BRPI1015788B1 - principais domínios e epítopos imunoprotetores da nucleosídeo hidrolase de leishmania (l.) donovani para uso em vacinação - Google Patents

Abstract

principais domínios e epítopos imunoprotetores da nucleosídeo hidrolase de leishmania para uso em vacinação, imunoterapia e diagnóstico a inovação ora proposta trata da identificação das sequências principais da proteína nucleosideo hidrolase de leishmanía (l) donovani, a serem incluídas numa vacina recombinante ou de dna ou sintética, para gerar proteção e proteção cruzada contra as ieishmanioses, também trata da identificação dos epitopos principais que reagem com anticorpos a serem utilizados para imunodiagnostico das ieishmanioses e sua aplicação na proteção cruzada contra outros microrganismos que tem sequência em comum das suas nucieosideo hidrolases.

Description

[001] A presente invenção trata da identificação das sequências principais da proteína Nucleosídeo hidrolase de Leishmania (L) donovani a serem incluídas numa vacina recombinante ou de DNA ou sintética, para gerar proteção e proteção cruzada, contra as leishmanioses humanas e caninas. Também trata da identificação dos epítopos principais que reagem com anticorpos e células do sistema imune a serem utilizados para imunodiagnóstico das leishmanioses, para controle da transfusão sanguínea, para controle do bloqueio da transmissão. A invenção também tratada aplicaçãodos domínios imunogênicos e/ou epítopos da Nucleosídeo hidrolase de Leishmania donovani (NH36) na proteção cruzada contra outros microrganismos que tem nas suas Nucleosídeo hidrolases seqüências comuns com a Nucleosídeo hidrolase de Leishmania donovani.

Descrição do Estado da Técnica [002] As leishmanioses são enfermidades causadas por protozoários intracelulares do gênero Leishmania. Em 1903, William Leishman e Charles Donovan descreveram, na índia, a existência do agente etiológico da leishmaniose, a partir da observação de lâminas post-mortem de baços de soldados que tinham morrido com quadros febris sugestivos de malária, porém sem demonstração dos plasmódios (Ross, 1903). As leishmanioses são doenças endêmicas e epidêmicas em muitas áreas tropicais, subtropicais e no Mediterrâneo, causadas por mais de 20 espécies e transmitidas a humanos por aproximadamente 30 espécies diferentes de insetos flebotomíneos (Pearson

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2/43 &Sousa, 1996), apresentando 4 principais quadros clínicos: a cutânea, a mucocutânea, a visceral ou calazar e a dérmica pós-calazar.

[003] Na leishmaniose cutânea, geralmente o paciente apresenta uma ou várias úlceras ou nódulos na pele. Em pacientes imunocompetentes as úlceras curam espontaneamente, porém, lentamente, podendo deixar cicatrizes desfigurantes. Na leishmaniose muco-cutânea, os pacientes sofrem de ulcerações progressivas destrutivas da mucosa, que se estendem do nariz e da boca em direção à faringe e laringe. Estas lesões não se auto curam, sendo a Leishmania (L) braziliensis o agente responsável por muitos casos de leishmaniose muco-cutânea (Kedzierski, L; Zhu, Y. &Handman, E.; 2006).

[004] A leishmaniose visceral por outro lado, é uma doença sistêmica e fatal se não tratada logo após o aparecimento de sintomas. Existem dois tipos de leishmaniose visceral, que diferem nas suas características de transmissão: a leishmaniose visceral zoonótica, cuja transmissão ocorre via animal - vetor - homem; e a leishmaniose visceral antroponótica cuja transmissão ocorre via homem - vetor - homem. O homem é o hospedeiro ocasional e os animais, principalmente cães e canídeos, são os reservatórios do parasita (Alvar et al., 2004). A leishmaniose zoonótica é encontrada nas áreas de transmissão da Leishmania (L.) infantum/ Leishmania (L.) chagasi enquanto que a leishmaniose visceral antroponótica é encontrada nas áreas de transmissão da Leishmania (L.) donovani (Zijlstraef al., 2003). A leishmaniose dérmica pós-calazar é caracterizada por uma mácula, mácula-papular ou “rash” nodular e constitui uma complicação da leishmaniose visceral frequentemente observada depois do tratamento de casos humanos no Sudão e mais raramente em outras áreas do leste africano e na índia. Também pode ocorrer em indivíduos imunossuprimidos em áreas endêmicas de L. (L.) infantum. Os casos de leishmaniose dérmica pós-calazar são altamente infecciosos devido a grande quantidade de parasitas existentes nas lesões nodulares, e tais casos são os reservatórios de leishmaniose visceral antroponótica nos ciclos

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3/43 epidêmicos (Addy & Nandy, 1992). Nas leishmanioses viscerais zoonóticas os reservatórios são os canídeos.

[005] As leishmanioses são infecções endêmicas em 88 países, sendo 72 destes, países em desenvolvimento. Estima-se que exista uma prevalência de 12 milhões de casos de leishmaniose no mundo atualmente (OMS, 2010). O número de novos casos anuais de leishmanioses é estimado em 1,5 milhões dos quais 500.000 são de leishmaniose visceral. Noventa por cento dos casos de leishmaniose visceral são registrados em Bangladesh, índia, Nepal, Sudão e Brasil, enquanto que 90% dos casos de leishmaniose cutânea são encontrados no Afeganistão, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria (OMS, 2010). No Brasil, aproximadamente 90% dos casos humanos de leishmaniose visceral se concentravam no Nordeste até 1993. Em 2002, 64,02% dos casos correspondem ao Nordeste sendo que a epidemia se estendeu pelo Norte (14,12%), Centro-Oeste 8,22% e Sudeste (13,63%) do país (MS-SINAN, 2003). O Brasil declarou um total de 50.060 casos clínicos de leishmaniose visceral entre 1990 e 2006 que representaram 90% de todos os casos reportados nas Américas. Enquanto que a média de números de casos humanos de VL anuais nos anos 80 era 1.500, um aumento foi registrado entre os anos 2000 e 2006 quando a média observada foi de 3.362 casos por ano (Romero & Boelaer, 2010).

A LEISHMANIOSE VISCERAL NO MEDITERRÂNEO E NAS AMÉRICAS: CICLO DO PARASITA, QUADRO CLÍNICO, DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO [006] A leishmaniose visceral é causada por: Leishmania (L.) donovani e a Leishmania (L.) infantum no Velho Mundo e a L. (L.) chagasi nas Américas. A leishmaniose visceral humana nas Américas e no Mediterrâneo é uma zoonose de canídeos. Os parasitas são transmitidos de raposas e canídeos silvestres a cães peridomiciliares e destes aos seres humanos nos ambientes domiciliares, através de picadas de insetos flebotomíneos. No Mediterrâneo, a doença é causada por L. (L.) infantum e o principal vetor é o

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Phlebotomus perniciosus. Entretanto, no Novo Mundo, a doença é causada por L. (L.) chagasi e é transmitida pelo inseto flebotomíneo Lutzomya longipalpis (Guargaet al., 2000). A emergência da leishmaniose visceral zoonótica (LVZ) constitui um severo e preocupante problema de Saúde Pública.

[007] Recentemente, caracterizou-se a identidade da L. (L.) infantum e da L. (L.) chagasi mediante o estudo e o auxílio de técnicas enzimáticas e genéticas concluiu-se que as diferenças entre amostras de L. (L.) infantum e de L. (L.) chagasi de diversas procedências são muito restritas. Desse modo, L (L.) chagasi passa a ser sinônimo de L. (L.) infantum (Maurício et al., 2000).0 ciclo biológico do parasita é heteroxênico, desse modo, durante o seu desenvolvimento apresenta dois estágios: uma forma flagelada extracelular denominada promastigota (móvel e alongada com 10-20 pm), que se desenvolve no hospedeiro invertebrado dos gêneros Lutzomya (Novo Mundo) e Phlebotomus (Velho Mundo); e uma forma amastigota (esférica com diâmetro de 3-7 pm de diâmetro), que prolifera dentro de fagolisossomo de macrófagos dos hospedeiros vertebrados. Os promastigotas são inoculados na pele do hospedeiro vertebrado, juntamente com a saliva, no momento da picada do vetor e são fagocitados por células do sistema monocítico fagocitário (macrófagos, monócitos, neutrófilos e células dendríticas), diferenciando-se em formas amastigotas. Os parasitas intracelulares se multiplicam por divisão binária e chegam a romper os macrófagos infectados. Ao romper a célula, tais formas são liberadas para infectar outros macrófagos e fagócitos, assumindo uma localização final, na pele, no baço, no fígado, na medula óssea e nos linfonodos. O ciclo se fecha quando outros flebotomíneos picam os reservatórios vertebrados e ingerem as formas amastigotas. Finalmente, os amastigotas atingem o tubo digestivo do vetor, onde após passarem por várias etapas diferenciam-se em promastigotas infectivas (Awasthi, 2004).

[008] A leishmaniose visceral é a forma mais grave da doença, sendo sua evolução gradual e podendo atingir crianças e adultos. Trata-se de

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5/43 uma doença crônica e frequentemente letal se não for tratada logo após o aparecimento dos primeiros sintomas. A leishmaniose visceral também é conhecida pelas seguintes denominações: febre de Dum-Dum ou esplenomegalia tropical, na índia; calazar infantil ou anemia esplenomegálica, na Bacia do Mediterrâneo; e calazar, leishmaniose visceral, calazar americano ou neotropical, nas Américas (Handman, 2001). O período de incubação leva geralmente entre dois e 6 meses e pacientes com leishmaniose visceral apresentam sintomas e sinais de infecção sistêmica persistente incluindo febre, fadiga, fraqueza, perda de apetite e perda de peso. A invasão parasitária no sangue e no sistema fagocítico é difundida para os linfonodos, baço e fígado. A febre é usualmente associada a tremores e calafrios e pode ser intermitente. A fadiga e fraqueza são agravadas pela anemia que é causada pelo persistente estado inflamatório, destruição periférica de eritrócitos e algumas vezes por sangramentos. Conforme a doença avança, a esplenomegalia pode aumentar, causando distensão abdominal e dor que é, às vezes, aumentada por concomitante hepatomegalia. Os sintomas geralmente persistem por várias semanas e meses antes do paciente procurar cuidados médicos ou morrer de co-infecção, hemorragias ou anemia severa (revisado por Chappuiset al., 2007).

[009] A co-infecção de Leishmania e HIV têm ocasionado reativação da doença em pacientes assintomáticos ou em pacientes considerados curados de leishmaniose. Isso indica que o parasita pode ser considerado um oportunista, o que geralmente causa resistência ao tratamento, assim como, aceleração no progresso da AIDS (Roberts et al., 2000).

