (Patente No. GB 1 ,282,163). También se han empleado mPEG (Dreborg et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1990;6:315-65) y conjugaciones a polisacáridos (Solicitud de patente europea No. EP 008 3497 A2).
Estas soluciones logran, en algunos casos (por Ej. los alérgenos polimerizados con glutaraldehído y adyuvados con Alúmina, Grammer et al, Modified forms of allergen immunotherapy, J Allergy Clin Immunol 1985;44:108-15), incrementar los títulos de anticuerpos IgG dirigidos contra los alérgenos en modelos animales. Sin embargo, el incremento de esta clase de anticuerpos no implica necesariamente una mejoría clínica del paciente, sobre todo si va acompañada de un incremento paralelo de los anticuerpos IgE. De hecho, algunas de las subclases de la IgG (lgG1 en los ratones e lgG4 en humanos) están implicadas también en diferentes formas de la reacción alérgica, por ser capaces de fijarse, aunque transitoriamente, a los mastocitos. Por otra parte, las evidencias clínicas en humanos indican que el incremento de los anticuerpos IgG no está directamente correlacionado con la mejoría clínica del paciente, sugiriendo que el mismo juega solamente un papel secundario en el mecanismo regulatorio inducido por el tratamiento (Rak S. Lowhagen O, Venge P. The effect of immunotherapy on bronchial hyperresponsiveness and eosinophil cationic protein in pollen-allergic patients. J Allergy Clin Immunol 1988; 82:470-80 y Jutel M, Müller U, Fricker M, Rihs S, Pichler W, Dahlnden C. Influence of bee venom immunotherapy on degranulation and leukotñene generation in human blood basophils. Clin Exp Immunol 1996;12:1112-18).
El empleo de alérgenos modificados químicamente (alergoides) aunque tiene algunas ventajas en cuanto a reducción de las reacciones secundarias durante el tratamiento, en comparación con los extractos alergénicos tradicionales, no producen una significativamente mejoría clínica (Bousquet et al. J. Allergy Clin. Immunol. 1989;84:546-56 y Grammer et al al. J Allergy Clin Immunology 1985;76:397-401 ). Otro de los inconvenientes de los alergoides empleados hasta el momento en la clínica (modificados por glutaraldehído o formaldehído), es la imposibilidad práctica de lograr una composición estandarizada de los productos, ya que los mismos se obtienen mediante reacciones químicas a partir de los extractos alergénicos, los cuales constituyen mezclas heterogéneas de polipéptidos y otras blomoléculas. En estas reacciones se obtienen inevitablemente especies moleculares con diferentes grados de polimerización o modificación química, las cuales pueden constituir subproductos no deseables, difíciles de eliminar.
El empleo de hidróxido de aluminio sólo ha logrado reducir el número de inyecciones necesarias para lograr el mismo efecto que con los alérgenos no adyuvados, lo cual se debe a su efecto de depósito y liberación lenta. Sin embargo, este adyuvante propicia la producción de IgE, tanto en animales como en humanos provocando un típico patrón Th2, lo cual podría eventualmente reforzar la respuesta alérgica patogénica durante su administración. El fosfato de calcio o la tiroslna se han empleado también como adsorbentes para crear depósitos y producir la liberación lenta de los alérgenos, sin embargo no han mostrado ventajas de consideración con respecto a los extractos acuosos o adyuvados con Alúmina, en cuanto a mejorar la eficacia o la seguridad del tratamiento (Altintas DU et al. Comparison between the use of adsorbed and aqueous immunotherapy material in Dermatophagoides pteronyssinus sensitive asthmatic patients. Allergologie et Immunopathologie 1999; 27(6):309-317). Ninguna de las soluciones existentes en la actualidad, enumeradas anteriormente, logra inducir una modulación inmunológica completamente efectiva (expresada en inhibición o reducción del patrón Th2 o inducción del Th1 ) ya sea en animales o en humanos, ni eficacia clínica en estos últimos, empleando un número reducido de inyecciones.
El empleo de liposomas que contienen alérgenos ha sido descrito en la solicitud de patente WO 89/10753. Los liposomas, además de crear un depósito y reducir la alergenicidad del producto, se cree que influyan en los mecanismos de presentación de los antígenos al sistema inmune, debido a su naturaleza lipídica y particulada (WHO Position Paper. Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines against Allergic Diseases. Geneva, January 1998). Sin embargo, este enfoque no ha podido extenderse a la práctica clínica debido a la inestabilidad característica de estos preparados, así como a inconvenientes relacionados con la tecnología para la inclusión de forma consistente de los alérgenos dentro de los liposomas. La falta de estabilidad de la formulación de los liposomas durante su conservación o durante su administración al paciente tiene implicaciones serias en la seguridad del producto, ya que la eventual liberación de los alérgenos de los liposomas puede provocar reacciones anafilácticas severas, de la misma forma que ocurren con los alérgenos en estado acuoso. Tampoco en ese caso se han logrado evidencias de la inducción de una respuesta inmunológica que afecte el balance Th1/Th2 y que induzca un patrón no patológico o protectogénico. Las estrategias más recientes que se conocen intentan emplear formulaciones de alérgenos con adyuvantes inductores de respuesta Th1, tales como el monofosforil lípido A (MLA) (Patente US. 5,762,943), proteínas de shock térmico ("Heat Shock Proteins", HSP, siglas en inglés), también conocidas como proteínas de estrés de micobacterias, lo cual es descrito en la patente WO9823735. En el caso del MLA, el cual constituye una variante detoxificada de LPS, se ha demostrado que reduce los niveles de IgE específica, incrementando la IgG en experimentos en ratones, sin embargo no se ha demostrado que reduzca de modo efectivo el componente celular Th2 de la respuesta alérgica, de modo que su uso estaría limitado estrictamente a las enfermedades alérgicas para las cuales el mecanismo de hipersensibilidad tipo 1 sea el principal, lo cual excluiría el asma. Otro de los inconvenientes, es que aunque se logra atenuar el efecto tóxico de los LPS, no se elimina por completo la toxicidad (Baldrick P et al. Vaccine 20, 2002 737-743), lo cual podría limitar su uso en niños de pequeña edad. En el caso de las HSP, no se han provisto evidencias experimentales de que las mezclas o conjugados de dicha proteínas con los alérgenos produzcan un efecto de desviación de la respuesta Th2 específica a los alérgenos, ya sea en modelos animales o en humanos. El empleo de proteoliposomas derivados de la membrana externa de bacterias Gram-negativas se ha descrito para la preparación de vacunas profilácticas contra enfermedades infecciosas por Ruegg CL y cois. (Preparation of proteosome-based vaccines. J Immunological Methods 1990;135:101-9); Lowell y cois. (Proteosome- Lipopeptlde Vaccines: Enhancement of Immunity for Malaria CS Peptides. Science 1988;240:800-2); también en la Pat. No. US No. 5,597,572. En esta última, el núcleo fundamental es el proteoliposoma o vesículas de membrana externa (VME) derivados de Neissería meningitidis serogrupo B, cuya estructura particulada, sus trazas de lipooligosacáridos (LPS) incorporadas en las VME, el polisacárido C, su composición lipídica característica y su adsorción en alúmina, están relacionadas con su inmunogenicidad y probada protectogenicidad en humanos. A pesar de contener LPS, dicha formulación vacunal no provoca efectos tóxicos en humanos ni animales, lo cual es atribuido a la peculiar estructura y composición de las VME. Por otra parte se logra retener el efecto inmunomodulador y adyuvante de los LPS. La vacuna basada en este proteoliposoma ha sido aplicada en más de 50 millones de dosis y ha demostrado ser segura, no reactogénica y eficaz para proteger contra N. meningitidis serogupos B y O Es además, aplicada durante la lactancia de forma segura y eficaz, donde convierte la T-independencia del Polisacárido C en un antígeno T-dependiente. Esta vacuna induce un patrón preferencial Th1 caracterizado por la inducción en humanos y animales de linfoproliferación; anticuerpos IgG antl-VME; subclases lgG1 en humanos e lgG2a en ratones; IFNγ, IL-2 e IL-12 a nivel de ARNm y proteínas, y la no inducción de IgE anti-VME ni incrementos en la IgE total, ni tampoco de la IL-4, IL-5 a nivel de ARNm ni proteico (Infect Immun. 2001 , 69(72001 ):4502-4508). La respuesta inducida por la vacuna, como es caracteristico de la inmunidad adaptativa, es específica a los antígenos bacterianos que componen el producto, y por consiguiente, no hay evidencias de que induzca respuesta alguna contra los alérgenos conocidos. Divulgación de la Invención El objetivo técnico de la presente invención es obtener una preparación farmacéutica de uso terapéutico o profiláctico empleando proteoliposomas bacterianos, en lo adelante denominados proteoliposomas, la cual al ser aplicada en un paciente que padece de alergias, es capaz de transformar la respuesta alérgica (Th2) inducida por el alérgeno, hacia una respuesta celular Th1. La invención también incluye el esquema de inmunización con dicha composición vacunal. Es también un objetivo de la presente invención proveer una composición farmacéutica capaz de prevenir la aparición y desarrollo de la enfermedad alérgica en niños con antecedentes familiares atópicos. Esta composición puede contener uno o varios alérgenos los cuales se pueden acoplar o administrar conjuntamente con un proteoliposoma, induciéndose una respuesta inmunológica terapéutica o protectora en el individuo alérgico, al o a los alérgenos en cuestión. Esta respuesta se caracteriza por una menor producción de anticuerpos IgE con respecto a la inmunoterapia tradicional, la no inducción de IL-5, así como la inducción de anticuerpos de subclase lgG1 (en humanos) e lgG2a (en murinos) y las citocinas IFNγ e IL-2 (en ambos), correspondientes a una respuesta Th1 , elementos que evidencian la transformación de la respuesta Th2 alergénica hacia una celular, Th1.
