BR112018074352B1

BR112018074352B1 - Partículas de nanoalume contendo um agente de dimensionamento

Info

Publication number: BR112018074352B1
Application number: BR112018074352-6A
Authority: BR
Inventors: Neal Van Hoeven; Traci Mikasa; Christopher B. Fox; Anwar Ahniyaz; Mark T. Orr; Amit Khandhar
Original assignee: Infectious Disease Research Institute
Priority date: 2016-06-01
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2021-11-30
Also published as: AU2017273650A1; IL262877B2; JP7140684B2; IL311086A; KR20220165789A; JP2024063036A; MX2018014399A; BR112018074352A2; IL298227B1; US20220016042A1; AU2022263559A1; IL298227A; MX2021010105A; CA3023271A1; WO2017210364A1; AU2017273650B2; JP2019521960A; CN109195587A; EP3463300A1; RU2018137841A

Abstract

trata-se de partículas de nanoalume que compreendem um sal de alumínio e um agente de dimensionamento, em que o tamanho da partícula está na faixa de cerca de 1 nm a 450 nm. tais partículas de nanoalume são estáveis e são receptivas a uma etapa de esterilização terminal antes do enfrascamento. são também fornecidas composições que compreendem as partículas de nanoalume e a produção e uso das partículas de nanoalume.

Description

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício de Pedido de Patente Provisório no U.S. 62/344.347, depositado em 1 de junho de 2016, que está incorporado a título de referência ao presente documento em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se ao campo de formulações farmacêuticas e de vacina. Mais especificamente, as modalidades descritas no presente documento referem-se partículas de nanoalume, composições que compreendem as partículas de nanoalume e métodos para produzir e usar as partículas de nanoalume.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Os sais de alumínio (coletivamente denominados Alume) têm sido usados por mais de oito décadas devido ao seu bom perfil de segurança e sua capacidade para induzir uma resposta imunológica intensificada a antígenos de vacina adsorvidos [1, 2]. Como uma das poucas classes de adjuvantes aprovadas pelo FDA dos EUA, os sais de alumínio têm uma trajetória regulatória estabelecida em oposição a formulações adjuvantes mais inovadoras [1]. Quando dispersos em uma solução aquosa, os sais de alumínio formam particulados agregados heterogêneos de ~0,5 a 10 mícrons (μm) de tamanho, que podem ser, então, difíceis de caracterizar pelo controle de qualidade em comparação com as formulações com populações de tamanho monodisperso, tais como emulsão de óleo em água. Essa complexidade é composta pelo fato de que há múltiplos tipos de sais de alumínio disponíveis com propriedades distintas, incluindo fosfato de alumínio, sulfato de hidroxifosfato de alumínio e oxi-hidróxido de alumínio.

[0004] Diversos estudos propuseram que o tamanho médio de partícula de uma formulação adjuvante é um fator essencial que pode afetar a atividade biológica da vacina (1). Recentemente, abordagens sintéticas inovadoras têm sido empregadas com o uso de sais de alumínio para fabricar novamente novas formulações sintéticas contendo nanopartículas de alume. Foi descrito que essas nanopartículas sintéticas geram uma resposta imunológica mais forte enquanto diminuem a inflamação no sítio de injeção, em comparação com as micropartículas [1, 4, 5]. No entanto, em cada um desses estudos, uma abordagem sintética ascendente foi empregada para fabricar partículas de alumínio, e nenhuma comparação foi realizada a adjuvantes de sal de alumínio clínico, tais como Alhydrogel®, tornando difícil interpretar o valor das formulações inovadoras versus o material clinicamente aprovado.

[0005] Adicionalmente, a partir de uma perspectiva regulatória, as micropartículas à base de alumínio clínico não podem ser terminalmente esterilizadas por filtração através de filtros de 0,45 ou 0,20 mícrons e são apenas esterilizáveis por radiação ou autoclave; tornando sua fabricação não receptiva a uma etapa de esterilização terminal quando combinadas com antígenos e adjuvantes. Existe uma necessidade de fornecer nanopartículas à base de alumínio que exibam pouca a nenhuma agregação, ou agregação reduzida, e possam ser terminalmente esterilizadas antes de serem enfrascadas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A presente revelação fornece partículas de nanoalume, composições que compreendem as partículas de nanoalume e métodos para produzir e usar as partículas de nanoalume. As partículas de nanoalume são úteis no campo de produtos farmacêuticos e/ou formulações de vacina. São fornecidas no presente documento composições (incluindo formulações) que compreendem uma pluralidade de partículas de nanoalume que compreendem um sal de alumínio e um agente de dimensionamento, em que o tamanho das partículas na composição é menor que 1 μm. O termo partícula de nanoalume é usado no presente documento para denotar que a partícula compreende alumínio e tem um tamanho medido em nanômetros, tipicamente de 1 nm a cerca de 450 nm. Em algumas modalidades, a composição é para uma esterilização terminal por filtro para produtos de acordo com regulação do FDA (tal como uso de um filtro de < 0,45 mícron). Em algumas modalidades, o tamanho das partículas presentes na composição está na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 450 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio das partículas na composição está na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 450 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio das partículas na composição está na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 200 nm. As composições de nanoalume descritas aqui podem ser produzidas por processamento ou moagem de hidróxido de alumínio na presença do agente de dimensionamento por técnicas padrão conhecidas na arte, incluindo, porém sem limitação, microfluidização, sonicação e mistura de alto cisalhamento. A mistura de alto cisalhamento pode ser realizada com o uso de um misturador de alto cisalhamento. Silverson é uma empresa que produz misturadores de alto cisalhamento que podem ser usados nos presentes métodos.

[0007] As partículas de nanoalume nas composições são estáveis e exibem pouca a nenhuma agregação, ou agregação reduzida, e são receptivas a uma etapa de esterilização terminal antes do enfrascamento. As partículas de nanoalume fornecidas no presente documento são úteis para entrega de um agente, tal como um polipeptídeo ou um polinucleotídeo, a um indivíduo. A título de exemplo apenas, as partículas de nanoalume fornecidas no presente documento são úteis para a entrega de antígenos e/ou adjuvantes a um hospedeiro para gerar uma resposta imunológica.

[0008] A presente revelação fornece uma partícula de nanoalume que compreende: (a) um sal de alumínio; e (b) um agente de dimensionamento; em que o tamanho da partícula está na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 450 nm.

[0009] Em certas modalidades, o tamanho médio das partículas é a média Z conforme determinado por dispersão dinâmica de luz.

[0010] Em certas modalidades, o sal de alumínio é selecionado a partir do grupo que consiste em hidróxido de alumínio, gel de hidróxido de alumínio, AlPO4, AlO(OH), Al(OH)(PO4) e KAl(SO4)2.

[0011] Em certas modalidades, o agente de dimensionamento é selecionado dentre agentes de dimensionamento apresentados na Tabela 1. O agente de dimensionamento pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em PAA, PEG e PEG ligado a um lipídio. O agente de dimensionamento pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em quitosano, dextrano (por exemplo, sulfato de dextrano) ou poli(alilamina). O agente de dimensionamento pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em PAA, PEG, PEG ligado a um lipídio, quitosano, sulfato de dextrano ou poli(alilamina).

[0012] Em certas modalidades, o agente de dimensionamento é PEG ligado a um fosfolipídio. Em certas modalidades, o agente de dimensionamento é PEG e o peso molecular médio do PEG está na faixa de cerca de 750 Daltons a cerca de 5.000 Daltons. Em certas modalidades, o agente de dimensionamento é PEG ligado a um lipídio (opcionalmente um fosfolipídio) e o peso molecular médio do PEG está na faixa de cerca de 750 Daltons a cerca de 5.000 Daltons. Em certas modalidades, o lipídio é selecionado a partir do grupo que consiste em DSPE, DPPE e DMPE. Em certas modalidades, o agente de dimensionamento é PAA e o peso molecular médio do PAA está na faixa de cerca de 750 Daltons a cerca de 7.000 Daltons.

[0013] Quando o agente de dimensionamento é quitosano, o mesmo pode ser quitosano de baixo peso molecular (por exemplo, um peso molecular de cerca de 15 kDa a cerca de 190 kDa), quitosano de peso molecular médio (por exemplo, um peso molecular de cerca de 190 kDa a cerca de 700 kDa) ou um quitosano de alto peso molecular (por exemplo, um peso molecular de cerca de 700 kDa a cerca de 1.000 kDa). O grau de desacetilação de quitosano (DDA) variará dependendo do método de purificação e das condições da reação. O grau de desacetilação de quitosano tipicamente está na faixa de cerca de 40% a cerca de 90% com quitosanos comerciais que têm tipicamente um DDA de cerca de 70% a cerca de 90%, entretanto, quitosanos com DDAs maiores que 90% ou menores que 40% podem ser usados nos presentes métodos como quitosanos com DDAs de cerca de 40% a cerca de 90%, de preferência, de cerca de 70% a cerca de 90%. Em algumas modalidades, pelo menos um grupo amina primária no carbono C2 de quitosano pode ser usado como sítio para conjugação covalente. Consequentemente, o termo quitosano, conforme usado no presente documento, induz conjugados de quitosano, incluindo, porém sem limitação, quitosano manosilado ou quitosano fluorescentemente identificado. O quitosano para uso nos presentes métodos está comercialmente disponível junto a muitas fontes, incluindo SIGMA- ALDRICH™.

[0014] Quando o agente de dimensionamento é dextrano, o mesmo pode ser qualquer um dos dextranos de classe 1, 2 ou 3 que têm um peso molecular igual ou maior que 1.000 daltons. Um dextrano particularmente preferencial para uso como um agente de dimensionamento é sulfato de dextrano. O sulfato de dextrano é tipicamente vendido como sal de sódio - consequentemente, conforme usado no presente documento, o termo sulfato de dextrano também inclui formas de sal do mesmo, incluindo suas formas de sal de sódio. Como com quitosano, quando o agente de dimensionamento é sulfato de dextrano, o mesmo pode ser sulfato de dextrano de baixo peso molecular (por exemplo, 5.000 daltons a 100 kDa), de peso molecular médio (por exemplo, 100 kDa a 500 kDa) ou de alto peso molecular (por exemplo, 500 kDa a 1.000 ou mesmo 2.000 kDa). Um sulfato de dextrano preferencial tem um peso molecular de cerca de 20 kDa a cerca de 80 kDa.

[0015] Poli(alilamina) é um polímero catiônico solúvel em água com grupos amino primários livres que pode ser usado como um agente de dimensionamento conforme descrito no presente documento. A poli(alilamina), de preferência, tem um peso molecular de cerca de 5 kDa a cerca de 100 kDa, com máxima preferência, cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, com máxima preferência, de cerca de 5 kDa a cerca de 25 kDa. Qualquer forma de base livre de poli(alilamina) pode ser usada ou qualquer uma de suas formas de sal (por exemplo, sal de ácido clorídrico). O versado na técnica poderia entender que polímeros de poli(alilamina) com pesos moleculares maiores que 100 kDa podem ser usados nos métodos descritos no presente documento e, adicionalmente, quando uma forma de sal de poli(alilamina) é usada, seu peso molecular aumentará.

[0016] Em certas modalidades, a partícula de nanoalume está em uma formulação líquida que é esterilizada por filtração. Em certas modalidades, a partícula de nanoalume é estável em uma formulação líquida a cerca de 0 °C a cerca de 8 °C por pelo menos cerca de 1 mês, pelo menos cerca de 6 meses ou pelo menos cerca de 1 ano. Em certas modalidades, a partícula de nanoalume é estável em uma formulação líquida a cerca de 37 °C por pelo menos cerca de 1 mês. Em certas modalidades, o agente de dimensionamento está associado ao sal de alumínio.

[0017] A presente revelação fornece um método para produzir uma partícula de nanoalume que compreende submeter um sal de alumínio a uma fonte de alta energia na presença de um agente de dimensionamento, de modo que uma partícula de nanoalume seja produzida, e em que o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 450 nm.

[0018] Conforme será percebido pelo versado na técnica, as partículas de nanoalume da presente invenção podem ser produzidas a partir de partículas maiores de tamanho de micrômetro. Consequentemente, a presente revelação fornece um método para produzir as partículas de nanoalume descritas a partir de partículas de sal de alumínio precursoras que têm 0,5 μm a 20 μm de tamanho ou 0,5 um a 10 μm de tamanho.

[0019] A presente revelação fornece um método para produzir uma partícula de nanoalume que compreende (a) submeter um sal de alumínio a uma fonte de alta energia para produzir uma partícula de nanoalume com um tamanho que está na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 450 nm e (b) misturar um agente de dimensionamento com a partícula de nanoalume dentro de cerca de 30 minutos após a etapa (a).

[0020] Em certas modalidades, a fonte de alta energia é gerada a partir de um microfluidizador, uma extrusora, um sonicador, um misturador de alto cisalhamento (por exemplo, misturador silverson) ou um homogeneizador. Duas ou mais fontes de energia podem ser usadas. Por exemplo, a fonte de alta energia pode ser gerada a partir de um microfluidizador e um misturador de alto cisalhamento, e a mistura que compreende o sal de alumínio e o agente de dimensionamento pode ser passada através do microfluidizador por uma ou mais passagens (por exemplo, de uma passagem a cerca de 30 ou mais passagens). Em certas modalidades, a fonte de alta energia é gerada a partir de um microfluidizador, e a mistura que compreende o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é passada através do microfluidizador de uma passagem a cerca de 15 passagens. Em certas modalidades, o sal de alumínio é selecionado a partir do grupo que consiste em hidróxido de alumínio, gel de hidróxido de alumínio, AlPO4, AlO(OH), Al(OH)(PO4) e KAl(SO4)2. Em certas modalidades, o agente de dimensionamento é selecionado a partir do grupo que consiste em PAA, PEG e PEG ligado a um lipídio. Alternativamente, o agente de dimensionamento pode ser selecionado dentre um agente de dimensionamento apresentado na Tabela 1 ou dentre quitosano, dextrano ou poli(alilamina). Em certas modalidades, o agente de dimensionamento é PEG e o peso molecular médio do PEG está na faixa de cerca de 750 Daltons a cerca de 5.000 Daltons. Em certas modalidades, o agente de dimensionamento é PEG ligado a um lipídio (opcionalmente um fosfolipídio) e o peso molecular médio do PEG está na faixa de cerca de 750 Daltons a cerca de 5.000 Daltons. Em certas modalidades, o lipídio é selecionado a partir do grupo que consiste em DSPE, DPPE e DMPE. Em certas modalidades, o agente de dimensionamento é PAA e o peso molecular médio do PAA está na faixa de cerca de 750 Daltons a cerca de 7.000 Daltons. Em certas modalidades, o método compreende, ainda, esterilização por filtração da partícula de nanoalume. Em certas modalidades, a razão entre sal de alumínio e PEG está entre cerca de 2:1 a cerca de 7,5:1. Nas modalidades em que o agente de dimensionamento é quitosano ou poli(alilamina), o sal de alumínio sofrerá modificação de superfície por meio de troca de ligante de fosfato.

[0021] A presente revelação fornece uma partícula de nanoalume obtenível ou produzida por um método revelado no presente documento, em que o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 450 nm.

[0022] A presente revelação fornece uma composição que compreende a partícula de nanoalume revelada no presente documento.

[0023] Em certas modalidades, a composição compreende, ainda, um agente bioativo. Em certas modalidades, o agente bioativo está associado à partícula de nanoalume na composição. Em certas modalidades, mais de cerca de 75% do agente bioativo está associado à partícula de nanoalume na composição, conforme determinado por eletroforese em gel. Em certas modalidades, o agente bioativo é um polipeptídeo, um polinucleotídeo, um antígeno, um adjuvante, um agente diagnóstico, um agente terapêutico ou um organismo. Em certas modalidades, o agente bioativo é um polipeptídeo. Em certas modalidades, o polipeptídeo é um antígeno, uma proteína de fusão, uma proteína de comprimento completo, um peptídeo ou um mimético de peptídeo. Em certas modalidades, o antígeno é um agonista de Rig I. Em certas modalidades, o agente bioativo é um polinucleotídeo. Em certas modalidades, o polinucleotídeo é DNA. Em certas modalidades, o DNA compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo. Em certas modalidades, o DNA é um oligonucleotídeo. Em certas modalidades, o polinucleotídeo é RNA. Em certas modalidades o RNA é selecionado a partir do grupo que consiste em RNA de replicon, mRNA, tRNA, siRNA, shRNA e microRNA. Em certas modalidades, o RNA compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo. Em certas modalidades, a composição compreende, ainda, um adjuvante. Em certas modalidades, o adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em um AS-2, monofosforil lipídio A, monofosforil lipídio A 3-de-O-acilado, IFA, QS21, CWS, TOM, AGPs, oligonucleotídeos contendo CpG, agonistas de receptor similar a Toll (TLR), Leif, saponinas, miméticos de saponina, lipídio A biológico e sintético, imiquimod, gardiquimod, resiquimod, poliI:C, flageilina, GLA, SLA, STING e combinações dos mesmos.