[0010] O diagnóstico da leishmaniose visceral depende muitas vezes do histórico epidemiológico e clínico do paciente, sendo estes requisitos básicos no diagnóstico diferencial. Sinais e sintomas de co-infecção bacteriana tais quais pneumonia, diarréia ou tuberculose podem gerar confusão no diagnóstico. Entretanto, muitas outras doenças tropicais apresentam

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6/43 quadros semelhantes, por exemplo, malária e esquistossomose. A pesquisa direta dos parasitas pode definir o resultado, para isso, pode ser realizada a punção principalmente de medula óssea ou mais raramente, de baço, seguidas de coloração das lâminas com o corante de Giemsa e observação ao microscópio das formas amastigotas (Herwaldt, 1999). Embora a especificidade seja alta, a sensibilidade de microscopia varia, sendo mais alta para aspirados de baço (93-99%) que para medula (53-86%) ou linfonodo (53-65%) (Young, S„ 1939; Ho, E.A.; Soong, T.H. & Li, Y„ 1948; Siddig et aí, 1988; Zijlstra et aí, 1992; Babiker et aí, 2007). Este método é muito agressivo e penoso para o paciente, que pode sofrer complicações como hemorragias (aproximadamente 0,1% dos indivíduos) e por isso requer consideráveis conhecimentos técnicos (Kager & Rees, 1983). Apesar disso, a punção de medula óssea é ainda o padrão ouro requerido pelos médicos. A sorologia é extremamente útil para a triagem de casos e também em inquéritos epidemiológicos (Badaró, 1983; Palatnik de Sousa et aí, 1995; Aoun et al., 2009; Moreno et aí, 2009; Mohapatra et al., 2010). Técnicas moleculares, como PCR, são mais sensíveis que microscopia, mas são técnicas que permanecem restritas a hospitais e centros de pesquisa (Reithinger & Dujardin, 2007; Leite et aí, 2010). A dosagem de proteínas e a eletroforese do soro, com alteração da relação albumina/globulina e hipergamaglobulinemia acentuada, são sugestivas. Outros exames como hemograma acusando anemia, leucopenia, monocitose e linfócitos e são auxiliares no diagnóstico (Boelaert et aí, 2004).

[0011] O diagnóstico precoce é de fundamental importância nos casos de calazar, pois quanto mais precoce, melhores são as perspectivas de sucesso na terapia e a diminuição de casos fatais é esperada. Outro fator importante é a existência de indivíduos na população com infecção subclínica. Estes indivíduos podem ser doadores assintomáticos de sangue infectado com Leishmania gerando o calazar transfusional (Palatnik de Sousa et aí, 1996; Lê Fichouxet a/., 1999).

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7/43 [0012] O tratamento contra a leishmaniose é bastante difícil e desconfortável para o paciente. Os antimoniais pentavalentes, antimoniato de meglumina (Glucantime) e estibogluconato de sódio (Pentostan), foram as primeiras drogas a serem utilizadas na terapia e continuam até os dias atuais como terapia de escolha no tratamento da leishmaniose visceral. Tais drogas são utilizadas por mais de 70 anos, exigem hospitalização para a administração endovenosa e promovem muitas reações adversas (arritmias cardíacas, pancreatite aguda) (Murray, 2004; Collinet al., 2004). Pacientes menores de dois anos ou maiores de 45 anos com doença avançada e má nutrição são pacientes de alto risco de morte durante a terapia com antimoniais. Com o aumento do número de casos de leishmaniose visceral começaram a aparecer resistência ao tratamento e recidivas da doença. De fato, os antimoniais pentavalentes começaram a apresentar ineficácia em 5-10% dos casos no Brasil (Schmunis & López Antunano, 1997) e em 50-65% dos casos na índia (Maltezou, 2010), havendo necessidade de novas estratégias terapêuticas para combater a doença.

[0013] Assim, o uso de Anfotericina B e a Pentamidina foi introduzido na terapia. A anfotericina B lipossomal é considerada a melhor droga contra leishmaniose visceral e está sendo usada como primeira escolha de tratamento na Europa e Estados Unidos. O envoltório lipossomal reduz a sua toxicidade. Porém o seu alto preço levou a sua exclusão como terapia nos países em desenvolvimento (Gradoni, L.; Gramiccia, M & Scalone, A.; 2003; Bem etal., 2006). Muitas terapias, novas, têm sido sugeridas, chegando a mais de 60 tratamentos testados (revisado por Murray, 2004). Um aminoglicosídeo denominado Paromomicina, também tem sido testado nas regiões do Quênia, índia e Sudão, e tem apresentado bons resultados (cerca de 95% de cura) com menor toxicidade (revisado por Murray 2004). A Miltefosina (Hexadecilfosfocolina) originalmente desenvolvida como um agente antineoplásico, é uma droga oral que apresenta propriedades anti-Leishmania,

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8/43 porém demonstra toxicidade gastrointestinal, aumento dos níveis de enzimas hepáticas e creatinina. Além disso, é uma droga teratogênica (Berman, 2005). O aumento do uso de Miltefosina para tratamento da leishmaniose canina na Europa pode ter provocado o desenvolvimento da resistência à droga em L.(L.) infantum. A combinação de terapias é sugerida para aumentar a eficácia do tratamento, prevenir o desenvolvimento de resistência às drogas, reduzir o tempo de tratamento e seu custo Bryceson, 2001).

Formas de controle da doença [0014] Conforme recomendações da Organização Mundial da Saúde, o controle epidemiológico da leishmaniose é baseado em três medidas (Tesh, 1995):

1) Detecção e tratamento de casos humanos: Promove a redução de morbidade e de mortalidade.

2) Sacrifício ou tratamento de cães e canídeos: Baseia-se nos aspectos clínicos e na sorologia dos animais (Tesh, 1995; Courtenay et al., 2002; MSSINAN, 2003; Palatnik de Sousa et al., 2004). Esta forma de controle somente é praticada atualmente no Brasil.

3) Controle do vetor: Combate aos flebotomíneos adultos e larvas. O uso de inseticidas no interior de residências visa reduzir o ciclo peridoméstico e desse modo, a transmissão do parasita, porém esse efeito é apenas temporário, além de ocorrer resistência ao inseticida com o uso prolongado (Tesh, 1995).

[0015] No entanto, com o ressurgimento da leishmaniose visceral e sua importância evidente na Saúde Pública, faz-se necessário o desenvolvimento de novas armas de combate à doença. Uma vacina humana não está disponível apesar da intensa pesquisa e o atual tratamento quimioterápico é altamente tóxico (revisado por Palatnik-de-Sousa, 2008).

[0016] O controle epidemiológico, entretanto, ainda se baseia no sacrifício de cães infectados, tendo sido criticado pela sua falta de eficácia (Costa & Furtado Vieira, 2001). Modelos matemáticos (Dye, 1996)

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9/43 descritos para transmissão de leishmaniose visceral determinaram que o sacrifício dos cães infectados não causa impacto no decréscimo da população canina infectada e indicam que o desenvolvimento de uma vacina humana e/ou canina constituiría uma forma eficiente de se controlar a doença. Tais modelos matemáticos utilizam um sistema de equação diferencial. A ineficácia da prática da remoção canina somente ocorre com os valores baixos da variável κ (índice de remoção de cães infecciosos pela campanha de controle), que coincide com os valores baixos de soro positividade detectados no campo, pelo uso de testes pouco sensíveis ou grande demora entre a detecção e a remoção dos animais. Aplicando os valores maiores de κ, o controle se tornaria eficaz (Courtenay et al., 2002; Palatnik de Sousa et al., 2004). A variação do valor de Kinfluencia no R_oque é a taxa intrínseca reprodutiva. O R_o indica a taxa de contágio, ou o número de casos novos gerados por um indivíduo infectado ao entrar numa população de indivíduos suscetíveis. Quando o valor de R_o= 1 a epidemia se interrompe (R_o= (Οοαοσ)/(δ + κ)(σ + δ + κ)) (Dye 1996, Palatnik-de-Sousa et al., 2004).

[0017] A vacinação é considerada a ferramenta de melhor custo-benefício no controle de doenças infecciosas. Várias vacinas têm sido muito eficientes no controle de infecções, e algumas têm levado à completa erradicação de doenças como a varíola ou na quase completa erradicação como a poliomielite (Paul, 2005). As leishmanioses, portanto, certamente poderíam ser controladas por uma vacina. Uma vacina “ideal” anti-Leishmania teria os seguintes requisitos: ser segura; acessível para as populações em necessidade; induzir resposta celular CD4+ e CD8+ e memória imunológica que possa ser estimulada por infecção natural; ser efetiva contra mais de uma espécie de Leishmania', proteger indivíduos em áreas onde leishmaniose cutânea e visceral coexista; possuir estabilidade físico-química e ser uma vacina profilática e terapêutica (Kedzierski et al., 2006)

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Imunidade na leishmaniose visceral [0018] A cura em todas as formas de leishmaniose é influenciada pela resposta imune celular capaz de ativar macrófagos e eliminar o parasita. Em experimentos com camundongos deficientes em células T, eles rapidamente sucumbiram à doença após inoculação com algumas das várias espécies de Leishmania, e a transferência de células T normais conferiu resistência aos animais (revisado por Tripathi et al., 2007). Os linfócitos T CD4+, portanto, são cruciais para resistência à doença, entretanto os linfócitos T CD8+ parecem participar mais na geração de resposta imune de memória do que como células efetoras envolvidas na eliminação dos parasitas (revisado por Tripathi et al., 2007 e revisado por Palatnik-de-Sousa, 2008). Na leishmaniose visceral, não foi descrita associação de IL-4 com doença ativa, entretanto níveis mantidos de IFN-γ e uma direta correlação entre aumento de IL-10 e doença ativa causada por Leishmania donovani foram detectados (revisado por Palatnik-de-Sousa, 2008). No modelo murino de leishmaniose visceral, células específicas de resposta TH2 e células apresentadoras de antígenos estão envolvidas na supressão de resposta de células T. A resposta de intradermorreação é suprimida em camundongos, cães e humanos, mas é recuperada após a cura. Macrófagos medeiam à supressão celular que leva ao aumento da carga parasitária e também estão vinculados à apresentação defeituosa de antígenos ou inibição da expressão de moléculas de MHC classe I e II (revisados por Palatnik-de-Sousa, 2008). A imunossupressão em camundongos está relacionada com o aumento da expressão de TGF-β, IL-10 e a possível participação de células regulatórias CD4+CD25+. Existem dois receptores para moléculas B-7: o CD28 para a ativação de células T (TH1) e o CTLA-4 para término da ativação das células T. O bloqueio do CTLA-4 induz resistência à infecção, sugerindo que a expressão de CTLA-4 possui um papel importante em manter as células T CD4+ irresponsivas durante a leishmaniose visceral no modelo murino (Gomes et al., 1998; revisado por Palatnik-de

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Sousa, 2008). A expressão de CTLA-4 resulta na secreção de TGF-β que promove o crescimento de parasitas dentro dos macrófagos (Gomes, N. A. & Dos Reis, G.A., 2001; revisado por Palatnik-de-Sousa, 2008).

[0019] A interação de células dendríticas e linfócitos T no compartimento linfóide periarteriolar (PALS) do baço determina o sucesso da imunidade celular. As células dendríticas migram para os PALS em resposta a um gradiente de quimiocinas CCL21 e CCL19, produzidas por células endoteliais dos PALS que se ligam no receptor CCR7 das DCs (Ato et al., 2002). Defeitos nessa migração provocam alterações da microarquitetura do baço que resultam em produção defeituosa de TNF-α. A infecção por L. (L.) donovani é capaz de alterar a natureza dos microcompartimentos linfóides, pois embora o número de células dendríticas esplênicas esteja aumentado, elas falham em localizar os PALS em decorrência de uma diminuição da expressão de CCL21 e CCL19 e da expressão defeituosa do receptor CCR7 determinando a imunossupressão na leishmaniose visceral (Ato et al., 2002).