Es otro objetivo de esta invención proveer el método para acoplar dicho (s) alérgeno (s) con el proteoliposoma y otros adyuvantes, así como proveer una composición farmacéutica apropiada para su administración por vía parenteral. La novedad de la invención radica primeramente en el uso de proteoliposomas derivados de proteínas de la membrana externa de bacterias Gram-negativas y más particularmente de Neissería meningitidis B, los cuales pueden estar solos o unidos a un polisacárido; para ser posteriormente acoplados de forma no covalente o covalente con una o varias proteínas alergénicas y de esa forma ser administrados a los individuos alérgicos.
Es particularmente novedoso que la composición farmacéutica de la presente invención induce una modulación de la respuesta inmune específica a los alérgenos incluidos en la misma, hacia un patrón Th1 no patogénico y protector, empleando solamente 2 inyecciones.
Otro aspecto novedoso es su aplicación profiláctica en descendientes de parentales alérgicos o en individuos atópicos diagnosticados tempranamente. Es también novedoso el procedimiento empleado para el acople no-covalente de los componentes de la formulación y particularmente del proteoliposoma y de los alérgenos, así como el empleo de alérgenos purificados con ese propósito. En la presente invención se emplean proteoliposomas o VME purificadas a partir del cultivo de bacteria Gram-negativas en particular de N. meningitidis B según se describe en la Patente No. US 5,597,572. En la presente invención se emplean alérgenos preferentemente de naturaleza proteica o glicoproteica aunque también es posible emplear alérgenos pollsacarídicos. Los mismos son obtenidos a partir de fuentes alergénicas naturales por métodos de extracción y purificación conocidos en el arte o de forma recombinante expresados en microorganismos o células superiores. Alternativamente se pueden emplear polipéptidos obtenidos por síntesis química cuya secuencia de aminoácidos se corresponde con los alérgenos nativos. Particularmente, se emplean alérgenos respiratorios y en primer lugar de ácaros del polvo doméstico de la familias Piroglyphidae o Glyciphagidae, especialmente de los géneros Dermatophagoides o Blomia y específicamente de las especies Dermatophagoides siboney, Dermatophagoides pteronyssinus o Dermatophagoides farínae. Los alérgenos purificados de dichas especies de ácaros se obtienen a partir de cualquier extracto alergénico comercial, el cual es sometido primeramente a liofilización o concentración por ultrafiltración hasta una concentración de proteínas de 10 a 100 mg/mL y a continuación a precipitación salina en solución de sulfato de amonio 50 - 100%. El precipitado es fraccionado mediante cromatografía de tamizaje molecular empleando como matrices Sephacryl S-100, Sephacryl S-200 o Sephacryl S-300 o Superdex 75, colectándose el pico que corresponde a los pesos moleculares 10-60 kDa. Esta fracción contiene fundamentalmente los Alérgenos mayores del Grupo 1 (glicoproteínas de 25 kDa: Der s 1 , Der p 1 ) y Grupo 2 (proteínas de 15 kDa: Der s 2, Der p 2). Alternativamente, puede ser empleado un procedimiento de purificación independiente para cada uno de los alérgenos por separado, basado en la cromatografía de afinidad con anticuerpos monoclonales anti-Grupo 1 y anti- Grupo 2, acoplados a una resina, con la posterior formulación de ambos componentes importantes en un solo preparado o la unión a los Proteoliposomas por separado. La unión de ambos componentes básicos (alérgeno y proteoliposoma) se realiza por métodos covalentes o no covalentes, teniendo en cuenta las propiedades de cada alérgeno en particular. En el caso de la unión no covalente, los alérgenos de ácaros, se incorporan en concentraciones de alérgeno de 0,1 a 1 μg por cada 10 μg de proteoliposoma. Esta incorporación se realiza mediante agitación durante 30 a 90 minutos a 60 a 600 rpm, aprovechando las interacciones de tipo hidrofóbico o llpofílico entre ambos componentes. La mezcla obtenida puede ser administrada directamente en solución acuosa o adsorbida en alúmina. En el caso del empleo de alúmina, el alérgeno se adsorbe a la misma antes del proteoliposoma o preferentemente posterior a éste. La alúmina se emplea de 10 a 25 veces la cantidad de proteoliposoma, manteniéndose la proporción entre éste y el alérgeno. La adsorción a la alúmina se realiza mediante agitación lenta entre 60 a 600 rpm y pH de 6 a 8.
La efectividad de la adsorción de cada alérgeno a la Alúmina puede determinarse empleando métodos ELISA específicos a los mismos, como por ejemplo los ELISA para Der s 1 (Sewer et al. Int Arch Allergy Immunol 2000;123:242-248) o para Grupo 2 del género Dermatophagoides (Heymann PW, Chapman MD et al J Allergy Clin Immunol 1989;83:1055 -1067.)
La unión del proteoliposoma y el alérgeno también puede realizarse de forma covalente a través de la unión de un espaciador al proteoliposoma por los grupos amlnos libres presentes en éste y a continuación la unión del grupo maleimido a los grupos sulfihidrilo libres presentes en el alérgeno. Tales grupos existen en los alérgenos mayores de los ácaros del polvo (grupo 1 y 2), pero pueden ser también inducidos en otros alérgenos mediante la reducción de los puentes disulfuro o incluidos mediante la derivatización de las proteínas por métodos conocidos. Los conjugados obtenidos se purifican posteriormente mediante diálisis o ultrafiltración y por último mediante cromatografía de exclusión molecular (Sephacryl S-300 ó Superdex 200) para eliminar los reactivos de conjugación, así como los alérgenos no unidos al proteoliposoma. Las moléculas alergénicas deben constituir entre el 1 y el 10% de la masa total del conjugado con el objetivo de lograr la respuesta inmunogénica adecuada. El conjugado se administra por vía inyectable en un excipiente acuoso apropiado o también adsorbido en gel de Hidróxido de Aluminio u otro adyuvante de depósito. La presente invención también comprende la conjugación por el método antes descrito, de residuos lipofílicos a los alérgenos, tales como ácidos grasos bipolares de 16 a 20 carbonos, para facilitar su incorporación no covalente al proteollposoma.
