WO2011137876A2 - Tolerogenos adyuvados como vacuna de malaria - Google Patents

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Maribel PÉREZ CUELLO
Osmir Cabrera Blanco
Julio Antonio BALBOA GONZÁLEZ
Miriam de San Juan Bosco LASTRE GONZÁLEZ
Caridad Caridad Zayas Vignier
Elizabeth GONZÁLEZ AZNAR
Belkis Romeu Alvarez
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Instituto Finlay. Centro De Investigación - Producción De Sueros Y Vacunas
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Definitions

  • This invention relates to the field of vaccines, specifically with the obtaining and use of adjuvant vaccines for the treatment or prevention of vertically transmitted infections, particularly Malaria.
  • the technical objective pursued is to use the tolerogens early transferred from the mother to the fetus / newborn and formulate them with potent adjuvants, particularly those derived from Neisseria meningitidis serogroup B (AFPL1, Adjuvant Finlay Proteoliposome 1 and AFCo (cocleatol), response inducers Thl and CTL for use in prophylactic or therapeutic vaccines against vertically transmitted infections, particularly Malaria, the use of these formulations at an early age reverses tolerance by inducing protective responses.
  • AFPL1 Neisseria meningitidis serogroup B
  • AFCo cocleatol
  • WHO declares Malaria as the most important tropical disease, which kills more people than any other communicable disease with the exception of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and Tuberculosis. This estimates between 350 to 500 million cases of clinical malaria each year, resulting in 1.1 million deaths annually. The highest mortality occurs among children under 5 years. Malaria is endemic to some 100 countries where 40% of the world's population lives (WHO / IVB / 06.01: 46-55,2006). It is estimated that every 30 seconds another child dies of malaria in endemic countries.
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • Malaria is caused by protozoa of the genus Plasmodium. There are about 156 species of this genus that infect different vertebrates. Among them: P. berghei, P. chaboie and P. yoeli infect rodents; P. knowlesi and P. cynomolgi infect nonhuman primates and only 5 species: P. falciparum, P. vivax, P. ovale and P. malariae and recently P. knowlesi was added to infect humans.
  • the infection occurs by the bite of females of the genus Anopheles that require blood for reproduction. About 50 species of Anopheles that serve as intermediate hosts are known. Despite this and the restriction of the host, the cycle is very similar.
  • the mosquito inoculates the sporozoitic form, an infective form, present in its saliva and once in the blood, in less than 30 minutes they reach the liver and penetrate the hepatocytes.
  • Each hepatocyte is infected by a single sporozoite, where by asexual schizogonia, it is transformed into eschizontes that, in turn, give rise to tens of thousands of merozoites in just 6-16 days. The rupture of the hepatocyte allows its blood release and the invasion of red blood cells.
  • Malaria symptoms / signs include: high fever, malaise, headache, joint pain, nausea and vomiting.
  • P. falciparum infection is more severe due to the ability of infected red blood cells to adhere to blood vessels. Acute renal failure, cerebral malaria and pulmonary edema occur more commonly in non-immune populations such as children and travelers from non-endemic areas.
  • Another high-risk group is pregnant women. Malaria causes severe anemia, which is the main factor that contributes to maternal death during pregnancy. Concomitant infection with human immunodeficiency virus (HIV) and Malaria in pregnant women leads to infection of the newborn with HIV (Miller LH, et al. Nature, 2002, 415: 673-679 and WHO / IVB / 06.01: 46 - 55,2006).
  • HIV human immunodeficiency virus
  • Premunition was introduced to define immunity against Malaria characterized by the state of resistance concomitant with the persistence of parasites (Sergent ED, Parrot L, Institute Pasteur d'Algerie Archives, 1935.3: 279-319). This is only acquired in hyperendemic countries after at least 2 decades of continuous exposure (Gordon-Thomson J, Immunity in Malaria. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1933, 26 (6): 483-514). Premunition or non-sterilizing immunity is acquired very slowly; unable to eliminate the infection and very labile, disappearing due to the absence of reinfection for more than a year.
  • the effector immune response is generally divided into mediated by antibodies or cells. This division leads to misinterpretations, since it is assumed that the first comes from a Th2 pattern and the second from a Thl. It is not taken into account that the Thl response is the one that also produces a good response of functional antibodies (complement fixators and with opsonophagocytic [cyclophilic] capacity) and induces a good memory response. In addition, the induction of a CTL response and its duration (memory) is only induced when a powerful Thl response is established. If we take these considerations into account, assuming that the antibody or cell response is responsible for the protection against any of the stages of the Malaria cycle tends to confuse their essence.
  • the marginalization of infected erythrocytes, as well as gametocytes, is one of the parasitic escape mechanisms primarily aimed at avoiding the splenic elimination of the former and enabling the best uptake by the mosquito of the latter.
  • This Marginalization although occurs in many organs is particularly important in the placenta during pregnancy, when merozoites change their vascular adhesion receptors from CD36 to chondroityl sulfate A (CSA). It is thought that the placental merozoites are a different variant from the circulatory one and that in the placenta this variant is maintained independent of the other.
  • VSA surface antigen
  • the murine are infected by species such as: P chaboudi; P. vinckei; P. yoelii or P. bergei and within these, there are more or less virulent strains with different lethalities that can reproduce even cerebral malaria.
  • the P. bergei NK65 strain is one of the highly virulent producing mortality in mice before 20 days of inoculation.
  • This risk ranges from: very high in primiparous or multiparous non-immune (non-endemic areas), high in semi-immune primiparous (areas of low endemicity); moderate in semi-immune multiparas (areas of low endemicity); low in the hyperimmune primiparous (hyperendemic areas); to very low in hyperimmune multiparas (hyperendemic areas) (Hviid L and Staalsoe T. Trens in Parasitology, 2004, 20 (4): 66-72).
  • This risk does not include the passage of antigens nor that of idiotypic antibodies (Id) / anti Id that resemble the antigens (Rajewsky K and Takemori T. Ann. Rev.
  • VSASM severe malaria
  • VSAUM uncomplicated malaria
  • VSAPAM pregnancy-associated malaria
  • IL-10 anemia, low TNFoc / IL-10 ratio and high parasitaemia are risk factors for the mother-fetus relationship (Tilg H, et al. J Immunol 2002,169: 2204-2209) and IL -10 has also been associated with increased anemia (Tilg H, et al. J. Immunol., 2002, 169: 2204-2209 and Jeans RT Jr. Curr. Hematol. Rep., 2003, 2: 116-121 ). Therefore, the possible transfer of antigens by excretion / secretion or parasites in a micro suppressor environment can induce tolerance or an inadequate response to some antigens essential for protection against malaria.
  • allergens are capable of crossing the placental barrier (Holt PG, et al. Allergy, 2000, 55: 688-97) and together with helminths they are the main inducers of IgE and a Th2 pattern. It is also known that the response to BCG immunization in children of mothers with helminthiasis is depressed (Malhotra I, et al. J. Immunol., 2001, 166: 2141-6). Although the appearance and development of allergies is related to environmental factors, the basic role in the individual's propensity to develop a Th2 / IgE response to environmental antigens is genetic (Holgate ST. J. Allergy Clin. Immunol.
  • Adjuvants are substances that enhance the specific immune response against an antigen causing a faster induction of it and increasing its duration (Vogel FR. Dev. Biol. Stand., 1998, 92: 241-248). Alumina continues to be the most commonly used adjuvant in parenteral vaccines. However, this is not a potent adjuvant that could help new vaccines by subunits. It is considered that it only has distribution system properties, although a new mechanism of action independent of Toll-like receptors that involves Nalp3 (Eisenbarth SC et al. Nature, 2008, 453: 1122-1 126) has recently been described. Its mucosal utility has also not been proven and it is assumed that it preferentially induces a Th2 response.
  • Licensed vaccine adjuvants are scarce (MF59, AS02, virosome, AFPL1, Proteollin, MPL, etc.) and few are those of mucosal application (CT, LT, CTB, LT mutants (LT63K, LTR72), CpG, Chitosan, ISCOM and AFCol) (Singh M and O'Hagan DT. Pharm. Res. 2002,19 (6): 715-728, Pérez O et al. Immunology and Cell Biology, 2004, 82: 603-610). Only CTB has been licensed in humans in a cholera vaccine.
  • adjuvants in vaccine formulations allows reducing the amount of antigen needed, directing the response to a desired pattern and reducing the number of doses required.
  • Adjuvant platform based on Proteo-Cochleates (AFPL1 and AFCol) derived from N. meningitidis serogroup B or similar of other microorganisms for use in parenteral or mucosal vaccines. These adjuvants induce a preferential Thl response in murine and human by parenteral administration.
  • IgG and Thl anti PL subclasses characterized by: IgG and Thl anti PL subclasses; production of IFNy, IL-12 and TNFa, positive response of delayed hypersensitivity and additionally, the induction of cytotoxic T lymphocytes (CTL)
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • AFCol and AFPLl have also been demonstrated by nasal, oral, vaginal and rectal applications and its production has been extended to similar derivatives of other microorganisms.
  • Proteoliposomes and their cochleate derivatives have also been used as adjuvants as disclosed in WO / 2004/047805.
  • the simultaneous application of mucosal AFCol and parenteral AFPLl with the corresponding antigens induces potent responses (OCPI patent CU / P / 2008/215).
  • the present inventors have found a solution to the problem of malaria in newborns and children from mothers infected with P. falciparum. These die primarily of anemia caused by uncontrolled blood cycles, due to their inability to develop protective immune responses. They recognize parasitic derivatives that arrive from infected placenta to fetuses / newborns with immature immune systems as tolerant. In this way, parasitic derivatives cannot be recognized as antigens but as their own substances or tolerogens.
  • the present inventors have found that in Malaria the placental necrosis allows a greater passage of the tolerogens when the infection occurs at the end of pregnancy. This is due to the decrease in the thickness of the placenta in the terminal stage of gestation and thus to the greater effectiveness of necrosis at the level of the placenta to transfer the tolerogens.
  • the present inventors have found, in a murine model of P. berghei and as in the case caused by P. falciparum, that the signs of malaria (fetal and maternal mortality, dead births and low birth weight) are more serious if the infection occurs at the end of pregnancy, that is, close to delivery.
  • the present inventors have found in a murine model of pregnant women infected with P. berghei anemia as a sign of Malaria in newborns and that this is increased by a new reinfection of newborns.
  • the present inventors have found that congenital Malaria, rare in human, it is very common in a murine model of P. berghei.
  • the present inventors have found that parasites and / or their derivatives serve as tolerogens in the immunologically immature fetal / newborn environment leading to a response of diminished anti-merozoite IgG class antibodies and a mainly Th2 pattern.
  • the present inventors have used tolerogens to obtain formulations with potent adjuvant proprietary adjuvants of helper T cells (Thl) and cytotoxic (CTL).
  • Thl helper T cells
  • CTL cytotoxic
  • the present inventors have found Malaria tolerogens formulated with potent adjuvants are efficient in inducing cellular responses, Thl in newborns.
  • the present invention aims to use the tolerogens early transferred from the mother to the fetus / newborn and formulate them with potent adjuvants in particular those derived from N. meningitidis (AFPL1 and AFCol), inducers of Thl and CTL responses for use in vaccines prophylactic or therapeutic against vertically transmitted infections, particularly Malaria.