[0020] As citocinas formam uma rede complexa de interações de sinergismo e antagonismo, que não somente induzem, mas também controlam a resposta imune. IFN-γ e IL-12 são citocinas clássicas de resposta TH1, e são diminuídas durante a leishmaniose visceral aguda, acompanhada de altos níveis de IL-10. Recentemente a IL-10 tem sugerido ter um papel em contrabalançar a polarização de resposta que pode se desenvolver seguindo para a cura. O paradigma TH1 e TH2 tem sido usado como estratégia para a seleção de antígenos no desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose (revisado por Tripathi et al., 2007). Antígenos que estimulem predominantemente resposta TH1 têm sido aceitos como potenciais antígenos protetores para LV. Por outro lado, antígenos que predominantemente estimulem resposta TH2 são menos interessantes como candidatos a vacina, por estarem associados com a patologia (revisado por Tripathi et al., 2007).

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12/43 [0021] A citocina TNF desempenha um papel central na defesa contra infecções intracelulares e é responsável pela promoção de diferentes aspectos da resposta imune inata tal como o recrutamento de células inflamatórias e a diferenciação celular (revisado por Korner et al., 2010). Esta citocina geralmente exibe atividades pró-inflamatórias corroborantes com os estágios iniciais da resposta inflamatória; e tem sido demonstrado que ela é especialmente importante durante a infecção com patógenos. A exemplo disso, camundongos TNF -/- com leishmaniose fatalmente morrem. O TNF é produzido predominantemente por macrófagos logo após o desafio e está envolvido na resposta imune com um papel central na defesa contra patógenos intracelulares (revisado por Korner et al., 2010). Em outros estudos de leishmaniose visceral experimental, onde se bloqueou o TNF in vivo pela administração de anticorpos anti-TNF, houve exacerbação do curso da doença resultando no aumento da carga parasitária no fígado (Tumang et al., 1994). Por outro lado, a razão TNF-a/IL-10 é maior em pacientes humanos com leishmaniose visceral pós-dérmica do que com leishmaniose visceral ativa (calazar) (Ansari etal., 2008).

[0022] Foi observado que a participação de fatores inerentes à imunidade inata, de receptores “Toll-like”, de células natural “killer” da IL-1-α e fator de diferenciação mielóide 88 (Hawn et al., 2002) é importante na resistência precoce contra a infecção e imunidade adquirida contra as leishmanioses (Cooler & Reed, 2005). O TLR-4 tem demonstrado contribuir no controle do crescimento dos parasitas e ambas as respostas, inata e adquirida, contra infecção por Leishmania (Kropfeta/., 2004). A contribuição da imunidade inata em humanos com leishmaniose visceral também foi recentemente descrita (Peruhype-Magalhães etal., 2005).

Vacinação contra leishmaniose [0023] A pesquisa de vacinas contra a leishmaniose foi iniciada há muitos anos. A primeira vacina contra a leishmaniose foi

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13/43 desenvolvida pelo Professor Adler da Universidade hebraica de Jerusalém, Israel, que observou que as mães do Líbano expunham os braços de suas crianças à picada de flebótomos porque elas intuitivamente sabiam que o desenvolvimento de auto-cura de uma única primeira lesão podería protegê-las da doença severa no futuro (revisado por Palatnik-de-Sousa, 2008). Portanto, esta antiga prática era usada para inocular indivíduos não infectados com material infeccioso de lesões, nas regiões do corpo onde a cicatriz podería ser escondida. Depois do estabelecimento das condições de crescimento de formas promastigotas em cultura, a leishmanização tornou-se ultrapassada em Israel e na Rússia e mais tarde evoluiu para o uso das vacinas de primeira geração (revisado por Palatnik-de-Sousa, 2008).

[0024] A primeira geração de vacinas contra a leishmaniose foi obtida por manipulação de parasitas mortos com ou sem adjuvantes, tendo sido utilizadas em testes clínicos em populações humanas nas áreas endêmicas contra a forma cutânea da doença principalmente (Antunes et al., 1986; Convit et al., 1987; Vélez et al., 2000), e mais recentemente contra a forma visceral (Khalil et al., 2000).

[0025] A segunda geração de vacinas pode ser dividida em três categorias de acordo com sua composição: vacinas vivas contendo genes de Leishmania ou usando Leishmania geneticamente modificada ou vírus expressando genes de Leishmania (Cruz, et al, 1991; Souza et al., 1994; Titus et al., 1995; Selvapandiyan et al., 2004; Selvapandiyan et al., 2006, Ramiro et al., 2003); vacinas de frações ou subunidades recombinantes ou sintéticas definidas (Russo et al., 1991; Skeiky et al., 1995; Gurunathan et al., 1997; Rafati et al., 2002; Coler et al., 2002; Gradoni et al., 2005; Badaró et al., 2006; Poot et al., 2006; Coler et al., 2007; Moreno et al., 2007) e vacinas com frações parcialmente purificadas (Palatnik etal., 1989; Jaffe etal., 1990; Jardim et al., 1991; Lemerse et al., 2005).. As vacinas de 3^a geração contêm genes de antígenos clonados em um vetor de promotor eucariótico injetado e traduzido

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14/43 diretamente no músculo (Xu&Liew, 1994; Handman, 2001; Ramiro et al., 2003; Aguilar Be et al., 2005; Rafati et al., 2005; Gamboa-León et al 2006). Mesmo com tantos avanços nos estudos baseados em formulações vacinais, ainda não se tem disponível uma vacina contra a leishmaniose visceral humana utilizada em rotina clínica. Alguns antígenos promissores candidatos à vacinas de 3^a geração são: LACK (Gurunathan, etal., 1997; Gurunathan, et al., 1998; Ramiro et al., 2003; Melby et al., 2001), LeIF, TSA, LmSTH (Campos-Neto et al., 2002), Cpa+CPb (Rafati et al., 2005), KMP11 (Basuet al., 2005) e NH36 (Gamboa-León etal., 2006).

[0026] Destacam-se os antígenos exaustivamente testados em modelos pré-clínicos e que já foram testados em ensaios clínicos: Leish 111 (LeIF+TSA+LmSTH) (Fujiwara et al., 2005); LACK (Ramiro et al., 2003); CPb (Rafati et al., 2002); CPb+CPa (Poot et al., 2006) e NH36 (Borja Cabrera et al., 2009). Enquanto as vacinas tradicionais induzem a formação de anticorpos, resposta imune celular, resposta citotóxica e apresentam perigo de reversão para a virulência, as vacinas recombinantes ou de DNA não induzem nenhuma dessas respostas. A razão dessa diferença é a presença de antígenos non-self microbianos nas vacinas tradicionais que funcionam como adjuvantes naturais: LPS, Lipídio A, Monofosforil Lipídio A, Peptidoglicanas, ácidos micólicos e seqüências CpG não metiladas, entre outros. A adição de adjuvantes não é necessária, portanto, em muitas vacinas de primeira geração embora ela seja fundamental para a obtenção de uma resposta contra os antígenos recombinantes (vacina de segunda geração). Esses adjuvantes são reconhecidos como antígenos “non-self” conservados de microrganismos e se denominam PAMPs (Pathogen Associated Microbial Patterns). Na superfície de células apresentadoras de antígenos (APCs), os PAMPs interagem com os seus receptores específicos (Toll-Like 1-9, receptor para manose, etc), ativando uma resposta de citocinas e quimiocinas que induz um aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias (B7, CD40) resultando numa

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15/43 potencialização do estímulo para linfócitos T CD4 (Singh &O’Hagan, 2003). Uma ótima resposta imune é aquela desenvolvida pelo sistema imune inato e bons adjuvantes são aqueles que ativam o sistema imune inato. O papel dos adjuvantes é importante, portanto, em vacinas contendo antígenos purificados, recombinantes ou vacinas de DNA.

Adjuvantes [0027] O termo adjuvante é oriundo do latim adjuvare que significa ajudar (Voguel, 1998), constituindo-se em compostos adicionados a antígenos imunogênicos que imunopotencializam a resposta imune contra os mesmos. Esses compostos vêm sendo usados para melhorar a eficácia de vacinas desde a década de 1920 (Cox & Colter, 1997). A pesquisa por novos adjuvantes tem sido crescente nos últimos anos, uma vez que eles aumentam a eficácia de antígenos purificados, recombinantes ou sintéticos. Adjuvantes podem ser usados para aperfeiçoar a resposta imune em antígenos vacinais de diversas maneiras: aumentando a imunogenicidade de antígenos fracos, a velocidade e duração da resposta imune; modulando a avidez, especificidade, isótipos ou a distribuição de subclasses de anticorpos; estimulando a imunidade celular, promovendo a indução de imunidade de mucosa, reduzindo a dose do antígeno e assim o custo da vacina (Singh &O’Hagan, 1999). Infelizmente, a ação de um adjuvante potente é geralmente correlacionada com o aumento de toxicidade. O desafio, então, na pesquisa por adjuvantes é o ganho de potência enquanto minimiza-se a toxicidade. A dificuldade de atingir este objetivo é refletida no fato de que alumina, apesar de ter sido inicialmente descoberta a mais de 80 anos, ainda mantém o domínio de uso em humanos (Petrovsky & Aguilar, 2004).

[0028] A classificação dos adjuvantes pode ser baseada na sua natureza química, propriedades químicas e físicas, capacidade de estimular a resposta Th1 ou Th2, ou ainda pela capacidade de estimular a imunidade inata ou adaptativa (Marciani, 2003).

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16/43 [0029] Os adjuvantes então, simulando os antígenos “nonself” infecciosos, facilitam a geração e aumento da expressão dos sinais coestimulatórios na superfície de APCs, como por exemplo: as famílias de ligantes B7, os ligantes CD40 e citocinas mediadoras.

[0030] Dois sinais simultâneos são necessários para a estimulação eficiente das células T. Ao mesmo tempo em que as APCs apresentam o antígeno processado via MHCII aos receptores TCR dos linfócitos, os ligantes B7 se ligam aos CD28 na superfície dos linfócitos fazendo a co-estimulação, o que resulta na ativação das células T. As células T ativadas expressam um novo receptor, o CTLA-4, que se liga com alta afinidade ao B7 bloqueando-o, e assim regulando a ativação de células T (Marciani, 2003). Alguns estudos revelam que os ligantes B7-1 promovem uma maior ativação de linfócitos TH1 e que os ligantes B7-2 promovem a ativação de linfócitos TH2 (Marciani, 2003).

Saponinas:

[0031] São moléculas complexas de alto peso molecular, que se apresentam sob a forma de conjugados naturais de triterpenos, esteróides ou glico-alcalóidesesteroidais com uma ou mais cadeias de açúcares (Osbourn, 1996a; Osbourn, 1996b). O termo saponina faz referência à sua propriedade clássica detergente, que por sua vez, está relacionada com a natureza anfipática da molécula (uma porção glicídica que é hidrofílica e uma aglicona ou sapogenina que é hidrofóbica). São substâncias bastante utilizadas em vacinas veterinárias (Borja-Cabrera et al., 2002; Morein et al., 2004; Schettersef al., 2006) e humanas (Slovinef al., 2005; Ragupathief al., 2003). Destacam-se pela capacidade de induzirem potente resposta Th1, aumentarem os níveis de lgG2a, IFN-γ e IL2. Um dos mecanismos de ação propostos é que as saponinas se intercalam nas membranas celulares através da sua fração hidrofóbica ocasionando a formação de poros, o que facilita a apresentação do antígeno pela via MHC-1 e assim, promovem o aumento da resposta CTL.