[0024] Em certas modalidades, a composição é uma formulação líquida. Em certas modalidades, a composição pode ser filtrada através de um filtro com tamanho de 0,20 mícron ou um filtro com tamanho de 0,45 mícron. Em certas modalidades, a composição pode ser esterilizada terminalmente antes do enfrascamento. Em certas modalidades, a composição é estável a cerca de 0 °C a cerca de 8 °C por pelo menos cerca de 1 mês, pelo menos cerca de 6 meses ou pelo menos cerca de 1 ano. Em certas modalidades, a composição é estável a cerca de 37 °C por pelo menos cerca de 1 mês. Em certas modalidades, a composição compreende, ainda, um lipossoma. Em certas modalidades, o tamanho médio das partículas na composição é de cerca de 1 nm a cerca de 450 nm.

[0025] A presente revelação fornece um kit que compreende um primeiro frasco contendo a composição revelada no presente documento. Em certas modalidades, o kit compreende, ainda, um segundo frasco contendo outro agente.

[0026] A presente revelação fornece um método para estimular uma resposta imunológica em um sujeito que compreende administrar a composição revelada no presente documento a um sujeito, de modo que estimule uma resposta imunológica no sujeito.

[0027] Em certas modalidades, a resposta imunológica é uma resposta imunológica não específica. Em certas modalidades, a resposta imunológica é uma resposta imunológica específica para antígeno. Em certas modalidades, a resposta imunológica envolve a ativação de células B, ativação de células T, produção de anticorpos ou liberação de citocinas. Em certas modalidades, a composição é usada para monoterapia. Em certas modalidades, a composição é usada para tratamento de alergia, vício, câncer ou autoimunidade. Em certas modalidades, a via de administração da composição é oral, intravenosa intradérmica, transdérmica, nasal, subcutânea ou anal. Em determinadas modalidades, o sujeito é um ser humano. Em determinadas modalidades, o indivíduo é um mamífero não humano. Em certas modalidades, o mamífero não humano é um cão, um gato, uma vaca ou um cavalo.

[0028] A presente revelação fornece um método para entregar um agente bioativo a uma célula em um sujeito que compreende administrar ao sujeito uma composição que compreende (a) uma partícula de nanoalume que compreende um sal de alumínio e um agente de dimensionamento, em que o tamanho da partícula está na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 450 nm e (b) um agente bioativo, entregando, assim, o agente bioativo à célula do sujeito.

[0029] Em certas modalidades, o agente bioativo é entregue à célula. Em certas modalidades, o agente bioativo é um RNA que compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo, e o polipeptídeo é expresso pela célula. Em certas modalidades, a composição gera uma resposta imunológica no sujeito.

[0030] A presente revelação fornece um método para produzir uma composição que compreende misturar a partícula de nanoalume revelada no presente documento com um agente bioativo.

[0031] A presente revelação fornece um método para produzir uma composição que compreende as etapas de: (a) submeter um sal de alumínio a uma fonte de alta energia na presença de um agente de dimensionamento, de modo que uma partícula de nanoalume seja produzida, e em que o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 450 nm; e (b) misturar a partícula de nanoalume produzida na etapa (a) com um agente bioativo.

[0032] A presente revelação fornece um método para produzir uma composição que compreende as etapas de: (a) submeter um sal de alumínio a uma fonte de alta energia para produzir uma partícula de nanoalume com um tamanho que está na faixa de cerca de 1 nm a cerca de 450 nm; (b) misturar um agente de dimensionamento com a partícula de nanoalume dentro de cerca de 30 minutos após a etapa (a); e (c) misturar a partícula de nanoalume com um agente bioativo durante ou após a etapa (b).

[0033] Esses e outros aspectos da presente invenção serão tornados evidentes mediante a referência à descrição detalhada a seguir e desenhos anexos. Adicionalmente, são apresentadas várias referências no presente documento que descrevem em mais detalhes certos aspectos desta invenção e são, portanto, incorporadas a título de referência em sua totalidade.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0034] Figuras 1A a F: Formulações de Nanoalume com Agentes de Dimensionamento de PAA e PEG e Análise de Estabilidade de Formulações de Nanoalume. A Figura 1A demonstra que as formulações de nanoalume processadas ou moídas na presença de PAA2000 como o agente de dimensionamento submetido a três ou seis passagens a 206,84 MPa (30.000 PSI) têm tamanhos médios de partícula de cerca de 100 nm com polidispersidade em torno de 0,25 a 0,3. O aumento da moagem para 10 a 15 passagens resultou em formulações de nanoalume de aproximadamente 78 a 87 nm sem aumento em polidispersidade. A Figura 1B e C representa o diâmetro da partícula ao longo do tempo de formulações de nanoalume com PEG fosfolipídio (PEG 5000-DSPE à razão de 2:1 para alume) ou PAA como o agente de dimensionamento. As formulações que têm tamanhos de partícula iniciais de aproximadamente 78 nm foram armazenadas a 4 °C por até um ano e testadas nos pontos no tempo indicados para tamanho de partícula e polidispersidade. As amostras foram tomadas em triplicata. Figura 1D a F: Termoestabilidade de Formulações de Nanoalume. Formulações de nanoalume de tamanho de partícula menor que 100 nm formuladas com lipídios peguilados de diferentes comprimentos de PEG (5.000, 2.000 e 750) e/ou diferentes comprimentos de cadeia de acila (18, 16 ou 14 carbonos) foram avaliadas quanto à termoestabilidade a 25 °C, 37 °C ou 60 °C por 0, 2 ou 4 semanas. QG194 é PEG5000-DSPE; QG195 é PEG2000-DMPE; QG196 é PEG2000-DPPE; QG197 é PEG750-DSPE; QG198 é PEG2000-DSPE.

[0035] Figura 2: Formulações de nanoalume que têm agente de dimensionamento variado contêm o teor de alume previsto. As formulações de nanoalume que foram preparadas com agentes de dimensionamento de PEG de diferentes comprimentos ligados a fosfolipídios de comprimentos de cadeia de acila variáveis têm o teor de alume previsto. As formulações de nanoalume compreendidas por agentes de dimensionamento com um fosfolipídio de 18C (DSPE) e comprimentos de PEG variáveis de 5.000 (amostra 1), 2.000 (amostra 4) e 750 (amostra 5) contêm quantidades aproximadamente equivalentes do valor inicial de alume de 4 mg/ml previsto conforme medido por teste ICP-OES na faixa de 3,9 mg/ml para PEG750-DSPE (amostra 5) a 4,5 mg/ml para PEG2000-DPPE (amostra 3).

[0036] Figura 3A a D: Camundongos foram imunizados com 2,5 μg de ID97 sozinho ou com adjuvante de alume, PAA, nanoalume PAA, nanoalume PEG ou o agonista de TLR4 GLA-SE. Uma semana após a imunização, os esplenócitos foram isolados e não estimulados ou estimulados com a proteína ID97 na presença de Brefeldin A por 8 horas a 37 °C. As células foram, então, manchadas para expressão de superfície de CD4, CD8 e CD44, assim como expressão intracelular de CD154, IFN-Y, TNF- IL-2, GM-CSF, IL-5 e IL-17A. As respostas específicas para antígeno foram calculadas como a frequência de células T CD4+ que produz uma resposta nas amostras estimuladas com ID97 menos as amostras não estimuladas. A Figura 3A mostra a frequência de células T CD4+ que produz cada resposta específica para ID97. Soro foi coletado dos animais imunizados uma semana após a imunização e avaliado quanto às titulações de anticorpo que se liga a ID97 por ELISA para o isotipo de IgG (3B) e as subclasses IgG1 (3C) e IgG2 (3D). Os dados demonstram que nanoalume PAA aumenta as respostas de Th1. A legenda para a Figura 3B é a mesma que para 3A, e a legenda para 3C é a mesma que aquela para 3D.

[0037] Figura 4A a C: Camundongos fêmeas foram imunizados por via intramuscular com solução salina, alume, nanoalume PAA ou nanoalume PEG. Um dia depois, os nódulos linfáticos de drenagem foram removidos e analisados quanto às citocinas e quimiocinas secretadas por ensaio Luminex. Os dados demonstram que nanoalume PAA aumenta as citocinas de distorção de Th1 nos nódulos linfáticos de drenagem de camundongos.

[0038] Figura 5: Camundongos do tipo selvagem e camundongos IL-18R-/- foram imunizados com 2,5 ug de ID97 e 1 ug de antígenos recombinantes de PE com adjuvante de nanoalume PAA. Uma semana após a imunização, os esplenócitos foram isolados e não estimulados ou estimulados com a proteína ID97 na presença de Brefeldin A por 8 horas a 37 °C. As células foram, então, manchadas para expressão de superfície de CD4, CD8 e CD44, assim como expressão intracelular de CD154, IFN-Y, TNF, IL-2, GM-CSF, IL-5 e IL-17A. As respostas específicas para antígeno foram calculadas como a frequência de células T CD4 que produz uma resposta nas amostras estimuladas com ID97 menos as amostras não estimuladas. Os dados demonstram que nanoalume PAA aumenta as respostas de Th1 por meio de um mecanismo dependente de IL-18R.

[0039] Figura 6A a C: Os camundongos foram imunizados com vetores de expressão de replicon de RNA formulados com nanoalume. Os dados demonstram que em 24 horas após a injeção o replicon de RNA misturado por adição com a emulsão catiônica em doses 30 e 300 vezes (1 ou 0,1 ug) mais baixas que RNA não formulado (30 μg) demonstrou expressão equivalente ao RNA não formulado, enquanto o nanoalume com PAA demonstrou expressão mais baixa (Figura 6A). Entretanto, no Dia 4 e no Dia 7 após a injeção, o RNA misturado por adição com a emulsão catiônica de controle ou o nanoalume com PAA demonstrou expressão aproximadamente equivalente (Figura 6B e 6C) em ambas as doses de 1 μg (mcg) e 0,1 μg (mcg).

[0040] Figura 7A a D: Expressão de vetores de replicon de RNA formuladas com RNA de nanoalume não se deve ao agente de dimensionamento na formulação de nanoalume. Na Figura, 7A a D, os dados agrupados de acordo com a formulação e por dose do vetor de replicon entregue (mcg não formulado representado como um +) 1μg (mcg) e 0,1 μg (mcg) respectivamente) em 24 horas demonstram que PAA sozinho (painel superior direito) não entrega e/ou induz um nível expressível de um replicon de RNA em doses de 0,1 ou 1,0 μg, enquanto as mesmas doses do replicon de RNA formulado ou misturado por adição com a emulsão catiônica de controle ou nanoalume com PAA demonstram expressão de luciferase detectável.

[0041] Figura 8A a C: Camundongos imunizados com mRNA formulados com nanoalume expressam produtos de gene codificados por RNA in vivo. Os dados demonstram que as formulações de nanoalume têm capacidade para entrega e expressão de mRNA e têm propriedades de preservação de dose em comparação com mRNA não formulado. A Figura 8A representa a luminescência relativa observada em animais injetados com um mRNA que codifica luciferase e imageados quanto à expressão do gene de luciferase. O mRNA não formulado demonstra expressão detectável tanto a 10 μg quanto a 1 μg, mas não a 0,1 μg quando acessado em 24 horas após a injeção (grupo da esquerda). Entretanto, tanto a formulação catiônica de controle quanto a formulação de nanoalume com PAA (grupos intermediário e da extrema direita) não apenas expressam níveis equivalentes do gene codificado por mRNA em todas as doses (10 μg, 1 μg e 0,1 μg) em comparação uma à outra, mas também demonstram níveis de expressão aumentados (> 30 vezes) na dose de 1 μg em comparação com o mRNA não formulado e têm níveis de expressão detectáveis na dose de 0,1 μg, demonstrando propriedades de preservação de dose da formulação de nanoalume. A Figura 8B representa a imunofluorescência relativa de animais imageados quanto à expressão do mRNA em 5 dias após a injeção. O mRNA não formulado demostra a expressão detectável do gene codificado por mRNA a 10 μg, mas não nas doses mais baixas (1 μg e 0,1 μg), e o mRNA formulado na formulação catiônica de controle não demonstra expressão detectável em qualquer uma das doses entregues (10 μg, 1 μg, 0,1 μg) quando avaliado 5 dias após a injeção (grupo da esquerda e intermediário). A formulação de nanoalume com PAA (grupos da extrema direita) expressa níveis >10 vezes mais altos da luciferase codificada pelo mRNA na dose de 10 μg e mostra expressão detectável na dose de 1 μg que é aproximadamente equivalente aos níveis observados com 10 μg de mRNA não formulado, demonstrando propriedades de preservação de dose da formulação de nanoalume mesmo em 5 dias após a estrega do mRNA. A Figura 8C representa a expressão in vivo relativa do gene de luciferase codificada por mRNA em 6 horas, 24 horas e 5 dias após a mistura por adição como formulações de emulsões catiônicas de controle não formuladas ou nanoalumes com PAA e injetada in vivo. Os dados demonstram que os animais que foram imunizados com mRNA formulado com formulações de nanoalume tiveram níveis de expressão aumentados e relativamente estáveis do gene de luciferase codificado por mRNA durante cinco dias (□) em comparação com mRNA não formulado (•) ou o mRNA formulado com emulsão catiônica de controle (Δ), que teve um declínio rápido em expressão.

[0042] Figura 9A a E: Formulações de Nanoalume Estabilizam RNA. Essa figura demonstra que, quando as formulações de nanoalume (grupo intermediário, nanoalume com PAA) são misturadas por adição com RNA, armazenadas como uma preparação de frasco único a 4 °C por 1 hora, 4 horas ou 24 horas e subsequentemente usadas para imunizar camundongos, as formulações misturadas por adição podem entregar um construto de RNA de replicon de modo que o nível de expressão de luciferase do RNA replicante seja equivalente ou maior que formulações misturadas por adição e imediatamente administradas no tempo zero quando analisadas no dia 1 (Figura 9A grupo intermediário) ou dia 5 (Figura 9B grupo intermediário). Os replicons de RNA não formulados não demonstram expressão detectável após armazenamento por 4 ou 24 horas quando a expressão de genes é medida 24 horas ou 5 dias após a administração, mas demonstram expressão detectável se administradas imediatamente ou 1 hora após a mistura por adição. Similarmente, a formulação catiônica de controle demonstra proteção do replicon de RNA quando administrada misturada por adição e armazenada a 4 °C por 1, 4 ou 24 horas, com expressão de genes medida em 1 dia ou 5 dias após a injeção. A Figura 9C a E são plotagens de dispersão dos dados que comparam diretamente a formulação catiônica de controle, nanoalume com PAA e replicon não formulado, respectivamente. RNA quando administrado imediatamente após a mistura por adição com o RNA de replicon (T=0, painel esquerdo 9C), administrado 4 horas após a mistura por adição e o armazenamento a 4 °C (T=1h, painel intermediário 9D) ou misturado por adição e armazenado por 24 horas (T=24h, painel direito 9E) a 4 °C. A expressão de genes é medida no dia 5 após a administração aos animais por unidades de luminescência relativa. Os níveis de expressão de luciferase demonstram que o RNA formulado com nanoalume é estável quando misturado por adição como uma formulação de frasco único a 4 °C por até 24 horas em comparação com RNA não formulado.