  • AFPL1 and AFCol potent adjuvants in particular those derived from N. meningitidis
  • Thl and CTL responses for use in vaccines prophylactic or therapeutic against vertically transmitted infections, particularly Malaria.
  • the use of these formulations at an early age reverses the tolerance stage by inducing protective responses.
  • vertical transmission is used to refer to infections, antigens or tolerogens transferred from the mother to the fetus / newborn through the placenta or during breastfeeding.
  • tolerogen is used in a broad immunological sense and will never be interpreted in a restrictive sense to a single component. This may be an epitope, a protein, a glycoprotin, a saccharide, an allergen, the total merozoite or any of its components or substances excreted / secreted by microorganisms, in particular by Plasmodium.
  • tolerance is used in a broad immunological sense and will never be interpreted in a restrictive sense to the specific absence of immune response. This term can be interpreted as absence or decrease of specific humoral response; deviation of the protective pattern Thl towards one Th2; presence of suppressor response at the level of cytokines (such as IL-10 and / or TGF) or regulatory T cells; absence of CTL response and no induction of adequate immune memory.
  • cytokines such as IL-10 and / or TGF
  • regulatory T is applicable to natural (Trl) or inducible (Th3, Treg, etc.) regulatory cells.
  • PL Proteoliposome
  • isolation without detergent a process that includes detergent (such as deoxycholate, sodium duodesilsulfate (SDS), etc.) or the extraction from vesicles ("bleb") of crop supernatants and particularly those disclosed in US 5,597,572.
  • PLs contain different patterns associated molecular Pathogen (PAMP, "pathogen-associated molecular patter ').
  • PLs also contain proteinogenic proteins and are therefore used not only as adjuvants against heterologous antigens, but also as vaccines. These contain structures of the outer membrane of bacteria; but for the purposes of this patent, those extracted are also considered. from other organisms such as viruses, fungi, protozoa, helminths or tumor cells.
  • AF Adjuvant Finlay
  • PL is reserved for the use of PL as an adjuvant.
  • Co Crohn's disease
  • a derivative of a PL which therefore also contains several PAMPs as referred to in the patent (WO / 2004/047805, Pérez O et al. Infec ⁇ Immun. 2001, 69 (7): 4502 ⁇ 1508 and Pérez O et al. Immunology and cell Biology. 2004, 82: 603-610).
  • AFPL1 represents the PL extracted from serogroup B of N. meningitidis.
  • the concept of Co extends to the production thereof from combinations of synthetic lipids with the inclusion of PAMPs that act synergistically, which radically differentiates them from other Co produced from lipids. synthetic and not included in the patent referred to above.
  • the novelty of the invention lies primarily in demonstrating that malaria during pregnancy produces congenital malaria in murines in percentages much higher than those reported for humans.
  • Formulations with potent adjuvants AFPL1 and AFCol containing Malaria antigens / toleragens reverse the tolerance induced, at an early age, by the transfer of tolerogens from pregnant women infected with Malaria to fetuses / newborns.
  • AFCol and AFPL1 work in simultaneous mucosl and parenteral applications (unitemporal vaccines).
  • AFPL1 and AFCol are functional at early ages (newborns).
  • Formulations containing the powerful adjuvants: AFCol and AFPL1 can be extended to the protection of other infections of vertical transmission.
  • Example 1 Obtaining Proteoliposome (PL).
  • PL Proteoliposome
  • N. meningitidis of any serogroup is carried out, particularly the B, Salmonella Typhi, Vibrio cholerae, Echerichia coli, Shiguella, Salmonella, Bordetella pertusus or Micobacterium tuberculosis and the biomass collected by centrifugation is subjected to a process from extraction with detergent, enzymes and ultrasound. The cell debris is removed by centrifugation and the supernatant is then digested with nucleases to remove nucleic acids.
  • the extract is recovered by ultracentrifugation, resuspended in solution with detergent and purified from the rest of the low and medium molecular weight components by molecular exclusion chromatography.
  • the PL of N. meningitidis serogroup B thus obtained contains: porins (PorA and PorB); traces of bacterial DNA and less than 10% (in relation to proteins) of native LPS inserted in its structure; But never free. Porins, DNA and the LPS present are PAMPs that interact synergistically with pattern recognition receptors, triggering the danger signals at the level of the cells involved in the innate response.
  • the final product is subjected to a set of biological and physical-chemical controls.
  • the antigen of interest can be increased up to at least 35% relative to the proteins.
  • a similar procedure to obtain liposomal structures enriched in outer membrane proteins has been used based on viruses and protozoa.
  • Example 2 Obtaining Cochleate (Co) derived from Proteoliposome (PL). It is based on PL obtained by the methods described in EP 885900077.8 or US 5, 597,572. These are resuspended in Tris-EDTA buffer solution with 0.5% sodium deoxycholate. Protein concentration was determined by Lowry modified according to Peterson (Peterson GL. Analyt. Biochem. 83, 346, 1977). The content of the phospholipids that form the PL is determined by the quantification of inorganic phosphorus (Bartlett GR. J. Biol. Chem., 1959, 234, 459-465).
  • a solution is prepared with the PL adjusted to a final protein concentration of 5-6 mg / mL in Tris-EDTA buffer containing sodium deoxycholate in an amount of 6 to 15 times the total amount of protein.
  • This solution is filtered directly into the dialysis device through a filter with a pore size of 0.2 ⁇ .
  • the dialysis is performed by rotational agitation, tangential filtration, or a closed system for 24 h with continuous and slow change of the dialysis buffer in the first, several washes in the second and volume increases as required in the third.
  • P. berghei NK65 strain is maintained by successive passes in mice. Subsequently, this strain was adapted to rats. Young or adult female Dowly Spray rats, with 7 ⁇ 2 or 11 weeks of birth, respectively, were mated and their gestation was verified by the loss of the mucous buffer. Then, they were infected with P. berghei NK65 at least 7, 5 or 3 days before the average date of delivery in pregnant women (22 days). Infection was considered on day -3 with respect to childbirth as term infections, that is, late. In rats the infection was verified by microscopic examination of their blood. The rats were observed 2 times a day and the days of delivery were determined. Delay was considered when the rats gave birth at least one day after the control rats. The tests were repeated at least 3 times.
  • Infection protocol Young or adult female Dowly Spray rats, with 7 ⁇ 2 or 1 1 weeks of birth, respectively, were paired and their pregnancy was verified by the loss of the mucous buffer. Subsequently, the rats were infected with P. berghei NK65 at 7, 5 or 3 days before delivery. Infection was considered on day -3 with respect to delivery as late or late infections. In rats the infection was verified by microscopic examination of their blood. The rats were observed at least 4 times a day and the percentages of dead births and the mortality of newborns were determined. These were quantified from day 1 to 5 of births. The tests were repeated at least 3 times.
  • Protocol of infection Spray Dowly female or young female rats, with 7 ⁇ 2 or 11 weeks of birth, respectively, were mated and their pregnancy was verified by the loss of the mucous buffer. Subsequently, the rats were infected with P. berghei NK65 at 7, 5 or 3 days before delivery. Infection was considered on day -3 with respect to childbirth as late or late infections. In rats the infection was verified by microscopic examination of their blood. Rats were observed at least 4 times a day and weights in grams (g) of live born mice were determined. The tests were repeated at least 3 times.
  • Infection protocol Spray Dowly young or adult female rats, with 7 ⁇ 2 or 1 1 weeks of birth, respectively, were mated and their pregnancy was verified by the loss of the mucous buffer. Subsequently, the rats were infected with P. berghei NK65 at 7, 5 or 3 days before delivery. Infection was considered on day -3 with respect to childbirth as late or late infections. In rats the infection was verified by microscopic examination of their blood. The rats were observed at least 4 times a day and the occurrence of maternal mortality was determined. The tests were repeated at least 3 times.
  • Infection protocol Dowly female Spray rats were mated and their pregnancy was verified by the loss of the mucous buffer. Subsequently, the rats were infected with P. berghei NK65 at -7, -5 or -3 days before delivery. In rats as well as in their offspring the infection was determined by microscopic examination of their blood. The tests were repeated at least 3 times.
  • Results All newborns of infected mothers at any time during pregnancy had congenital malaria, that is, they had merozoites in their blood. Summary: 100% of newborns of infected mothers congenital malaria tube.
  • Example 8 Presence of anemia in newborns of infected mothers.
  • Infection protocol female Spray Dowly rats were mated and their pregnancy was verified by the loss of the mucous buffer. Subsequently, the rats were infected with P. berghei NK65 at -7, -5 or -3 days before delivery. In rats the infection was verified by microscopic examination of their blood. Newborns of infected or healthy mothers were also infected with P. berghei NK65 5 days after being born intraperitoneally. A group from infected mothers was not infected and this was used as a control. Anemia was expressed in percent. The tests were repeated at least 3 times. Results: Anemia was observed in 18% of the children of mothers infected with P. berghei NK65, which increased to 50% when newborns were reinfected with the same strain (Fig. 1).
  • Example 9 Congenital malaria induces anemia in newborns and is increased by reinfection.
  • Example 9 Powerful Thl response induced by formulations of malaria peptides and Finlay Adjuvants administered intramuscularly or intranasally in newborns with memory induction.
  • P. falciparum peptides were formulated with AFPL1 or AFCol.
  • Balb / c mice 7 days old were immunized intramuscularly with AFPL1 + peptide in 2 intramuscular doses spaced 14 days; with AFCol + peptide in 3 intranasal doses spaced 7 days or with simultaneous application by both routes.
  • the response in saliva and in anti-peptide serum was evaluated 7 and 21 days after the last dose.
  • a booster dose after 3 months of immunized was applied to assess the induced immune memory.
  • Coating buffer solution Na 2 C0 3 11 mM, NaHC0 3 35 mM (pH 9.6) Phosphate Buffered Saline (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
  • Blocking solution 1% SSTF / SAB: 0.15 M SSTF (pH 7.2), 1% Bovine Seroalbumine (w / v)
  • Substrate buffer solution STS (Na 2 HP0 4 52 mM and 25 mM citric acid (pH 5.6))
  • the reaction is stopped by adding 50 ⁇ 50 of a stop solution.
  • the optical density absorbance (OD) measurement is performed at 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus)
  • Saliva Extraction and Processing Method Saliva extraction was performed 7 days after the last dose. For saliva sampling, salivation in animals was stimulated with the 50 ⁇ intraperitoneal application. by 0.5% pilocarpine mouse (Imefa, Cuba). Samples were kept on ice during extraction and immediately inactivated at 56 ° C for 15 min. They were then centrifuged at 14000 g for 15 min at 4 ° C, the supernatant was collected and stored at -70 ° C until use.