Alternativamente, la composición vacunal incluye otros antígenos que no afecten al patrón celular inducido y sí potencien la respuesta deseada contra el alérgeno, lo cual permite la obtención de una vacuna polivalente. Los polisacáridos pueden ser uno de estos antígenos y particularmente el polisacárido C de N. meningitidis. Estos se adicionan de forma no covalente en concentraciones de 0.5 - 4 veces con respecto al proteoliposoma. La presente invención también comprende el empleo de alérgenos de naturaleza polisacarídica, tales como los determinantes pollsacarídicos con reactividad cruzada ("Cross-reactive Carbohydrate Determinants", CCD, siglas en inglés) (Aalberse, RC. Crossreactivity of IgE antibodies to allergens. Allergy 56 (6), 2001 , pp478-490), encontrados en algunos pólenes y alimentos vegetales. En ese caso los mismos se añaden a la formulación al igual que el polisacárido C de N. meningitidis.
De forma inesperada, la administración de esta composición por vía parenteral en solo dos dosis, produce no solo una respuesta de tipo Th1 específica a los antígenos del proteoliposoma como ya se conocía con anterioridad, sino también una respuesta similar de tipo Th1 dirigida contra los alérgenos incluidos en la formulación. Sorprendentemente también esta respuesta Th1 se impone, a pesar del empleo en la formulación de Hidróxido de Aluminio preservándose, sin embargo, el efecto de depósito del mismo. Esta respuesta se caracteriza por un patrón de citoquinas compuesto preferentemente por IFN-γ, con ausencia de respuesta de IL-5, también por una inducción de anticuerpos de la subclase lgG2a y una reducción de los anticuerpos IgE e lgG1 en ratones, específicos al alérgeno. La administración de dicha composición no afecta una respuesta preexistente contra los antígenos bacterianos, inducida por una inmunización anterior.
La solución propuesta tiene las siguientes ventajas:
El efecto inmunológlco logrado por este preparado permite contrarrestar la respuesta alérgica tanto de tipo anafiláctico (reducción de IgE e lgG1 ) como la inflamatoria tardía y crónica (reducción de IL-5), lo cual la hace efectiva también en el tratamiento del asma. El efecto terapéutico se debe a la presentación de los alérgenos al sistema inmune en un contexto no alergénico y se alcanza en un número reducido de inyecciones y en un menor tiempo con respecto a la inmunoterapia tradicional con extractos alergénicos. Tal efecto se emplea ventajosamente no solo en el tratamiento de los pacientes alérgicos, sino también permite prevenir el agravamiento de la enfermedad en individuos con un estado alérgico incipiente o prevenir el desarrollo de nuevas alergias a alérgenos diferentes.
El efecto inmunológico de los proteoliposomas como adyuvante inmunomodulador es eficaz y seguro en edades tempranas durante la lactancia, lo cual posibilita la administración de la formulación vacunal en esa edad con fines profilácticos, antes de la aparición y desarrollo de la enfermedad, en niños con antecedentes familiares alérgicos y por lo tanto con alta probabilidad de serlo también. La adsorción de los componentes activos de la formulación en un adyuvante de depósito, particularmente en gel de hidróxido de Aluminio, permite la reducción de la alergenicidad del preparado (o sea la capacidad de unión de IgE) en más de 10 veces con relación a una dosis similar de alérgeno en estado acuoso, lo cual implica una reducción considerable de los riesgos de reacciones anafilácticas severas durante su administración. También la adsorción al gel de hidróxido de Aluminio contribuye a prolongar la estabilidad del preparado durante su conservación, al disminuir la cinética de las reacciones químicas que puedan eventualmente causar degradación de los componentes activos. El empleo de alérgenos purificados y particularmente de los alérgenos purificados de ácaros del género Dermatophagoides, incluyendo alérgenos de los grupos 1 y 2, permite estandarizar la composición de los productos, determinando y ajusfando de forma precisa su contenido en la formulación y su incorporación al proteoliposoma o al gel de hldróxido de aluminio. También en el caso del acople covalente, es posible separar fácilmente los productos no deseados (tales como los polímeros alérgeno-alérgeno) de los productos activos (conjugados proteoliposoma-alergeno) gracias a la gran diferencia de masa existente entre ambos componentes, lo cual se realiza empleando métodos de cromatografía de exclusión molecular, disponibles comerclalmente. La tecnología es aplicable a alérgenos de diferente naturaleza, siendo posible emplear varios alérgenos en una misma formulación.
La ausencia de toxicidad de la formulación a pesar de contener pequeñas cantidades de LPS, los cuales retienen su efecto inmunogénico, es otra de las ventajas de la solución propuesta que lo hacen apropiado para su administración segura a humanos y en particular a niños en edad temprana.
Los proteoliposomas también convierten a antígenos T-independientes, tales como carbohidratos, en antígenos T-dependientes. Esta propiedad se aplica también de forma ventajosa a los alérgenos de naturaleza polisacarídica, tales como los CCD. La presente invención será descrita a través de los siguientes ejemplos específicos. Ejemplo 1. Obtención y purificación de alérgenos de ácaros. Estos preparados se obtienen a partir del cultivo completo de los ácaros, el cual contiene ácaros muertos, exhuvias, heces, así como ingredientes no alergénicos de bajo peso molecular provenientes del medio de cultivo. Los alérgenos son extraídos en solución de bicarbonato de amonio o bicarbonato de sodio o solución salina o solución salina tamponada con fosfato, a un pH cercano al fisiológico. El extracto crudo es clarificado mediante centrifugación y filtración y los componentes de bajo peso molecular son removidos mediante cromatografía de tamizaje molecular (Sephadex G-25) o diafiltración (límite de corte 5-10 kD) o ambos. Este preparado es entonces concentrado mediante ultrafiltración y liofilizado para garantizar su estabilidad. Para lograr un producto con un mayor grado de pureza, el extracto liofillzado es resuspendido en solución acuosa y sometido a precipitación salina en solución de sulfato de amonio 50 - 100%. El precipitado es fraccionado mediante cromatografía de tamizaje molecular empleando Superdex 75, colectándose el pico intermedio que corresponde a los pesos moleculares 10- 60 kDa. Esta fracción contiene fundamentalmente los Alérgenos mayores del Grupo 1 (25 kDa) y Grupo 2 ( 15 kDa). Por último, la fracción colectada es liofilizada de nuevo para ser reconstituida en una concentración apropiada para su conjugación o mezcla con el proteoliposoma
Ejemplo 2. Obtención del proteoliposoma.