[0043] Figura 10A a E: : Os camundongos imunizados com vetores de expressão de replicon de RNA que codificam uma proteína de fusão de leishmaniose formulada com nanoalume expressam RNA in vivo e produzem respostas imunológicas específicas para antígeno de preservação de dose. Essa figura demonstra que camundongos imunizados com um vetor de replicon de RNA que codifica um polinucleotídeo de fusão de leishmaniose, EMCH, geram respostas específicas para antígeno. A Figura 10A a D demonstra que a imunização com doses 100 vezes mais baixas de RNA EMCH formulado com emulsão catiônica de controle ou nanoalume com PAA gera porcentagens aproximadamente equivalentes de células T produtoras de citocina de alto CD4+ CD44 CD154, IFN Y, IL-2 ou TNFα como 10Ü de RNA não formulado em comparação com pouca ou nenhuma indução de citocina após a administração de 0,1 □ de replicon de RNA não formulado. Figura 10E: O marco de resposta imunológica protetora contra leishmaniose inclui a presença de células T específicas para antígeno polifuncionais que secretam múltiplas citocinas. As células T de alto CD4+ CD44 foram, ainda, analisadas quanto às respostas de células T polifuncionais. Os dados demonstram que os camundongos imunizados com 100 ng de replicon de RNA EMCH formulado com nanoalume com PAA (barra hachurada) ou formulado com a emulsão catiônica de controle (barra com listras laterais) tiveram números equivalentes de células T de alto CD44 IFN-Y+IL-2+TNFα+ CD4+ triplo positivas em relação aos animais imunizados com 10 μg de RNA não formulado (barra preta sólida). As células duplo positivas que expressam IFN-Y e IL-2 ou IL-2 e TNFα também estavam presentes. Os dados demonstram que formulações de PAA podem entregar RNA que é expresso em um nível suficiente para gerar respostas imunológicas específicas para antígeno relevantes.

[0044] A Figura 11A e B demostra que os camundongos imunizados com formulações de nanoalume que têm tamanhos de partícula de nanoalume de 400 nm, 130 nm ou 75nm adsorvidas ao peptídeo de fusão TB ID93 produzem respostas imunológicas específicas para antígeno. A Figura 11A demonstra que as formulações de nanoalume produzem titulações de anticorpo IgG1 específico para antígeno indicativas de uma polarização de Th2. A Figura 11B demonstra que as formulações de nanoalume mais o agonista de TLR4, SLA, produzem titulações de anticorpo IgG2c específico para antígeno indicativas de uma polarização de Th1.

[0045] A Figura 12A a C demonstra que camundongos imunizados com formulações de nanoalume com PEG que compreendem agentes de dimensionamento de fosfolipídio peguilado com diferentes comprimentos de PEG ou o mesmo comprimento de PEG ligado a fosfolipídios de diferentes comprimentos de cadeia de acila e misturados por adição com peptídeo de fusão TB ID93 mais o agonista de TLR4 SLA produzem resposta específicas para antígeno.

[0046] Figura 13A e B. A Figura 13A demonstra o efeito do número de passagens de microfluidização a 206,84 MPa (30.000 psi) sobre o tamanho hidrodinâmico de nanoalume sintetizado com o uso do precursor AdjuPhos® e quitosano de 120 kDa com 75 a 85% de DD. 13B demonstra o diâmetro hidrodinâmico e PDI de nanoalume fabricado com o uso de adjuvante AdjuPhos® como precursor e quantidades variáveis de quitosano de 120 kDa com 75 a 85% de DD. As amostras foram microfluidizadas a 206,84 MPa (30.000 psi) por 22 passagens distintas.

[0047] Figura 14A e B. A Figura 14A fornece o tamanho de partícula de nanoalume derivado de Alhydrogel® (0,2% em p/v de Al) estabilizado com sulfato de dextrano de 40 kDa. A microfluidização é realizada a 206,84 MPa (30.000 psi). A Figura 14B exibe os dados de estabilidade de tamanho de partícula para o lote de nanolume-dextrano QG774 (0,2% em p/v de alumínio + 0,22% de sulfato de dextrano-40 kDa) armazenado a 5 °C, 25 °C e 37 °C.

[0048] Figura 15A e B: A Figura 15A fornece o potencial zeta de adjuvante Alhydrogel® nativo antes de depois de tratamento com tampão PBS contendo fosfato 67 mM. A Figura 15B demonstra o diâmetro de partícula (média Z) e distribuição de tamanho de nanoalume derivado de Alhydrogel® (0,2% em p/v de Al ou 2 mg de Al/ml) estabilizado com várias quantidades de quitosano. Os dados de tamanho foram coletados imediatamente após a microfluidização e antes da filtração estéril.

[0049] A Figura 16 demonstra o efeito da fração de poli(alilamina) (PAH) sobre o tamanho de partícula e distribuição de tamanho de nanoalume sintetizado a partir de PE-Alhydrogel®.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0050] A presente revelação descrita no presente documento fornece partículas de nanoalume, composições que compreendem as partículas de nanoalume e métodos para produzir e usar as partículas de nanoalume.

I. DEFINIÇÕES

[0051] Os termos a seguir têm os seguintes significados a não ser que indicado de outro modo. Quaisquer termos não definidos têm seus significados reconhecidos na técnica.

[0052] Na presente descrição, os termos “cerca de” e “que consiste essencialmente em” significam ± 20% da faixa, valor ou estrutura indicada, a não ser que indicado de outro modo. Em algumas modalidades, os termos “cerca de” e “que consiste essencialmente em” significam ± 15%; ± 10%; ou ± 5% da faixa, do valor ou da estrutura indicada, a não ser que indicado de outro modo.

[0053] O uso da alternativa (por exemplo, “ou”) deve ser entendido significando um, ambos ou qualquer combinação dos mesmos das alternativas.

[0054] Conforme usado no presente documento, os termos ‘incluir”, “ter” e “compreender” são usados como sinônimos, em que termos e variantes dos mesmos devem ser interpretados como não limitantes.

[0055] Conforme usado no presente documento e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “um”, “uma” e "o”, “a” incluem referência no plural a menos que o contexto indique claramente de outro modo.

[0056] O termo “agente bioativo”, conforme usado no presente documento, refere-se a qualquer material a ser entregue pelas formulações de nanoalume da presente revelação e incluem, sem limitação, macromoléculas, peptídeos, proteínas, peptidomiméticos, ácidos nucleicos, oligonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, mRNA, RNAi, RigI, RNA de replicon, adjuvantes, incluindo agonistas de TLR (por exemplo, agonistas de TLR2, TLR3, TLR4, TLR 7, TLR8 e TLR9), saponinas, partículas virais inteiras, fragmentos virais, fragmentos celulares. Estão também incluídos no termo agente bioativo são, por exemplo, aptâmeros, carboidratos, carboidratos conjugados e partículas similares a vírus.

[0057] O termo “macromolécula”, conforme usado no presente documento, refere-se a moléculas grandes exemplificadas por, porém sem limitação, peptídeos, proteínas, oligonucleotídeos e polinucleotídeos de origem biológica ou sintética. Estão também incluídos no termo macromolécula, por exemplo, carboidratos.

[0058] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de modo intercambiável no presente documento para se referir aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um componente de identificação. Estão também incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), assim como outras modificações conhecidas na técnica que incluem compostos peptidomiméticos que são derivados de peptídeo e proteínas por modificação estrutural com o uso de aminoácidos não naturais.

[0059] O termo “isolado” significa a molécula ter sido removida de seu ambiente natural.

[0060] “Purificado” significa que a molécula teve a pureza aumentada, de modo que exista em uma forma que é mais pura do que existe em seu ambiente natural e/ou quando inicialmente sintetizada e/ou amplificada sob condições de laboratório. Pureza é um termo relativo e não necessariamente significa pureza absoluta. Em algumas modalidades, purificado pode significar 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% ou 80% mais puro do que existe em seu ambiente natural e/ou quando inicialmente sintetizado e/ou amplificado sob condições de laboratório.

[0061] Um “polinucleotídeo” ou “ácido nucleico”, conforme usado de forma intercambiável no presente documento, refere-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, incluindo DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadas e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em um polímero por DNA ou RNA polimerase, ou por uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos dos mesmos. Se presente, a modificação à estrutura do nucleotídeo pode ser conferida antes ou após a montagem do polímero. Os polinucleotídeos da presente revelação incluem ribonucleotídeos (por exemplo, RNA, RNAi, tRNA e mRNA como termos bem conhecidos na técnica) e desoxirribonucleotídeos (DNA) conhecidos na técnica e podem ser moléculas de filamento simples ou duplo.

[0062] “Oligonucleotídeo”, conforme usado no presente documento, de modo geral, refere-se a polinucleotídeos, de modo geral, de filamento simples, de modo geral, sintéticos, curtos, mas não necessariamente, de menos que cerca de 200 nucleotídeos de comprimento. Os termos “oligonucleotídeo” e “polinucleotídeo” não são mutualmente exclusivos. A descrição acima para polinucleotídeos é aplicável igual e completamente a oligonucleotídeos. Os exemplos incluem agonistas de Rig I.

[0063] Um “replicon”, conforme usado no presente documento, inclui qualquer elementos genético, por exemplo, um plasmídeo, um cosmídeo, um bacmídeo, um fago ou um vírus, que tenha capacidade para replicação amplamente sob seu próprio controle. Um replicon pode ser RNA ou DNA e pode ser de filamento simples ou duplo.

[0064] Um “indivíduo” ou um “sujeito” é qualquer mamífero. Os mamíferos incluem, porém sem limitação, seres humanos, primatas, animais de fazenda, animais de esporte, animais de estimação (tais como gatos, cães, cavalos) e roedores.

[0065] “Alquila” é um hidrocarboneto saturado ramificado ou reto. Por exemplo, um grupo alquila pode ter 1 a 30 átomos de carbono (isto é, (C1-C30)alquila) ou 1 a 20 átomos de carbono (isto é, (C1-C20 alquila) ou 1 a 10 átomos de carbono (isto é, (C1-C10)alquila) ou 1 a 8 átomos de carbono (isto é, (C1-C8)alquila) ou 1 a 6 átomos de carbono (isto é, (C1-C6)alquila) ou 1 a 4 átomos de carbono (isto é, (C1-C4)alquila). Esse termo inclui, a título de exemplo, grupos hidrocarbila lineares e ramificados, tais como metila (CH3-), etila (CH3CH2-), n-propila (CH3CH2CH2-), isopropila ((CH3)2CH-), n-butila (CH3CH2CH2CH2-), isobutila ((CH3)2CHCH2-), sec-butila ((CH3)(CH3CH2)CH-), t- butila ((CH3)3C-), n-pentila (CH3CH2CH2CH2CH2-), neopentila ((CH3)3CCH2-) e n- hexila (CH3(CH2)5-).

[0066] “Halo” ou “halogênio” refere-se a fluoro, cloro, bromo e iodo.

[0067] “Hidróxi” ou "hidroxila" refere-se ao grupo -OH.

[0068] “Alcóxi” refere-se ao grupo -O-alquila, em que alquila é conforme definido no presente documento. Alcóxi inclui, a título de exemplo, metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi, n-butóxi, t-butóxi, sec-butóxi, n- pentóxi e similares.

[0069] “Éster de carboxila” ou “éster de carbóxi” refere-se aos grupos -C(O)O-alquila e -C(O)O-alquila substituída, em que alquila e alquila substituída são definidas no presente documento. II. TÉCNICAS GERAIS

[0070] A prática da presente revelação empregará, a não ser que indicado de outro modo, técnicas convencionais de biologia molecular, DNA recombinante, bioquímica e química, que estão dentro da habilidade da arte. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Consultar, por exemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Edição, Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volumes I e II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., Patente no U.S. 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); a dissertação, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); e em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Baltimore, Maryland (1989). III. PARTÍCULAS DE NANOALUME

[0071] As partículas de nanoalume fornecidas no presente documento compreendem um sal de alumínio (denominado de forma intercambiável como um alume) e um agente de dimensionamento, em que o tamanho da partícula está na faixa de cerca de 1 nm a 450 nm. A discussão dos sais de alumínio e agentes de dimensionamento é fornecida abaixo. A. SAIS DE ALUMÍNIO

[0072] As composições descritas no presente documento podem compreender um sal de alumínio, que pode ser denominado no presente documento como alume. Os sais de alumínio adequados incluem hidróxido de alumínio, tri-hidrato de alumínio, oxi-hidróxido de alumínio, fosfatos de alumínio, hidroxifosfato de alumínio, sulfato de hidroxifosfato de alumínio e sulfato de potássio e alumínio. Os sais de alumínio podem ser também denominados pelas fórmulas: Al(OH)3, AlH3O3, AlH6O3, AlO(OH), Al(OH)(PO4) e KAl(SO4)2. O versado na técnica perceberá que hidroxifosfato de alumínio é não estequiométrico e, embora seja representado no presente documento como Al(OH)(PO4), a razão entre hidroxilas de superfície e fosfatos varia dependendo das condições de fabricação e, como tal, é mais precisamente representada pela fórmula: Al(OH)x(PO4)y.

[0073] Os sais de alumínio usados como coadjuvantes são vantajosos devido ao fato de que têm um bom registro de segurança, aumentam as respostas de anticorpo, estabilizam antígenos e são relativamente simples para produção em larga escala. (Edelman 2002 Mol. Biotechnol. 21:129 a 148; Edelman, R. 1980 Rev. Infect. Dis. 2:370 a 383).

[0074] Em certas modalidades, o sal de alumínio é Alhydrogel®, um hidróxido de alumínio ou oxi-hidróxido de alumínio. Alhydrogel® tem uma carga positiva geral e pode facilmente adsorver porções químicas carregadas negativamente. Alhydrogel® pode ser também denominado como Amphojel; Gel de hidróxido de alumínio; Alumina hidratada; tri-hidróxi de alumínio ou Alugelibye.

[0075] Em certas modalidades, o sal de alumínio é AdjuPhos®, um fosfato de alumínio. AdjuPhos® tem uma carga negativa geral e pode facilmente adsorver porções químicas carregadas positivamente.

[0076] O versado na técnica perceberá que, nas modalidades em que o sal de alumínio e o agente de dimensionamento serem usados têm a mesma carga de superfície, é desejável submeter o sal de alumínio à modificação de superfície de modo que sua carga possa ser revertida, permitindo, assim, a atração entre o agente de dimensionamento e o sal de alumínio. Como um exemplo, quando o sal de alumínio tem uma carga de superfície catiônica (por exemplo, ALO(OH)) e o agente de dimensionamento tem uma carga de superfície catiônica (por exemplo, quitosano, poli(alilamina)), a troca de ligante (por exemplo, troca de ligante de fosfato) atua para alterar a carga de superfície do sal de alumínio para aniônica, permitindo, assim, a interação entre o agente de dimensionamento e o sal de alumínio. B. AGENTES DE DIMENSIONAMENTO

[0077] Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume é mantido devido ao fato de que o agente de dimensionamento reduz, bloqueia ou retarda a agregação do sal de alumínio processado ou moído, em comparação com um nanoalume que compreende um sal de alumínio na ausência de um agente de dimensionamento.

[0078] Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento é adicionado durante o processamento de sal de alumínio por alta entrada de energia, tal como sonicação ou microfluidização, para atingir o tamanho de partícula de nanoalume desejado. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento é adicionado após o processamento de sal de alumínio por alta entrada de energia, tal como sonicação ou microfluidização, para atingir o tamanho de partícula de nanoalume desejado. Em algumas modalidades, quando o agente de dimensionamento é adicionado após processamento de sal de alumínio para atingir o tamanho de partícula de nanoalume desejado por alta entrada de energia, tal como sonicação ou microfluidização, o agente de dimensionamento é adicionado imediatamente após o processamento ou cerca de 0,5 minuto, 0,5 a 1,0 minuto, 1,0 a 1,5 minutos, 1,5 a 2,0 minutos, 2,0 a 2,5 minutos, 2,5 a 3,0 minutos, 3,0 a 3,5 minutos, 3,5 a 4,0 minutos, 4,0 a 4,5 minutos, 4,5 a 5,0 minutos, 5,05 a 5,5 minutos, 5,5 a 6,0 minutos, 6,0 a 6,5 minutos, 6,5 a 7,0 minutos, 7,0 a 7,5 minutos, 7,5 a 8,0 minutos, 8,0 a 8,5 minutos, 8,5 a 9,0 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 12 minutos, cerca de 14 minutos, cerca de 16 minutos, cerca de 18 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 22 minutos, cerca de 24 minutos, cerca de 26 minutos, cerca de 28 minutos, cerca de 30 minutos após o processamento de sal de alumínio para atingir o tamanho de partícula de nanoalume desejado.

[0079] Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento é aquele que altera as propriedades de superfície do sal de alumínio. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento é aquele que estabiliza o tamanho do sal de alumínio.