  • Coating buffer solution Na 2 C0 3 11 mM, NaHC0 3 35 mM (pH 9.6) Phosphate Buffered Saline (SSTF) 0.15 M (pH 7.2) Blocking solution (1% SSTF / SAB): 0.15 M SSTF (pH 7.2), 1% Bovine Seroalbumine (w / v)
  • wash solution (SSTF, 0.1% Tween 20): SSTF, 0.1% Tween 20 (v / v), pH 7.4) Sample dilution solution (SSTF, 1% SAB, 0.1% Tween 20)
  • Anti-IgA R5-140 of biotinylated peroxidase-conjugated mouse (Sigma, St. Louis, MO, USA) Streptavidin-peroxidase (Sigama, St. Louis, MO, USA)
  • Substrate buffer solution STS (Na 2 HP0 4 52 mM and 25 mM citric acid (pH 5.6))
  • Standard Antibody Saliva As an internal antibody standard, for the IgA anti PL assays, a curve made with saliva samples from hyperimmune mice was used.
  • Standard Antibody Saliva and saliva to be evaluated were diluted 1: 2 in Sample dilution solution. 100 ⁇ / ⁇ is applied in duplicate of the dilutions of the individual sera and the reference serum and incubated 2 h at 37 ° C.
  • a second conjugate (streptavidin peroxidase) is added in a 1: 2000 dilution in Sample Dilution Solution and incubated 30 min at 37 ° C
  • the absorbance (OD) measurement is performed at a reading of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • Example 10 Lower IgG anti merozoites in newborns of mothers infected with P. berghei Infection protocol: female Balb / c mice were paired and their pregnancy was verified by the loss of mucous buffer. Subsequently, they were infected with P. berghei NK65 at -3 days before delivery. In pregnant women and their offspring infection was verified by microscopic examination of their blood. A group of pregnant women was not infected and their offspring were used as a control. These were infected P. berghei N 65 after 5 days of being born intraperitoneally. Blood samples were taken from the newborns and their serum was taken. In these, the ELISA-induced anti-merozoite IgG response was evaluated. The tests were repeated at least 3 times.
  • the anti peptide IgG response was evaluated as described in example 9.
  • Coating buffer solution Na 2 C0 3 11 mM, NaHC0 3 35 mM (pH 9.6) Phosphate Buffered Saline (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
  • Blocking solution 1% SSTF / SAB: 0.15 M SSTF (pH 7.2), 1% Bovine Seroalbumine (w / v)
  • wash solution (SSTF, 0.1% Tween 20): SSTF, 0.1% Tween 20 (v / v), pH 7.4) Sample dilution solution (SSTF, 1% SAB, 0.1% Tween 20)
  • Substrate buffer solution STS (Na 2 HP0 4 52 mM and 25 mM citric acid (pH 5.6))
  • the sera to be evaluated are diluted 1: 100 in Sample dilution solution. 100 ⁇ / ⁇ is applied in duplicate of the dilutions of the sera and incubated 2 h at 37 ° C.
  • a second conjugate (streptavidin peroxidase) is added in a 1: 2000 dilution in Sample Dilution Solution and incubated 30 min at 37 ° C
  • the absorbance measurement (OD) is performed at a reading of 492 nm in a microplate reader (Titertek, Multiskan Plus).
  • IgG1 (Th2) response predominated in newborns of infected mothers, while IgG2a (Thl) anti merozoites response was also detected in the offspring of healthy pregnant women who were infected after birth.
  • mice from uninfected mothers induced IgG2a response against P. berghei merozoites. Similarly, those from infected mothers also induced a Thl pattern (IgG2a). Summary: formulations with adjuvant antigens were able to reverse the tolerance of newborns from infected mothers.

Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de las composiciones vacunales para el tratamiento efectivo o preventivo de infecciones de transmisión vertical, particularmente la malaria y preferiblemente la humana causada por Plasmodium falciparum. El objetivo técnico que se persigue es usar los tolerógenos trasferidos tempranamente de la madre al feto/recién nacido y formularlos con potentes adyuvantes inductores de respuestas Th1 y T citotóxica para su uso en vacunas profilácticas o terápeuticas contra las infecciones de transmisión vertical y particularmente la malaria. El empleo de estas formulaciones por vía parenteral o mucosal o ambas a la vez en edades tempranas revierte la tolerancia inducida por la transferencia de tolerógenos y con ello inducir respuestas protectivas.

Description

TOLEROGENOS ADYUVADOS COMO VACUNA DE MALARIA
Memoria Descriptiva
Rama de la Técnica
Esta invención se relaciona con el campo de las vacunas, específicamente con la obtención y uso de vacunas adyuvadas para el tratamiento o prevención de infecciones de transmisión vertical, particularmente la Malaria.
Las materias de estudio e informaciones reveladas en las publicaciones y patentes o patentes aplicadas mencionadas en estas especificaciones son incorporadas aquí por referencia (EP 885900077.8 o US 5, 597,572; WO/2004/047805; WO/2003/094964, EP1716866, CU/P/2008/215; Pérez O et al. Infect Immun. 2001, 69(7):4502-4508; Pérez O et al. Immunology and cell Biology. 2004,82:603-610; Rodríguez, T et al. Vaccine 2005, 26:1312- 21; Pérez O, et al. Scand J Immunology 2007,66:271-77).
El objetivo técnico que se persigue es usar los tolerógenos trasferidos tempranamente de la madre al feto/recién nacido y formularlos con potentes adyuvantes en particular los derivados de Neisseria meningitidis serogrupo B (AFPL1, Adjuvant Finlay Proteoliposome 1 y AFCo (cocleatol), inductores de respuestas Thl y CTL para su uso en vacunas profilácticas o terapéuticas contra infecciones de transmisión vertical, particularmente la Malaria. El empleo de estas formulaciones en edades tempranas revierte la tolerancia induciendo respuestas protectivas.
Estado del arte
La OMS declara a la Malaria como la enfermedad tropical más importante, que mata más personas que cualquier otra enfermedad transmisible con excepción del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y la Tuberculosis. Esta estima entre 350 a 500 millones de casos de malaria clínica cada año, resultando en 1.1 millones de muertes anuales. La mayor mortalidad ocurre entre los niños menores de 5 años. La Malaria es endémica de unos 100 países donde vive el 40% de la población mundial (WHO/IVB/06.01:46-55,2006). Se estima que cada 30 segundos muere otro niño de malaria en los países endémicos.
La Malaria es causada por protozoos del género Plasmodium. Existen alrededor de 156 especies de éste género que infectan diferentes vertebrados. Entre ellas: P. berghei, P. chaboie y P. yoeli infectan a los roedores; P. knowlesi and P. cynomolgi infectan a los primates no humanos y sólo 5 especies: P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae y recientemente se adición P. knowlesi infectan al humano.
La infección ocurre por la picada de hembras del género Anopheles que requieren de sangre para su reproducción. Se conocen unas 50 especies de Anopheles que sirven de huésped intermediario. A pesar de esto y la restricción del huésped, el ciclo es muy similar. El mosquito inocula la forma esporozoítica, forma infectiva, presente en su saliva y una vez en la sangre, en menos de 30 minutos arriban al hígado y penetran en los hepatocitos. Cada hepatocito es infectado por un sólo esporozoito, donde por eschizogonia asexual, se trasforma en eschizontes que a su vez, dan lugar a decenas de miles de merozoitos en sólo 6-16 días. La ruptura del hepatocito permite su liberación sanguínea y la invasión de los hematíes. Aquí ocurre la multiplicación y maduración en periodos de 24 a 72 horas en dependencia de la especie. Cada explosión eritrocitaria es consecuencia de la multiplicación parasitaria y conlleva a la invasión de nuevos eritrocitos. Los signos clásicos de Malaria como son los episodios de fiebre aguda y rigidez que ocurren cada 48-72 horas coinciden con la lisis sincronizada de los eritrocitos infectados. Algunos merozoitos se transforman en el estadio sexual, gametocitos, que son adquiridos por el mosquito donde ocurre su unión y evolución a esporozoitos.
Los síntomas/signos de la Malaria incluyen: fiebre alta, malestar, dolor de cabeza, dolores articulares, náuseas y vómitos. La infección por P. falciparum es más severa por la habilidad de los hematíes infectados de adherirse a los vasos sanguíneos. El fallo renal agudo, la malaria cerebral y el edema pulmonar ocurren más comúnmente en poblaciones no inmunes como son los niños y los viajeros provenientes de zonas no endémicas. Otro grupo de alto riesgo son las gestantes. La Malaria causa anemia severa, que es el principal factor que contribuye a la muerte materna durante la gestación. La infección concomitante con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y la Malaria en las gestantes propicia la infección del recién nacido con VIH (Miller LH, et al. Nature, 2002, 415:673-679 y WHO/IVB/06.01 :46- 55,2006).
En áreas donde el control vectorial con abate ha fallado, la quimioterapia, consistente en una selección limitada de agentes antimaláricos, es la única defensa contra esta enfermedad. El incremento de la resistencia a las drogas en toda las regiones endémicas de Malaria es causa de gran preocupación y llamadas para el desarrollo de nuevas medidas contra la Malaria, las cuales incluirían una gran variedad de drogas, así como un amplio espectro de estrategias vacunales (Richie TL y Saúl A. Nature 2002, 415:694-701, Gardner MJ et al. Nature 2002, 419:498-511 y Banyal HS y Inselburg J. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1985, 34: 1055-1064).
La batalla contra la Malaria conlleva esfuerzos para mejorar el diagnóstico, la quimioterapia, así como las medidas de control basadas en mosquiteros impregnados con insecticidas y la fumigación con insecticidas residuales. En ellos se están integrando esfuerzos de múltiples organizaciones. Sin embargo, la emergencia o resurgencia de países con Malaria es evidente. Por ello, el desarrollo de una vacuna segura, efectiva y de posible uso general es una prioridad crítica de la salud pública global (WHO/IVB/06.01 :46-55,2006).
El término Premunición fue introducido para definir la inmunidad contra la Malaria caracterizada por el estado de resistencia concomitante con la persistencia de parásitos (Sergent ED, Parrot L, Institute Pasteur d'Algerie Archives, 1935,3:279-319). Esta sólo se adquiere en países hiperendémicos tras al menos 2 décadas de continua exposición (Gordon- Thomson J, Immunity in Malaria. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1933, 26(6):483-514). La Premunición o immunidad no esterilizante es adquirida muy lentamente; incapaz de eliminar la infección y muy lábil, desapareciendo por ausencia de reinfección por más de un año.
La respuesta inmune efectora es generalmente dividida en mediada por anticuerpos o células. Esta división conlleva a interpretaciones erróneas, pues se asume que la primera proviene de un patrón Th2 y la segunda de una Thl . No se tiene en cuanta que la respuesta Thl es la que también produce una buena respuesta de anticuerpos funcionales (fijadores de complemento y con capacidad opsonofagocítica [citofílica]) e induce una buena respuesta de memoria. Además, la inducción de una respuesta CTL y su duración (memoria) sólo se induce cuando se establece una potente respuesta Thl. Si tenemos en cuenta estas consideraciones, asumir que la respuesta de anticuerpos o de células es la responsable de la protección contra cualquiera de los estadios del ciclo de Malaria tiende a confundir la esencia de los mismos.
La marginalización de los eritrocitos infectados, así como de los gametocitos, es uno de los mecanismos de escape parasitario dirigido fundamentalmente a evitar la eliminación esplénica de los primeros y posibilitar la mejor captación por el mosquito de los segundos. Esta marginalización aunque ocurre en muchos órganos es particularmente importante en la placenta durante la gravidez, cuando los merozoitos cambian sus receptores de adhesión vascular de CD36 a condroitil sulfato A (CSA). Se piensa que los merozoitos de la placenta son una variante diferente a la circulatoria y que en la placenta se mantiene esta variante independiente de la otra.