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Também foi descrito que a presença do grupo aldeído no C-4 permite que a saponina mimetize o ligante B7 aumentando o estímulo de APCs sobre linfócitos helper CD4 (TH1) (revisado por Marciani, 2003; Singh & 0'Hagan, 2003). As saponinas de Quillajasaponaría que são conjugados de duas porções glicídicas associadas aos C-3 e o C-28 de um núcleo triterpênico, apresentam duas características peculiares que as tornam muito potentes: a presença de um grupo aldeído (CHO) no C-4 e a presença de normoterpenos no C-28 do triterpeno (Marciani, 2003). Na superfície de células apresentadoras de antígenos o grupamento aldeído da molécula co-estimulatória B7 interage com aminas da superfície de linfócitos formando bases de Schiff. Essa interação desencadeia a transmissão de um sinal que estimula a resposta TH1 (Marciani, 2003). Assim, foi proposto que os aldeídos das saponinas Quillajasaponaría agem como análogos da família de moléculas co-estimulatórias, ligantes B7, na superfície de células apresentadoras de antígenos, formando também e de forma independente bases de Schiff (Marciani, 2003). Por outro lado, o normonoterpeno ligado ao C-28 é responsável pela toxicidade e pela resposta citotóxica (CD8) induzida pelo tratamento com as saponinas (Marciani, 2003).

[0032] A Quil-A é uma mistura de saponinas da Quillajasaponaría Molina que contém: a QS-7, QS-17, QS-18 e QS-21 (Kensil et al., 1991). A saponina QS-21 mostrou-se a mais potente de todas na produção de anticorpos (lgG2b e lgG2a), sendo menos letal para camundongos, e também como forte adjuvante em testes clínicos fase I e II em humanos, contra HIV-1, malária e melanoma e contra pneumococos em indivíduos idosos (Ragupathi et al., 2010). A capacidade da saponina QS-21 de estimular respostas TH1, TH2 e também resposta CTL contra antígenos exógenos, faz dela ideal para uso em vacinas contendo subunidades, e vacinas contra patógenos intracelulares, assim como vacinas terapêuticas contra o câncer (revisado por Sun et al., 2009).

ISCOMs:

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18/43 [0033] São partículas de 40 qm compostas de colesterol, fosfolipídios e saponinas de Quillajasaponaría Molina. Essa preparação reduz a toxicidade destas saponinas, diminuindo sua ação hemolítica (revisado por Singh & O’Hagan, 2003 e por Morein et al., 2004). No ISCOM a saponina encontra-se ligada ao colesterol e não interage livremente com as membranas celulares. Está estabelecido que os ISCOMs induzem resposta Th1 e Th2 e de citocinas pró-inflamatórias (Cox et al., 2006). Os ISCOMs têm sido estudados em vários modelos animais e uma vacina contra Influenza eqüina, usando ISCOMs, está licenciada na Suíça (revisado por Singh & O’Hagan, 2003; Morein et al., 2004; Cox et al., 2006). Os ISCOMs podem ser usados através das vias oral, respiratória e vaginal (Anderson, 1996). São particularmente efetivos na ativação de imunidade celular e citotóxica (Kensil, 1996), mas, geralmente tem problemas com estabilidade e toxicidade.

A VACINA FML-SAPONINA [0034] No intuito de obter uma ferramenta de controle contra a leishmaniose visceral desenvolvemos a vacina FML-saponina. Tratase de uma vacina de segunda geração composta por um complexo glicoprotéico isolado de L. (L) donovani e a saponina Riedel de Haen (R) como adjuvante. O potencial da vacina FML na imunoprofilaxia contra o cal azar foi demonstrado em camundongos e hamsters (Santos et al., 1999 e 2002) comparando os diversas adjuvantes: Alumina, BCG, Saponina R, QuilA, QS-21, IL-12. Os grupos tratados com saponinas (R, QuilA e QS-21), desenvolveram a melhor proteção (93,73 e 79 %, respectivamente) (Santos et al., 1999 e 2002). Em ensaios de Fase III para avaliar a eficácia da vacina FML em cães sadios e soronegativos, foram detectados 92-95 % de proteção específica contra o calazar no grupo vacinado (76-80 % de eficácia vacinai) (da Silva et al., 2000; Borja-Cabrera et al., 2002). As respostas de IDR e sorológica mantiveram-se positivas e altas assim como o PCR negativo, até 3,5 anos após a vacinação

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19/43 (Borja-Cabrera et al., 2002). A vacina FML induziu no campo, portanto, um efeito protetor duradouro e significante contra a leishmaniose visceral canina. Durante o período, o número de casos de calazar humano na região diminuiu (Borja-Cabrera et al., 2002). O possível potencial imunoterápico da vacina FML em cães com infecção sub-clínica foi também recentemente demonstrado (Borja-Cabrera et al. 2004). Cães vacinados quando soropositivos e ainda assintomáticos, permanecem sadios e não infecciosos quatro anos após a vacinação (Borja Cabrera et al., 2004). A vacina FML canina foi a única vacina de segunda geração incluídas para apresentação de resultados no “4th Meeting IDR-WHO on Second Generation Vaccine for Leishmania (Dumonteil, E.; Mc-Mahon-Pratt, D &Price, V.L., 2001) e foi posteriormente industrializada e licenciada no Brasil para uso na profilaxia de cães contra o calazar, sob o nome de Leishmune ® (Borja Cabrera et al., 2010).

[0035] O estudo do adjuvante da vacina Leishmune® revelou que a saponina da Riedel de Haen é uma mistura extraída da Quillajasaponaría Molina (Palatnik de Sousa et al., 2004) cujos componentes ativos são a saponina QS21 e saponinas deaciladas (Oliveira-Freitas et al., 2006), ambas contendo aldeídos. Diferente do reportado na literatura (Marciani, 2003), as saponinas deaciladas, isentas da fração hidrofóbica normonoterpeno, estimularam a resposta imune celular e foram protetoras (Oliveira-Freitas et al., 2006).

[0036] Por conter a saponina QS21, a Leishmune®induz 15,9% de reações de inchaço no local da injeção [1]. Estas são reações inflamatórias locais e espontaneamente reversíveis associadas à presença de dor e, portanto indesejadas no desenvolvimento de qualquer vacina. Por outro lado, foi observado que as saponinas menos tóxicas, após tratamento químico, também perdem em potencial adjuvante e protetor.

[0037] Estudos recentes sobre a via endógena proinflamatória indutora de resposta TH1 dependente de IL-12 revelaram que a

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20/43 bradicinina é um potente sinal de maturação para células dendríticas induzindo a resposta TH1 (Scharfsteinet al., 2007). A bradicinina é liberada do bradicininogênio pela ação de proteases que se ativam em resposta aos sinais de dano tissular. Estes sinais podem ocorrer durante a resposta inflamatória originada pela vacinação com QS21. Normalmente, a bradicinina ativa as células dendríticas imaturas através da ligação com os seus receptores B1R e/ou B2R acoplados a proteína-G. Nossos resultados preliminares indicaram que a saponina QS21 pode gerar cininaspro-inflamatórias no local da injeção da vacina, que contribuem parcialmente no seu potencial adjuvante e na proteção gerada contra a leishmaniose visceral (Nico etal., 2007).

[0038] Testes em cães de área endêmica com a vacina Leishmune® demonstraram 96,7% de proteção, dois anos após a vacinação (Borja Cabrera et al., 2005), e ausência de toxicidade (Parra-López et al., 2006). Cães de áreas endêmicas, vacinados com Leishmune® não são infecciosos para flebótomos, demonstrando ausência de reações de imunohistoquímica para Leishmania, e PCR negativos para DNA de Leishmania em sangue e linfonodos (Nogueira et al., 2005). A vacina Leishmune® também se comporta como uma TBV (“transmission blocking vaccine” ou vacina bloqueadora da transmissão), sendo que os anticorpos gerados pela vacina em cães, bloqueiam a ligação do parasita na membrana intestinal do flebótomo vetor Lutzomyia longipalpis, impedindo a sua replicação. O inseto então não transmite a infecção para um novo hospedeiro (Saraiva et al., 2006). Por outro lado soros de cães naturalmente infectados aumentam a percentagem de infecção e o número de parasitas nos flebótomos (Palatnik de Sousa et al., 2008). As vacinas bloqueadoras da transmissão, não protegem diretamente o indivíduo vacinado, porém, conferem proteção a população interrompendo a epidemia (UNDP/World Bank/WHO, 2000). A vacina FML-saponina e Leishmune® com concentração aumentada do adjuvante saponina demonstrou

Petição 870190010971, de 01/02/2019, pág. 35/72 /43 o potencial imunoterápico no calazar canino natural e experimental (BorjaCabrera et al., 2004; Santos et al., 2002).

[0039] Recentemente detectou-se uma redução de 66,1 % em Belo Horizonte e 80,2% em Araçatuba na incidência de leishmaniose canina entre cães vacinados quando comparados com a incidência global de cada cidade. (Borja-Cabrera et al., 2008). O impacto do uso da vacina Leishmune® já é notado na redução da incidência de casos caninos e humanos da doença em Belo Horizonte e Araçatuba (Palatnik de Sousa et al., 2009). Analisamos o possível efeito aditivo da vacinação preventiva com Leishmune® sobre a remoção de cães pela campanha de controle, na diminuição da incidência da leishmaniose visceral canina (LVC)e da leishmaniose visceral humana (LV) em duas áreas endêmicas, de 2004 a 2006. Em Araçatuba a foi visto um declínio de 25% na incidência de LVC e de 61% na de LV (de 36 para 14 casos). Em Belo Horizonte (BH), onde 8.1% (12113/149470) dos cães foram vacinados até o final de 2006, os distritos mais vacinados (85.7% das doses) exibiram declínios ou níveis estáveis de LVC e LV, enquanto que os menos vacinados (14.3% das doses), mostraram aumentos de LVC e LV. Nos distritos com maior vacinação, os casos humanos diminuíram em 36.5% caindo fora do IC95% dos distritos menos vacinados (IC95% 2.23-21.11) que mostraram um aumento médio de 11.67% e incidências caninas muito aumentadas (24.48-328.57%). A diminuição de casos caninos (p=-0.008) e humanos (p=-0.048) está diretamente correlacionada com o aumento do número de cães vacinados, confirmando o efeito aditivo da vacinação com Leishmune® sobre o controle por sacrifício canino, reduzindo o reservatório parasitário, protegendo cães, e desta forma, reduzindo o risco de transmissão de LV a humanos e se tomando uma nova ferramenta de controle eficaz (Palatnik de Sousa et al., 2009). Uma aumento da cobertura vicinal certamente contribuiría para a interrupção da epidemia.

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22/43 [0040] A vacina Leishmune® gera anticorpos anti-FML que são sim reconhecidos pelo ensaio de ELISA contra antígeno FML, porém não são reconhecidos pelos ensaios de ELISA o IF contra lisado de L chagasi usados para controle epidemiológico [69]. Em um inquérito epidemiológico total realizado em Campo Grande (MS) em 2007 foram analisados um total de 100.000 cães. Entre eles 5860 cães tinham sido vacinados com Leishmune®. Apenas 76 dos 5860 foram positivos nos testes de ELISA e IF oficiais representando 1.3% do total apenas. Desta forma a utilização da vacina Leishmune® não interfere com o controle de Saúde Pública (Palatnik de Sousa etal., 2009).