[0080] Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento é aquele que estabiliza ou protege um agente bioativo. Os exemplos de agentes bioativos incluem, porém sem limitação, um antígeno, um adjuvante, agonista de TLR, mimético de peptídeo, um peptídeo, um polipeptídeo, uma proteína, um nucleotídeo, um polinucleotídeo, RNA, DNA, um genoma viral inteiro e vírus inteiro. O agente bioativo pode ser entregue pelas formulações de nanoalume da presente revelação. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento protege ou blinda o agente bioativo contra oxidação. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento protege ou blinda o agente bioativo contra estresse de calor, que pode incluir fatores de temperatura e tempo de calor. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento protege ou blinda o agente bioativo contra estresse de frio, que pode incluir fatores de temperatura e tempo de frio. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento protege ou blinda o agente bioativo contra degradação. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento é aquele que blinda ou protege o agente bioativo a ser entregue pela formulações de nanoalume da presente revelação contra degradação ou inativação quando exposta a componentes de soro ou sangue. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento protege ou blinda o agente bioativo de modo que o agente possa ser formulado com as nanopartículas como uma formulação de frasco único estável.

[0081] Em algumas modalidades, a presença do agente de dimensionamento reduz, bloqueia ou retarda a agregação ou a reagregação do sal de alumínio em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou mesmo bloqueia a agregação ou a reagregação do sal de alumínio em quase 100% em comparação com uma partícula de nanoalume formada na ausência do agente de dimensionamento.

[0082] Nas partículas de nanoalume fornecidas no presente documento, o agente de dimensionamento está associado ao sal de alumínio. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento é diretamente ligado ao sal de alumínio. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento é adsorvido à partícula de nanoalume. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento está associado ao sal de alumínio por troca de ligante. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento está associado ao sal de alumínio por carga/interações eletrostáticas. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento está associado ao sal de alumínio por meio de um grupo cabeça de fosfato encontrado no agente de dimensionamento. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento está, ainda, ligado a um lipídio. Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento está, ainda, ligado a um fosfolipídio.

[0083] A Tabela 1 fornece uma lista não limitante de agentes de dimensionamento para inclusão nas partículas de nanoalume fornecidas no presente documento. TABELA 1: AGENTES DE DIMENSIONAMENTO

[0084] Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento é ácido poliacrílico (PAA). Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PAA está na faixa de 500 a 7.000; 1.000 a 7.000; 1.500 a 7.000; 2.000 a 7.000; 2.500 a 7.000; 3.000 a 7.000; 3.500 a 7.000; 4.000 a 7.000; 4.500 a 7.000; 5.000 a 7.000; 5.500 a 7.000; 6.000 a 7.000; ou 6.500 a 7.000. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PAA está na faixa de cerca de 500 a 1.000; 500 a 1.500; 500 a 2.000; 500 a 2.500; 500 a 3.000; 500 a 3.500; 500 a 4.000; 500 a 4.500; 500 a 5.000; 500 a 5.500; 500 a 6.000; 500 a 6.500; ou 500 a 7.000. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PAA está na faixa de cerca de 1.000 a 3.000 ou 1.500 a 2.500. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PAA é cerca de 7.000, 6.500, 6.000, 5.500, 5.000, 4.500, 4.000, 3.500, 3.000, 2.500, 2.400, 2.300, 2.200, 2.100, 2.000, 1.900, 1.800, 1.700, 1.600, 1.500, 1.400, 1.300, 1.250, 1.200, 1.100, 1.000 ou 500. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PAA é cerca de 5.000, 2.000, 1.250, 1.200 ou 1.000. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PAA é cerca de 2.000.

[0085] Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento é polietilenoglicol (PEG). Em algumas modalidades particulares, o peso molecular médio do PEG ou o comprimento de PEG está na faixa de cerca de 500 Daltons a cerca de 6.000 Daltons. Em algumas modalidades particulares, o peso molecular médio do PEG ou o comprimento de PEG está na faixa de cerca de 750 Daltons a cerca de 5.000 Daltons. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG ou o comprimento de PEG está na faixa de cerca de 750 a 1.000; 750 a 1.500; 750 a 2.000; 750 a 2.500; 750 a 3.000; 750 a 3.500; 750 a 4.000; 750 a 4.500; ou 750 a 5.000 Daltons. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG ou o comprimento de PEG está na faixa de cerca de 4.500 a 5.000; 4.000 a 5.000; 3.500 a 5.000; 3.000 a 5.000; 2.500 a 5.000; 2.000 a 5.000; 1.500 a 5.000; 1.000 a 5.000; ou 750 a 5.000 Daltons. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG ou o comprimento de PEG está na faixa de cerca de 500 a 1.000; 500 a 750; ou 750 a 1.000 Daltons. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG ou o comprimento de PEG está na faixa de cerca de 1.500 a 2.500; 1.500 a 2.000; ou 2.000 a 2.500 Daltons. Em algumas modalidades, o peso molecular médio do PEG ou o comprimento de PEG está na faixa de cerca de 4.500 a 5.500; 4.500 a 5.000; ou 5.000 a 5.500 Daltons. Em uma modalidade exemplificativa, o agente de dimensionamento é PEG750. Em uma modalidade exemplificativa, o agente de dimensionamento é PEG2000. Em uma modalidade exemplificativa, o agente de dimensionamento é PEG5000. C. LIPÍDIOS LIGADOS AO AGENTE DE DIMENSIONAMENTO

[0086] Em algumas modalidades, o agente de dimensionamento está, ainda, ligado a um lipídio ou um fosfolipídio. A Tabela 2 fornece uma lista não limitante de lipídios que podem estar ligados ao agente de dimensionamento. Em uma modalidade exemplificativa, o agente de dimensionamento é PEG, e o PEG está ligado a DSPE. Em certa modalidade, o agente de dimensionamento é PEG, e o PEG está ligado a DPPE. Em certa modalidade, o agente de dimensionamento é PEG, e o PEG está ligado a DMPE.

[0087] Em certas modalidades, o lipídio é um fosfolipídio ou um lipídio de sal de amônio quaternário. Em certas modalidades, o lipídio é um fosfolipídio que é uma fosfatidilcolina ou um fosfoglicerídeo. Em certas modalidades, o lipídio compreende qualquer uma dentre as seguintes porções químicas:

[0088]

[0089] em que X- é um contraíon de metal alcalino, e Y+ é um contraíon de haleto.

[0090] Em certas modalidades, o tensoativo é um poloxâmero:

[0091]

em que a é 2 a 130, e b é 15 a 67.

[0092] Em certas modalidades, o lipídio compreende uma cadeia de C10-20 alquila. Em certas modalidades, o lipídio compreende uma cadeia de C12-18 alquila.

[0093] Em certas modalidades, o lipídio é aniônico. Em certas modalidades, o lipídio é catiônico. Em certas modalidades, o lipídio é em geral carregado de modo neutro. Em certas modalidades, o lipídio é um zwiteríon.

[0094] Em certas modalidades, os lipídios adequados são mostrados na Tabela 2. TABELA 2 - LIPÍDIOS

[0095] Em certas modalidades, o lipídio é Poloxâmero 188.

[0096] Em certas modalidades, o lipídio é selecionado dentre DLPG, DMPG, DPPG, DSPG, DOPG, DSTAP e DPTAP. Em certas modalidades, o lipídio é selecionado dentre DLPG, DMPG, DPPG, DSPG e DOPG. Em certas modalidades, o lipídio é selecionado dentre DSTAP e DPTAP.

[0097] Em certas modalidades, o lipídio é DSPG. Em certas modalidades, o lipídio é DSTAP. Em certas modalidades, o lipídio é DPTAP.

[0098] Em certas modalidades, o lipídio é selecionado dentre DSPG, DSTAP e Poloxâmero 188.

[0099] Em certas modalidades, o lipídio é selecionado dentre DLPC, DMPC, DPPC, DSPC, DOPC e POPC. Em certas modalidades, o lipídio é selecionado dentre DLPC, DSPC e DOPC.

[0100] Em certas modalidades, o lipídio é DSPE. Em uma modalidade exemplificativa, o agente de dimensionamento PEG está ligado a DSPE na partícula de nanoalume.

[0101] Em certas modalidades, o lipídio é DPPE. Em uma modalidade exemplificativa, o agente de dimensionamento PEG está ligado a DPPE na partícula de nanoalume.

[0102] Em certas modalidades, o lipídio é DMPE. Em uma modalidade exemplificativa, o agente de dimensionamento PEG está ligado a DMPE na partícula de nanoalume.

[0103] Em certas modalidades, o lipídio é DLPE. Em uma modalidade exemplificativa, o agente de dimensionamento PEG está ligado a DLPE na partícula de nanoalume. D. MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PARTÍCULA DE NANOALUME

[0104] É fornecida no presente documento uma partícula de nanoalume que compreende um sal de alumínio e um agente de dimensionamento, em que o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 1 nm a 450 nm. A presente revelação fornece métodos para preparar tais partículas de nanoalume.

[0105] O método para produzir uma partícula de nanoalume compreende submeter um sal de alumínio a uma fonte de alta energia ou força de cisalhamento de alta energia na presença de um agente de dimensionamento, de modo que o tamanho do sal de alumínio seja reduzido e uma partícula de nanoalume seja produzida, e em que o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 1 nm a 450 nm.

[0106] Em certas modalidades, o alume é processado ou moído na presença do agente de dimensionamento ou que o agente de dimensionamento é adicionado ao alume moído pelo menos segundos, minutos ou horas após processamento. Em algumas modalidades, o alume é processado e imediatamente liofilizado ou seco, e o agente de dimensionamento é adicionado mediante reconstituição ou dentro de segundos, minutos, horas de reconstituição. O processamento ou a moagem ocorre com o uso de técnicas- padrão conhecidas na arte, incluindo sonicação, mistura de alto cisalhamento (mistura silverson) e microfluidização. Outra técnica padrão conhecida na arte que pode ser usada nos presentes métodos é homogeneização em alta pressão.

[0107] Em algumas modalidades, a fonte de alta energia fornece pelo menos 34,47 MPa (5.000 PSI), pelo menos 68,95 MPa (10.000 PSI), pelo menos 103,42 MPa (15.000 PSI), pelo menos 137,9 MPa (20.000 PSI), pelo menos 172,37 MPa (25.000 PSI), pelo menos 206,84 MPa (30.000 PSI), pelo menos 241,32 MPa (35.000 PSI), pelo menos 275,79 MPa (40.000 PSI), pelo menos 310,26 MPa (45.000 PSI) ou pelo menos 344,74 MPa (50.000 PSI). Em algumas modalidades, a fonte de alta energia fornece cerca de 34,47 (5.000) a 344,74 (50.000); 34,47 (5.000) a 68,95 (10.000); 34,47 (5.000) a 103,42 (15.000); 34,47 (5.000) a 137,9 (20.000); 34,47 (5.000) a 172,37 (25.000); 34,47 (5.000) a 206,84 (30.000); 34,47 (5.000) a 241,32 (35.000); 34,47 (5.000) a 275,79 (40.000); 34,47 (5.000) a 310,26 (45.000); ou 34,47 (5.000) a 344,74 MPa (50.000 PSI). Em algumas modalidades, a fonte de alta energia fornece cerca de 310,26 a 344,74 (45.000 a 50.000); 275,79 a 344,74 (40.000 a 50.000); 241,32 a 344,74 (35.000 a 50.000); 206,84 a 344,74 (30.000 a 50.000); 172,37 a 344,74 (25.000 a 50.000); 137,9 a 344,74 (20.000 a 50.000); 103,42 a 344,74 (15.000 a 50.000); 68,95 a 344,74 (10.000 a 50.000); ou 34,47 a 344,74 MPa (5.000 a 50.000 PSI). Em algumas modalidades, a fonte de alta energia fornece cerca de 172,37 a 241,32 9(5.000 a 35.000); 172,37 a 206,84 (25.000 a 30.000); ou 206,84 a 241,32 MPa (30.000 a 35.000 PSI). Em algumas modalidades, a fonte de alta energia fornece cerca de 206,84 MPa (30.000 PSI).

[0108] Em algumas modalidades, a fonte de alta energia é uma fonte de alto cisalhamento.

[0109] Em algumas modalidades, a fonte de alta energia é um microfluidizador. A microfluidização é usada para descrever um processo em que as composições são expostas à alta força de cisalhamento. Em algumas modalidades da presente revelação, as composições são processadas por um instrumento ou um dispositivo conhecido como um MICROFLUIDIZER®.

[0110] Em algumas modalidades, a fonte de alta energia é uma extrusora.

[0111] Em algumas modalidades, a fonte de alta energia é um sonicador.

[0112] Em algumas modalidades, a fonte de alta energia é um homogeneizador.

[0113] Em algumas modalidades, o sal de alumínio e o agente de dimensionamento são submetidos a pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50 ou 100 passagens da alta força de cisalhamento. Em algumas modalidades, o sal de alumínio e o agente de dimensionamento são submetidos a 1 a 5, 6 a 10, 11 a 15, 16 a 20, 21 a 30, 31 a 40, 41 a 50, 51 a 60, 61 a 70, 71 a 80, 81 a 90 ou 91 a 100 passagens da alta força de cisalhamento. Em algumas modalidades, o sal de alumínio e o agente de dimensionamento são submetidos a 3, 6 ou 10 passagens da alta força de cisalhamento.

[0114] Em algumas modalidades, o método para produzir as partículas de nanoalume da presente revelação é realizado a 0 °C, a 4 °C, a 25 °C, a 30 °C, a 50 °C ou a 60 °C. Em algumas modalidades, o método para produzir as partículas de nanoalume da presente revelação é realizado a 0 a 4, 5 a 10, 11 a 15, 16 a 20, 21 a 25, 26 a 30, 31 a 35, 36 a 40, 41 a 45, 46 a 50, 51 a 55 ou 56 a 60 °C. Em algumas modalidades, o método para produzir as partículas de nanoalume da presente revelação é realizado a 4 °C.

[0115] Em algumas modalidades, a concentração inicial do sal de alumínio é 10 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração inicial do sal de alumínio é 4 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração inicial do sal de alumínio é 2 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração inicial do sal de alumínio é 0,5 a 10 mg/ml, 1 a 10 mg/ml, 0,5 a 5 mg/ml; 1 a 5 mg/ml; 0,5 a 4 mg/ml; 0,5 a 3 mg/ml; ou 0,5 a 3 mg/ml.

[0116] Em algumas modalidades, o tamanho inicial do sal de alumínio é 1 μm. Em algumas modalidades, o tamanho inicial do sal de alumínio é 0,5 a 5 μm; 0,5 a 4 μm; 0,5 a 3 μm; 0,5 a 2 μm; ou 0,5 a 1 μm.

[0117] Em algumas modalidades, uma partícula de nanoalume descrita no presente documento é produzida por moagem ou processamento de acordo com os métodos descritos no presente documento na presença de um agente de dimensionamento e tem um tamanho médio de partícula de 1 a 450 nm. Em certas modalidades, um nanoalume sintético pode incluir alume sintético conforme foi descrito na técnica, que é novamente sintetizado para produzir o tamanho de partícula de alume adequado ao qual um agente de dimensionamento da presente revelação foi adicionado para criar uma formulação de nanoalume adequada. As partículas de nanoalume da formulação podem ser misturadas com excipientes farmaceuticamente aceitáveis conhecidos na técnica para produzir composições ou formulações de nanoalume.