La influencia de la presencia o no de inmunidad contra la Malaria en las gestantes es otro serio problema durante el embarazo. En consecuencia se sabe que las gestantes no inmunes, seguidas de las gestantes semi-inmunes son más afectadas por la Malaria que las inmunes. Por otro lado, es determinante la paridad (número de partos), donde las primíparas y por ello, las madres jóvenes, son las más afectadas. Esto es debido a que durante las sucesivas gestaciones la madre se pone en contacto con nuevas variantes de parásitos en la placenta adquiriendo cierta inmunidad contra los mismos. No obstante, esto se contradice con la necesidad de al menos dos décadas requeridas para adquirir inmunidad y que esta se pierde tan rápido como al año sin exposición a mosquitos infectados. Como resultado del secuestro de parásitos en la placenta ocurre: mayor mortalidad de la madre y del recién nacido; abortos; anemia materna y del niño; nacidos muertos y bajo peso al nacer.
Existen varias evidencias de que se puede obtener una vacuna profiláctica contra la Malaria como son: protección del 90% de los inmunizados con sporozoitos irradiados; adquisición de Premunición después de décadas de exposición continua en áreas de alta endemicidad y protección por transferencia pasiva de anticuerpos específicos (WHO/IVB/06.01 :46-55, 2006).
En humanos existen dos poblaciones importantes que requieren enfoques diferentes: habitantes de zonas endémicas y viajeros que no han tenido ningún contacto con la Malaria. En el primero, se encuentran varios grupos de riesgo sujetos a infecciones reiteradas con P. falciparum: a) los niños menores de un año que sufren particularmente de anemia con riesgo para la vida; b) los niños de 2 a 5 años que sufren de coma inducido (Marsh K y Snow RW. Parasitología 1999, 41 :241-246); y c) las mujeres primo grávidas que sufren severas enfermedades relacionadas con el secuestro de los parásitos en la placenta (Ricke CH et al. J. Immunol. 2000, 165:3309-3316) sobre todo las primíparas no inmunes.
Para la futura madre: el recrudecimiento de la anemia; la morbi-mortalidad materna y los altos porcentajes de abortos (Heard D y Jordán T. Cent. Afr. J. Med., 1981, 27:62-68), así como los nacidos muertos y los bajos de peso al nacer son hechos frecuentes en la Malaria. La mayor gravedad de la Malaria durante la gestación y sobre todo en las primíparas (McGregor IA. Am. J. Trp. Med. Hyg., 1984, 33:517-25 y Brabin A. Int. J. Epidemiol., 1991, 20:276-83) es un hecho aceptado por todos. No obstante, sus mecanismos no están totalmente elucidados. Por ello, existen varias hipótesis que tratan de explicar parcialmente, este fenómeno:
• Primero, la respuesta inmune Thl requerida para la protección contra la malaria (Fried M, et al. J. Immunol., 1998, 160:2523-30, Fievet N, et al. J. Infecí. Dis., 2001, 183: 1530-34 y Suguitan AJL et al. J. Infect. Dis., 2003, 188: 1074-82) está deprimida durante la gestación (Riley EM, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1989, 40: 141 -4, Fievet N, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1995, 53:612-17 y Recusen EN, et al. Am. J. Reprod. Immunol., 2001 , 46: 169-79); pues el embarazo genera una respuesta Th2 sistémica, para proteger al feto incompatible con la madre por el aporte paterno de ser rechazado. Esta respuesta pudiera ser, junto a la exacerbación de la anemia, una de las causas de aborto o muerte fetal temprana.
• Segundo, los anticuerpos anti adhesión contra los parásitos que se unen a CSA están asociados con la protección y se adquieren por gestaciones sucesivas (Ricke CH et al. J. Immunol., 2000, 165:3309-16, O'Neil-Dunne I, et al. Infect. Immun., 2001 , 69:7487-92, Fried M and Duffy PE. Science 1996,272: 1502-1504). Durante la infección, los merozoitos en sangre periférica se adhieren a los endotelios vasculares a través del CD36, mientras que los secuestrados en la placenta se adhieren a CSA (Fried M y Duffy PE. Science, 1996, 272:1502-1504, Beeson JG, et al. Nat. Med., 2000, 6:86-90), ambos representan clones con variantes de antígenos de superficie (VSA) diferentes (Ofori MF, et al. Infect. Immun., 2003, 71(3):1584-1586). Se han identificado varias familias de genes que codifican para las VSA. La mejor caracterizada es la familia de genes var que codifican para la proteína 1 de la membrana eritrocitaria de P. falciparum (PfEMPl) (Smith JD, et al. Cell, 1995, 82,101-110, Baruch DI, et al. Cell, 1995, 82,77-87 y Su X, et al. Cell, 1995, 82:89-100). Dos genes var que son menos polimórficos que el resto de la familia var: varlcsa y var2csa (Salanti A, et al. Mol. Microbiol., 2003, 49; 179-191) han sido identificados y éstos parecen ser prometedores candidatos vacunales. No obstante, cualquier vacuna de este tipo no protegerá contra la infección, pues la respuesta observada es contra los estadios eritrocitarios y no contra los hepáticos o sexuales. También existe la posibilidad de escape por mutantes en estos genes que evadan la inmunidad y como las secuencias vari sea y var2csa varían entre las cepas y una vacuna eficaz tendría que estimular una amplia respuesta de anticuerpos. Esta teoría no explica tampoco por qué no se protegen las madres que elaboran anticuerpos contra los parásitos que se unen a CSA desde el segundo trimestre del embarazo (Ricke CH, et al. J. Immunol., 2000,
165:3309-3316 y Staalsoe T, et al. J. Inf. Dis., 2001, 184:618-626).
• Tercero, la inmunosupresión no específica por hormonas asociadas a la gestación que deprimen la respuesta innata, particularmente las células asesinas naturales (NK) (Bouyou-Akotet MK, et al. CID, 2004, 38:342-347).
Para el futuro hijo: las muertes por abortos; los nacidos muertos; la anemia; la prematuridad y los bajos pesos al nacer, son hechos frecuentes impuestos por el secuestro de parásitos en la placenta (Desowitz RS, et al. Am J Trop Med Hyg, 1989, 41(6):630-4). Para los que logran nacer, la influencia de la infección materna con Malaria pudiera ser positiva o negativa:
• En la positiva podemos encontrar: traspaso de anticuerpos (IgG o IgA) anti Malaria por la placenta y/o la leche que protejan al recién nacido durante los primeros meses de vida en los humanos y traspaso de antígenos que logren estimular ('priming') efectivamente a nivel del feto o perinatalmente.
• En la negativa podemos suponer: que el traspaso de antígenos en un sistema inmune inmaduro induzca tolerancia; que se induzca una respuesta inapropiada (Th2) o que los anticuerpos interfieran con la futura respuesta a la infección por afectación de la especificidad fina de la repuesta inmune (Stanisic DI, et al. J Immunology 2003, 172:5570-5581).
A los murinos los infectan especies tales como: P chaboudi; P. vinckei; P. yoelii o P. bergei y dentro de éstas, existen cepas más o menos virulentas con letalidades diferentes y que pueden reproducir hasta la malaria cerebral. La cepa P. bergei NK65 es una de las altamente virulenta produciendo mortalidad en los ratones antes de los 20 días de la inoculación.
Por un lado, existen reportes de infección en murinos (ratones y ratas) con P. bergei NK65 durante la gestación (Leopardo O, et al. Patológica, 1994, 86(3):284-290, Desowitz RS, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1989, 41(6):630-634, Oduela AM, et al. J. Protozool., 1982, 29(1):77-81 y Hioki A, et al. J. Protozool., 1990, 37(3): 163-167) que en dependencia de los días de inoculación logran completar las gestaciones. Estos trabajos son anteriores a 1995 y si bien, permiten afirmar que el modelo es posible, no se beneficiaron de los recientes hallazgos inmunológicos relacionados con las teorías innatistas, procesamiento y presentación antigénica y de células T reguladoras que están revolucionando los enfoques de la inducción y regulación de la respuesta inmune. De hecho, se está retomando la necesidad de modelos de infección durante la gestación para testar las vacunas anti maláricas (Galinski MR y V Corredor. Mol. Biochem. Parasitol., 2004, 134:17-25) y ya aparecen trabajos relacionados con las células T supresoras durante la infección con P. berghei NK65. Este trabajo fue en ratones adultos y se relaciona con la inducción de protección (Long TT, et al. Int. J. Parasitol., 2003, 33(2): 175-83).
Por otro lado, el paso de antígenos e incluso parásitos desde la madre a la descendencia no es un hecho infrecuente en la malaria murina ni en la humana. No obstante, no esta totalmente claro sus porcentajes.
• Trabajos usando ratonas inmunes inducidas por infecciones/tratamientos anti maláricos sucesivos transfieren células y anticuerpos que afectan el desarrollo de la vacunación posterior e incluso el comportamiento de la infección con malaria a las dos semanas de nacido (Stanisic DI, et al. J. Immunology, 2003, 171:5461-5469 y Stanisic DI, et al. J Immunology, 2003, 172:5570-5581). En gestantes humanos con secuestro de Malaria en la placenta, la transferencia de parásitos al recién nacido puede ser variable, con un reporte de hasta el 50%. La transferencia de parásitos se considera que es en bajas concentraciones y sin llegar a producir Malaria congénita (Ismaili J, et al. Clin. Exp. Immunol., 2003, 133:414-421).
No obstante, ningún trabajo murino aborda la infección temprana de los descendientes de madres gestantes infectadas, los cuales están bajo la influencia del posible traspaso de parásitos (Akingbade OA. J. Reprod. Med., 1992, 37(3):273-6) o antígenos (Guoling Xi, et al. Infec. Immun., 2003, 71:1242-46) perinatalmente y se sabe que el secuestro placentario produce severas alteraciones llegando hasta inducir necrosis en la placenta (Desowitz RS, et al. Am J Trop Med Hyg, 1989, 41(6):630-4).