Para la obtención del proteoliposoma se realiza un cultivo de N. meningitidis B y la biomasa colectada mediante centrifugación se somete a un proceso de extracción con detergente, enzimas y ultrasonido. El debris celular es removido mediante centrifugación y el sobrenadante es sometido entonces a digestión con nucleasas para eliminar los ácidos nucleicos. El extracto es recuperado mediante ultracentrifugación, resuspendido en solución con detergente y purificado del resto de los componentes de bajo y mediano peso molecular mediante cromatografía de exclusión molecular. El proteoliposoma así obtenidos contienen menos del 10% de ácidos nucleicos y alrededor de 10% de LPS insertados en su estructura; pero nunca libres. Opclonalmente, se añade polisacárido capsular de N. meningitidis serogrupo C producido según Gold y Gotschlich (Gold et al., 1969-1970, WHO Bull. 45: 279-282 and Gotschlich et al., 1969, J. Exp. Med. 129: 1349-1365) de 0.5 a 4 veces el contenido de proteoliposoma. También opcionalmente se puede añadir alúmina al polisacárido-proteoliposoma, como un adyuvante adicional en una proporción de 10 a 25 veces la cantidad de Proteoliposoma. El pH final es 7,0 + 0,4, la adsorción al gel de alúmina del proteollposoma-polisacárido es mayor del 80% y un contenido de LPS menor del 6% es garantizado. El LPS presente está insertado en el proteoliposoma, por lo que se logra una adecuada presentación al sistema inmune y reduce la posibilidad de inducir reacciones indeseables. Se puede adicionar thiomersal como preservativo a una concentración entre 0.005- 0.02%. El producto final es sometido a un conjunto de controles biológicos y físico- químicos. Ejemplo 3. Determinación de la alergenicidad (unión de IgE humana) de la formulación adsorbida en hidróxido de Aluminio.
La actividad alergénica, expresada como la capacidad de unión de anticuerpos IgE humanos, se determinó mediante ELISA de inhibición de IgE el cual determina la habilidad de la muestra en solución de inhibir la unión de la IgE humana al alérgeno fijado a una fase sólida. La formulación muestra es alérgeno de D. siboney purificado según el Ej. 1 , mezclado con los proteoliposomas según el Ej. 2 y adsorbidos en gel de hidróxido de Aluminio. La concentración de alérgeno mayor Der s 1 , inicial es de 4 μg/mL y la actividad alergénica 400 UB/mL (UB: Unidades Biológicas según la definición délas Guías Nórdicas para el Registro de Productos alergénicos, 2da Edición. 10 000 UB equivalen a 10 mg/mL de Histamina HCI en la prueba de punción cutánea)
El ELISA se realiza de acuerdo al siguiente procedimiento. Se recubren microplacas de pollestireno con el Extracto Alergénico de Referencia. Se bloquean los sitios de unión inespecífica de la placa con PBS-BSA 1 %. A continuación se realiza la inhibición de la IgE sérica del pool de sueros, mediante la incubación del suero con cantidades crecientes del alérgeno muestra y la Referencia, en paralelo. La IgE no-inhibida por los alérgenos en solución, se une al alérgeno fijado a la placa. Después de efectuar el procedimiento de lavado de los anticuerpos unidos inespecíficamente, se realiza la detección de la IgE unida al alérgeno, mediante un conjugado anti-lgE-Peroxidasa. El revelado se realiza mediante la adición de un sustrato cromogénico. La intensidad del color producto de la reacción enzimática es cuantificada mediante un lector de placas ELISA. La interpretación de los resultados del ensayo se realiza mediante el método estadístico de las rectas paralelas. Se construyen curvas de Inhibición para la Referencia y las muestras por separado. Se lleva a cabo una regresión lineal de los valores de Absorbancia vs Inhibición, comprobándose el paralelismo de cada muestra con la Referencia. Por último, se calcula la potencia relativa como el antilogaritmo de la distancia horizontal entre las rectas paralelas.
En el análisis de la muestra dada se obtuvieron los siguientes resultados: Actividad alergénica: 21.2 UB/mL (IC95% 13.6 - 32.4). Corresponde a un 5.3% de la actividad del alérgeno en estado acuoso inicial. Ejemplo 4. Determinación del esquema y dosis menos inductoras de IgE total.
Para la determinación del esquema de inmunización (espaciamiento entre dosis) y la concentración de alérgeno, ratones Balb/c fueron tratados por vía intramuscular con dos inmunizaciones en las semanas: 0 y 2 (esquema corto) ó 0 y 4 (esquema largo) con Alérgeno (Al) + Alúmina (A) en concentraciones de 1 ó 5 μg/ratón de alérgeno. En el esquema corto los animales fueron sangrados en la semana 0, 2 y 5, y en el largo en la semanas 0, 4 y 7. El nivel de IgE total en las mezclas de sueros fue determinado por ELISA.
Como puede observarse en la Fig. 1 el esquema corto induce una respuesta de IgE total significativamente menor que el esquema largo. Por otro lado, la menor concentración, 1 μg de alérgeno, no indujo respuesta de IgE total en ninguno de los esquemas. Por ello, los siguientes experimentos fueron realizados con el esquema corto y con concentraciones de alrededor de 1 μg/ratón. Para aún precisar más la dosis, ratones Balb/c fueron tratados por vía intramuscular con dos inmunizaciones en la semana 0 y 2 y fueron sangrados en la semana 0 y 4. El grupo I recibió proteollposoma + polisacárido de N. meningitidis del serogrupo C + AI(OH)3. Los grupos II, III y IV recibieron AI(OH)3 + alérgeno con una concentración de alérgeno de 0,5; 1 ,25 ó 2,5 μg/ratón/dosis, respectivamente. El nivel de IgE total en los mezclas de sueros fueron determinados por ELISA. Como puede observarse en la Fig. 2, la IgE total no se elevó significativamente en ninguno de los grupos evaluados.
Ejemplo 5. Ausencia de efecto de la incorporación del alérgeno sobre la respuesta anti proteoliposoma y modulación de la respuesta de subclases de IgG anti-alergeno. Para la determinación de la ausencia de efecto del alérgeno sobre la respuesta hacia el adyuvante, ratones Balb/c fueron tratados por vía intramuscular con- dos inmunizaciones en la semana 0 y 2. El grupo I recibió proteoliposoma + polisacárido de N. meningitidis del serogrupo C + Al (OH)3 (Va). Los grupos II, III y IV recibieron 0,5; 1 ,25 y 2,5 μg de Alérgeno + Va por ratón. El sangramiento se realizó a los 0, 15 y 35 días después de la primera dosis de inmunización y se determinó la respuesta de IgG y subclases anti-proteoliposoma y anti-alergeno en las mezclas de los sueros por ELISA. En la Fig. 3 se muestra los elevados títulos de IgG anti-proteoliposoma detectados y sorprendentemente la no afectación de la incorporación del alérgeno en esta respuesta ni en las subclases de IgG anti-Proteoliposoma estimuladas (Fig. 4). Los altos títulos de lgG2a son la expresión de la preferencial respuesta Th1 inducida por este adyuvante. En la Fig. 5 aparecen las subclases de IgG estimuladas, donde se puede observar el incremento de respuesta lgG2a anti- Alérgeno en las concentraciones menores de alérgeno y preferenclalmente en 1 ,25 y 0,5 μg. La inducción de respuesta de lgG2a frente al alérgeno refleja que el adyuvante fue capaz de modular la respuesta Th2 hacia una Th1. Ejemplo 6. Producción de IFNγ y no IL-5 por células de bazo de ratones inmunizados y desafiados in vitro con proteoliposoma o alérgeno y su correlación con la IgG y las subclases de IgG anti-alergeno inducidas por los adyuvantes: proteoliposoma + polisacárido C + AI(OH)3 en comparación con el AI(OH)3.