A GLICOPROTEÍNA GP36 DE L.(L.) DONOVANI [0041] Paralelamente ao desenvolvimento da vacina FML, identificamos dentro do complexo FML, a glicoproteína GP36, que é o antígeno marcador para o diagnóstico do calazar em humanos (Palatnik de Sousa et al., 1996) e um marcador da doença ativa em cães (Santana et al., 2002).A banda glicoproteica de 36kDa presente no FML, é reconhecida unicamente pelos soros de pacientes com Calazar, tomando esta glicoproteína o antígeno específico marcador para o diagnóstico do Calazar em humanos (Palatnik-deSousa et al., 1996). A GP36 mostrou-se ser o antígeno dominante do FML, presente na superfície de formas promastigotas e amastigotas, reconhecido por soro de coelho e por 22 anticorpos monoclonais do tipo IgG obtidos em camundongo Balb/c. A integridade da porção glicídica foi necessária para a sua reatividade contra os monoclonais testados (Palatnik-de-Sousa et al., 1993).A GP36 foi a única banda do FML reconhecida especificamente por soros de pacientes com leishmaniose visceral ativa (Palatnik de Sousa et al., 1996). Sendo que a soro positividade no teste de FML-ELISA é usada para controle de qualidade de transfusão sanguínea para leishmaniose visceral, a GP36 e

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23/43 suas frações poderão ser utilizadas para controle de qualidade de sangue para transfusão.

[0042] Entre os açúcares componentes da GP36 foi revelada a presença de fucose (10%), manose (27%) e glicose (63%). A análise dos derivados metilados revelou estar composta por resíduos de fucose 3-0 e 4-O-ligados assim como uma predominância de resíduos de manopiranose 4-0 substituída, além de resíduos tri-metilados de galactose. A porção carboidrato da GP36 é relevante na sua antigenicidade (Palatnik de Sousa et al., 1993). A vacinação de camundongos com GP36 nativa isolada por “T cellblott” e eluição química e saponina da Riedel De Haen (Paraguai de Souza et al., 2001), revelou 68,1% de proteção significativa na diminuição da carga parasitária. Em relação ao subtipo de imunoglobulinas predominante no soro, ocorreu um aumento do teor de IgG total apenas nos animais vacinados, com elevação significativa dos níveis de lgG1, lgG2a e lgG2b, correlacionada com os resultados de redução de carga parasitária no fígado (Paraguai de Souza et al., 2001).

[0043] A porção protéica da GP36 foi clonada em E. coli. Trata-se de uma Nucleosídeo hidrolase (NH36) de 34kDa que apresentou 95% de identidade com a de L. (L.) major (Santana et al., 2002). Resultados preliminares de vacinação murina com a NH36 e saponina e do estudo do seu potencial imunogênico na resposta imune celular de camundongos revelam o seu possível uso numa vacina recombinante (Aguilar-Be et al., 2005).

[0044] Uma vacina de DNA foi obtida clonando o gene da NH36 no plasmídio VR1012 (Aguilar-Be et al., 2005). O plasmídio VR1012 tem um promotor de Citomegalovírus e um sítio de resistência a kanamicina. Esta vacina de terceira geração induziu uma forte resposta protetora de caráter TH1 contra a infecção por L.(L) chagas! e infecção heteróloga por Leishmania (L.) mexicana no modelo murino. A sua potência protetora foi maior que a da vacina contendo a NH36 recombinante e saponina (Aguilar-Be et al., 2005). A

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24/43 mesma vacina demonstrou seu efeito imunoterápico no modelo murino, reduzindo a carga parasitária e aumentando a sobrevivência dos animais (Gamboa-León et al., 2006).

[0045] Quando usada na profilaxia canina, a vacina de DNA gerou proteção significativa evidenciada através da: maior proporção de reações de IDR positivas e de maiores diâmetros; da proporção aumentada de linfócitos CD4+ Leishmania-específicos e do decréscimo de scores acumulados de sintomas (Boirja-Cabrera et al., 2009). No caso da vacina aplicada para imunoterapia, os cães infectados e vacinados posteriormente desenvolveram aumentos significativos de tamanhos e proporções das reações de IDR e das proporções de linfócitos T CD4+ anti-NH36 que reconheciam o domínio Cterminal da NH36. Aumentos nas razões de anticorpos lgG2/lgG1 contra o domínio N-terminal da NH36 e nas proporções de linfócitos TCD4+ antidomínio C-terminal e CD8+ anti-N-terminal foram também detectados. Três dos seis animais vacinados e apenas dois dos sete controles sobreviveram até o final do experimento (dia 576). As mortes no grupo controle começaram mais cedo. Cinco dos sete controles e apenas dois dos seis cães do grupo de imunoterapia morreram com alta carga parasitária nos linfonodos sugerindo que a vacina de DNA NH36 contribuiu para a redução da infecção e aumentou a sobrevivência (Santos FB et al., 2011) [0046] Recentemente, foi proposto o primeiro modelo por homologia para a Nucleosídeo hidrolase de Leishmania donovani (França et al., 2008) construído a partir das estruturas das Nucleosídeo hidrolases de Crithidia fasciculata (Parkin et al., 1991) e de Leishmania major (Schi et al., 1999).

Vacinas sintéticas [0047] Vacinas sintéticas baseadas em peptídeos que representam epítopos imunogênicos possuem vantagens sobre as vacinas

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25/43 tradicionais, sendo compostas de antígenos quimicamente definidos, apresentando baixo custo e sendo livres de efeitos deletérios (Jeonef al., 2002). Ao contrário das vacinas tradicionais com microorganismos vivos, inativados ou atenuados as vacinas sintéticas não revertem para a virulência em indivíduos imunocomprometidos, e ao contrário das vacinas genéticas, não envolvem questões éticas. Vacinas sintéticas anticâncer contendo os carboidratos expostos por células tumorais (Zhu et al., 2009) e vacinas de peptídeos e glicopeptídeos contra bactérias (Kao & Hodges, 2009) e fungos (Xinef al., 2009) foram testadas em estudos pré-clinicos. Vacinas de peptídeos antimalária passaram por testes clínicos em humanos (Patarroyo 1987; Bermúdez et al., 2007) e uma vacina de proteína conjugada a polissacarídeo antimeningite foi licenciada para crianças (Vérez-Bencomo et al., 2004). Ambos, os peptídeos sintéticos (Jeon et al., 2002; Kao & Hodges 2009; Patarroyo et al., 1987; Bermúdez et al., 2007) e os peptídeos com epítopos de polissacarídeos fúngicos para células T helper (Xin et al., 2009) são eficientes antígenos de vacinas sintéticas.

[0048] Não obstante a baixa imunogenicidade de peptídeos sintéticos, uma vacina sintética contendo um epítopo de 17 aminoácidos do pilus tipo IV de Pseudomonas aeruginosa superou o potencial protetor da proteína nativa do pilus que contém 115 aminoácidos (Kao & Hodges, 2009). Apesar da potencial restrição predita para alguns fenótipos de MHC ou HLA (Parra-López et al., 2006), um epítopo de 20 aminoácidos universal para células T helper de Plasmodium falciparum evoca em voluntários imunizados, resposta de células T restritas por muitos alótipos HLA-DR, liga-se a múltiplas moléculas de HLADR e HLA-DQ In vitro e evoca células T helper em camundongos de diversas origens genéticas (Parra-López et al., Calvo-Calleef al., 1997; Moreno etal., 1993).

[0049] Com o crescimento de populações imunocomprometidas nas quais as vacinas vivas atenuadas podem reverter

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26/43 para virulência (Greensfelder, 2000), aumenta o interesse por vacinas com antígenos e adjuvantes quimicamente definidos que podem atender melhor aos padrões das agências regulatórias e são mais fáceis e mais baratas de produzir (Zauner et al., 2001). Desse modo, no intuito de conhecer melhor o mecanismo pelo qual as vacinas contendo a Nucleosídeo hidrolase NH36 induzem proteção, surge a necessidade de desenvolvimento de uma vacina sintética (Zauner et al., 2001), composta pelos epítopos mais importantes da molécula acompanhados de um potente adjuvante definidos. Uma vez conhecidos os epítopos principais indutores de resposta imune humoral e celular contra Leishmania, formulações otimizadas destes epítopos poderão ser sintetizadas, evitando os inconvenientes de uma possível toxicidade de vacinas recombinantes geradas em bactérias, ou de uma possível incorporação do DNA de vacinas de plasmídeos no DNA do ser humano ou animal vacinado.

Uma vacina sintética que contivesse o maior número de peptídeos derivados da Nucleosídeo hidrolase, que fossem reconhecidos pelos linfócitos CD8+ e CD4+, além de um bom adjuvante, seria, portanto, uma formulação ideal (Doolan et al., 2003). A menor avidez dos complexos peptídeo-MHC classe II pelos receptores de células T e a baixa frequência em que células CD4+ antígeno-específicas são encontradas a respeito das células CD8+, tem dificultado o uso de peptídeos MCH classe II para estudar as respostas CD4+ ex vivo. Nas doenças parasitárias, a identificação do peptídeo imunodominante para linfócitos CD4+ permanece como um desafio (Doolan et al., 2003). Este também é o caso da leishmaniose visceral, na qual a imunidade protetora em cães se tem mostrado mediada por células CD4+ (Guarga et al., 2000). Para ser efetiva na proteção contra leishmaniose visceral, vacinas de subunidades precisam incluir epítopos para células T capazes de evocar resposta imune protetora.

Identificação de epítopos para o desenvolvimento de vacinas sintéticas de SUBUNIDADES

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27/43 [0050] Para identificar os epítopos de células T que interessam incluir numa determinada vacina, várias estratégias vêm sendo usadas (Zauner et al., 2001):

a) O primeiro método envolve purificação dos peptídeos de uma mistura por imunoafinidade contra moléculas MHC seguido de extração ácida dos peptídeos e análise química detalhada (HPLC-espectrometria de massa). A desvantagem principal deste método é a sua análise muito complexa e o fato de exigir uma grande quantidade de células.

b) Um segundo método consiste na estratégia genética mediante a construção de uma biblioteca de expressão de cDNA do patógeno transfectada em células que expressem moléculas MHC de interesse. As células transfectadas serão testadas na sua habilidade de estimular células citotóxicas (Zauner et al., 2001) ou células CD4+ de animais vacinados ou infectados.

c) O terceiro método usa programas de computador para predição de epitopos ligantes de MHC numa sequência de uma proteína (Zauner et al., 2001). O algoritmo de Sette (Doolan et al., 2003), por exemplo, se baseia na análise da hidrofobicidade dos aminoácidos para identificar sítios ligantes de linfócitos CD4+. O algoritmo realiza com sucesso predições de ligação de peptídeos a moléculas de MHC com bolsos (“pocket”) hidrofóbicos, mas não com moléculas de MHC com “pockets” hidrofílicos carregados (Altuvia et al., 1997). A vantagem principal deste método é a rapidez e o baixo custo uma vez que um grande número destes programas se encontram disponíveis na Internet.

d) O quarto método consiste no uso de uma série de peptídeos sobrepostos cobrindo a sequência da proteína de interesse (Ghosh et al., 2001; Geginat et al., 2001). A vantagem deste método é a sua factibilidade sendo pouco complexo. Por outro lado, a síntese de tantos peptídeos é muito onerosa e a

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28/43 triagem por ELISPOT, muito trabalhosa (Zauner et al., 2001, Ginat et al., 2001; Doolan et al., 2003).