En humanos, se han encontrado altas concentraciones de exoantígenos en el suero de cordón (Iakodsen PH, et al. Immunology, 1998, 93:264-9) y el riesgo del recién nacido a desarrollar Malaria congénita esta en dependencia del estatus inmune y del secuestro de malaria en la placenta de la gestante. Este riesgo va desde: muy alto en las primíparas o multíparas no- inmunes (áreas no endémicas), alto en primíparas semi-inmunes (áreas de baja endemicidad); moderado en las multíparas semi-inmunes (áreas de baja endemicidad); bajo en las primíparas hiperinmunes (áreas hiperendémicas); hasta muy bajo en multíparas hiper-inmunes (áreas hiperendémicas) (Hviid L y Staalsoe T. Trens in Parasitology, 2004, 20(4): 66-72). Este riesgo no incluye el paso de antígenos ni tampoco el de anticuerpos idiotípicos (Id)/ anti Id que semejen a los antígenos (Rajewsky K y Takemori T. Ann. Rev. Immunol., 1983, 1 :569 y Kaerney JF, et al. Chem. Immunol., 1990, 48: 1). Esta clasificación del riesgo ha sido relacionada con un enfoque de cambios de subclones de P. falciparum que expresen diferentes VSA: VSASM (malaria severa); VSAUM (malaria no complicada) y VSAPAM (malaria asociada a la gestación) (Smith JD y Deitsch KW. J. Exp. Med., 2004, 200(9): 1093- 1097 y Rajewsky K y Takemori T. Ann. Rev. Immunol., 1983, 1 :569) que escapan así, a los anticuerpos preexistentes. Este enfoque parasitológico-humoral se focaliza sobre la presión de los anticuerpos para inducir cambios en los parásitos a través de la variación de los VSA. Sin embargo, no se tiene en cuenta la respuesta celular (Thl y CTL) importante en la protección contra la Malaria y que es la que en definitiva produce los anticuerpos que se desean (como expresamos anteriormente), ni tampoco la influencia de los posibles antígenos de malaria que arriban al feto/recién nacido en un ambiente inmunológico no maduro y bajo la influencia de citocinas y/o células T supresoras.
Es de recordar que durante la gestación tanto en murinos como en humanos hay cambios hormonales e inmunológicos que favorecen el cambio de un patrón Thl hacia uno Th2 y que el recién nacido tiene también una mayor producción de citocinas Th2 que Thl (Hassan J y Reen DJ. Immunology Today, 2000, 21 : 107-8). Este cuenta con un sistema inmune inmaduro donde las funciones de las células dendríticas, células presentadoras profesionales, están disminuidas con un subsiguiente déficit en la producción de IL-12 (Goriely S et al. J. Immunol., 2001, 166:2141-6), citocina involucrada en el direccionamiento hacia un patrón Thl y la producción de IFND requeridos para el control de la infección con malaria. También, P. falciparum inhibe la maduración de las células dendríticas (Urban BC, et al. Nature, 1999, 400:71-73). Adicionalmente, en el recién nacido existe neutropenia y déficit de algunos componentes del complemento que pudieran también estar involucrados. La producción de citocinas supresoras como la IL-10 y el TGFp por la placenta infectada junto a células T supresoras han sido reportadas (Suguitan AL, et al. Amer. J Trop. Med. Hyg., 2003,69:574-81 y Stanisic DI, et al. J Immunology 2003,171:5461-5469). La IL-10, la anemia, la baja relación TNFoc/IL-10 y la alta parasitemia son factores de riesgo para la relación madre- feto (Tilg H, et al. J Immunol 2002,169:2204-2209) y la IL-10 también se ha asociado con el incremento de la anemia (Tilg H, et al. J. Immunol., 2002, 169:2204-2209 y Jeans RT Jr. Curr. Hematol. Rep., 2003, 2:116-121). Por ello, la posible transferencia de antígenos por excreción/secreción o parásitos en un micro ambiente supresor puede inducir tolerancia o una respuesta inadecuada a algunos antígenos esenciales para la protección contra la Malaria.
La protección contra la Malaria congénita del recién nacido puede ocurrir por:
1. los anticuerpos derivados de la madre transferidos por vía de la placenta (Edozien JC, et al. Lancet, 1962, 2:951; Akanmori BD, et al. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1995, 89:560, Campell CC, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1980, 29:151, How B, et al. Infect. Immun., 1995 ,63:4034, Branco OH, et al. J. Infec. Dis. 2000, 181 :1746, Bruce-Chwatt I, Nature, 1954, 173:353 y Ferry RJ. Trans. R Soc. Trop. Med. Hyg. 1956, 50:41). En los murinos se plantea que ocurre fundamentalmente por la leche (Halliday R. Proc. R. Soc. London. Ser., 1955, B 144:427). No obstante, nosotros encontramos transferencia por la placenta;
2. la presencia de hemoglobina fetal que hace a los eritrocitos menos susceptibles a la infección (Pasvol G, et al. Nature, 1977 ,270: 171);
3. la ausencia de ácido para-aminobenzóico requerido por el parásito en la leche materna (Hawking F. Br. Med. J., 1954, 1 :1201 y Maegraith BG, et al Br. Med. J., 1952, 2:1382) y
4. la menor exposición a las picadas de los mosquitos (MacDonald G. Trop. Dis. Bull., 1950, 47:915) por el uso de mosquiteros en algunos casos impregnados con insecticidas.
Esta protección puede explicar por qué los niños menores de 6 meses están relativamente protegidos contra la malaria severa, su mortalidad y altas parasitemias asexuales (McGuinness d, et al. Trop. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1998, 92:527). No obstante, en la Malaria ocurre un fenómeno único de secuestro de parásitos en la placenta que puede producir muerte fetal, prematuridad, bajo peso al nacer y niños nacidos muertos. Además, las serias alteraciones de la arquitectura de la placenta pueden favorecer el traspaso de antígenos o parásitos que en presencia de anticuerpos maternos pueden ser eficientemente eliminados. También los inmunocomplejos formados (Desowiz RS. Am. Trop. Med. Parasitol., 1988, 82: 121, Jacoksen PH, et al. Immunology, 1998, 93:264-269 y Kasuhara Y, et al. Int. J. Parasitol., 2000, 24:609-15) podrían estimular la respuesta en un micro ambiente desfavorable. De hecho se ha reportado que estos antígenos producen la estimulación ('priming') T en los recién nacidos (Rasheed FN, et al. Parasite. Immunol. 1995, 17: 1 y Fievet N, et al. Parasite. Immunol., 1996, 18:483, Jacoksen PH, et al. Immunology, 1998, 93:264-269). Si esto ocurre es de esperar que dicha estimulación sea de linfocitos Th2 y no de los protectores, Thl . Evidencias que apuntan hacia ello es la producción de IL-4, además de IFND. tras la sensibilización en el útero (King CH, et al. J. Immunol., 2002, 168:356-364), la producción de IgM e IgE anti Malaria en suero de recién nacidos (Achidi EA and Salimanu LS, Afr. J. Med. Sci., 1997, 26:167-70, Chizzolini C, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1991, 45:57-64, Deloron P, et al. Clin. Exp. Immunol., 1997, 110:212-218, Desowitz RS et al. PNG Med. J., 1992, 35:303-305 y Egwunyenga OA, et al. J. Commun. Dis. 1995, 27:77-83), el aumento de sCD30 e IL13 (Holt PG, et al.Allergy 2000,55:688-97) y el predominio de IgGl en ratones (Malhotra I, et al. J Immunolo 2001, 166:2141-6). Es de recordar que la IL-4, la IgE, el sCD30, la IL-13 y en ratones la IgGl son característicos de una respuesta Th2.
Se sabe que los alérgenos son capaces de atravesar la barrera placentaria (Holt PG, et al. Allergy, 2000, 55:688-97) y junto a los helmintos son los principales inductores de IgE y de un patrón Th2. También se sabe que la respuesta a la inmunización con BCG en niños de madres con helmintiasis está deprimida (Malhotra I, et al. J. Immunol., 2001, 166:2141-6). Aunque la aparición y desarrollo de las alergias está relacionada con factores de tipo ambiental, el papel básico en la propensión del individuo a desarrollar una respuesta Th2/IgE hacia antígenos ambientales, es de orden genético (Holgate ST. J. Allergy Clin. Immunol., 1999, 104: 1139-1146). Esto se traduce en que, la descendencia de padres alérgicos lo será también con una mayor frecuencia que los hijos de padres no alérgicos (esta frecuencia se ha estimado en 75, 50 y 25% si ambos parentales, la madre o el padre son alérgicos, respectivamente). Lo que significa que existe una alta probabilidad de predecir el comportamiento de un individuo dentro de la población y por tanto de ésta, si se tiene un sistema de detección a nivel parental. También es conocido que el afianzamiento del patrón patológico Th2 ocurre en los primeros 6-24 meses de vida del niño y que factores ambientales como la exposición a infecciones bacterianas puede influir de forma positiva en la enfermedad induciendo un patrón Thl, que contraregula el Th2 alérgico (Holt PG. Allergy Clin. Immunol. International, 2000, S 1:83-85). Estos hallazgos dejan entrever la posibilidad de diseñar vacunas anti-alérgicas profilácticas, que prevengan el afianzamiento del patrón Th2 hacia los alérgenos, en la temprana infancia. Estas vacunas podrían estar basadas en el empleo de adyuvantes Thl formulados con los alérgenos que fueran efectivos durante la lactancia. La Cloroquina ha sido y sigue siendo empleada como anti malárico. Este es una droga inmunomoduladora (Ertel W, et al. Blood, 1991, 78: 1781-8 y Landewe R, et al. J. Rheumatol. 1992, 19: 1353-7) por lo que empleada en la quimioprofilaxis o tratamiento durante la gestación pudiera estar incrementando los problemas del recién nacido ya sea por la disminución de la adquisición de anticuerpos (Ibeziako PA y Williams AI. Br. J. Obst. Gynecol., 1980, 87:976-82) o por disminuir la sensibilización ('priming') in útero. Las consecuencias del tratamiento con esta u otras drogas no han sido completamente exploradas.
Los adyuvantes son sustancias que potencian la respuesta inmune específica contra un antígeno provocando una inducción más rápida de ésta y aumentando su duración (Vogel FR. Dev. Biol. Stand., 1998, 92:241-248). La Alúmina continúa siendo el adyuvante más usado en las vacunas parenterales. No obstante, éste no es un potente adyuvante que pudiera ayudar a las nuevas vacunas por subunidades. Se considera que sólo posee propiedades de sistema de reparto, aunque recientemente se ha descrito un nuevo mecanismo de acción independiente de los receptores parecidos a Toll que involucra al Nalp3 (Eisenbarth SC et al. Nature, 2008, 453:1122-1 126). Su utilidad mucosal tampoco ha sido probada y se asume que induce preferentemente una respuesta Th2. Los adyuvantes vacunales licenciados son escasos (MF59, AS02, virosoma, AFPL1, Proteollin, MPL, etc.) y pocos son los de aplicación mucosal (CT, LT, CTB, mutantes de LT (LT63K, LTR72), CpG, Quitosana, ISCOM y AFCol) (Singh M y O'Hagan DT. Pharm. Res. 2002,19(6):715-728, Pérez O et al. Immunology and Cell Biology, 2004, 82:603-610). Solo el CTB ha sido licenciado en humanos en una vacuna contra el cólera.
El empleo de los adyuvantes en las formulaciones vacunales permite reducir la cantidad de antígeno necesaria, dirigir la respuesta hacia un patrón deseado y disminuir el número de dosis requeridas. Nosotros contamos con una plataforma de Adyuvantes basada en Proteo- Cocleatos (AFPL1 y AFCol) derivado de N. meningitidis serogrupo B o similares de otros microorganismos para usar en vacunas parenterales o mucosales. Estos adyuvantes inducen una respuesta preferencial Thl en murinos y humanos por administración parenteral caracterizada por: IgG y subclases Thl anti PL; producción de IFNy, IL-12 e TNFa, respuesta positiva de hipersensibilidad retardada y adicionalmente, la inducción de linfocitos T citotóxicos (CTL) (Pérez O et al. Infecí Immun. 2001, 69(7):4502-4508; Pérez O et al. Immunology and Cell Biology. 2004,82:603-610; Rodríguez, T et al. Vaccine 2005, 26:1312- 21; Pérez O, et al. Scand J Immunology 2007,66:271-77). La acción mucosal del AFCol y el AFPLl también ha sido demostrada por aplicaciones nasales, orales, vaginales y rectales y su producción ha sido extendida a similares derivados de otros microorganismos. Los Proteoliposomas y sus derivados los cocleatos, también se han empleado como adyuvantes como es revelado en WO/2004/047805. La aplicación simultánea de AFCol mucosal y AFPLl parenteral con los antígenos correspondientes induce respuestas potentes (patente OCPI CU/P/2008/215).