[0118] Conforme usado no presente documento, os termos “moagem”, “dimensionamento” ou “processamento” referem-se a um processo para tratar uma solução de alume a fim de atingir partículas de tamanho nano. O processo inclui processar uma composição de alume (incluindo formulação) por meio da fonte ou entrada de alta energia para reduzir a agregação das partículas de alume conforme medidas por um tamanho médio de partícula reduzido abaixo de 0,5 a 10 μm. Os exemplos adequados de entrada de energia para atingir composições de nanoalume incluem, porém sem limitação, mistura de alto cisalhamento (tal como ultrassonicação ou mistura de alto cisalhamento com um misturador de alto cisalhamento Silverson), extrusão, homogeneização e microfluidização. Em algumas modalidades, a mistura de alto cisalhamento é realizada a 1.000, 2.000, 5.000 ou 10.000 rpm por 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos ou 10 minutos. Em algumas modalidades, o microfluidizador é um Microfluidics M110P (Newton, MA), equipado com uma câmara de interação de diamante F12Y seguida por um módulo de processamento auxiliar de cerâmica H30Z. Em algumas modalidades, as composições de alume são microfluidizadas a pressões de 20,68 MPa (3.000 PSI), 34,47 MPa (5.000 PSI), 68,95 MPa (10.000 PSI), 103,42 MPa (15.000 PSI) ou 206,84 MPa (30.000 PSI). Em algumas modalidades, a solução de alume é processada por um microfluidizador com uma temperatura da água de recirculação de 60 °C, 40 °C, 20 °C ou 4 °C para atingir composições de nanoalume. Em algumas modalidades, a solução de alume é moída ou processada pelo menos cerca de 1, 3, 6, 10, 15, 20 ou 30 passagens para atingir de modo reproduzível nanopartículas da presente revelação que têm um tamanho médio de partícula de 1 a 450 nm de tamanho. Em algumas modalidades, a solução de alume é microfluidizada por até 10 passagens a 206,84 MPa (30.000 PSI) com uma recirculação de água a 4 °C para impedir o aumento de temperatura durante o processamento. Em algumas modalidades, a solução de alume é processada na presença do agente de dimensionamento. Em algumas modalidades, a razão entre o agente de dimensionamento e alume é 30:1, 20:1, 15:1, 10:1, 7,5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1,5:1, 0,5:1 ou 0,25:1. Em algumas modalidades, a razão entre o agente de dimensionamento e alume é 7,5:1, 4:1, 3:1, 2:1 ou 1:1.

[0119] Entende-se que certas variáveis podem ser controladas em um método para preparar uma partícula de nanoalume das modalidades. Certas variáveis incluem, porém sem limitação, o agente de dimensionamento, o tipo de fonte de alta energia, a pressão exercida pela fonte de alta energia, o número de passagens da mistura através da fonte de alta energia, a temperatura em que o processo ocorre, a concentração de agente de dimensionamento, o ponto no método em que o agente de dimensionamento é adicionado ao alumínio e a razão entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento em peso. TABELA 3. EFEITO DE COMPRIMENTOS OU PESO MOLECULAR DE PEG SOBRE O AGENTE DE DIMENSIONAMENTO

*Alume é uma solução a 4 mg/ml exceto para PAA, em que o alume é 1,6 mg/ml. Os valores em negrito de mg/ml de agente de dimensionamento, razão alume:agente de dimensionamento e média Z (d.nm)±Erro) na Tabela 3 representam as condições que produzem nanoalumes da presente revelação.

[0120] Entende-se que certas variáveis e combinações das mesmas podem estar envolvidas em um método para preparar uma partícula de nanoalume das modalidades, tal como na Tabela 3.

[0121] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é PEG5000, o método pode ter qualquer um ou mais dos seguintes recursos:

[0122] a) o tipo de fonte de alta energia é microfluidizador;

[0123] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0124] c) o número de passagens da mistura através da fonte de alta energia é 1 a 10, tal como 3, 6 ou 10 passagens;

[0125] d) a temperatura em que o processo ocorre é cerca de 4 °C;

[0126] e) a concentração de alume é cerca de 4 mg/ml

[0127] f) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 8 mg/ml; e

[0128] g) a razão entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 1:2.

[0129] Em uma variação, o método conforma-se a pelo menos um dos recursos (a) a (g). Em outra variação, o método conforma- se a dois ou mais (e, em certas variações, todos) dos recursos (a) a (g). Em uma variação particular, o método conforma-se ao recurso (a). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b) e (c). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (d). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (e). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (f). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (g).

[0130] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é PEG2000, o método pode ter qualquer um ou mais dos seguintes recursos:

[0131] a) o tipo de fonte de alta energia é microfluidizador;

[0132] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0133] c) o número de passagens da mistura através da fonte de alta energia é 1 a 10, tal como 3, 6 ou 10 passagens;

[0134] d) a temperatura em que o processo ocorre é cerca de 4 °C;

[0135] e) a concentração de alume é 4 mg/ml

[0136] f) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 10 mg/ml; e

[0137] g) a razão entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 1:2,5.

[0138] Em uma variação, o método conforma-se a pelo menos um dos recursos (a) a (g). Em outra variação, o método conforma- se a dois ou mais (e, em certas variações, todos) dos recursos (a) a (g). Em uma variação particular, o método conforma-se ao recurso (a). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b) e (c). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (d). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (e). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (f). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (g).

[0139] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é PEG750, o método pode ter qualquer um ou mais dos seguintes recursos:

[0140] a) o tipo de fonte de alta energia é microfluidizador;

[0141] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0142] c) o número de passagens da mistura através da fonte de alta energia é 1 a 10, tal como 3, 6 ou 10 passagens;

[0143] d) a temperatura em que o processo ocorre é cerca de 4 °C;

[0144] e) a concentração de alume é 4 mg/ml

[0145] f) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 30 mg/ml; e

[0146] g) a razão entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 1:7,5.

[0147] Em uma variação, o método conforma-se a pelo menos um dos recursos (a) a (g). Em outra variação, o método conforma- se a dois ou mais (e, em certas variações, todos) dos recursos (a) a (g). Em uma variação particular, o método conforma-se ao recurso (a). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b) e (c). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (d). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (e). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (f). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (g).

[0148] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é PEG750, o método pode ter qualquer um ou mais dos seguintes recursos:

[0149] a) o tipo de fonte de alta energia é microfluidizador;

[0150] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0151] c) o número de passagens da mistura através da fonte de alta energia é 1 a 10, tal como 3, 6 ou 10 passagens;

[0152] d) a temperatura em que o processo ocorre é cerca de 4 °C;

[0153] e) a concentração de alume é 4 mg/ml

[0154] f) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 20 mg/ml; e

[0155] g) a razão entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 1:5.

[0156] Em uma variação, o método conforma-se a pelo menos um dos recursos (a) a (f). Em outra variação, o método conforma-se a dois ou mais (e, em certas variações, todos) dos recursos (a) a (f). Em uma variação particular, o método conforma-se ao recurso (a). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b) e (c). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (d). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (e). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (f). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (g).

[0157] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é PAA, o método pode ter qualquer um ou mais dos seguintes recursos:

[0158] a) o tipo de fonte de alta energia é microfluidizador;

[0159] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0160] c) o número de passagens da mistura através da fonte de alta energia é 1 a 10, tal como 3, 6 ou 10 passagens;

[0161] d) a temperatura em que o processo ocorre é cerca de 4 °C;

[0162] e) a concentração de alume é 1,6 mg/ml

[0163] f) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 4,8 mg/ml; e

[0164] g) a razão entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 1:3.

[0165] Em uma variação, o método conforma-se a pelo menos um dos recursos (a) a (f). Em outra variação, o método conforma-se a dois ou mais (e, em certas variações, todos) dos recursos (a) a (f). Em uma variação particular, o método conforma-se ao recurso (a). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b) e (c). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (d). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (e). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (f). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c), (d) e (g). TABELA 4. EFEITO DE COMPRIMENTO DE CADEIA DE ACILA SOBRE LIPÍDIO AFETA AGENTE DE DIMENSIONAMENTO

*Alume é uma solução a 4 mg/ml. Os valores em negrito de mg/ml de agente de dimensionamento, razão alume:agente de dimensionamento e média Z (d.nm)±Erro) na Tabela 4 representam as condições que produzem nanoalumes da presente revelação.

[0166] Entende-se que certas variáveis e combinações das mesmas podem estar envolvidas em um método para preparar uma partícula de nanoalume das modalidades, tal como na Tabela 4.

[0167] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é PEG5000 com DSPE-18C, o método pode ter qualquer um ou mais dos seguintes recursos:

[0168] a) o tipo de fonte de alta energia é microfluidizador;

[0169] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0170] c) o número de passagens da mistura através da fonte de alta energia é 1 a 10, tal como 3, 6 ou 10 passagens;

[0171] d) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 8 mg/ml; e

[0172] e) a razão entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 1:2.

[0173] Em uma variação, o método conforma-se a pelo menos um dos recursos (a) a (e). Em outra variação, o método conforma- se a dois ou mais (e, em certas variações, todos) dos recursos (a) a (e). Em uma variação particular, o método conforma-se ao recurso (a). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b) e (c). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (d). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (e).

[0174] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é PEG2000 com DSPE-18C, o método pode ter qualquer um ou mais dos seguintes recursos:

[0175] a) o tipo de fonte de alta energia é microfluidizador;

[0176] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0177] c) o número de passagens da mistura através da fonte de alta energia é 1 a 10, tal como 3, 6 ou 10 passagens;

[0178] d) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 10 mg/ml; e

[0179] e) a razão entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 1:2,5.

[0180] Em uma variação, o método conforma-se a pelo menos um dos recursos (a) a (e). Em outra variação, o método conforma- se a dois ou mais (e, em certas variações, todos) dos recursos (a) a (e). Em uma variação particular, o método conforma-se ao recurso (a). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b) e (c). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (d). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (e).

[0181] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é PEG5000 com DPPE-16C, o método pode ter qualquer um ou mais dos seguintes recursos:

[0182] a) o tipo de fonte de alta energia é microfluidizador;

[0183] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0184] c) o número de passagens da mistura através da fonte de alta energia é 1 a 10, tal como 3, 6 ou 10 passagens;

[0185] d) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 1 mg/ml a cerca de 8 mg/ml, tal como 4 ou 8 mg/ml; e

[0186] e) a razão entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 1:1 ou 1:2.

[0187] Em uma variação, o método conforma-se a pelo menos um dos recursos (a) a (e). Em outra variação, o método conforma- se a dois ou mais (e, em certas variações, todos) dos recursos (a) a (e). Em uma variação particular, o método conforma-se ao recurso (a). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b) e (c). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (d). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (e).

[0188] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é PEG2000 com DPPE-16C, o método pode ter qualquer um ou mais dos seguintes recursos:

[0189] a) o tipo de fonte de alta energia é microfluidizador;

[0190] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0191] c) o número de passagens da mistura através da fonte de alta energia é 1 a 10, tal como 3, 6 ou 10 passagens;

[0192] d) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 10 mg/ml; e

[0193] e) a razão entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 1:2,5.

[0194] Em uma variação, o método conforma-se a pelo menos um dos recursos (a) a (e). Em outra variação, o método conforma- se a dois ou mais (e, em certas variações, todos) dos recursos (a) a (e). Em uma variação particular, o método conforma-se ao recurso (a). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b) e (c). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (d). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (e).

[0195] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é PEG2000 com DMPE-14C, o método pode ter qualquer um ou mais dos seguintes recursos:

[0196] a) o tipo de fonte de alta energia é microfluidizador;

[0197] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0198] c) o número de passagens da mistura através da fonte de alta energia é 1 a 10, tal como 3, 6 ou 10 passagens;

[0199] d) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 10 mg/ml; e

[0200] e) a razão entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 1:25.

[0201] Em uma variação, o método conforma-se a pelo menos um dos recursos (a) a (e). Em outra variação, o método conforma- se a dois ou mais (e, em certas variações, todos) dos recursos (a) a (e). Em uma variação particular, o método conforma-se ao recurso (a). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b) e (c). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (d). Em outra variação, o método conforma-se aos recursos (a), (b), (c) e (e).

[0202] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é quitosano e o sal de alumínio é Al(OH)(PO4) (por exemplo, AdjuPhos®), o método pode ter qualquer combinação dos seguintes recursos:

[0203] a) o tipo de fonte de alta energia é um misturador de alto cisalhamento seguido por um microfluidizador;

[0204] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0205] c) o número de passagens da mistura através do microfluidizador é 1 a 30, de preferência, de 10 a 30;

[0206] d) o misturador de alto cisalhamento mistura a cerca de 5.000 rpm

[0207] e) a concentração de alume é cerca de 2 mg de alumínio/ml

[0208] f) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 2 mg/ml; e

[0209] g) a razão de massa entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 1:1.

[0210] h) o agente de dimensionamento é quitosano de baixo peso molecular.

[0211] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é dextrano (por exemplo, sal de sódio de sulfato de dextrano) e o sal de alumínio é AlO(OH) (por exemplo, Alhydrogel®), o método pode ter qualquer combinação dos seguintes recursos:

[0212] a) o tipo de fonte de alta energia é um misturador de alto cisalhamento seguido por um microfluidizador;

[0213] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0214] c) o número de passagens da mistura através do microfluidizador é 1 a 30, de preferência, de 10 a 30;

[0215] d) o misturador de alto cisalhamento mistura a cerca de 5.000 rpm

[0216] e) a concentração de alume é cerca de 2 mg de alumínio/ml

[0217] f) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 0,5 mg/ml (por exemplo, 0,44 mg/ml); e

[0218] g) a razão de massa entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 4,5:1.

[0219] h) o agente de dimensionamento é sal de sódio de sulfato de dextrano de baixo peso molecular.

[0220] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é quitosano e o sal de alumínio é AlO(OH) (por exemplo, Alhydrogel®), o método pode ter qualquer combinação dos seguintes recursos:

[0221] a) o tipo de fonte de alta energia é um misturador de alto cisalhamento seguido por um microfluidizador;

[0222] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0223] c) o número de passagens da mistura através do microfluidizador é 1 a 30, de preferência, de 10 a 30;

[0224] d) o misturador de alto cisalhamento mistura a cerca de 5.000 rpm

[0225] e) a concentração de alume é cerca de 2 mg de alumínio/ml

[0226] f) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 1 mg/ml; e

[0227] g) a razão de massa entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 2:1.

[0228] h) o agente de dimensionamento é quitosano de baixo peso molecular.

[0229] i) antes de misturar o sal de alumínio e o agente de dimensionamento, o sal de alumínio é submetido à troca de ligante (por exemplo, troca de ligante de fosfato).

[0230] Em certas modalidades, para o método para preparar uma partícula de nanoalume, em que o agente de dimensionamento é poli(alilamina) e o sal de alumínio é AlO(OH) (por exemplo, Alhydrogel®), o método pode ter qualquer combinação dos seguintes recursos:

[0231] a) o tipo de fonte de alta energia é um misturador de alto cisalhamento seguido por um microfluidizador;

[0232] b) a pressão exercida pela fonte de alta energia é cerca de 206,84 MPa (30.000 psi);

[0233] c) o número de passagens da mistura através do microfluidizador é 1 a 30, de preferência, de 10 a 30;

[0234] d) o misturador de alto cisalhamento mistura a cerca de 5.000 rpm

[0235] e) a concentração de alume é cerca de 2 mg de alumínio/ml

[0236] f) a concentração de agente de dimensionamento é cerca de 0,5 mg/ml; e

[0237] g) a razão de massa entre o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é cerca de 4:1.

[0238] h) o agente de dimensionamento é cerca de 15 kDa.

[0239] i) antes de misturar o sal de alumínio e o agente de dimensionamento, o sal de alumínio é submetido à troca de ligante (por exemplo, troca de ligante de fosfato). E. TAMANHO DE PARTÍCULAS DE NANOALUME

[0240] Conforme fornecido no presente documento, o tamanho da partícula de nanoalume que compreende um sal de alumínio e um agente de dimensionamento está na faixa de cerca de 1 nm a 450 nm.