As Nucleosídeos Hidrolases e a Nucleosídio Hidrolase (NH36) de L. (L.) DONOVANI [0051] Em recentes anos, as Nucleosídeos Hidrolases (NHs) de protozoários tripanossomatídeos têm emergido como um forte marcador filogenético do gênero Leishmania (Lukes et al., 2007; Maurício et al., 2006) e como protagonistas vitais de vias de replicação de parasitas e estabelecimento de infecção. Protozoários dependentes de purina: Crithidia fasciculata (Gopaul et al., 1996); Trypanosoma brucei (Pellé et al., 1998), Trypanosma cruzi (Miller et al., 1984), Leishmania major (Shi, W; Schiramm VL, Almo SC., 1999), Leishmania donovani (Cui, L., Rajasekariah, G.R, Martin, S.K., 2001; Santana et al., 2002) e Leishmania infantum (Maurício et al., 2006), como muitos outros. As atividades das NHs tem sido descritas também em bactérias e fungos (Todd et al., 2003; lovane et al., 2008) mas não em mamíferos (Mitterbauer, R; Karl, T; Adam G, 2002), que possuem vias alternativas.

[0052] Visto que as NHs são expressadas nos estágios iniciais de infecção, elas são excelentes candidatos alvo para o reconhecimento do patógeno pela resposta imune adaptativa. As NHs de Leishmania têm sido descritas nos estágios do parasita que infectam o hospedeiro mamífero (Lukes et al., 2007; Maurício et al., 2006; Shi, W., Schramm, V.L., Almo, S.C., 1999; Cui, L., Rajasekariah, G.R., Martin, S.K., 2001; Santana et al., 2002) e na membrana de exosporio de Bacillus anthracis sendo importante na transmissão de antrax (Todd et al., 2003). Vacinas contra as NHs preveniríam, então, a replicação de diferentes patógenos no seu primeiro estágio de ciclo de vida, prevenindo da infecção, da doença leve, da doença severa e da morte, enquanto que antígenos presentes em estágios

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29/43 tardios do ciclo do parasita protegeríam da doença severa e morte, apenas (UNDP/World Bank/Who 1997).

[0053] A NH de L.donovani é composta por 314 aminoácidos (Cui, L., Rajasekariah, G.R., Martin, S.K., 2001) e demonstra significante homologia com as sequências de L. major (95%) (Cui, L, Rajasekariah, G.R., Martin, S.K., 2001), L chagasi (99%), L. infantum (99%), L. tropica (97%), L. mexicana (93%), L. brasiliensis (84%) (BLAST, 2010), T. brucei (27%) e Crithidia fasciculata (80%) (Cui, L., Rajasekariah, G.R., Martin, S.K., 2001), compartilha 68% de identidade com Haemophylus influenzae e 30% de identidade e motivos conservados com Bacillus anthracis (Todd et al., 2003; BLAST, 2010).A identificação de domínios moleculares imunogênicos da NH de um patógeno podería permitir o desenho racional de desenvolvimento de uma vacina de subunidades ou sintética de proteção cruzada, e explicaria a proteção gerada pela NH de Leishmania donovani contra infecções por outras Leishmanias (Aguilar-Be et al., 2005; Chalé-Balboa et al., 2009; Souza & Palatnik-de-Sousa, 2009; Al-Wabel etal., 2007).

[0054] De acordo com as diretrizes da Organização Mundial da Saúde (UNDP/World Bank/WHO), a NH36 foi primeiramente identificada como um antígeno poderoso presente no estágio parasitário inicial da infecção, a glicoproteína GP36 (Palatnik de Sousa et al., 1993). A natureza da NH e o seu grau de identidade com outras NHs de Leishmanias foi somente revelada depois de clonagem molecular (Santana et al., 2002). Na sua forma nativa ela protegeu camundongos da infecção por L. donovani (Paraguai-de-Souza et al., 2001) e foi também identificada por anticorpos policlonais entre exo-antígenos de promastigotas (Cui, L., Rajasekariah, G.R., Martin, S.K., 2001). Em sua formulação recombinante ou de DNA protegeu camundongos da infecção por L. chagasi, L. mexicana (Aguilar-Be et al., 2005; Chalé-Balboa et al., 2009), L. amazonensis (Souza & Palatnik-de-Sousa, 2009) e L. major (Al-Wabelef al., 2007) e cães da infecção por L. chagasi (Borja-Cabrera et al., 2009) indicando

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30/43 o potencial uso da sua sequência na proteção contra ambas leishmanioses. Como uma vacina bivalente, ela induziu uma resposta imune TH1 mediada por células T CD4+ produtoras de IFN-γ que levou a 88% de profilaxia contra leishmaniose visceral (VL) (Aguilar-Be et al., 2005), 65-81% contra leishmaniose tegumentar (TL) (Aguilar-Be et al., 2005; Souza &Palatnik-deSousa, 2009; Al-Wabel et al., 2007) e 91% de imunoterapia contra VL (Gamboa-León et al., 2006). Também foram encontradas maiores proporções de linfócitos específicos CD4+-NH36 e de níveis de IFN-γ, IL-2 em cães vacinados com NH36 que nos controles não tratados (Borja-Cabrera et al., 2009).

[0055] Com a ajuda do programa NetNGIyc 1.0, verificamos recentemente a presença de três potenciais sítios de N-glicosilação presentes na sequência de aminoácidos prevista para a NH36 de Leishmania donovani. Dentre estes sítios de N-glicosilação 2 estão localizados na porção N-terminal e 1 na porção central da NH36.

[0056] Com o objetivo de desenvolver uma vacina sintética contra a LV, mapeamos o domínio da NH36 que é o alvo da resposta imune adaptativa de camundongos Balb/c vacinados e desafiados com Leishmania chagasi. Também iniciamos a caracterização da possível proteção cruzada dada pela vacina contra a LT murina por Leishmania amazonensis.

Sumário da Invenção [0057] A presente invenção tem como objetivo a identificação das sequências principais a serem incluídas no desenvolvimento de uma vacina recombinante ou de DNA ou sintética contra a leishmaniose visceral canine e humana, a leishmaniose tegumentar humana (cutânea, mucocutânea ou difusa) a partir da Nucleosídeo hidrolase de Leishmania (L) donovani. As Nucleosídeos hidrolases (NHs) demonstram homologia entre parasitas protozoários, fungos e bactérias. Elas são protagonistas vitais do estabelecimento inicial da infecção sendo, portanto, excelentes candidatas ao

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Descrição Detalhada da Invenção [0058] A inovação ora proposta diz respeito à identificação do domínio da NH de L. donovan/(NH36) responsável pela sua imunogenicidade e eficácia protetora contra leishmaniose visceral murina (LV). A NH36 é composta por 314 aminoácidos e a partir de sua seqüência, geramos três peptídeos recombinantes que cobrem a sequência inteira da NH36: F1 (aminoácidos 1-103, domínio N-terminal)(SEQ ID NO:1); F2 (aa 104-198, domínio central)(SEQ ID NO:2) e F3 (aa 199-314, domínio C-terminal)(SEQ ID NO:3) no sistema de expressão Pet28a e Pet28b, conforme representado nas sequências ID NO: 1, 2 e 3 mostrada na Figura 1.

[0059] Camundongos Balb/c foram imunizados com as proteínas NH36, F1, F2 ou F3 (100pg) e saponina (100pg) (vacinas NH36sap, F1sap, F2sap e F3sap respectivamente), desafiados com amastigotas de Leishmania chagasi na quarta semana e sacrificados na sexta semana (Figura 2A). A resposta humoral avaliada por ELISA revelou níveis de anticorpos antiNH36 mais altos nos soros de animais vacinados do que nos controles depois da imunização (ANOVA, p<0,004) e depois do desafio (p=0,001) (Figuras 2B e C). A vacina F3sap induziu níveis de IgG tão altos quanto a NH36sap. Os níveis de IgM e lgG2a induzidos pela vacina F3sap foram tão altos quanto os induzidos pelas vacinas NH36sap e F1sap (Figura 2B). A vacina F2sap induziu somente lgG2b e lgG1, com a mesma intensidade que as outras vacinas. Depois do desafio (Figura 2 C) somente as respostas de lgG1 (p=0,039) e de IgM (p=0,003) foram menores. A F1sap aumentou as respostas de IgA e IgM e

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32/43 a F3sap, as respostas de IgG, lgG2a e lgG3 (Figura 2 C). Os níveis de lgG2a induzidos pela vacina F3sap foram 70% e 34% mais altos que aqueles induzidos pelas vacinas F2sap e F1sap, respectivamente, sugerindo que os epítopos da NH36 para células B produtora de anticorpos protetores estão localizados principalmente no fragmento F3 seguido pelo fragmento F1. O programa baseado em algoritmo predisse três epítopos para células B no F3(SEQ NO:4, SEQ NO:5 e SEQ NO:6), somente um no F1(SEQ NO:7), um entre F1 e F2 (SEQ NO:8)e um no F2(SEQ NO:9)(Figuras 1 e 3) e a inibição da ligação de anticorpos foi majoritariamente induzida pelos epítopos sintéticos do F3 (18,82-31,40%) (SEQ NO:4, SEQ NO: 5 e SEQ NO:6)(Figura 3) confirmando sua superioridade na indução de resposta imune humoral.

[0060] A resposta imune mediada por células foi inicialmente avaliada pela IDR contra antígeno de Leishmania, um forte correlato de proteção contra a leishmaniose visceral humana e animal que foi maior nos animais vacinados que nos controles antes (Figura 4 A) e após o desafio (Figura 4 B) (ANOVA, p<0,0001 em ambos os casos). Depois da imunização, a vacina F3sap induziu o maior inchaço nas patas (p<0,05), seguido pela NH36sap (p<0,05) (Figura 4A). Após o desafio, as respostas de IDR foram aumentadas (p<0,0001), principalmente pela NH36sap que foi tão potente quanto a vacina F3sap (p>0,05), 24h depois da injeção (Figura4 B). O predomínio da vacina F3sap foi recuperado (p<0,05), 48h depois da injeção confirmando a sua superioridade imunogênica (Figura 4 B). As proporções de linfócitos CD4+ (Figura 5 A) e CD8+ (Figura 5 B) anti-NH36 específicos nos baços foram analisadas por citometria de fluxo. Após a imunização, as proporções de células T CD4+ esplênicas (Figura 5 A) permaneceram inalteradas. Depois do desafio, por outro lado, as vacinas F3sap, F1sap e NH36sap demonstraram proporções aumentadas de células T CD4+ sobre os controles de salina (p<0,05) e da vacina F2sap (p<0,05). A melhor performance foi atingida pela vacina F3sap com maiores proporções de células T CD4+ do

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33/43 que a vacina NH36sap (p<0,05). Vale salientar que conforme esperado para progresso da VL, após o desafio, as proporções de células T CD4+ estavam diminuídas nos controles de salina (22%, p<0,05) (Figura 5 A). As proporções de células T CD8+ (Figura 5 B) que permaneceram inalteradas depois da imunização, foram por outro lado aumentadas por todas as vacinas depois da infecção (p<0,0001) quando comparadas com seus respectivos valores antes da infecção (p<0,05), e com os controles de salina (p<0,05) (Figura 5 B).