Los inventores presentes han encontrado una solución al problema de la malaria en recién nacidos y niños provenientes de madres infectadas con P. falciparum. Estos mueren fundamentalmente de anemia causada por ciclos hemáticos incontrolados, por su incapacidad de desarrollar respuestas inmunes protectoras. Estos reconocen como tolerógenos a los derivados parasitarios que arriban desde la placenta infectada a los fetos/recién nacidos con sistemas inmunes inmaduros. De esta forma los derivados parasitarios no pueden ser reconocidos como antígenos sino como sustancias propias o tolerógenos.
Los inventores presentes han encontrado que en la Malaria la necrosis de la placenta permite un mayor paso de los tolerógenos cuando la infección ocurre al término de la gestación. Esto se debe a la disminución del espesor de la placenta en la etapa terminal de la gestación y con ello a la mayor efectividad de las necrosis a nivel de la placenta para transferir los tolerógenos.
Los inventores presentes han encontrado, en un modelo murino de P. berghei y como ocurre en la causada por P. falciparum, que los signos de malaria (la mortalidad fetal y la materna, los nacidos muertos y los bajo peso al nacer) son más graves si la infección ocurre al final de la gestación, es decir, próximo al parto.
Los inventores presentes han encontrado en un modelo murino de gestantes infectadas con P. berghei la anemia como signo de la Malaria en los recién nacidos y que ésta es incrementada por una nueva reinfección de los recién nacidos.
Los inventores presentes han encontrado que la Malaria congénita, poco frecuente en los humanos, es muy frecuente en un modelo murino de P. berghei.
Los inventores presentes han encontrado que los parásitos y/o sus derivados sirven como tolerógenos en el ambiente fetal/recién nacido inmunológicamente inmaduro conllevando a una respuesta de anticuerpos de clase IgG anti merozoitos disminuida y de un patrón principalmente Th2.
Los inventores presentes han usado los tolerógenos para obtener formulaciones con adyuvantes propietarios potentes inductores de respuesta de linfocitos T auxiliarores (Thl) y citotóxicos (CTL).
Los inventores presentes han encontrado tolerógenos de Malaria formulados con potentes adyuvantes son eficientes al inducir respuestas celulares, Thl en recién nacidos.
La presente invención tiene como objeto usar los tolerógenos trasferidos tempranamente de la madre al feto/recién nacido y formularlos con potentes adyuvantes en particular los derivados de N. meningitidis (AFPL1 y AFCol), inductores de respuestas de Thl y CTL para su uso en vacunas profilácticas o terapéuticas contra infecciones de transmisión vertical, particularmente la Malaria. El empleo de estas formulaciones en edades tempranas revierte el estadio de tolerancia induciendo respuestas protectivas.
El término "transmisión vertical" es usado para denominar las infecciones, antígenos o tolerógenos transferidos de la madre al feto/recién nacido a través de la placenta o durante la lactancia.
El término "tolerógeno" es usado en un sentido inmunológico amplio y nunca será interpretado en un sentido restrictivo a un solo componente. Este puede ser un epitope, una proteína, una glicoprotína, un sacárido, un alérgeno, el merozoito total o alguno de sus componentes o sustancias excretadas/secretadas por microrganismos, en particular por Plasmodium.
El término "tolerancia" es usado en un sentido inmunológico amplio y nunca será interpretado en un sentido restrictivo a la ausencia específica de respuesta inmune. Este término puede interpretarse como ausencia o disminución de respuesta humoral específica; desviación del patrón protectivo Thl hacia uno Th2; presencia de respuesta supresora a nivel de citocinas (tales como IL-10 y/o TGF ) o de células T reguladoras; ausencia de respuesta CTL y no inducción de una adecuada memoria inmune. El término "T reguladoras" es aplicable a las células reguladoras naturales (Trl) o inducibles (Th3, Treg, etc.)
El término "Proteoliposoma (PL)" es usado para nanopartículas obtenidos de bacterias usando cualquier método conocido, como puede ser: su aislamiento sin detergente; un proceso que incluya detergente (como desoxicolato, duodesilsulfato de sodio (SDS), etc.) o la extracción a partir de vesículas ("bleb") de sobrenadantes de cultivos y particularmente los revelados en US 5,597,572. Los PLs contienen diferentes Patrones Moleculares Asociados a Patógenos (PAMP, "pathogen-associated molecular patter'). Estos son estructuras moleculares conservadas entre los patógenos capaces de estimular fuertemente al sistema inmunitario innato, particularmente a las células dendríticas y con ello, inducir una potente respuesta adaptativa. Los PLs también contienen proteínas protectogénicas por lo que son usados no solo como adyuvantes contra antígenos heterólogos, sino también como vacunas. Estos contienen estructuras de la membrana externa de las bacterias; pero para los efectos de esta patente también se consideran los extraídos de otros organismos tales como virus, hongos, protozoos, helmintos o células tumorales. El término AF (Adjuvant Finlay) PL se reserva para el uso del PL como adyuvante.
Por "Cocleato (Co)" se entiende un derivado de un PL que por lo tanto también contiene varios PAMPs según se refiere en la patente (WO/2004/047805, Pérez O et al. Infecí Immun. 2001, 69(7) :4502^1508 y Pérez O et al. Immunology and cell Biology. 2004, 82:603-610). El AFPL1 representa el PL extraído del serogrupo B de N. meningitidis. También, para los efectos de esta patente, el concepto de Co se extiende a la producción de los mismos a partir de combinaciones de lípidos sintéticas con la inclusión de PAMPs que actúen sinérgicamente, los que los diferencia radicalmente de otros Co producidos a partir de lípidos sintéticos y no incluidos en la patente referida anteriormente.
Fue sorprendente encontrar que, contrario a lo que ocurre en las gestantes humanas infectadas con P. falciparum donde sólo un relativamente bajo porcentaje de recién nacidos desarrollan malaria congénita, el 100% de los recién nacidos de murinos (ratones y ratas) gestantes infectadas con P. berghei contenían merozoitos, es decir presentaban malaria congénita.
Fue inesperado reproducir muchos de los signos principales de la Malaria humana (mortalidad materna, abortos, anemia, nacidos muertos y bajo peso) en los modelos murinos (ratones y ratas). Fue sorprendente encontrar mayor frecuencia de signos de Malaria en las gestantes infectadas al final del embarazo en los modelos murinos (ratones y ratas), como también ocurre en las gestantes humanas infectadas con P. falciparum.
Fue sorprendente encontrar mayor gravedad de las infecciones en las embarazas jóvenes que en las adultas en los modelos murinos (ratones y ratas), como también ocurre en las gestantes humanas infectadas con P. falciparum.
Fue inesperado encontrar reducción de la respuesta inmune Thl (producción de IgG2a específica) e incremento de la respuesta Th2 (IgGl específica) en los ratones recién nacidos de madres infectadas.
Fue sorprendente encontrar que el AFPL1 y el AFCol funcionan en recién nacidos e inducen respuesta de memoria en los modelos murinos (ratones y ratas).
Más sorprendente fue encontrar que dichas formulaciones funcionen también por vía mucosal y en aplicaciones mucosales y parenterales simultáneas (unitemporales) en los modelos murinos (ratones y ratas).
La novedad de la invención radica primeramente en demostrar que la malaria durante la gestación produce malaria congénita en murinos en porcentajes muy superiores a los reportados para los humanos.
Es también novedoso que, como en los humanos donde las gestantes jóvenes son las más afectadas y cuando las infecciones ocurren en el tercer trimestre del embarazo; pero sin producir malaria congénita en los recién nacidos, también en los murinos los gestantes jóvenes y aquellas preferentemente infectadas al final del embarazo (a término) son las más afectadas, solo que en éstas sí inducen malaria congénita en la descendencia.
También es novedoso que esta infección se comporte como tolerógenos al disminuir la respuesta de anticuerpos y ser estos de un patrón Th2 (IgGl).
Es también novedoso que las formulaciones conteniendo APCol y AFPL1 y antígenos de malaria induzcan respuesta Thl .
Es también novedoso que las formulaciones conteniendo AFCol y AFPL1 funcionen por vía mucosal e incluso en inmunizaciones unitemporales.
Es también novedoso que las formulaciones conteniendo AFCol y AFPL1 funcionen en neonatos e induzcan también respuesta inmune de memoria en edades tempranas. La solución propuesta tiene las siguientes ventajas:
• La necrosis de la placenta, inducida principalmente; pero no exclusivamente por P. falciparum, permite el paso de merozoitos y sustancias derivados de éstos que inducen tolerancia en vez de estimulación antigénica en los fetos/recién nacidos, que es posible revertiría por inmunizaciones tempranas efectivas.
• Las Formulaciones con los potentes adjuvantes: AFPL1 y AFCol conteniendo antígenos/tolerógenos de Malaria revierten la tolerancia inducida, en edades tempranas, por el traspaso de tolerógenos de las gestantes infectadas con Malaria a los fetos/recién nacidos.
• Las Formulaciones con los potentes adjuvantes: AFPL1 y AFCol conteniendo antígenos/tolerógenos de Malaria inducen un patrón de respuesta inmune Thl y CTL.
• Las Formulaciones conteniendo como adyuvante el AFCol funcionan por vía nasal induciendo respuestas inmunes sistémicas potentes a nivel celular (Thl) y de anticuerpos, así como una respuesta inmune cualitativamente superior caracterizada por respuesta a nivel de mucosas.
• Las Formulaciones con los potentes adjuvantes: AFCol y AFPL1 funcionan en aplicaciones por vía mucosl y parenteral simultáneas (vacunas unitemporales).
• Las Formulaciones conteniendo los potentes adjuvantes: AFPL1 y AFCol son funcionales en edades tempranas (recién nacidos).
• Las Formulaciones conteniendo los potentes adjuvantes: AFCol y AFPL1 pueden ser extendidas a la protección de otras infecciones de trasmisión vertical.
• Otros varios objetivos y ventajas de la presente invención se convertirán en aparentes de las siguientes descripciones de esta invención conjuntamente con las figuras.
La presente invención será descrita a través de los siguientes ejemplos específicos.