Para la determinación de la respuesta de cltocinas Th1 (IFN-γ) y Th2 (IL-5) se inmunizaron ratones Balb/c con dos dosis en las semanas 0 y 2. El grupo I recibió proteoliposoma + polisacárido de N. meningitidis serogrupo C + AI(OH)3 (Va). Los grupos II, III y IV recibieron 0,5; 1 ,25 y 2,5 μg de Alérgeno + Va por ratón. El grupo V recibió una dosis inicial con Va y otra de 0,5 μg de Alérgeno + Va. Los animales fueron sacrificados 7 días después de la última dosis, se procesó su bazo por técnicas rutinarias y las células fueron enfrentadas a profeoliposoma o alérgeno. A las 72 horas, los sobrenadantes fueron extraídos y procesados por ELISA para la determinación de IFN-γ e IL-5. El proteoliposoma indujo la producción de IFN-γ en todos los grupos, en correspondencia con el patrón Th1 inducido por este adyuvante. No obstante, con 0,5 μg de alérgeno, sorprendentemente, la producción de IFN-γ se vio potenciada tanto en dos dosis como cuando se empleó una dosis previa de Va y una sola con Alérgeno (Fig. 6). Sorprendentemente, el alérgeno también indujo respuesta de IFN-γ en todas las concentraciones empleadas, aunque inesperadamente, ésta fue superior en la concentración de 0,5 μg tanto con dos dosis como con una dosis y una previa de Va (Fig. 7). No se detectó respuesta de IL-5 frente al proteoliposoma ni al alérgeno. Estos resultados reflejan la modulación por el adyuvante del patrón Th2 Inducido por los alérgenos hacia un patrón Th1. Para determinar la IgG y las subclases de IgG anti-alergeno se evaluó un grupo en paralelo inmunizado en iguales condiciones a las referidas anteriormente; pero con tres grupos adicionales que contenían AI(OH)3 y el alérgeno en las mismas tres concentraciones (0,5; 1 ,25 y 2,5). El sangramiento se realizó a los 0, 15 y 35 días después de la inmunización. Las respuestas séricas fueron evaluadas por ELISA. La respuesta de IgG anti-alergeno fue significativamente superior cuando se empleó Va como adyuvante que con Al(OH)3 y sorpresivamente las diferencias entre las respuestas de los dos adyuvantes también fue superior con las concentraciones menores de 0,5 y 1 ,25 μg. No obstante, la mayor respuesta de IgG anti-alergeno fue con la mayor concentración con ambos adyuvantes (Fig. 8). La subclase de IgG anti-alergeno predominante fue lgG1 en todas las combinaciones y adyuvantes. No obstante, se estimuló la lgG2a en todos las combinaciones con Va y fueron ligeramente positivas con AI(OH)3 sólo con las dos concentraciones mayores (2,5 y 1 ,25 μg). Por el contrario, sorpresivamente, también la mayor diferencia de las lgG2a anti-alergeno, entre los dos adyuvantes fue encontrada con la menor concentración (0,5 μg), donde es negativa con el adyuvante AI(OH)3 y positiva con Va (Fig. 9).
Ejemplo 7. Determinación de la inducción de IgE anti-Alergeno, su funcionabilidad y modulación en el preparado vacunal. Para la determinación de la respuesta de IgE anti-alergeno, se inmunizaron ratones Balb/c con dos dosis en las semanas 0 y 2. El grupo I recibió AL(OH)3. El grupo II recibió proteoliposoma + polisacárido C + AI(OH)3 (Va). Los grupos III y IV recibieron 1 y 5 μg de alérgeno + AL(OH)3, respectivamente. Los grupos V y VI recibieron 0,5; 1 ,25 y 2,5 μg de alérgeno + Va. Los animales fueron sangrados a 0, 15 y 35 días de inmunizados. La respuesta de IgE se evaluó en ratas Wistar machos por el método de anafilaxia cutánea pasiva (PCA) cualitativa y semicuantitativa. Las respuestas fueron expresadas en tiempo y dilución de suero que resultó positiva y en densidades de las manchas.
Los sueros fueron evaluados antes To, después de 1 ra, T15 y 14 días después de 2da dosis, T35. Como puede observarse las ultimas diluciones positivas del preparado vacunal (grupos V a Vil) son Inferiores al de los grupos en alúmina (grupos III y IV). De igual forma ocurre en las densidades ópticas. Esto aboga hacia una reducción importante en la respuesta de IgE antialergeno inducida. No se observo respuesta en los controles negativos (I y II).
En los dos primeros grupos controles negativos, las respuestas fueron negativas. En el grupo III, se observó respuesta a los 35 días, con una intensidad de 10660 y detectable hasta una dilución de 1 :16. El grupo IV fue positivo desde la primera dosis (15 días) con una Intensidad de 9345 y detectable hasta la dilución de 1 :8. A los 35 días se observó una potente respuesta con 39843 de intensidad y detectable hasta la dilución de 1 :32. Por el contrario, sorprendentemente con nuestro preparado vacunal Va, las respuestas de IgE anti-alergeno fueron muy inferiores, sólo detectables al día 35, con intensidades bajas y detectables siempre a menores diluciones. Es de señalar que con la menor concentración, 0,5 μg de alérgeno sólo se detectó una ligera respuesta en el suero puro (1 :1 ), es decir, desaparecía la respuesta cuando el suero era diluido 1 :2 (Fig. 10 y Tabla 1 ). En la Tabla 1 se muestra la Intensidad de las manchas de las reacciones y última dilución del suero donde la anafilaxia cutánea pasiva fue positiva. Estos resultados de menor inducción de IgE anti-alergeno con el adyuvante Va que con AL(OH)3 y en las menores concentraciones de alérgeno, están en correspondencia con los resultados de los Ejemplos anteriores donde se encuentra menor IgE total, inducción de IFNγ y subclase lgG2a con este adyuvante. Tabla 1
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Leyenda: Al, AI(OH)3; P, Proteoliposoma; PC, Polisacárido C de N. meningitidis serogrupo C; A, Alérgeno y *días después de 1ra dosis.
Ejemplo No. 8. Unión covalente del alérgeno al Proteoliposoma. La unión covalente mediante conjugación química puede realizarse por alguno de los métodos conocidos, como por ejemplo los descritos en la patente US 4,695,694 y en las solicitudes de patente USSN 362,179; 555,558; 555,974; 555,966 y 555,339. Los métodos preferidos emplean reactivos homobifuncionales como Glutaraldehído o Anhídrido Succínico logrando la unión a través de los grupos aminos libres, tanto del alérgeno como del proteoliposoma (en particular los grupos aminos de las Lisinas). También se emplean reactivos heterobifuncionales, preferiblemente Esteres de N-Hidroxisuccinimída-Maleimida (tales como MBS, MPS, SMPB, GMBS, EMCS). La reacción en este caso se realiza primero a través de la unión del espaciador al Proteoliposoma por los grupos amlnos libres presentes en éste, y a continuación la unión del grupo Malelmido a los grupos Sulfidrilo libres presentes en el alérgeno. En el presente ejemplo se expone la conjugación del alérgeno purificado de Dermatophagoides siboney al proteoliposoma empleando el método de Glutaraldehído y la respuesta inmunológica obtenida en ratones con el preparado.