[0061] Os níveis de citocinas foram dosados nos sobrenadantes de linfócitos após estimulação in vitro com NH36 recombinante (Figura 6). Depois da imunização, e comparados com os controles de salina (IC95% -1,27 a 9,20 qg/mL), as maiores concentrações de IFN-γ foram detectadas somente nos camundongos vacinados com a NH36sap (média= 20,61 qg/ml). Depois da infecção, por outro lado, as vacinas F1sap (média= 12,35 qg/mL), F2sap (média= 9,30 qg/mL) e F3sap (média=21,84 qg/mL) foram superiores aos controles de salina (IC95% -1,65 a 8,10 qg/mL) e as vacinas F1sap e F3sap demonstraram maiores níveis de IFN-γ que a vacina NH36sap (0,08-11,11 qg/mL) (Figura 6).

[0062] Como detectado para IFN-γ, os níveis de TNF-a, depois da imunização (Figura 6) estavam aumentados nos sobrenadantes de animais vacinados com NH36sap apenas (média= 114,70 pg/ml) quando comparados com os controles injetados com salina (IC95% -9,20 to 87,88 qg/ml). Depois da infecção, a secreção de TNF-α que correlacionada com a secreção de IFN-γ (p<0,0001) demonstrou também os mais altos valores nos animais vacinados com a F3sap e F1sap (447,44 pg/mL e 431,40 pg/mL, respectivamente).

[0063] A expressão de IFN-γ, TNF-α e IL-10 também foram estudadas por ICS (“intracellular cytokinestaining”). A fim de caracterizar a potencial resposta TH1 gerada pela vacinação com os peptídeos da NH36, nós

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34/43 demonstramos os resultados como razões de células T CD4+ e CD8+ produtoras de IFN-y/IL-l0 e TNF-a/IL-10 (Figura 7).

[0064] Nossas análises revelaram o predomínio do domínio F3 da Nucleosídeo hidrolase que induziu a mais alta resposta TH1 depois da imunização, que se manteve após o desafio. De fato, depois da imunização, as razões de células T CD4+ produtoras de IFN-y/IL-10 estavam significativamente aumentadas (p<0,009) principalmente nos camundongos vacinados com F3sap sobre aqueles camundongos vacinados com F2sap (p<0,05) enquanto que não foram encontradas diferenças nas células T CD8+. Depois do desafio, as razões de células T CD4+ produtoras de IFN-y/IL-10 também demonstraram aumentos significativos (p<0,0001). Os camundongos vacinados com F3sap demonstraram um aumento de 65% em comparação com os controles de salina e aumentos sobre todas as outras vacinas (p<0,05) exceto para F1sap que por sua parte mostrou um aumento de 32% nas razões sobre os controles de salina (p<0,05). As células T CD8+ produtoras de IFNγ/IL-IO também demonstraram diferenças (p<0,031) principalmente devidas ao aumento das mesmas detectado em camundongos vacinados com F3sap (p<0,05) (Figura 7).

[0065] Além disso, a resposta de células T CD4+ produtoras de TNF-a/IL-10 depois do desafio foi mais forte que a resposta de células T CD4+ produtoras de IFN-y/IL-10 (p <0,0001). De fato, as razões de células T CD4+ produtoras de TNF-a/IL-10 dos animais vacinados com F3sap mostraram um aumento de 29% por sobre as razões de IFN-y/IL-10 para o mesmo grupo (p<0,0001). Além disso, diferente do que aconteceu para IFN-γ, ambos as vacinas NH36sap e F3sap demonstraram razões de células T CD4+ produtoras de TNF-a/IL-10 mais altas do que os controles de salina, animais vacinados com F2sap e F1sap (p<0,005). Adicional mente, a razão CD4+ TNFa/IL-10 da vacina F3 foi 22% maior que a da vacina NH36 (p<0,05) (Figura 7). Finalmente, as razões de células T CD8+ produtoras de TNF-a/IL-10 foram

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35/43 somente aumentadas nos camundongos vacinados com F3sap (p<0,05). Nossos resultados indicam que a resposta induzida pelo peptídeo F3 (domínio C-terminal) supera aquela induzida pela proteína NH36 cognata sugerindo que ela contém as principais sequências da NH36 responsáveis pela resposta imune TH1. A razão TNF-a/IL-10 também sugere, na sequência de F3, a presença de mais epítopos interagindo com células T CD4+ do que com células T CD8+ (a média de CD4= 1,71 cai fora do IC95% de CD8= 1,12-1,62). Este não é o caso da vacina NH36sap que estimula proporções similares de ambas as subclasses de células T (a média de CD4= 1,3 está incluída no IC95% de CD8= 1,02-1,54).

[0066] O ensaio de depleção in vivo com anticorpos monoclonais anti-CD4+ e anti-CD8+ (Figura 8) em camundongos imunizados com as vacinas NH36sap e F3sap confirmaram os resultados de ICS (Figura 7). Quando comparados com o controle de salina (média =1402,9 LDU) uma redução 90,5% foi determinada pela vacina F3sap (média=132,56 LDU) (Figura 8) enquanto que somente 65% de redução foi obtido depois da vacinação com a vacina NH36sap (média=478,95 LDU) (p<0,05) (Figura 8), indicando que a vacina F3sap induziu um aumento de 25,2% na eficácia protetora contra camundongos com VL.

[0067] Em correlação com o que foi detectado para as razões de TNF-a/IL-10 depois da infecção (Figura 7), nos camundongos vacinados com NH36sap, o tratamento com anti-CD4+ induziu 59,5%, e com anti-CD8+, 52% do total de LDU contadas em camundongos tratados com ambos os anticorpos simultaneamente, indicando um grau similar de contribuição de células T CD4+ e CD8+ T (Figura 8; p>0,05) na proteção induzida pela vacina. Também em correlação com os resultados das razões de TNF-a/IL-10 (Figura 7), a proteção gerada pela vacina F3sap foi principalmente mediada por células T CD4+ T (p<0,05) com uma menor contribuição de células T CD8+, visto que o tratamento com anticorpos anti-CD4+ ou antiCD8+

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36/43 levaram ao aumento na susceptibilidade em 59,0% e 29,5%, respectivamente (Figura 8 B). Coincidentemente, o aumento do peso relativo fígado/corpo (hepatomegalia), foi promovido nos camundongos vacinados com NH36sap tratados com anticorpos monoclonais anti-CD4+ ou anti-CD4+ e anti-CD8+ simultaneamente (Figura 8 C) e nos camundongos vacinados com F3sap tratados com anticorpos monoclonais anti-CD4+ apenas. Estes resultados confirmam que enquanto uma proteção global da NH36sap é mediada por linfócitos CD4+ e CD8+, a contribuição para a resposta imune da proteína F3 é principalmente mediada por células T CD4+ com uma menor contribuição das células T CD8+.

[0068] Com relação à avaliação parasitológica da infecção e como esperado dos resultados de respostas imune humoral e celular, diferenças significativas foram encontradas entre os tratamentos (p=0,011) e a vacina F3sap induziu a mais forte eficácia com uma redução de carga parasitária de 88,23% (p<0,05) (Figura 9).A redução da vacina F3sap não foi significativamente diferente da promovida pela vacina NH36sap (37,06%), que apesar disso, exibiu mais de 1000 LDU em 2 dos 6 camundongos vacinados (Figura 9). A vacina F3sap também induziu uma redução de 20,9% (p<0,05) do peso relativo fígado/corpo (Figura 10).

[0069] A vacina F1sap, por outro lado, não promoveu proteção (Figura 9) apesar dos resultados de anticorpos (Figura 3), FACS (Figura 5), ICS (Figura 7) e análise de citocinas (Figura 6).

[0070] Os programas de predição de epítopos revelaram três peptídeos H2-Ld de 9aa para linfócitos CD8+ na NH36 (Figura 1). O epítopo para CD8+ YPPEFKTKL(SEQ NO:10)está localizado no fragmento F1 e os epítopos SPVAEFNVF (SEQ NO:11)e DPEAAHIVF(SEQ NO:12)no fragmento F2. Dentre os epítopos para linfócitos CD4+, os peptídeos ELLAITTWGNQ (alelo IA^d) (SEQ NO:13)e FRYPRPKHCHTQ (alelo IE^d) (SEQ NO:14)de mais alta afinidade predita, estão localizados no fragmento F1 e F3,

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37/43 respectivamente (Figura 1) enquanto que dois peptídeos de menor afinidade estão localizados no F3(SEQ NO: 15 e SEQ NO: 16), um no fragmento F1(SEQ NO: 17) e um no fragmento F2(SEQ NO: 18).

[0071] Visando elucidar a possível indução de proteção cruzada contra a infecção por L.amazonensis, já observada na vacinação com a vacina de DNA VR1012-NH36 (Aguilar-Be et al., 2005; Souza e Palatnik-deSousa, 2009) camundongos Balb/c foram imunizados com NH36 ou com os peptídeos recombinantes, F1, F2 ou F3 e saponina e desafiados com 10⁵promastigotasinfectivos de L. amazonenses (PH8). A resposta de anticorposlgG2a e lgG1 estava dirigida contra os fragmentos F3 (SEQ NO:3) seguido do F1(SEQ NO:1). O fragmento F3 também induziu a maior resposta de IDR contra o lisado de L. amazonensis, e aumentos similares das proporções de células CD4+ em relação com a vacina NH36, e as maiores razões de IFN-y/IL-10 e TNF-a/IL-10 para linfócitos T CD4+ e CD8+ secretores. Conforme esperado pelos resultados da resposta imune gerada, os tamanhos das lesões e a carga parasitária na lesão avaliada por RTPCR estavam significativamente reduzidos nos animais tratados com as vacinas NH36 e F3 seguidos da F1 (Figura 11).

[0072] No modelo da leishmaniose tegumentar então, o domínio C-terminal (F3) seguido do N-terminal (F1) da proteína NH36 contribuem para a proteção e são os alvos principais da imunidade e da eficácia e proteção cruzadas contra a infecção por L. amazonesis) (Nico et al., 2011).

[0073] Também iniciamos a análise do efeito imunoterápico das vacinas F1, F2 e F3 no modelo murino de leishmanioses [0074] Para a análise do efeito imunoterapéutico sobre a leishmaniose visceral infectamos camundongos com 3x10⁷ amastigotas de Leishmania chagas! pela via endovenosa caudal. Após 15 dias de infecção, os animais foram imunizados pela via subcutânea no dorso com 3 doses das

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38/43 vacinas: F1 (100ug), ou F2 (100ug), ou F3 (100ug), ou NH36 (100ug) e 100 ug de saponina Riedel de Haen, com intervalos de 7 dias entre as doses. Foi utilizado um controle de salina. A semelhança do detectado na vacinação profilática contra L. chagasi, a IDR ao lisado de L. donovani foi aumentada principalmente pela vacina F3 e NH36 (p<0,05) e os anticorpos IgG e lgG2a pelas vacinas F1 e F3.A diferença do detectado na profilaxia, entretanto, os 3 peptídeos reduziram parcialmente a carga parasitária, sendo a maior redução induzida pelo F1 e F3 (Figura 12).