Ejemplo 1. Obtención del Proteoliposoma (PL). Para la obtención del PL se realiza un cultivo de N. meningitidis de cualquier serogrupo, particularmente el B, Salmonella Typhi, Vibrio cholerae, Echerichia coli, Shiguella, Salmonella, Bordetella pertusus o Micobacterium tuberculosis y la biomasa colectada mediante centrifugación se somete a un proceso de extracción con detergente, enzimas y ultrasonido. El debris celular es removido mediante centrifugación y el sobrenadante es sometido entonces a digestión con nucleasas para eliminar los ácidos nucleicos. El extracto es recuperado mediante ultracentrifugación, resuspendido en solución con detergente y purificado del resto de los componentes de bajo y mediano peso molecular mediante cromatografía de exclusión molecular. El PL de N. meningitidis serogrupo B así obtenido contiene: porinas (PorA y PorB); trazas de DNA bacteriano y menos del 10% (en relación a las proteínas) de LPS nativo insertado en su estructura; pero nunca libre. Las porinas, el DNA y el LPS presente son PAMPs que interactúan sinérgicamente con los receptores de reconocimiento de patrones desencadenando las señales de peligro a nivel de las células involucradas en la respuesta innata. El producto final es sometido a un conjunto de controles biológicos y físico-químicos. En el caso de que el LPS sea, además de un PAMP, el antígeno de interés este puede incrementarse hasta al menos 35% con relación a las proteínas. Similar procedimiento para obtener estructuras liposomales enriquecidas en proteínas de membrana externa se ha empleado partiendo de virus y protozoos.
Ejemplo 2. Obtención de Cocleato (Co) derivado de Proteoliposoma (PL). Se parte de PL obtenido por los métodos descritos en EP 885900077.8 ó US 5, 597,572. Estos son resuspendidos en solución buffer de Tris-EDTA con 0.5% de desoxicolato de sodio. La concentración de proteínas se determinó por Lowry modificado según Peterson (Peterson GL. Analyt. Biochem. 83, 346, 1977). El contenido de los fosfolípidos que forman el PL es determinado mediante la cuantificación del fósforo inorgánico (Bartlett GR. J. Biol. Chem., 1959, 234, 459-465). Tanto la concentración de las proteínas como la concentración de los fosfolípidos fueron empleadas para establecer las condiciones óptimas y las cantidades de detergentes necesarios para la formación del Co. Se prepara una solución con el PL ajustado a una concentración final proteica de 5-6 mg/mL en tampón Tris-EDTA conteniendo desoxicolato de sodio en una cantidad de 6 a 15 veces la cantidad total de proteínas. Esta solución es filtrada directamente en el dispositivo de diálisis a través de un filtro con tamaño de poro de 0,2 μηι. La diálisis es realizada por agitación rotacional, filtración tangencial, o un sistema cerrado durante 24 h con cambio continuo y lento del tampón de diálisis en el primero, varios lavados en el segundo y incrementos de volúmenes según se requiere en el tercero. Esta última solución consistió en NaCl 50-150 mM, Imidazol 1-4 mM, HEPES 3-5 mM y CaCl 2-7 mM en H20 preparada bajo condiciones de esterilidad que fueron conservadas durante todos los pasos. La formación del Co es comprobada por la formación de un precipitado blanco y la posterior observación microscópica tanto óptica como electrónica. La concentración de proteínas y fosfolípidos es nuevamente estimada y ajustada para los posteriores ensayos. Las propiedades físico-químicas de las proteínas incluidas en el Co son chequeadas y comparadas con las del PL mediante electroforesis en geles de poliacrilamida teñidos con Azul de Coomassie. Adicionalmente, la integridad estructural de estas fue chequeada y comprobada por medio de la metodología de Western Blot.
Ejemplo 3. Prolongación de la gestación en ratas jóvenes infectadas con Plasmodium berghei NK65 cerca de la fecha del parto
Protocolo de infección: la cepa de P. berghei NK65 es mantenida por pases sucesivos en ratones. Posteriormente, esta cepa fue adaptada a ratas. Ratas Spray Dowly hembras jóvenes o adultas, con 7±2 ó 11 semanas de nacidas, respectivamente, fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Luego, éstas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los menos 7, 5 ó 3 días antes de la fecha media de parto en los gestantes controles (22 días). Se consideró la infección en el día -3 con respecto al parto como infecciones a término, es decir tardía. En las ratas se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Las ratas fueron observadas 2 veces al día y se determinó los días de parto. Se considero retardo cuando las ratas parieron al menos un día después de las ratas controles. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.
Resultados: las ratas Spray Dowly no infectadas empleadas como controles parieron a los 22 días de gestadas lo que es característico de esta línea. Todas las gestantes infectadas tempranamente durante la gestación, 7 días antes del parto (7) parieron también a los 22 días. Por el contrario las infectadas posteriormente entre -5 y -3 días se retrasaron en sus partos, particularmente las ratas jóvenes en las cuales el retraso fue de 3 días. Las ratas adultas se retrasaron un solo un día (Tab. 1).
Tab. 1. Prolongación de la gestación en ratas jóvenes infectadas cerca de la fecha del parto
Gestación Día de infección Retardo (días)
-3 3
Jóvenes -5 3
-7 0 -3 1
Adultos -5 1
-7 0
Resumen: la infección con P. berghei tardía durante el embarazo produce retardo del parto lo que es más acentuado cuando las gestantes son jóvenes.
Ejemplo 4. Nacidos muertos en ratas jóvenes infectadas cerca del parto y mortalidad de los recién nacidos en ratas adultas infectadas cerca del parto
Protocolo de infección: Ratas Spray Dowly hembras jóvenes o adultas, con 7±2 ó 1 1 semanas de nacidas, respectivamente, fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, las ratas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los 7, 5 ó 3 días antes del parto. Se consideró la infección en el día -3 con respecto al parto como infecciones a término o tardío. En las ratas se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Las ratas fueron observadas al menos 4 veces al día y se determinó los por cientos de nacidos muertos y la mortalidad de los recién nacidos. Estos se cuantificaron desde el día 1 al 5 de nacidos. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.
Resultados: en las ratas Spray Dowly no infectadas empleadas como controles no se observan nacidos muertos ni mortalidad de los recién nacidos. En las gestantes infectadas tempranamente (-7 ó -5 días antes del parto) no se observaron nacidos muertos. Por el contrario, en las ratas gestantes infectadas a término (-3 días antes del parto) se produjeron nacidos muertos tanto en las ratas adultas (12.5%) como en las jóvenes (75%). No obstante, la mortalidad fue muy superior en las jóvenes. La mortalidad de los recién nacidos ocurrió en las ratas adultas infectadas a término (-3 días antes del parto). La alta cifra de nacidos nuestros explica por qué no se produjo mortalidad en los recién nacidos en las ratas jóvenes infectadas a término (Tab. 2).
Tab. 2. Nacidos muertos en ratas jóvenes infectadas cerca del parto y mortalidad de los recién nacidos en ratas adultas infectadas cerca del parto
Gestación Día de infección Nacidos Mortalidad de
muertos (%) recién nacidos (%)
-3 75 0
Jóvenes -5 0 0
-7 0 0 -3 12.5 43
Adultos -5 0 0
-7 0 0
Resumen: la infección con P. berghei tardía durante el embarazo produce alta mortalidad particularmente en las ratas gestantes jóvenes así como mortalidad de los recién nacidos. Ejemplo 5. Ratas jóvenes infectadas a término tuvieron recién nacidos de bajo peso
Protocolo de infección: ratas Spray Dowly hembras jóvenes o adultas, con 7±2 ó 11 semanas de nacidas, respectivamente, fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, las ratas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los 7, 5 ó 3 días antes del parto. Se consideró la infección en el día -3 con respecto al parto como infecciones a término o tardía. En las ratas se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Las ratas fueron observadas al menos 4 veces al día y se determinó los pesos en gramos (g) de los ratones nacidos vivos. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.
Resultados: en las ratas Spray Dowly no infectadas empleadas como controles los pesos de los recién nacidos fueron superiores en las gestante jóvenes que en las adultas. La infección en las gestantes adultas no alteraron en ningún caso el peso de sus recién nacidos. Por el contrario las gestantes jóvenes infectadas a término (-3 días antes del parto) si redujeron el peso de los recién nacidos (Tab. 3).
Tab. 3. Ratas jóvenes infectadas a término tuvieron recién nacidos de baj
Gestación Día de infección Peso nacidos vivos ± ED (g)
-3 5.26 ± 0.45
Jóvenes -5 7.23 ± 0. 83
-7 8.79 ± 0.65
Control 8.18 ±0.46
-3 5.96 ± 0.89
Adultos -5 5.88± 0.56
-7 5.48 ± 0.32
Control 6.67 ± 0.65 Resumen: la infección con P. berghei NK65 a término durante el embarazo reduce el peso de los recién nacidos.
Ejemplo 6. Las ratas jóvenes infectadas a término presentaron mortalidad materna
Protocolo de infección: ratas Spray Dowly hembras jóvenes o adultas, con 7±2 ó 1 1 semanas de nacidas, respectivamente, fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, las ratas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los 7, 5 ó 3 días antes del parto. Se consideró la infección en el día -3 con respecto al parto como infecciones a término o tardía. En las ratas se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Las ratas fueron observadas al menos 4 veces al día y se determinó la ocurrencia de mortalidad materna. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.
Resultados: en las ratas Spray Dowly no infectadas empleadas como controles así com en las gestantes adultas infectadas en diferentes días no se observó mortalidad materna. Tampoco se presentó mortalidad materna en las gestantes jóvenes infectadas a los -7 ó -5 días. Por el contrario, las gestantes jóvenes infectadas a término (-3 días antes del parto) si ocurrió mortalidad materna (Tab. 4).
Tab. 4. Ratas jóvenes infectadas a término tuvieron mortalidad materna
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Resumen: la infección con P. berghei tardía durante el embarazo produce alta mortalidad las gestantes jóvenes. Ejemplo 7. Malaria congénita en recién nacidos de madres infectadas
Protocolo de infección: Ratas Spray Dowly hembras fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, las ratas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los -7, -5 ó -3 días antes del parto. En las ratas así como en su descendencia se determinó la infección por examinación microscópica de su sangre. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.
Resultados: Todos los recién nacidos de madres infectadas en cualquier momento de la gestación tuvieron malaria congénita, es decir tenían merozoitos en su sangre. Resumen: El 100% de los recién nacidos de madres infectadas tubo malaria congénita.
Ejemplo 8. Presencia de anemia en los recién nacidos de madres infectadas.
Protocolo de infección: ratas Spray Dowly hembras fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, las ratas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los -7, -5 ó -3 días antes del parto. En las ratas se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Los recién nacidos de madres infectadas o sanas fueron infectados también con P. berghei NK65 a los 5 días de nacidos por vía intraperitoneal. Un grupo proveniente de madres infectadas no fue infectado y este se uso como control. La anemia se expreso en por cientos. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces. Resultados: Se observó anemia en el 18% de los hijos de madres infectadas con P. berghei NK65, la que aumento hasta el 50% cuando los recién nacidos fueron reinfectados con la misma cepa (Fig. 1).
Resumen: La malaria congénita induce anemia en los recién nacidos y esta es incrementada por la reinfección. Ejemplo 9. Potente respuesta Thl inducida por formulaciones de péptidos de malaria y los Adyuvantes Finlay administrados por vía intramuscular o intranasal en recién nacidos con inducción de memoria.