Conjugación: Las proteínas alergénicas purificadas según el Ejemplo 1 se mezclaron a una concentración de 20 μg/mL con 200 μg/mL de Proteoliposoma en solución Salina Tamponada con Fosfato pH 7.0 (PBS); se adicionó igual volumen de Glutaraldehído al 0.4%; se agitó durante 1 hora y se detuvo la reacción con 0.25 mol/L de Glicina (concentración final). Seguidamente, se ajustó el pH a 7.0 - 7.8. El Glutaraldehído no enlazado se eliminó mediante gel-filtración en una columna de Sephadex G25. Para lograr un mayor grado de purificación del conjugado Alergeno-Proteoliposoma y eliminar el Alérgeno libre, se pasó el preparado por una columna cromatográfica con Sephacryl S-300 con la adición previa de detergente Deoxicolato de Sodio hasta una concentración final de 1 %, colectando el primer pico correspondiente al volumen de exclusión de la matriz. Posteriormente se eliminó el detergente por diálisis empleando PBS. El preparado obtenido fue concentrado 10 veces por Ultrafiltración (Amicon, USA) con una membrana de 10 000 KD como valor de corte. Se determinó el contenido de Der s 1 en el conjugado empleando un ELISA sandwich con anticuerpos monoclonales específicos a dicho alérgeno y se ajustó la concentración, mediante dilución con PBS hasta un valor apropiado para el proceso de adyuvación: 10 μg/mL. Por último el preparado se esterilizó mediante filtración por membrana de 0.2μm. Adyuvación: Se mezclaron cantidades iguales de Hidróxido de Aluminio a 1.2 mg/mL y la solución de Alérgeno estéril a 10 μg/mL de Der s 1 , ambos en solución PBS a un pH de 7.0. Se agitó la mezcla ligeramente durante 30 min a 200 rpm. Se comprobó la adsorción de las proteínas al gel de Aluminio monitoreando la absorbancia a 280 nm del sobrenadante de la suspensión, resultando ser superior al 90 %. Inmunización: Se inmunizaron 3 grupos de ratones Balb/C con 7 ratones en cada grupo, con dos dosis de cada preparado respectivamente: Alérgeno en solución de PBS ("Ds"), Conjugado de Alérgeno Proteoliposoma en PBS ("PLS-Ds") y Conjugado adsorbido en Hidróxido de Aluminio ("[PLS-Ds]Alum"). La dosis empleada fue de 5 μg/mL de alérgeno Der s 1 , por vía ¡ntraperitoneal. Las inmunizaciones se realizaron en la semanas 0 y 4. A los ratones se les extrajo sangre al inicio del experimento y en las semanas 4 y 8.
Resultados: Se determinaron los anticuerpos séricos de las clases IgE (total) e IgG (específicos al alérgeno). También las subclases lgG1 , lgG2a e lgG2b. Dichas determinaciones fueron realizadas mediante ELISA. Por último se determinó la respuesta IgE específica hacia el alérgeno, empleando el método de Anafilaxia Cutánea Pasiva (PCA) en ratas. En la Fig. 11 se observan los resultados obtenidos en cuanto a anticuerpos. Se aprecia que en general las variantes que contienen conjugados inducen una respuesta IgG significativamente mayor que el alérgeno solo, lo cual es también válido para todas las subclases"lgG1 , lgG2a e lgG2b. Sin embargo, la respuesta IgE total fue menor para la variante que contiene al conjugado no adyuvado en Hidróxido de Aluminio. También los resultados del PCA (IgE específica) demostraron que esa variante no indujo respuesta detectable (mayor que el Control Negativo), mientras que el alérgeno libre y el conjugado adyuvado en Aluminio si inducían respuestas detectables a las diluciones 1 :1 y 1 :10, respectivamente. Ejemplo 9. Formulación de varios alérgenos La formulación de diferentes alérgenos en un mismo preparado vacunal puede ser llevado a cabo tanto de forma no covalente, mediante mezcla o adsorción en el gel de Hidróxido de Aluminio, como de forma covalente, según el Ejemplo 8. En ese caso cada alérgeno se conjuga por separado al proteoliposoma y se formulan en conjunto mediante mezcla o adsorción en Hidróxido de Aluminio. En el presente ejemplo se expone la preparación de una formulación no covalente de tres alérgenos de diferentes especies de ácaros, comunes en regiones tropicales: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermmatophagoides siboney y Blomia tropicalis.
Los alérgenos de dichos ácaros se preparan por separado según el Ejemplo 1. En el caso de Blomia se emplea el extracto alergénico completo, liofillzado, sin fraccionar. El contenido de alérgenos principales Der p 1 , Der s 1 y Blo t 5 se determina empleando ensayos ELISA con anticuerpos monoclonales específicos. La actividad Alergénica total se determina mediante ELISA de inhibición de IgE humana, según se describe en el Ejemplo 3. Los alérgenos liofilizados se resuspenden en PBS pH 7.0 a una concentración de 20 μg/mL de Der p 1 y Der s1 y a 10 μg/ml de Blo t 5 y se esterilizan mediante filtración por membrana de 0.2 μm. La actividad Alergénica de los mismos es de 4000 UB/mL. Se añadió Proteoliposoma a cada alérgeno por separado hasta una concentración final de 200 μg/mL y se homogeneizó durante 30 min con agitación lenta a 150 rpm. Por último se mezclaron cantidades iguales de Hidróxido de -Aluminio a 2 mg/mL y las soluciones de Alérgenos con Proteoliposoma por separado, en solución PBS a un pH de 7.0. Se agitó la mezcla lentamente durante 60 min a 150 rpm. Se comprobó la adsorción de las proteínas al gel de Aluminio monitoreando la absorbancia a 280 nm del sobrenadante de la suspensión. Por último se mezclaron los tres preparados de alérgenos individuales en una sola suspensión, con agitación lenta durante 10 minutos. La adsorción de los alérgenos y del proteoliposoma se demostró mediante análisis del sobrenadante de la suspensión con ELISA para Der p 1 , Der s 1 y Blo t 5 (INDOOR Biotech, UK) y el método de Lowry para la determinación de proteínas. La actividad Alergénica residual (no adsorbida) se determinó según el Ejemplo 3. Se obtuvo más del 90 % de adsorción de los alérgenos en el gel y reducción de la actividad Alergénica a menos del 20 %. Se administraron dos dosis de 0.5 mL (3.33 μg de Der s 1 y Der p 1 y 1.17 μg de Blo t 5) del preparado a ratones Balb/c con un intervalo de tres semanas por vía intraperitoneal. Pasadas 7 semanas del inicio de la inmunización se determinaron los niveles de anticuerpos IgG inducidos, mediante ELISA. Se encontró la existencia de anticuerpos dirigidos contra los tres alérgenos en una proporción de alrededor de 2:2:1 , respectivamente a D. pteronyssinus, D. siboney y Blomia tropicalis. Los niveles de anticuerpos IgG observados fueron como promedio 80 % superiores a los obtenidos mediante la inmunización con la mezcla de los tres alérgenos en solución PBS. Breve Descripción de las Figuras:
Figura 1 : La Figura 1 muestra que el esquema de corto (0-14 días) es menos inductor de IgE total que esquema largo (0-28 días). Sangramiento 0, 15 y 35 en esquema corto y 0, 28 y 35 días después de la inmunización en esquema largo. Va, Proteollposoma + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 1 y 5, μg de A/ratón. Como puede observarse la respuesta de IgE es significativamente superior (p<0.5) en el grupo Inmunizado con 5 μg de esquema largo que el de esquema corto aunque necesita dos dosis. De hecho la respuesta secundaria en el grupo con Igual concentración del esquema corto, tiende a disminuir.
Figura 2: Se observa que la concentración de alérgeno es menos inductora de IgE total. Sangramiento 0, 15 y 35 días después de la inmunización. Va, Proteoliposoma + Pollsacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, μg de A/ratón. Como puede observarse la inducción de IgE total por la concentración de 0.5 μg de alérgeno esta a nivel del control con solo adyuvante (Va). Las otras dos concentraciones incrementan los niveles de IgE total. Figura 3: Muestra como la Inclusión del Alérgeno no afecta la respuesta de IgG anti-proteoliposoma (PLS). Sangramiento 0, 15 y 35 días después de la inmunización. Va, Proteoliposoma + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, AI (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, μg de A/ratón. El preparado vacunal no afecta la respuesta de IgG anti-proteoliposoma, ni tras la primera ni segunda dosis en comparación con el adyuvante solo . Figura 4: Se observa que las subclases de IgG anti-proteoliposoma (PLS) no son afectadas por inclusión de alérgeno. Sangramlento 0, 15 y 35 días después de la inmunización. Va, Proteoliposoma + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, μg de A/ratón. El preparado vacunal mantiene igual patrón de respuesta anti PLS a nivel de subclases que el adyuvante solo (Va)
Figura 5: Muestra lgG2a anti-alergeno inducida por bajas concentraciones de alérgeno. Sangramiento 0, 15 y 35 días después de la inmunización. Va, Proteoliposoma (P) + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, μg de A/ratón. Fig.A, con polisacárido y Fig.B sin polisacárido. Las dos concentraciones menores de alérgeno inducen respuesta de lgG2a antialergeno. Figura 6: Es referida a la determinación del IFNγ contra el proteoliposoma (PLS). Las células de bazo fueron tomadas 7 días después de dos dosis (0 y 2 semanas) de inmunización, respectivamente. Va, Proteoliposoma + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, μg de A/ratón; 1Va+Va-A0,5, dosis previa de Va. La inclusión de la menor concentración de alérgeno incrementa la respuesta de IFNγ contra el PLS con respecto al control (Va).