[0241] Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 75 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 100 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 150 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 200 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 300 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 400 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 450 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 20 nm a 100 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 20 nm a 50 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 10 nm a 200 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 10 nm a 100 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 10 nm a 50 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume é cerca de 1 nm, é cerca de 5 nm, é cerca de 10 nm, é cerca de 15 nm, é cerca de 20 nm, é cerca de 25 nm, é cerca de 30 nm, é cerca de 35 nm, é cerca de 40 nm, é cerca de 45 nm, é cerca de 50 nm, é cerca de 55 nm, é cerca de 60 nm, é cerca de 65 nm, é cerca de 70 nm, é cerca de 75 nm, é cerca de 80 nm, é cerca de 85 nm, é cerca de 90 nm, é cerca de 95 nm, é cerca de 100 nm, é cerca de 105 nm, é cerca de 110 nm, é cerca de 115 nm, é cerca de 120 nm, é cerca de 125 nm, é cerca de 130 nm, é cerca de 135 nm, é cerca de 140 nm, é cerca de 145 nm, é cerca de 150 nm, é cerca de 155 nm, é cerca de 160 nm, é cerca de 165 nm, é cerca de 170 nm, é cerca de 175 nm, é cerca de 180 nm, é cerca de 185 nm, é cerca de 190 nm, é cerca de 195 nm, é cerca de 200 nm, é cerca de 210 nm, é cerca de 220 nm, é cerca de 240 nm, é cerca de 250 nm, é cerca de 260 nm, é cerca de 280 nm, é cerca de 200 nm, é cerca de 300 nm, é cerca de 320 nm, é cerca de 340 nm, é cerca de 350 nm, é cerca de 360 nm, é cerca de 380 nm, é cerca de 400 nm, é cerca de 420 nm, é cerca de 440 nm ou é cerca de 450 nm. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume não é maior que 1 nm, não é maior que cerca de 5 nm, não é maior que cerca de 10 nm, não é maior que cerca de 15 nm, não é maior que cerca de 20 nm, não é maior que cerca de 25 nm, não é maior que cerca de 30 nm, não é maior que cerca de 35 nm, não é maior que cerca de 40 nm, não é maior que cerca de 45 nm, não é maior que cerca de 50 nm, não é maior que cerca de 55 nm, não é maior que cerca de 60 nm, não é maior que cerca de 65 nm, não é maior que cerca de 70 nm, não é maior que cerca de 75 nm, não é maior que cerca de 80 nm, não é maior que cerca de 85 nm, não é maior que cerca de 90 nm, não é maior que cerca de 95 nm, não é maior que cerca de 100 nm, não é maior que cerca de 105 nm, não é maior que cerca de 110 nm, não é maior que cerca de 115 nm, não é maior que cerca de 120 nm, não é maior que cerca de 125 nm, não é maior que cerca de 130 nm, não é maior que cerca de 135 nm, não é maior que cerca de 140 nm, não é maior que cerca de 145 nm, não é maior que cerca de 150 nm, não é maior que cerca de 155 nm, não é maior que cerca de 160 nm, não é maior que cerca de 165 nm, não é maior que cerca de 170 nm, não é maior que cerca de 175 nm, não é maior que cerca de 180 nm, não é maior que cerca de 185 nm, não é maior que cerca de 190 nm, não é maior que cerca de 195 nm, não é maior que cerca de 199 nm, não é maior que cerca de 210 nm, não é maior que cerca de 230 nm, não é maior que cerca de 250 nm, não é maior que cerca de 270 nm, não é maior que cerca de 290 nm, não é maior que cerca de 310 nm, não é maior que cerca de 330 nm, não é maior que cerca de 350 nm, não é maior que cerca de 370 nm, não é maior que cerca de 390 nm, não é maior que cerca de 410 nm, não é maior que cerca de 430 nm, não é maior que cerca de 440 nm ou não é maior que cerca de 449 nm ou não é maior que cerca de 450 nm.

[0242] Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume pode ser filtrada através de um filtro de pelo menos 0,45 mícron. Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume pode ser filtrada através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 mícron ou menor. Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume pode ser filtrada através de um filtro de 0,45 mícron. Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume pode ser filtrada através de um filtro de 0,20 mícron. Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume pode ser filtrada através de um filtro de 0,22 mícron. F. ESTABILIDADE

[0243] Em algumas modalidades fornecidas no presente documento, o tamanho de 1 a 450 nm da partícula de nanoalume que compreende um sal de alumínio e um agente de dimensionamento é estável pelo fato de que o tamanho da partícula de nanoalume menor que 450 nm é mantido e pelo fato de que o sal de alumínio exibe agregação reduzida, ou nenhuma agregação, em comparação com um sal de alumínio na ausência de um agente de dimensionamento.

[0244] Em algumas modalidades, “estável” refere-se a uma formulação ou uma composição de nanoalume compreendida por partículas de nanoalume que não “se agrega”, exibe pouca ou nenhuma agregação ou agregação reduzida ou demonstra pouco a nenhum aumento geral em tamanho médio de partícula ou polidispersidade da formulação ao longo do tempo em comparação com o tamanho de partícula inicial.

[0245] A estabilidade da partícula de nanoalume pode ser medida por técnicas familiares àqueles versados na arte. Em algumas modalidades, a estabilidade é observada visualmente. A inspeção visual pode incluir inspeção por particulados, floculência ou agregados. Em algumas modalidades, a estabilidade é determinada pelo tamanho da partícula de nanoalume. Por exemplo, o tamanho pode ser avaliado por técnicas conhecidas na arte, incluindo, porém sem limitação, difração de raios X e laser, dispersão dinâmica de luz (DLS), CryoEM ou Malvern Zetasize. Em algumas modalidades, o tamanho da partícula de nanoalume refere-se ao diâmetro de média Z. Em algumas modalidades, a estabilidade é determinada avaliando-se a % de agregação dos sais de alumínio na partícula de nanoalume. Em algumas modalidades, a estabilidade é avaliada pela capacidade da partícula de nanoalume de passar através de um filtro de um tamanho particular, por exemplo, através de um filtro de 0,20, 0,22 ou 0,45 mícron. Em algumas modalidades, a estabilidade é determinada pelo pH. Em algumas modalidades, a estabilidade é determinada por medição do índice de polidispersidade (PdI), por exemplo, com o uso da técnica de dispersão dinâmica de luz (DLS).

[0246] Em algumas modalidades, o diâmetro de média Z da nanopartícula aumenta menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 12%, menos de 10%, menos de 7%, menos de 5%, menos de 3%, menos de 1% durante o período de tempo avaliado. Em algumas modalidades, o índice de polidispersidade (PdI) da nanopartícula aumenta menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 12%, menos de 10%, menos de 7%, menos de 5%, menos de 3%, menos de 1% durante o período de tempo avaliado.

[0247] Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume é estável a 0 a 8 °C. Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume é estável a 0 °C, 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C ou 8 °C por pelo menos 1 minuto, por pelo menos 5 minutos, por pelo menos 10 minutos, por pelo menos 15 minutos, por pelo menos 20 minutos, por pelo menos 25 minutos, por pelo menos 30 minutos, por pelo menos 2 minutos, por pelo menos 40 minutos, por pelo menos 45 minutos, por pelo menos 50 minutos, por pelo menos 55 minutos, por pelo menos 1 hora, por pelo menos 2 horas, por pelo menos 6 horas, por pelo menos 12 horas, por pelo menos 18 horas, por pelo menos 24 horas, por pelo menos 48 horas, por pelo menos 72 horas, por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 1 mês, por pelo menos 2 meses, por pelo menos 3 meses, por pelo menos 4 meses, por pelo menos 5 meses, por pelo menos 6 meses, por pelo menos 7 meses, por pelo menos 8 meses, por pelo menos 9 meses, por pelo menos 10 meses, por pelo menos 11 meses, por pelo menos 1 ano, por pelo menos 2 anos ou por pelo menos 5 anos.

[0248] Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume é estável a 20 a 30 °C. Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume é estável a 25 °C por pelo menos 1 minuto, por pelo menos 5 minutos, por pelo menos 10 minutos, por pelo menos 15 minutos, por pelo menos 20 minutos, por pelo menos 25 minutos, por pelo menos 30 minutos, por pelo menos 20 minutos, por pelo menos 40 minutos, por pelo menos 45 minutos, por pelo menos 50 minutos, por pelo menos 55 minutos, por pelo menos 1 hora, por pelo menos 2 horas, por pelo menos 6 horas, por pelo menos 12 horas, por pelo menos 18 horas, por pelo menos 24 horas, por pelo menos 48 horas, por pelo menos 72 horas, por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 1 mês, por pelo menos 2 meses, por pelo menos 3 meses, por pelo menos 4 meses, por pelo menos 5 meses, por pelo menos 6 meses, por pelo menos 7 meses, por pelo menos 8 meses, por pelo menos 9 meses, por pelo menos 10 meses, por pelo menos 11 meses, por pelo menos 1 ano, por pelo menos 2 anos ou por pelo menos 5 anos.

[0249] Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume é estável a 35 a 40 °C. Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume é estável a 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C ou 40 °C por pelo menos 1 minuto, por pelo menos 5 minutos, por pelo menos 10 minutos, por pelo menos 15 minutos, por pelo menos 20 minutos, por pelo menos 25 minutos, por pelo menos 30 minutos, por pelo menos 2 minutos, por pelo menos 40 minutos, por pelo menos 45 minutos, por pelo menos 50 minutos, por pelo menos 55 minutos, por pelo menos 1 hora, por pelo menos 2 horas, por pelo menos 6 horas, por pelo menos 12 horas, por pelo menos 18 horas, por pelo menos 24 horas, por pelo menos 48 horas, por pelo menos 72 horas, por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 1 mês, por pelo menos 2 meses, por pelo menos 3 meses, por pelo menos 4 meses, por pelo menos 5 meses, por pelo menos 6 meses, por pelo menos 7 meses, por pelo menos 8 meses, por pelo menos 9 meses, por pelo menos 10 meses, por pelo menos 11 meses, por pelo menos 1 ano, por pelo menos 2 anos ou por pelo menos 5 anos.

[0250] Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume é estável a 57 a 62 °C. Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume é estável a 57 °C, 58 °C, 59 °C, 60 °C, 61 °C ou 62 °C por pelo menos 1 minuto, por pelo menos 5 minutos, por pelo menos 10 minutos, por pelo menos 15 minutos, por pelo menos 20 minutos, por pelo menos 25 minutos, por pelo menos 30 minutos, por pelo menos 35 minutos, por pelo menos 40 minutos, por pelo menos 45 minutos, por pelo menos 50 minutos, por pelo menos 55 minutos, por pelo menos 1 hora, por pelo menos 2 horas, por pelo menos 6 horas, por pelo menos 12 horas, por pelo menos 18 horas, por pelo menos 24 horas, por pelo menos 48 horas, por pelo menos 72 horas, por pelo menos 1 semana, por pelo menos 2 semanas, por pelo menos 3 semanas, por pelo menos 1 mês.

[0251] Em uma modalidade exemplificativa, a partícula de nanoalume é estável a 4 °C por pelo menos 2 anos. Em uma modalidade exemplificativa, a partícula de nanoalume é estável a 4 °C por pelo menos 4 anos. Em uma modalidade exemplificativa, a partícula de nanoalume é estável a 4 °C por pelo menos 5 anos. Em uma modalidade exemplificativa, a partícula de nanoalume é estável a 25 °C por pelo menos um mês. Em uma modalidade exemplificativa, a partícula de nanoalume é estável a 37 °C por pelo menos duas semanas. Em uma modalidade exemplificativa, a partícula de nanoalume é estável a 60 °C por pelo menos duas semanas.

[0252] Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume é estável após 1 a 4 congelamentos e descongelamentos. Em algumas modalidades, a partícula de nanoalume é estável após 1, após 2, após 3 ou após 4 congelamentos e descongelamentos. IV. COMPOSIÇÕES DE PARTÍCULA DE NANOALUME

[0253] São fornecidas no presente documento composições que compreendem partículas de nanoalume, em que as partículas de nanoalume compreendem um sal de alumínio e um agente de dimensionamento e em que o tamanho das partículas de nanoalume é cerca de 1 nm a 450 nm de tamanho. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 75 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 100 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 150 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 200 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 300 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 400 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 50 nm a 450 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 20 nm a 100 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 20 nm a 50 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 10 nm a 200 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 10 nm a 100 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da partícula de nanoalume está na faixa de cerca de 10 nm a 50 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da composição de nanoalume é cerca de 1 nm, é cerca de 5 nm, é cerca de 10 nm, é cerca de 15 nm, é cerca de 20 nm, é cerca de 25 nm, é cerca de 30 nm, é cerca de 35 nm, é cerca de 40 nm, é cerca de 45 nm, é cerca de 50 nm, é cerca de 55 nm, é cerca de 60 nm, é cerca de 65 nm, é cerca de 70 nm, é cerca de 75 nm, é cerca de 80 nm, é cerca de 85 nm, é cerca de 90 nm, é cerca de 95 nm, é cerca de 100 nm, é cerca de 105 nm, é cerca de 110 nm, é cerca de 115 nm, é cerca de 120 nm, é cerca de 125 nm, é cerca de 130 nm, é cerca de 135 nm, é cerca de 140 nm, é cerca de 145 nm, é cerca de 150 nm, é cerca de 155 nm, é cerca de 160 nm, é cerca de 165 nm, é cerca de 170 nm, é cerca de 175 nm, é cerca de 180 nm, é cerca de 185 nm, é cerca de 190 nm, é cerca de 195 nm, é cerca de 200 nm, é cerca de 210 nm, é cerca de 220 nm, é cerca de 240 nm, é cerca de 250 nm, é cerca de 260 nm, é cerca de 280 nm, é cerca de 200 nm, é cerca de 300 nm, é cerca de 320 nm, é cerca de 340 nm, é cerca de 350 nm, é cerca de 360 nm, é cerca de 380 nm, é cerca de 400 nm, é cerca de 420 nm, é cerca de 440 nm ou é cerca de 450 nm. Em algumas modalidades, o tamanho médio da composição de nanoalume não é maior que 1 nm, não é maior que cerca de 5 nm, não é maior que cerca de 10 nm, não é maior que cerca de 15 nm, não é maior que cerca de 20 nm, não é maior que cerca de 25 nm, não é maior que cerca de 30 nm, não é maior que cerca de 35 nm, não é maior que cerca de 40 nm, não é maior que cerca de 45 nm, não é maior que cerca de 50 nm, não é maior que cerca de 55 nm, não é maior que cerca de 60 nm, não é maior que cerca de 65 nm, não é maior que cerca de 70 nm, não é maior que cerca de 75 nm, não é maior que cerca de 80 nm, não é maior que cerca de 85 nm, não é maior que cerca de 90 nm, não é maior que cerca de 95 nm, não é maior que cerca de 100 nm, não é maior que cerca de 105 nm, não é maior que cerca de 110 nm, não é maior que cerca de 115 nm, não é maior que cerca de 120 nm, não é maior que cerca de 125 nm, não é maior que cerca de 130 nm, não é maior que cerca de 135 nm, não é maior que cerca de 140 nm, não é maior que cerca de 145 nm, não é maior que cerca de 150 nm, não é maior que cerca de 155 nm, não é maior que cerca de 160 nm, não é maior que cerca de 165 nm, não é maior que cerca de 170 nm, não é maior que cerca de 175 nm, não é maior que cerca de 180 nm, não é maior que cerca de 185 nm, não é maior que cerca de 190 nm, não é maior que cerca de 195 nm, não é maior que cerca de 199 nm, não é maior que cerca de 210 nm, não é maior que cerca de 230 nm, não é maior que cerca de 250 nm, não é maior que cerca de 270 nm, não é maior que cerca de 290 nm, não é maior que cerca de 310 nm, não é maior que cerca de 330 nm, não é maior que cerca de 350 nm, não é maior que cerca de 370 nm, não é maior que cerca de 390 nm, não é maior que cerca de 410 nm, não é maior que cerca de 430 nm, não é maior que cerca de 440 nm ou não é maior que cerca de 449 nm, conforme medido por DLS.

[0254] Em algumas modalidades, as composições são filtráveis e terminalmente esterilizáveis antes do enfrascamento. Em algumas modalidades, a composição pode ser filtrada através de um filtro de 0,45 mícron. Em algumas modalidades, a composição pode ser filtrada através de um filtro de 0,20 mícron. Em algumas modalidades, a composição pode ser filtrada através de um filtro de 0,22 mícron.

[0255] Em algumas modalidades, as composições são mantidas como formulações aquosas. Em algumas modalidades, as composições são mantidas como formulações liofilizadas. Em algumas modalidades, as composições são mantidas como formulações secas por aspersão.

[0256] Em algumas modalidades, a composição compreende um nanoalume e uma emulsão. Em algumas modalidades, a emulsão da composição é uma emulsão de água em óleo. Em algumas modalidades, a emulsão da composição é uma emulsão pickering. Em algumas modalidades, a emulsão da composição é uma emulsão de óleo em água. Em algumas modalidades, o óleo da emulsão é um óleo biodegradável. Em outras modalidades, os óleos são um esqualeno. Em outra modalidade, o óleo é um óleo biodegradável sintético.