[0075] Para análise do efeito imunoterápico dos peptídeos recombinantes na leishmaniose tegumentar murina utilizamos camundongos Balb/c infectados com 10⁵ promastigotas metacíclicos de Leishmania amazonensis (cepa PH8) pela via subcutânea no coxim plantar. Após 6 semanas de infecção, quando as diferenças entre os inchaços das patas se tornaram significantes, os animais foram tratados com 3 doses das vacinas: F1 (100ug), ou F2 (100ug), ou F3 (100ug), ou NH36 (100ug) e 100 ug de saponina Riedel de Haen, à intervalos semanais.A IDR e os anticorpos anti-NH36 do tipo IgG e lgG2 após-imunoterapia foram aumentados apenas pela vacina F3sap que foi a única que determinou uma redução significativa do tamanho das lesões nas patas quando comprada com a vacina F2sap e o controle de salina (Figura 13).

[0076] Os nossos resultados indicam que o efeito protetor da proteína NH36 formulada com saponina pode ser superado em 36% pelo do peptídeo F3 com saponina na profilaxia da leishmaniose visceral (Figura 14). Também o peptídeo 3 é o mais terapêutico contra a leishmaniose tegumentar. Por outro lado, a combinação dos peptídeosFI e F3 é mais eficaz na profilaxia da leishmaniose tegumentar e na imunoterapia da leishmaniose visceral. O peptídeo F3 foi, entretanto, o único que mostrou superar o efeito profilático da vacina NH36.

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39/43 [0077] Visando combinar a indução de repostas protetoras CD8+ pelo peptídeo F1 e CD4+ pelo peptídeo F3 nas leishmanioses viscerais e tegumentares estamos obtendo uma vacina quimérica recombinante contendo ambas seqüências.

A tabela mostra a eficiência da vacina F3 comparada à da vacina NH36 na profilaxia da leishmaniose visceral.

Variável	F3	NH36	Enriquecimento
Após imunização IDR 24h	0,262	0,178	32,06%
Após imunização IDR 48h	0,173	0,114	34,10%
Após desafio IDR 48h	0,243	0,191	21,40%
Razão de células T CD4 produtoras de IFN-y/IL-10	1,23	0,77	37,39%
Redução de carga parasitária (depleção in vivo)	90,5	65,90	27,18%
Redução de carga parasitária de Lchagasi	88,23	37,06	57,99%
Redução de carga parasitária de L amazonensis	100	53,00	47,00%
Média+SD			36,73+12,33

[0078] Os cálculos foram realizados de acordo com a seguinte equação: valores de (F3-NH36/F3)x100 = enriquecimento do efeito protetor Identificação do domínio da NH36 contendo os epítopos relevantes na interação com anticorpos e na apresentação por receptores MHC classe I e II no modelo de leishmaniose visceral murina.

[0079] Descrição das figuras [0080] Figura 1. Fragmentos F1, F2 e F3 da hidrolase NH36 nucleosídeo de Leishmania donovani. Epítopos para Células T e epítopos de

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40/43 anticorpos. A sequência peptídica qu ligam nas moléculas MHC classe ll-IAd e led (negrito), epítopos previstos que ligam nas moléculas MHC de classe I (sublinhados) e de epitopos para anticorpos (fundo cinzento) na NH36. doi: 10.1371 / journal.pntd.0000866.g002 [0081] Figura 2. Vacinação, desafio e desenvolvimento da resposta imune humoral específica da NH36: (A) Desenho do estudo: Camundongos Balb/c foram vacinados com NH36sap, F1sap, F2sap ou F3sap nos intervalos de tempo indicados, através da via subcutânea, seguida por desafio intravenoso com amastigotas de L. chagasi. Barras representam a média ± SE dos valores de absorbância de anticorpos, anti-NH36 de soros diluídos 1/100 de dois experimentos independentes (n=11-12 camundongos por tratamento) depois da imunização (B) e depois do desafio (C). * p<0,05 diferente do controle salina. V p<0,05 diferente da vacina F1sap;o p<0,05 diferente da vacina F2sap; ♦ p<0,05 diferente da vacina NH36sap;0 p<0,05 diferente de todas as outras vacinas.

[0082] Figura 3. Epítopos preditos para anticorpos e a sua percentagem de inibição da ligação da NH36 com anticorpos de cão antiLeishmune® [0083] Figura 4. Resposta de intradermorreação contra antígeno de Leishmania, 24h e 48h depois da completa imunização (A) e depois do desafio com 3x 10⁷ amastigotas de L. chagasi (B) obtidos de baços de hamsters. Resultados de 3 experimentos independentes com 20-24 camundongos (A) e 8-11 camundongos (B) por tratamento são mostrados como média + SE. *p<0,05 significativamente diferente dos controles tratados com salina, V de F1, o de F2 ou 0 de todas as outras vacinas.

[0084] Figura 5. Desenvolvimento da resposta imune celular NH36 específica. Análise de citometria de fluxo de esplenócitos marcados com anti-CD4 (A) ou e anti-CD8 (B) anticorpos de camundongos vacinados e desafiados com L. chagasi. Resultados são demonstrados como média + SE de 2 experimentos independentes (n=14-16 camundongos por tratamento. ** Aumento significativo na proporção de células T CD8+ depois do desafio, *

Petição 870190010971, de 01/02/2019, pág. 55/72 /43 p<0,05 diferenças significativas em relação ao grupo controle tratado com salina, o com a vacina F2sap e ♦com a vacina NH36sap.

[0085] Figura 6. Desenvolvimento da resposta imune celular anti-NH36 específica. Análise de citocinas nos sobrenadantes de esplenócitos de camundongos por ELISA. A média de um grupo de dados de camundongos vacinados (resultados de um experimento com n=7-8 camundongos por tratamento) é ou não incluído no IC 95% de grupos controles.

[0086] Figura 7. Desenvolvimento de resposta imune celular NH36 específica. Análise da marcação intracelular (ICS) de cultura de esplenócitos in vitro com NH36 antes e depois da infecção com L. chagasi. Anticorpos antiCD4-FITC e anti-CD8-FITC foram usados para marcação de superfície celular e anti-IFN-Y-APC, anti-TNF-α-ΡΕ e anti-IL-10-ΡΕ para marcação intracelular. Para caracterizar a resposta TH1, barras representam a razão de células produtoras IFN-y/IL-10 e TNF-a/IL-10. Resultados representam a média + SE de dois experimentos independentes (n=7-8 camundongos por tratamento). * p<0,05 indica diferenças significativas em relação ao controle tratado com salina, V com a vacina F1sap, ocoma vacina F2sap, e ♦com a vacina NH36sap.

[0087] Figura 8. Desenvolvimento da resposta imune mediada por células revelada por depleção in vivo com anticorpos monoclonais anti-CD4+ e anti-CD8+. Carga parasitária de Leishmania chagasi (A e B) e percentagem de peso relativo fígado/corpo (C e D) de camundongos vacinados com a vacina NH36sap e F3sap e tratados com soro de rato, anticorpos monoclonais antiCD4+ ou anti-CD8+ ou com a combinação de anti-CD4+ e anti-CD8+. As barras representam média + SD (5 camundongos para cada tratamento). A carga parasitária é expressa em valores de LDU (número de amastigotas por 600 núcleos de células de fígado/peso do fígado em mg) (A e B). Hepatomegalia avaliada pelo aumento individual do peso relativo expressado como percentagem do peso do corpo. + p<0,05 diferenças significativas entre os tratamentos.

[0088] Figura 9. Eficácia protetora de camundongos vacinados contra infecção com L. chagasi. A carga parasitária de L. chagasi nos fígados de animais controles e vacinados é expressa em LDU (número de amastigotas por 600 núcleos de células de fígado/peso do fígado em mg) de

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42/43 dois experimentos independentes, cada um com 4-8 camundongos por grupo de vacina. * p<0,05 diferenças significativas em relação aos controles de salina, V da vacina F1sap e o da vacina F2sap.As médias dos valores de LDU são: 1632,64 (sal); 1027,50 (NH36sap); 1806,49 (F1sap); 1469,91 (F2sap) e 192,14 (F3sapJ.

[0089] Figura 10. Percentagem de peso relativo fígado/corpo. * p<0,05 diferenças significativas em relação aos controles de salina.

[0090] Figura 11.Eficácia protetora em camundongos vacinados contra infecção por L. amazonensis. (A) evolução do tamanho das lesões nas patas de camundongos desafiados com 10⁵ promastigotas metacíclicas de L. amazonensis uma semana depois da completa vacinação. Resultados de 2 experimentos independentes com 5 animais por tratamento. Desenvolvimento das lesões foi seguido pela medida do aumento na espessura das patas infectadas comparadas com a espessura das patas contra-laterais não infectadas. Resultados representam a média+SE das medidas das patas. (Β) O número de promastigotas de L. amazonensis nas lesões das patas revelados por ensaio de PCR em tempo real. As linhas horizontais representam as médias. * p<0,05 diferenças significativas entre grupos de tratamentos^ [0091] Figura 12. Eficácia imunoterapêutica contra a leishmaniose visceral em camundongos infectados com L. chagasi e vacinados com NH36, F1, F2 ou F3 com saponina. A carga parasitária de L. chagasi nos fígados de animais controles e tratados é expressa em LDU (número de amastigotas por 600 núcleos de células de fígado/peso do fígado em mg) de dois experimentos (n=7-8 cada experimento).

[0092] Figura 13. Eficácia imunoterapêutica contra a leishmaniose tegumentar em camundongos infectados com L amazonensis e vacinados com NH36, F1, F2 ou F3 com saponina. Evolução do tamanho das lesões nas patas de camundongos desafiados com 10⁵promastigotasmetacíclicas de L. amazonensis e tratados com as vacinas NH36, F1, F2 ou F3 com saponina uma semana depois da completa vacinação. Resultados de 2 experimentos independentes com 7 animais por tratamento. O desenvolvimento das lesões foi seguido pela medida do aumento na espessura das patas infectadas comparadas com a espessura das patas contra-laterais não infectadas. Resultados representam a média+SE das medidas das patas. * p<0,05

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43/43 diferenças significativas em relação ao controle tratado com salina; # p<0,05 diferenças significativas em relação a vacina F2sap.

[0093] Figura 14. Eficiência da vacina F3 comparada à da vacina NH36 na profilaxia da leishmaniose visceral. Os cálculos foram realizados de acordo com a seguinte equação: valores de (F3-NH36/F3)x100 = enriquecimento do efeito protetor Identificação do domínio da NH36 contendo os epítopos relevantes na interação com anticorpos e na apresentação por receptores MHC classe I e II no modelo de leishmaniose visceral murina.

Claims (3)

1. Vacina recombinante caracterizada por ser composta pelo antígeno denominado domínio N-terminal (F1), SEQ ID NO:1, constituído pela seqüência de aminoácidos 1-103 ou o domínio C-terminal (F3) SEQ ID NO:3, constituído pela seqüência de aminoácidos 199-314 da Nucleosideo hidrolase de Leishmania donovani (NH36), pelo adjuvante saponina e pelo diluente solução salina.

2. Vacina recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser composta pelo antígeno denominado Domínio C-terminal, SEQ ID NO:3 (denominado F3) da Nucleosideo hidrolase de L. donovani (NH36) e o adjuvante saponina e diluente solução salina.

3. Vacina recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser composta pelo antígeno denominado Domínio N-terminal, SEQ ID NO: 1 (denominado F1) da Nucleosideo hidrolase de L. donovani (NH36) formulado com adjuvante saponina e diluente solução salina.