Figura 7: Muestra la producción de IFNγ contra el alérgeno y no afectación de una dosis previa del adyuvante. Las células de bazo fueron tomadas 7 días después de dos dosis de inmunización a los 0 y 2 semanas, respectivamente. Va, Proteoliposoma (P) + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, μg de A/ratón; 1Va+Va-A0,5, dosis previa de Va. Fig.A, con polisacárido y Fig.B sin polisacárido. La respuesta de IFNγ antialergeno se indujo por todas las concentraciones, pero fue muy superior en la menor concentración. La aplicación previa del adyuvante no afectó esta respuesta.
Figura 8: Se observa como las menores dosis de Alérgenos inducen mayores diferencias de IgG anti-alergeno al comparar preparado vacunal con el adjuvante Alúmina. Los sueros fueron tomados 14 días después de la segunda dosis. Estas fueron aplicadas a los o y 21 días. Va, Proteollposoma + Polisacárido de Neisseria meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, μg de A/ratón. Como puede observarse las menores dosis (0.5 y 1.125) inducen mayores incrementos en las respuesta de IgG antialergeno que la mayor dosis. Figura 9: Se refiere a la inducción de lgG2a antialergeno. Los sueros fueron tomados 14 días después de la segunda dosis. Estas fueron aplicadas a los o y 21 días. Va, Proteoliposoma + Polisacárido de Neissería meningitidis serogrupo C + Al (OH)3; A, alérgeno; Al, Al (OH)3; 0,5; 1 ,25 y 2,5, μg de A/ratón. Como puede observarse todos los preparados vacunales inducen respuesta de lgG2a antialergeno. Esta no se induce por la concentración de 0.5 μg en alúmina y si con el adyuvante.
Figura 10: Muestra la reducción de la IgE anti-alergeno en el preparado vacunal (Grupo V a Vil) en comparación con controles positivos (Grupos III y IV) evaluados por anafilaxia cutánea pasiva. A, Alérgeno; Va, VA-MENGOC- BC® y Al, AL(OH)3. Los sueros fueron evaluados antes To, después de 1 ra, T15 y 14 días después de 2da dosis, T35. Las respuesta en los grupos vacunales (V-VII) son menores que en los grupos inmunizados con alérgeno en alúmina (III y IV). No se observo respuesta en los controles negativos (I y II). Leyenda: -, ausente; +, presente; A, Alérgeno; Va, Proteoliposoma + pollsacárido C de N. meningitidis + Alúmina (Al).
Figura 11 : Respuesta de anticuerpos hacia las formulaciones de alérgenos unidos covalentemente (conjugados) al Proteoliposoma. Los ratones fueron Inmunizados con 2 dosis de 5 μg de Der s 1 , en diferentes variantes: Ds (alérgeno libre); Ds- PLS (conjugado con Proteoliposoma); [Ds-PLS]Alum (Conjugado adyuvado en Hidróxido de Aluminio. La respuesta fue evaluada en la semana 8 después de la primera inmunización. Las barras verticales indican la desviación estándar.

Claims

REIVINDICACIONES
1 ) Composición vacunal contra las alergias caracterizada porque comprende: a) proteoliposomas derivados de bacterias Gram-negativas que inducen un patrón de respuesta celular Th1 ; b) uno o más alérgenos en su estado natural o modificados; c) un adyuvante apropiado.
2) Composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque el proteoliposoma proviene de una bacteria del género Neisseria. 3) Composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque el proteoliposoma proviene de la especie N. meningitidis.
4) Composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada porque el proteoliposoma proviene de N. meningitidis serogrupo B.
5) Composición vacunal según las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizada por que la misma contiene entre 20 y 75 μg de proteoliposoma por dosis.
6) Composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque el alérgeno es de naturaleza peptídica, glicopeptídica o polisacarídica y causa sensibilización alérgica en humanos o en animales.
7) Composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque los alérgenos provienen de ácaros domésticos.
8) Composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque los alérgenos provienen de ácaros del género Dermatophagoides.
9) Composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque el alérgeno proviene de la especie D. siboney. 10)Composición vacunal de acuerdo con las reivindicaciones 8 y 9, caracterizado porque los alérgenos principales son los alérgenos del Grupo 1 (Der s 1 , Der p
1 , Der f 1 ) y del Grupo 2 (Der s 2, Der p 2, Der f 2).
11) Composición vacunal de acuerdo con las reivindicaciones de la 6 a la 10, caracterizada porque el alérgeno se encuentra a razón de 0.1 a 1 unidad por cada 10 unidades de proteoliposoma y entre 0,25 y 7,5 μg por dosis.
12)Composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque al alérgeno se le incorpora un residuo lipofílico unido covalentemente. 13)Composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizada porque el residuo llpofílico unido covalentemente es un ácido graso bipolar con 16 a 20 carbonos. 14)Composlción vacunal de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque el adyuvante es seleccionado del grupo consistente en Hidróxido de Aluminio y
Fosfato de Aluminio. 15)Composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada porque el adyuvante es adicionado a razón de 10 a 25 veces por unidad de proteoliposoma y su contenido final es de 250 a 1000 μg por dosis. 16)Composición vacunal según la reivindicación 1 , caracterizada porque contiene adicionalmente polisacáridos naturales o sintéticos. 17) Composición vacunal según la reivindicación 16, caracterizada porque el pollsacárido proviene del género Neisseria. 18)Composición vacunal según la reivindicación 17, caracterizada porque el polisacárido proviene de la especie N. meningitidis.
19)Composición vacunal según la reivindicación 18, caracterizada porque el polisacárido proviene de N. meningitidis serogrupo O 20)Composición vacunal de acuerdo con las reivindicaciones 16 a la 19, caracterizada porque el polisacárido es adicionado en una razón de 0.5 a 4 veces con respecto al proteoliposoma.
21 )Método para la obtención de las composiciones vacunales de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 20, caracterizada por que los alérgenos de ácaros del género Dermatophagoides son preparados y purificados siguiendo los siguientes pasos: a) liofilización o concentración por ultrafiltración del extracto alergénico hasta una concentración de proteínas de 10 a 100 mg/mL; b) precipitación en solución de sulfato de amonio 50 - 100% y colecta del precipitado; c) fraccionamiento mediante cromatografía de tamizaje molecular empleando como matrices Sephacryl S-100, Sephacryl S-200, Sephacryl S-300 o
Superdex 75 y colecta de la fracción que corresponde a los pesos moleculares 10-60 kDa; d) liofilización o concentración por ultrafiltración hasta una concentración de proteínas entre 10 y 100 μg/mL para el proceso de adyuvación. e) unión del alérgeno al proteollposoma en proporciones de 0.1 a 1 unidad por cada 10 unidades de peso del proteoliposoma; f) agitación de 60 a 600 rpm entre 30 y 90 minutos g) adición del adyuvante seleccionado del grupo compuesto por Hidróxido de Aluminio y Fosfato de Aluminio en proporciones de 2 a 6 veces el peso del proteollposoma; y h) homogeneización de la mezcla con agitación de 60 a 600 rpm entre 30 y 90 minutos.