[0257] Os lipossomas e nanovesículas derivadas de lipossoma são conhecidos na técnica [8] e podem ser usados com os nanoalumes da presente revelação. Em algumas modalidades, a composição compreende um lipossoma contendo as partículas de nanoalume. Em algumas modalidades, a composição compreende um nanoalume e um lipossoma, em que o lipossoma é um lipossoma catiônico. Em algumas modalidades, a composição compreende um nanoalume e um lipossoma, em que o lipossoma é um lipossoma aniônico. Em algumas modalidades, a composição compreende um nanoalume e um lipossoma, em que o lipossoma é um lipossoma neutro. Em algumas modalidades, a composição compreende um nanoalume e um lipossoma, em que o lipossoma é um arqueossoma. Em algumas modalidades, a composição compreende um nanoalume e um lipossoma, em que o lipossoma é um virossoma. A. AGENTES BIOATIVOS

[0258] Em algumas modalidades, a composição compreende, ainda, um ou mais agentes bioativos, por exemplo, o agente bioativo pode ser um polipeptídeo, um polinucleotídeo, um antígeno, um adjuvante, um agente diagnóstico, um agente terapêutico, um organismo, um vírus, um genoma viral. Em algumas modalidades, a composição compreende dois ou mais agentes bioativos. Em algumas modalidades, o agente bioativo está associado à partícula de nanoalume. Em algumas modalidades, o agente bioativo está associado à partícula de nanoalume por troca de ligante e/ou por uma interação eletrostática (à base de carga). Em algumas modalidades, pelo menos 25%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99% do agente bioativo presente na composição estão associados às partículas de nanoalume. Em algumas modalidades, a associação percentual do agente bioativo com a partícula de nanoalume é determinado por eletroforese em gel ou espectroscopia UV. Um método exemplificativo para determinar a associação percentual é demonstrado nos exemplos. I. MACROMOLÉCULAS

[0259] Em algumas modalidades, o agente bioativo é uma macromolécula. Uma macromolécula pode incluir, porém sem limitação, um polinucleotídeo, um polipeptídeo ou um antígeno. Em algumas modalidades, a macromolécula é de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a macromolécula é sintética. Em algumas modalidades, a macromolécula é identificada ou etiquetada. A. POLINUCLEOTÍDEOS

[0260] Proteínas, subunidades de proteína e patógeno inativado são estimuladores eficazes de respostas de anticorpo (imunidade humoral) e foram desenvolvidos com sucesso como vacinas bem- sucedidas para diversas doenças infecciosas em que a imunidade humoral é um forte correlato de proteção. Entretanto, para algumas doenças infecciosas ou câncer, adicionalmente a uma resposta humoral, uma resposta celular clássica ou de células T citolíticas pode ser necessária. Classicamente, a geração de respostas imunológicas celulares ocorre a partir da apresentação endógena ou intracelular de antígenos no contexto de moléculas de maior histocompatibilidade. Isso levou os pesquisadores a teorizar que a entrega de ácidos nucleicos para codificar antígenos intracelulares pode levar a estratégias de vacinação mais bem-sucedidas para infecção crônica e câncer. As vacinas de RNA são particularmente atrativas para entrega de ácido nucleico com base, teoricamente, na capacidade da proteína transcrita pelo RNA de ser mais eficazmente apresentada no contexto das moléculas de maior histocompatibilidade do hospedeiro. A entrega de vacinas de RNA na técnica inclui, por exemplo, a entrega de construtos de RNA mensageiro e RNA replicante expressos a partir de construtos de alfavírus, ambos os quais se baseiam na entrega e na expressão da proteína codificada por RNA na célula. Embora essa abordagem pareça promissora na teoria, até a presente data, na prática, o desenvolvimento de vacinas de RNA tem sido limitado pelo custo de produzir RNA, a entrega ineficaz relativa de RNA in vivo, a instabilidade de RNA nu e o nível in vivo relativo de expressão do RNA. Simplesmente, todas essas limitações podem ser atribuídas à falta de entrega eficaz de RNA in vivo. Recentemente, inúmeras estratégias têm sido empregadas para solucionar essas limitações, incluindo incorporação de nucleotídeos quimicamente modificados, modificação da estrutura de RNA, incluindo cap ARCA e caudas de poli(A) alongadas, e avaliação de estratégias de entrega para o RNA na faixa de RNA nu a lipídios catiônicos e veículos de entrega poliméricos (1 a 5). Talvez as formulações mais bem estudadas para entrega de RNA sejam as emulsões catiônicas compreendidas pelo lipídio catiônico, DOTAP, DOTAP, trioleato de sorbitano, polissorbato e esqualeno (5). Foi demonstrado que esses lipossomas catiônicos se montam em nanopartículas de lipídio sintéticas com o RNA encapsulado no núcleo da partícula. Embora esses lipossomas catiônicos tenham demonstrado a capacidade para entregar vacinas de RNA e induzam respostas imunológicas, a fabricação dessas formulações é bastante complexa e dispendiosa. É necessária na técnica uma fabricação estável, não dispendiosa e receptiva à larga escala, incluindo formulação de estabilização terminal para entrega de polinucleotídeos, incluindo RNA e DNA.

[0261] Em algumas modalidades, o agente bioativo é um polinucleotídeo. Um polinucleotídeo inclui, porém sem limitação, um DNA, um RNA, um aptâmero e um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é DNA. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é RNA. Em algumas modalidades, o DNA ou o RNA é de filamento simples ou de filamento duplo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um RNA de não codificação. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um RNA de codificação. Em algumas modalidades o RNA é selecionado a partir do grupo que consiste em RNA de replicon, mRNA, tRNA, siRNA, shRNA, Rig I e microRNA.

[0262] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que é um antígeno ou compreende um antígeno, conforme adicionalmente descrito abaixo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo é uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo é ID93.

[0263] Em uma modalidade específica, a nanopartícula compreende um agente de dimensionamento de PEG, e o agente é um RNA.

[0264] Em uma modalidade específica, a nanopartícula compreende um agente de dimensionamento de PAA, e o agente é um RNA. 1 CONSTRUTOS DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE

[0265] De acordo com certas modalidades reveladas no presente documento, as composições descritas no presente documento podem conter pelo menos um construto de expressão recombinante que compreende um promotor ligado de maneira funcional a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo. Em certas modalidades adicionais, o construto de expressão recombinante está presente em um vetor viral, tal como um vetor de adenovírus, vírus adenoassociado, herpesvírus, lentivírus, poxvírus ou retrovírus. As composições e os métodos para produzir e usar tais construtos e vetores de expressão são conhecidos na técnica para a expressão de antígenos de polipeptídeo conforme fornecidos no presente documento, por exemplo, de acordo com Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 2006 John Wiley & Sons, NY. Os exemplos não limitantes de construtos de expressão recombinante, de modo geral, podem ser encontrados, por exemplo, nas Patentes nos U.S. 6.844.192; 7.037.712; 7.052.904; 7.001.770; 6.106.824; 5.693.531; 6.613.892; 6.875.610; 7.067.310; 6.218.186; 6.783.981; 7.052.904; 6.783.981; 6.734.172; 6.713.068; 5.795.577 e 6.770.445 e em outro lugar, com ensinamentos que podem ser adaptados à expressão de antígenos de polipeptídeo conforme fornecidos no presente documento, para uso em certas modalidades reveladas no presente. 2 LIGAÇÃO INTERNUCLEOSÍDEO ALTERNADA E ANÁLOGOS DE ÁCIDO NUCLEICO

[0266] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos compreendem ligações internucleosídeo alternadas ou análogos de ácido nucleico. Por exemplo, em uma modalidade, o polinucleotídeo compreende fosforoditioato, ou uma ligação de fosforoditioato, embora fosfodiéster e outras ligações internucleotídeo estejam dentro do escopo da presente revelação, incluindo oligonucleotídeos com ligações internucleotídeo misturadas. Os métodos para produzir oligonucleotídeos de fosforoditioato ou fosforoditioato são descritos nas Patentes nos U.S. 5.666.153, 5.278.302 e WO95/26204. 3 REPLICONS

[0267] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é um replicon. Em algumas modalidades, o replicon é um plasmídeo, um cosmídeo, um bacmídeo, um fago ou um vírus, que tem capacidade para replicação amplamente sob seu próprio controle. Em algumas modalidades, o replicon é RNA ou DNA. Em algumas modalidades, o replicon tem filamento simples ou filamento duplo. Em algumas modalidades, o replicon é derivado de um vírus de RNA. B. POLIPEPTÍDEOS

[0268] Em algumas modalidades, o agente bioativo é um polipeptídeo. Assim, nessas modalidades, as composições descritas compreendem as partículas de nanoalume fornecidas no presente documento e compreendem, ainda, um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma proteína de comprimento completo ou um fragmento da mesma. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um peptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma proteína de fusão. Em algumas modalidades particulares, a proteína de fusão pode produzir uma resposta imunológica mediante administração a um indivíduo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um antígeno, conforme adicionalmente descrito abaixo. C. ANTÍGENOS

[0269] Em algumas modalidades, o agente bioativo é um antígeno. Em algumas modalidades, o antígeno é um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o antígeno é um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o antígeno é um polinucleotídeo de DNA entregue às formulações de nanoalume da presente revelação que codifica um polipeptídeo. Em algumas modalidades, o antígeno é um polinucleotídeo de RNA entregue às formulações de nanoalume da presente revelação que codifica o polipeptídeo. Assim, em algumas modalidades, as composições descritas compreendem qualquer uma das partículas de nanoalume fornecidas no presente documento e compreendem, ainda, um antígeno, em que o antígeno da partícula de nanoalume é fornecido como um polipeptídeo ou um polinucleotídeo.

[0270] Em algumas modalidades, o antígeno está envolvido em ou é derivado de uma alergia, câncer ou doença infecciosa.

[0271] Em algumas modalidades, as composições descritas no presente documento são úteis para propósitos de vacinação e são fornecidas como formulações de vacina (composições de vacina).

[0272] Um antígeno pode ser qualquer epítopo alvo, molécula (incluindo uma biomolécula), complexo molecular (incluindo complexos moleculares que contêm biomoléculas), montagem subcelular, célula ou tecido contra o qual a produção ou intensificação de imunorreatividade em um sujeito é desejada. Frequentemente, o termo antígeno fará referência a um antígeno de polipeptídeo de interesse. Entretanto, o antígeno, conforme usado no presente documento, pode também se referir a um construto recombinante que codifica um antígeno de polipeptídeo de interesse (por exemplo, um construto de expressão). Em certas modalidades, o antígeno pode ser, ou pode ser derivado de, ou pode ter reatividade imunológica cruzada com um patógeno infeccioso e/ou um epítopo, biomolécula, célula ou tecido que está associado a infecção, câncer, doença autoimune, alergia, asma ou qualquer outra afecção em que a estimulação de uma resposta imunológica específica quanto ao antígeno poderia ser desejável ou benéfica.

[0273] Consequentemente, certas modalidades contemplam um antígeno que é derivado de pelo menos um patógeno infeccioso, tal como uma bactéria, um vírus ou um fungo, incluindo uma Actinobacterium, tal como M. tuberculosis ou M. leprae, ou outra micobactéria; uma bactéria, tal como um membro do gênero Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia ou Bordetella; um vírus, tal como um vírus herpes simplex, um vírus da imunodeficiência humana (HIV), um vírus da imunodeficiência felina (FIV), citomegalovírus, Vírus Varicella Zoster, vírus da hepatite, Vírus Epstein Barr (EBV), vírus sincicial respiratório, papilomavírus humano (HPV) e um citomegalovírus; HIV, tal como HIV-1 ou HIV-2; um fungo, tal como Aspergillus, Blastomyces, Coccidioides e Pneumocysti, ou uma levedura, incluindo espécies de Candida, tais como C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis e C. parapsilosis; um parasita, tal como um protozoário, por exemplo, uma espécie de Plasmodium, incluindo P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale; ou outro parasita, tal como um ou mais dentre Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Angiostrongylus, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Cryptosporidium, Ancylostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria bancrofti, Giardia e Leishmania.

[0274] Por exemplo, em certas modalidades, os antígenos são derivados de Borrelia sp., os antígenos podem incluir ácido nucleico, antígeno derivado de patógeno ou preparações antigênicas, proteínas ou peptídeos produzidos de modo recombinante e proteínas de fusão quiméricas. Tal antígeno é OspA. O OspA pode ser uma proteína madura completa em uma forma lipidada em virtude de sua biossíntese em uma célula hospedeira (Lipo-OspA) ou pode ser, alternativamente, um derivado não lipidado. Tais derivados não lipidados incluem a proteína de fusão NS1-OspA não lipidada que tem os primeiros 81 aminoácidos N-terminais da proteína não estrutural (NS1) do vírus da gripe, e a proteína OspA completa e outra, MDP- OspA é uma forma não lipidada de OspA que porta 3 aminoácidos N-terminais adicionais.

[0275] Em certas modalidades, o antígeno é derivado de um vírus, tal como HIV-1, (tal como tat, nef, gp120 ou gp160), herpes vírus humano, tais como gD ou derivados do mesmo ou proteína Precoce Imediata, tal como ICP27 de HSV1 ou HSV2, citomegalovírus ((esp. Humana)(tal como gB ou derivados do mesmo), Rotavírus (incluindo vírus atenuados vivos), vírus Epstein Barr (tal como gp350 ou derivado do mesmo), vírus Varicella Zoster (tal como gpl, II e IE63) ou de um vírus da hepatite, tal como vírus da hepatite B (por exemplo, antígeno de superfície de Hepatite B ou um derivado do mesmo), vírus da hepatite A, vírus da hepatite C e vírus da hepatite E ou de outros patógenos virais, tais como paramixovírus: Vírus sincicial respiratório (tal como proteínas F e G ou derivados do mesmo), vírus parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, papilomavírus humano (por exemplo, HPV6, 11, 16, 18, etc.), flavivírus (por exemplo, vírus da febre amarela, vírus da dengue, vírus da encefalite transmitida por carrapato, vírus da encefalite japonesa, vírus do Nilo Ocidental, vírus da Zika, vírus Powassan) ou vírus da gripe (vírus vivo ou inativo inteiro, vírus da gripe dividido, cultivado em ovos ou células MDCK ou virossomas da gripe inteiros (conforme descrito por Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915 a 920) ou proteínas purificadas ou recombinantes dos mesmos, tais como proteínas HA, NP, NA ou M ou combinações dos mesmos).

[0276] Em certas outras modalidades, o antígeno é derivado de um ou mais patógenos bacterianos, tais como Neisseria spp, incluindo N. gonorrhea e N. meningitidis (por exemplo, polissacarídeos capsulares e conjugados dos mesmos, proteínas de ligação à transferrina, proteínas de ligação à lactoferrina, PilC, adesinas); S. pyogenes (por exemplo, proteínas M ou fragmentos das mesmas, C5A protease, ácidos lipoteicoicos), S. agalactiae, S. mutans: H. ducreyi; Moraxella spp, incluindo M. catarrhalis, também conhecido como Branhamella catarrhalis (por exemplo, adesinas e invasinas de peso molecular alto e baixo); Bordetella spp, incluindo B. pertussis (por exemplo, pertactina, toxina da coqueluche ou derivados da mesma, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclase, fímbrias), B. parapertussis e B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluindo M. tuberculosis (por exemplo, ESAT6, antígeno 85A, -B ou -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluindo L. pneumophila; Escherichia spp, incluindo E. coli enterotóxico (por exemplo, fatores de colonização, toxina termolábil ou derivados da mesma, toxina termoestável ou derivados da mesma), E. coli entero-hemorrágica, E. coli enteropatogênica (por exemplo, toxina similar à toxina shiga ou derivados da mesma); Vibrio spp, incluindo V. cholera (por exemplo, toxina de cólera ou derivados da mesma); Shigella spp, incluindo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluindo Y. enterocolitica (por exemplo, uma proteína Yop), Y. pestis, Y, pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluindo C. jejuni (por exemplo, toxinas, adesinas e invasinas) e C. coli; Salmonella spp, incluindo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluindo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluindo H. pylori (por exemplo, urease, catalase, toxina vacuolizante); Pseudomonas spp, incluindo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluindo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluindo E. faecalis, E.faecium; Clostridium spp., incluindo C. tetani (por exemplo, toxina do tétano e derivados da mesma), C. botulinum (por exemplo, toxina botulínica e derivados da mesma), C. difficile (por exemplo, toxinas de Clostridium A ou B e derivados da mesma); Bacillus spp., incluindo B. anthracis (por exemplo, toxina botulínica e derivados da mesma); Corynebacterium spp., incluindo C. diphtheriae (por exemplo, toxina da difteria e derivados da mesma); Borrelia spp., incluindo B. burgdorferi (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluindo E. equi e o agente da Erliquiose Humana Granulocítica; Rickettsia spp, incluindo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluindo C. trachomatis (por exemplo, MOMP, proteínas de ligação à heparina), C. pneumoniae (por exemplo, MOMP, proteínas de ligação à heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluindo L. interrogans; Treponema spp., incluindo T. pallidum (por exemplo, as proteínas de membrana externa raras), T. denticola, T. hyodysenteriae; ou outros patógenos bacterianos.