Protocolo: Péptidos de P. falciparum fueron formulados con AFPL1 o AFCol. Ratones Balb/c de 7 días de nacidos fueron inmunizados intramuscularmente con AFPLl+péptido en 2 dosis intramusculares espaciadas 14 días; con AFCol +péptido en 3 dosis intranasales espaciadas 7 días o con una aplicación simultánea por ambas vía. La respuesta en saliva y en suero anti peptídica fue evaluada a los 7 y 21 días posteriores a la última dosis. Una dosis de refuerzo posterior a los 3 meses de inmunizados fue aplicada para evaluar la memoria inmune inducida.
Método de Extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: la extracción de sangre se realizó a los 28 días de nacidos a través de una ligera incisura en la cola. Las muestras de sangre obtenidas se incubaron durante 1 h a 37°C, posteriormente se centrifugaron a 2000 g durante 10 min para extraer el suero. Detección de IgG anti merozoitos por ELISA:
Reactivos y Soluciones:
Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 11 mM, NaHC03 35 mM (pH 9.6) Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1% (p/v)
Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0, 1%): SSTF, Tween 20 al 0,1% (v/v), pH 7.4) Solución de dilución de las muestras (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0,1%)
Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO, EUA)
Solución tampón Sustrato, STS (Na2HP04 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6))
Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología:
• Se añade 100 μί/ροζο de antígenos de merozoitos purificados a una concentración de 10 μ^Γηί, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 4°C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con SSTF
• Se añade 100 μΙ7ροζο de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda
• Se lava tres veces con solución de lavado
• Se aplican 100 μΙ7ροζο por duplicado de las diluciones de los sueros individuales y se incuban 2 h a 37°C
• Se lava tres veces con Solución de lavado
• Se adicionan 100 μΙ7ροζο del conjugado anti IgG diluido 1 :2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con Solución de lavado
• Se añade 100 μΙ7ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0.01% (v/v) y del cromógeno orí/zo-fenilendiamina (OPD) 0.6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΐ, de una solución de detención. La medición de absorbancia en densidad óptica (DO) se realiza a 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus)
Método de Extracción y procesamiento de la saliva: la extracción de saliva se realizó a los 7 días después de la última dosis. Para la toma de muestras de saliva, se estimuló la salivación en los animales con la aplicación intraperitoneal de 50 μΐ. por ratón de pilocarpina al 0.5% (Imefa, Cuba). Las muestras se mantuvieron sobre hielo durante la extracción y se inactivaron inmediatamente a 56°C durante 15 min. Seguidamente fueron centrifugadas a 14000 g durante 15 min a 4°C, se colectó el sobrenadante y se almacenaron a -70°C hasta su uso.
Detección de IgA anti péptido por ELISA:
Reactivos y Soluciones:
Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 11 mM, NaHC03 35 mM (pH 9.6) Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2) Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1% (p/v)
Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0.1 %): SSTF, Tween 20 al 0.1% (v/v), pH 7.4) Solución de dilución de las Muestra (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0.1%)
Anti-IgA (R5-140) de ratón biotinilado conjugado a peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO, EUA) Estreptavidina-peroxidasa (Sigama, St. Louis, MO, EUA)
Solución tampón Sustrato, STS (Na2HP04 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6))
Solución de detención: H2S04 2 M.
Saliva Estándar de Anticuerpos: Como estándar interno de anticuerpos, para los ensayos de IgA anti PL, se empleó una curva elaborada con muestras de saliva de ratones hiper inmunes.
Metodología:
• Se añade 100 μί/ροζο de péptido a una concentración de 10 μg/mL, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 4°C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con SSTF.
• Se añade 100 μί/ροζο de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• La Saliva Estándar de Anticuerpos y las salivas a evaluar se diluyeron 1 :2 en Solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de las diluciones de los sueros individuales y del suero de referencia y se incuban 2 h a 37°C.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Se adicionan 100 μΙ7ροζο del conjugado anti IgA a una concentración de 2 μg/mL en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Posteriormente, se añade un segundo conjugado (estreptavidina-peroxidasa) en una dilución 1 :2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 30 min a 37°C
• Se lava cinco veces con Solución de lavado
• Se añade 100 μΙ7ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0.01% (v/v) y del cromógeno ort/zo-fenilendiamina (OPD) 0.6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min. • La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΐ. de una solución de detención
• La medición de la absorbancia (DO) se realiza a una lectura de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Resultados: Se indujo respuesta sistémica de IgG anti péptidos por ambas vías de inmunización y se indujo respuesta de IgA específica en saliva por la inmunización nasal. Adicionalmente, la aplicación simultánea por ambas vías también indujo respuesta sistémica y mucosal. Una dosis a los 3 meses de nacidos (memoria) incremento ambas respuestas inmunes.
Resumen: Las formulaciones adyuvadas inducen respuestas inmunes sistémicas y mucosales y de memoria en los ratones recién nacidos.
Ejemplo 10. Menor IgG anti merozoitos en los recién nacidos de madres infectadas con P. berghei Protocolo de infección: ratones Balb/c hembras fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, éstas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los -3 días antes del parto. En las gestantes y en su descendencia se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Un grupo de gestantes no fue infectado y su descendencia se empleo como control. Estos fueron infectados P. berghei N 65 a los 5 días de nacidos por vía intraperitoneal. Se tomaron muestras de sangre de los recién nacidos y se extrajo su suero. En estos se evaluaron la respuesta de IgG anti merozoitos inducidas por ELISA. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.
La respuesta de IgG anti péptido fue evaluada como se describe en el ejemplo 9.
Resultados: los recién nacidos de madres infectadas presentaron menores respuestas de IgG anti merozoitos que los infectados nacidos de madres sanas.
Resumen: los recién nacidos de madres infectadas reconocen menos la infección por P. berghei que los recién nacidos sanos infectados, es decir son tolerantes. Ejemplo 11. Alteración del patrón de reconocimiento a nivel de subclases de IgG anti merozoitos en los ratones recién nacidos de madres infectadas con P. berghei
Protocolo de infección: como en los ratones está más claro los patrones Thl/Th2 a nivel de subclases los experimentos para determinarlos se realizaron en ratones Balb/c hembras. Estas fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, se infectaron con P. berghei NK65 a los -3 días antes del parto. Se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre tanto en las gestantes como en su descendencia. Un grupo de gestantes no fue infectado y su descendencia se empleo como control. Estos fueron infectados P. berghei NK65 a los 5 días de nacidos por vía intraperitoneal. Se tomaron muestras de sangre de los recién nacidos y se extrajo su suero. En estos se evaluaron la respuesta de IgGl a IgG2a anti merozoitos inducidas por ELISA. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.
Método de Extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: Se procedió según se describe en el ejemplo 9. Detección de Subclases IgGl e IgG2a anti merozoitos por ELISA: Reactivos y Soluciones:
Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 11 mM, NaHC03 35 mM (pH 9.6) Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)
Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1 % (p/v)
Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0.1%): SSTF, Tween 20 al 0.1% (v/v), pH 7,4) Solución de dilución de las Muestra (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0.1%)
AcM de carnero anti IgGl y anti IgG2a de ratón biotinilado (Amersham, LIFE SCIENCE) Estreptavidina-peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO, EUA)
Solución tampón Sustrato, STS (Na2HP04 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6))
Solución de detención: H2S04 2 M.
Metodología: • Se añade 100 μΤ/ροζο de PL a una concentración de 20 μg/mL, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 4°C en cámara húmeda
• Se lava tres veces con SSTF.
• Se añade 100 μί/ροζο de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Los sueros a evaluar se diluyen 1 : 100 en Solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de las diluciones de los sueros y se incuban 2 h a 37°C.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti IgGl de ratón o anti IgG2a diluido
1:2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda.
• Se lava tres veces con Solución de lavado.
• Posteriormente, se añade un segundo conjugado (estreptavidina-peroxidasa) en una dilución 1 :2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incubó 30 min a 37°C
• Se lava cinco veces con Solución de lavado
• Se añade 100 μΕ/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y del cromógeno ortAo-fenilendiamina (OPD) 0,6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min.
• La reacción se detiene mediante la adición de 50 ¿L de una solución de detención
• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una lectura de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).
Los resultados de IgGl e IgG2a anti PL fueron expresados como densidad óptica (DO). En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor 0.25 de DO
Resultados: en los recién nacidos de madres infectadas predominó la respuesta de IgGl (Th2) mientras que en los descendientes de gestantes sanas que fueron infectados después de nacer se detectó también respuesta de IgG2a (Thl) anti merozoitos.
Resumen: se demuestra alteración de la respuesta Thl protectora contra la malaria en los descendientes de madres infectadas. Ejemplo 12. Inducción de respuesta Thl por formulaciones de antígenos de merozoitos de Plasmodium berghei formulados con potentes adyuvantes revierten la tolerancia en recién nacidos de madres infectadas
Protocolo: ratones Balb/c de 10 días de nacidos (recién nacidos) de madres infectadas fueron inmunizados con las formulaciones de AFPLl+antígenos de P. berghei o AFCol+ antígenos de P. berghei aplicadas en dos dosis espaciadas 14 días. Se uso también un grupo control proveniente de madres sanas. Se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre antes del comienzo de las inmunizaciones. Se tomaron muestras de sangre de los recién nacidos a los 21 días de la última dosis y se extrajo su suero. En estos se evaluaron la respuesta de IgGl a IgG2a anti antígenos de P. falciparum inducidas por ELISA. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.
Resultados: los ratones controles provenientes de madres no infectadas indujeron respuesta de IgG2a contra los merozoitos de P. berghei. De igual forma los provenientes de madres infectadas también indujeron un patrón Thl (IgG2a). Resumen: las formulaciones con antígenos adyuvados fueron capaces de revertir la tolerancia de los recién nacidos provenientes de madres infectadas.

Claims

TOLEROGENOS ADYUVADOS COMO VACUNA DE MALARIA Reivindicaciones
1. Formulaciones vacunales para la inmunización de mamíferos contra tolerógenos que empleen potentes adyuvantes que evoquen respuesta inmunes celulares (Thl y CTL) y sus correspondientes anticuerpos que rompan la tolerancia inducida por transmisión vertical de tolerógenos al ser administrados por vía parenteral y/o mucosal.
2. Formulaciones vacunales según reivindicación 1, donde el tolerógeno provenga de Malaria, un alérgeno u otra infección de transmisión vertical.
3. Formulaciones vacunales según reivindicación 2, donde la Malaria sea producida por el género Plasmodium, particularmente P. falciparum o P. vivax.
4. Formulaciones vacunales según reivindicación 3, donde el tolerógeno sea el Merozoito o uno de sus constituyentes o derivados.
5. Formulaciones vacunales según reivindicación 4, donde el constituyente sea una proteína, un fosfolípido, un sacárido o cualquiera de sus combinaciones.
6. Formulaciones vacunales según reivindicación 2, donde el alérgeno provenga de un ácaro, un polen o derivados de animales en forma natural o recombinante.
7. Formulaciones vacunales según reivindicación 1, donde el adyuvante sea el AFCol, el AFPL1 u otro adyuvante que induzca una respuesta inmune Thl y CTL o funcione por vía mucosal. Uso de las formulaciones vacunales donde se empleen simultáneamente o independientes la vía mucosal y la parenteral.
Método de tratamiento caracterizado porque comprende la aplicación de formulaciones vacunales conteniendo tolerógenos adyuvados.
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