22)Método según la reivindicación 21 caracterizado porque la unión del alérgeno al proteoliposoma del paso (e) es de forma covalente o no covalente. 23)Método según las reivindicaciones 21 y 22, caracterizado porque adicionalmente comprende los pasos de: a) adición de un polisacárido en proporciones de 0.5 a 4 veces en relación al proteoliposoma; y b) homogenización por agitación a 60-600 rpm de 30 a 90 minutos. 24)Método de tratamiento profiláctico o terapéutico para las alergias, caracterizado porque se emplea la composición de las reivindicaciones de la 1 a la 20 en un esquema de aplicación de 2 hasta 4 dosis por vía parenteral o mucosal del alérgeno espaciando dichas dosis entre 2 y 6 semanas.
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MXPA04011070A MXPA04011070A (es) 2002-05-08 2003-05-08 Composicion vacunal contra las alergias, metodo para su obtencion y empleo en el tratamiento de las mismas.
KR1020047017881A KR101058350B1 (ko) 2002-05-08 2003-05-08 알러지 백신 조성물, 그 생산방법 및 알러지 치료에있어서의 그것의 사용
EP03724819A EP1520587B1 (en) 2002-05-08 2003-05-08 Allergy vaccine composition, production method thereof and use of same in allergy treatment
AT03724819T ATE514431T1 (de) 2002-05-08 2003-05-08 Allergie-vakzine-zusammensetzung, herstellungsverfahren dafür und ihre verwendung bei der behandlung von allergien
DK03724819.2T DK1520587T3 (da) 2002-05-08 2003-05-08 Allergivaccinesammensætning, fremgangsmåde til fremstilling deraf og anvendelse deraf til allergibehandling
BRPI0309901-6A BR0309901A (pt) 2002-05-08 2003-05-08 composição de vacina para alergia, método de produção e uso da mesma no tratamento de alergia

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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005063287A1 (es) * 2003-12-30 2005-07-14 Instituto Finlay. Centro De Investigación-Producción De Sueros Y Vacunas Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes inductores de respuesta citotóxica y las formulaciones resultantes
WO2010057447A1 (es) 2008-11-19 2010-05-27 Instituto Finlay Centro De Investigacion Produccion De Sueros Y Vacunas Vacunas unitemporales
WO2011137876A2 (es) 2010-05-05 2011-11-10 Instituto Finlay. Centro De Investigación - Producción De Sueros Y Vacunas Tolerogenos adyuvados como vacuna de malaria
US8298547B2 (en) * 2008-12-09 2012-10-30 Pfizer Vaccines, LLC IgE CH3 peptide vaccine
WO2013064129A1 (es) 2011-11-02 2013-05-10 Instituto Finlay. Centro De Investigación- Producción De Sueros Y Vacunas. Adjuvantes para vacunas polisacaridicas y las formulaciones resultantes
EP2689775A1 (en) 2012-07-25 2014-01-29 Instituto Finlay, Centro de Investigacion-Produccion de vacunas y sueros Cochleate with only one mamp

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1872792A1 (en) * 2006-06-29 2008-01-02 Biotech Tools S.A. A method for the production of hydrolyzed allergen
CN110064053A (zh) * 2006-08-07 2019-07-30 哈佛大学校长及研究员协会 蛋白质基质疫苗及这种疫苗的制备和给药方法
EP2042193A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-01 Biomay AG RNA Vaccines
US20100278880A1 (en) * 2008-01-02 2010-11-04 Biotech Tools S.A. Pharmaceutical formulation for allergen preparation
CN101972472A (zh) * 2010-10-26 2011-02-16 北京新华联协和药业有限责任公司 一种变应原疫苗纯化及其制备的方法
EP3831401A4 (en) * 2018-06-22 2022-04-20 Zonhon Biopharma Institute, Inc. DRUG BLEND BASED ON RECOMBINANT ALLERGEN PROTEINS OF MITES AND THE USE OF THEREOF
CN112023062A (zh) * 2020-09-18 2020-12-04 北京基因安科技有限公司 一个用可溶性IgE受体抑制过敏反应的方法
IT202200011459A1 (it) * 2022-05-31 2023-12-01 Anallergo S P A Uso della ultrafiltrazione per la produzione di estratti allergenici purificati

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4695694A (en) 1986-02-14 1987-09-22 Fusion Systems Corporation Structure for minimizing microwave leakage
US5597572A (en) * 1987-07-30 1997-01-28 Centro Nacional De Biopreparados Method of producing Neisseria meningitidis B vaccine, and vaccine produced by method
US6165502A (en) * 1996-09-11 2000-12-26 Albany Medical College Protein-lipid vesicles and autogenous vaccine comprising the same
WO2002022677A2 (en) * 2000-09-12 2002-03-21 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Variants of allergenic proteins of the group 2 of dermatophagoides
WO2002072012A2 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Id Biomedical Corporation Of Quebec A novel proteosome-liposaccharide vaccine adjuvant

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4695694A (en) 1986-02-14 1987-09-22 Fusion Systems Corporation Structure for minimizing microwave leakage
US5597572A (en) * 1987-07-30 1997-01-28 Centro Nacional De Biopreparados Method of producing Neisseria meningitidis B vaccine, and vaccine produced by method
US6165502A (en) * 1996-09-11 2000-12-26 Albany Medical College Protein-lipid vesicles and autogenous vaccine comprising the same
WO2002022677A2 (en) * 2000-09-12 2002-03-21 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Variants of allergenic proteins of the group 2 of dermatophagoides
WO2002072012A2 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Id Biomedical Corporation Of Quebec A novel proteosome-liposaccharide vaccine adjuvant

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALLERGY, vol. 56, no. 6, 2001, pages 478 - 490
FERRANDIZ, R.: "Allergenic characterization of the domestic mite Dermatophagoides siboney.", LINKÖPING UNIVERSITY MEDICAL DISSERTATIONS. NUM. 531, 1997. HTTP://WWW.BIBL.LIU.SE/LIUPUBL/DISP/DISP97/MED532S.HTM, XP002248650 *
GOTSCHLICH ET AL., J. EXP. MED., vol. 129, 1969, pages 1349 - 1365
HEYMANN PW; CHAPMAN MD, J ALLERGY CLIN IMMUNOL, vol. 83, 1989, pages 1055 - 1067
SEWER ET AL., INT ARCH ALLERGY IMMUNOL, vol. 123, 2000, pages 242 - 248

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005063287A1 (es) * 2003-12-30 2005-07-14 Instituto Finlay. Centro De Investigación-Producción De Sueros Y Vacunas Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes inductores de respuesta citotóxica y las formulaciones resultantes
ES2301418A1 (es) * 2003-12-30 2008-06-16 Instituto Finlay. Centro De Investigacion-Producci Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes inductores de respuesta citotoxica y las formulaciones resultantes.
WO2010057447A1 (es) 2008-11-19 2010-05-27 Instituto Finlay Centro De Investigacion Produccion De Sueros Y Vacunas Vacunas unitemporales
US8298547B2 (en) * 2008-12-09 2012-10-30 Pfizer Vaccines, LLC IgE CH3 peptide vaccine
US9216229B2 (en) 2008-12-09 2015-12-22 Pfizer Vaccines Llc IgE CH3 peptide vaccine
WO2011137876A2 (es) 2010-05-05 2011-11-10 Instituto Finlay. Centro De Investigación - Producción De Sueros Y Vacunas Tolerogenos adyuvados como vacuna de malaria
WO2013064129A1 (es) 2011-11-02 2013-05-10 Instituto Finlay. Centro De Investigación- Producción De Sueros Y Vacunas. Adjuvantes para vacunas polisacaridicas y las formulaciones resultantes
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