[0277] Em certas outras modalidades, o antígeno é derivado de um ou mais parasitas (consultar, por exemplo, John, D.T. e Petri, W.A., Markell and Voge’s Medical Parasitology-9a edição, 2006, WB Saunders, Filadélfia; Bowman, D.D., Georgis’ Parasitology for Veterinarians-8a edição, 2002, WB Saunders, Filadélfia), tal como Plasmodium spp., incluindo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluindo T. gondii (por exemplo, SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluindo E. histolytica; Babesia spp., incluindo B. microti; Trypanosoma spp., incluindo T. cruzi; Giardia spp., incluindo G. lamblia; Leshmania spp., incluindo L, major, Pneumocystis spp., incluindo P. carinii; Trichomonas spp., incluindo T. vaginalis; ou de um helminto que pode infectar um mamífero, tal como: (i) infecções por nematoide (incluindo, porém sem limitação, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracanculus medinensis, Trichinella spiralis e Strongyloides stercoralis); (ii) infecções por trematoide (incluindo, porém sem limitação, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Opisthorchis sinensis, Paragonimus sp, Fasciola hepatica, Fasciola magna, Fasciola gigantica); e (iii) infecções por cestoide (incluindo, porém sem limitação, Taenia saginata e Taenia solium). Em certas modalidades, o antígeno é derivado de Schisostoma spp., Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobiu e/ou Schistosoma japonicum, ou derivado de levedura, tal como Candida spp., incluindo C. albicans; Cryptococcus spp., incluindo C. neoformans.

[0278] Outros antígenos específicos são derivados de M. tuberculosis, por exemplo, Th Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 e hTCC1 (WO 99/51748). As proteínas para M. tuberculosis também incluem proteínas de fusão e variantes da mesma, em que pelo menos duas, três ou quatro ou mais polipeptídeos de M. tuberculosis são fundidas em uma proteína maior. Certas fusões incluem Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI- MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99151748). Outros antígenos que podem ser usados incluem antígenos, combinação de antígenos e proteínas de fusão descritas nos documentos nos US 2010/0129391 e WO 2008/124647. Em uma modalidade exemplificativa, a proteína de fusão é ID93. Em uma modalidade exemplificativa, a proteína de fusão é ID91.

[0279] Outros antígenos específicos são derivados de Leishmania, por exemplo, polipeptídeos e polinucleotídeos de Leishmania da presente revelação podem ser preparados ou isolados com o uso de qualquer um de uma variedade de procedimentos e com o uso de qualquer uma de uma variedade de espécies de Leishmania, incluindo, porém sem limitação, L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. mexicana, L. tropics e L. guyanensis. Tais espécies estão disponíveis, por exemplo, junto à American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. As proteínas para Leishmania também incluem proteínas de fusão e variantes das mesmas, em que pelo menos dois, três ou quatro ou mais polipeptídeos de Leishmania são fundidos em uma proteína maior, conforme descrito nos documentos nos WO2009/012166, WO 2014/160987, WO 2014/160985. Em uma modalidade exemplificativa, a proteína de fusão é EMCH, conforme descrito no presente documento.

[0280] Outros antígenos específicos são derivados de Chlamydia e incluem, por exemplo, a Proteína de Alto Peso Molecular (HWMP) (WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412) e proteínas membrânicas putativas (Pmps). Outros antígenos de Chlamydia podem ser selecionados a partir do grupo descrito no documento no WO 99128475. Certos antígenos podem ser derivados de Streptococcus spp, incluindo S. pneumoniae (por exemplo, polissacarídeos capsulares e conjugados dos mesmos, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de ligação à colina) e o antígeno proteico Pneumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1.007; Rubins et al, Microbial Pathogenesis, 25, 337 a 342) e derivados detoxificados mutante dos mesmos (WO 90/06951; WO 99/03884). Outras vacinas bacterianas compreendem antígenos derivados de Haemophilus spp., incluindo H. influenzae tipo B (por exemplo, PRP e conjugados dos mesmos), H. influenzae não tipável, por exemplo, OMP26, adesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D e lipoproteína D e peptídeos derivados de fimbrina e fimbrina (Patente no U.S. 5.843.464) ou variantes de múltiplas cópias ou proteínas de fusão das mesmas.

[0281] Outros antígenos específicos são derivados de Hepatite B. Os derivados de antígeno de superfície da Hepatite B são bem conhecidos na técnica e incluem, entre outros, aqueles antígenos PreS1, Pars2 S apresentados descritos nos pedidos de patente EP-A414 374; EP-A-0304 578 e EP 198474. Em um aspecto, o antígeno é HIV-1 gp120, especificamente quando expresso em células CHO. Em outra modalidade, o antígeno é gD2t.

[0282] Em outras modalidades, o antígeno é derivado do Papilomavírus Humano (HPV) considerado como sendo responsável por verrugas genitais (HPV 6 ou HPV 11 e outros) e os vírus HPV responsáveis por câncer cervical (HPV16, HPV18 e outros). Os antígenos particulares incluem partículas de L1 ou capsômeros e proteínas de fusão que compreendem um ou mais antígenos selecionados dentre as proteínas de HPV 6 e HPV 11 E6, E7, L1 e L2. Certa formas da proteína de fusão incluem L2E7 conforme revelado no documento no WO 96/26277, e proteína (1/3)-E7 revelada no documento no GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285). Os antígenos possíveis adicionais incluem antígenos de HPV 16 ou 18. Por exemplo, monômeros de antígeno L1 ou L2 ou antígenos L1 ou L2 apresentados juntos como uma partícula similar a vírus (VLP) ou a proteína L1 sozinha apresentada sozinha em uma estrutura de VLP ou capsômero. Tais antígenos, partículas similares a vírus e capsômero são conhecidos por si. Consultar, por exemplo, os documentos nos WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 e WO93/02184.

[0283] Em outras modalidades, o antígeno é uma proteína de fusão. As proteínas de fusão podem estar incluídas sozinhas ou como proteínas tais como E7, E2 ou F5, por exemplo; as modalidades particulares incluem uma VLP que compreende proteínas de fusão L1E7 (WO 96/11272). Os antígenos de HPV 16 particulares compreendem as proteínas precoces E6 ou F7 em fusão com um carreador de proteína D para formar as fusões de Proteína D-E6 ou E7 de HPV 16, ou combinações dos mesmos; ou combinações de E6 ou E7 com L2 (WO 96/26277). Alternativamente, as proteínas precoces de HPV 16 ou 18 E6 e E7 podem ser apresentadas em uma única molécula, por exemplo, uma fusão de Proteína D-E6/E7. As composições podem conter opcionalmente qualquer uma ou ambas as proteínas E6 e E7 de HPV 18, por exemplo, na forma de uma proteína de fusão de Proteína D-E6 ou Proteína D-E7 ou proteína de fusão de Proteína D E6/E7. As composições podem compreender, ainda, antígenos de outras cepas de HPV, por exemplo, das cepas HPV 31 ou 33.

[0284] Os antígenos podem ser também derivados de parasitas que causa malária. Por exemplo, os antígenos de Plasmodia falciparum incluem RTS,S e TRAP. RTS é uma proteína híbrida que compreende substancialmente toda a porção C-terminal da proteína circunsporozoíta (CS) de P.falciparum ligada por meio de quatro aminoácidos da porção preS2 de antígeno de superfície da Hepatite B ao antígeno de superfície (S) do vírus da hepatite B. Sua estrutura completa é revelada no Pedido de Patente Internacional no PCT/EP92/02591, publicado como o documento no WO 93/10152 que reivindica a prioridade do Pedido de Patente no UK 9124390.7. Quando expressa em levedura, a RTS é produzida como uma partícula de lipoproteína e, quando é coexpressa com o antígeno S de HBV, produz uma partícula misturada conhecida como RTS,S.

[0285] Os antígenos TRAP são descritos no Pedido de Patente Internacional no PCT/GB89/00895 publicado como o documento no WO 90/01496. Uma modalidade da presente revelação é uma vacina contra malária, em que a preparação antigênica compreende uma combinação dos antígenos RTS,S e TRAP. Outros antígenos de plasmódios que são candidatos prováveis para serem componentes de uma vacina contra malária de múltiplos estágios são MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 de P. faciparum e seus análogos em Plasmodium spp.

[0286] Em uma modalidade, o antígeno é derivado de uma célula de câncer, visto que pode ser útil para o tratamento imunoterápico de cânceres. Por exemplo, o antígeno pode ser um antígeno de rejeição de tumor, tal como aqueles para cânceres de próstata, mama, colorretal, pulmão, pancreático, renal ou melanoma. Os antígenos derivados de célula de câncer ou câncer exemplificativos incluem MAGE 1, 3 e MAGE 4 ou outros antígenos MAGE, tais como aqueles revelados no documento no WO99/40188, PRAME, BAGE, Lage (também conhecido como NY Eos 1) SAGE e HAGE (WO 99/53061) ou GAGE (Robbins e Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, páginas 628 a 636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, página 293. Esses exemplos não limitantes de antígenos de câncer são expressos em uma ampla gama de tipos de tumor, tais como melanoma, carcinoma de pulmão sarcoma e carcinoma da bexiga. Consultar, por exemplo, a Patente no US 6.544.518.

[0287] Outros antígenos específicos quanto ao tumor incluem, porém sem restrição, gangliosídeos específicos quanto ao tumor ou associados a tumor, tais como GM2 e GM3 ou conjugados dos mesmos a proteínas carreadoras; ou um hormônio peptídico próprio, tal como hormônio que libera hormônio Gonatrofina de comprimento completo (GnRH, WO 95/20600), um peptídeo curto de 10 aminoácidos de comprimento, útil no tratamento de muitos cânceres. Em outra modalidade, os antígenos de próstata são usados, tais como antígeno específico para próstata (PSA), PAP, PSCA (por exemplo, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95(4) 1.735 a 1.740 1998), PSMA ou, em uma modalidade, um antígeno conhecido como Prostase. (por exemplo, Nelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3.114 a 3.119; Ferguson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96, 3.114 a 3.119; WO 98/12302; Patente no U.S. 5.955.306; WO 98/20117; Patentes nos U.S. 5.840.871 e 5.786.148; WO 00/04149. Outros antígenos específicos para próstata são conhecidos a partir dos documentos nos WO 98/137418, e WO/004149. Outro é STEAP (PNAS 96 14523 14528 7-12 1999).

[0288] Outros antígenos associados a tumor úteis no contexto da presente revelação incluem: Plu -1 (J Biol. Chem 274 (22) 15.633 a 15.645, 1999), HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon et al Bioessays 199, 21:61 a 70, Patente no U.S. 5.654.140) e Criptin (Patente no U.S. 5.981.215). Adicionalmente, os antígenos particularmente relevantes para vacinas na terapia de câncer também compreendem tirosinase e survivina.

[0289] Em outras modalidades, os agentes usados nas composições da presente revelação incluem antígenos associados a doenças respiratórias, tais como aquelas causadas ou exacerbadas por infecção bacteriana (por exemplo, pneumocócica), para profilaxia e terapia de afecções, tais como doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). A COPD é definida fisiologicamente pela presença de obstrução das vias aéreas irreversível ou parcialmente reversível em pacientes com bronquite crônica e/ou enfisema (Am J Respir Crit Care Med. novembro de 1995;152(5 Pt 2):S77 a 121). As exacerbações de COPD são frequentemente causadas por infecção bacteriana (por exemplo, pneumocócica) (Clin Microbiol Rev. abril de 2001;14(2):336 a 363). II. ADJUVANTES

[0290] Em algumas modalidades, o agente é um adjuvante e, assim, as composições que compreendem qualquer uma das partículas de nanoalume descritas no presente documento compreendem um adjuvante, na presença ou ausência de antígeno.

[0291] Em algumas modalidades, o adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em um AS-2, monofosforil lipídio A, monofosforil lipídio A 3-de-O-acilado, IFA, QS21, CWS, TOM, AGPs, oligonucleotídeos contendo CpG, agonistas de receptor similar a Toll (TLR), Leif, saponinas, miméticos de saponina, lipídio A biológico e sintético, imiquimod, gardiquimod, resiquimod, poliI:C, flagelina, GLA, SLA, STING e combinações dos mesmos.

[0292] Em uma modalidade exemplificativa, o adjuvante é GLA. Em uma modalidade exemplificativa, o adjuvante é SLA. A. AGONISTAS DE TLR

[0293] Conforme descrito no presente documento, certas modalidades da presente revelação contemplam compreender as partículas de nanoalume, conforme descrito no presente documento, e, ainda, incluem um ou mais agonistas do receptor similar a toll (agonista de TLR). Os receptores similares a Toll (TLR) incluem receptores transmembrânicos de superfície celular do sistema imunológico inato que conferem capacidade de reconhecimento de fase inicial às células hospedeiras para uma variedade de estruturas moleculares microbianas conservadas, tais como podem estar presentes em ou sobre um grande número de patógenos infecciosos. (por exemplo, Armant et al., 2002 Genome Biol. 3(8):análises 3011.1 a 3011.6; Fearon et al., 1996 Science 272:50; Medzhitov et al., 1997 Curr. Opin. Immunol. 9:4; Luster 2002 Curr. Opin. Immunol. 14:129; Lien et al. 2003 Nat. Immunol. 4:1.162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol. 1:135; Takeda et al., 2003 Ann Rev Immunol. 21:335; Takeda et al. 2005 Int. Immunol. 17:1; Kaisho et al., 2004 Microbes Infect. 6:1.388; Datta et al., 2003 J. Immunol. 170:4102).

[0294] A indução de transdução de sinal mediada por TLR para potencializar a iniciação das respostas imunológicas por meio do sistema imunológico inato pode ser efetuada por agonistas de TLR, que se engatam ao TLR de superfície celular. Por exemplo, lipopolissacarídeo (LPS) pode ser um agonista de TLR através de TLR2 ou TLR4 (Tsan et al., 2004 J. Leuk. Biol. 76:514; Tsan et al, 2004 Am. J. Physiol. Cell Phsiol. 286:C739; Lin et al., 2005 Shock 24:206); poli(inosina-citidina) (polil:C) pode se rum agonista de TLR através de TLR3 (Salem et al., 2006 Vaccine 24:5.119); sequências de CpG (oligodesoxinucleotídeos contendo citosina-guanosina não metilada ou motivos de dinucleotídeo “CpG”, por exemplo, CpG 7909, Cooper et al., 2005 AIDS 19:1.473; CpG 10101 Bayes et al. Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer et al. Expert Opinion on Biological Therapy 5:673; Vollmer et al., 2004 Antimicrob. Agents Chemother. 48:2.314; Deng et al., 2004 J. Immunol. 173:5.148) podem ser agonistas de TLR através de TLR9 (Andaloussi et a., 2006 Glia 54:526; Chen et al., 2006 J. Immunol. 177:2.373); peptidoglicanos podem ser agonistas de TLR2 e/ou TLR6 (Soboll et al., 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao et al., 2005 J. Immunol. 174: 1.566); 3M003 hidrato de (4-amino-2- (etoximetil)-α,α-dimetil-6,7,8,9-tetra-hidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanol, Mol. Wt. 318 Da da 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, que é também uma fonte dos compostos relacionados 3M001 e 3M002; Gorden et al., 2005 J. Immunol. 174:1.259) pode ser um agonista de TLR7 (Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35:1.591) e/ou um agonista de TLR8 (Johansen 2005); flagelina pode ser um agonista de TLR5 (Feuillet et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:12.487); e antígenos da hepatite C podem atuar como agonistas de TLR através de TLR7 e/ou TLR9 (Lee et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1.828; Horsmans et al., 2005 Hepatol. 42:724). Outros agonistas de TLR são conhecidos (por exemplo, Schirmbeck et al., 2003 J. Immunol. 171:5.198) e podem ser usados de acordo com certas modalidades descritas no presente. B. AGONISTAS DE TLR7/8

[0295] São fornecidos no presente documento agonistas de TLR7/8 que podem ser usados nas composições descritas no presente documento. Conforme usado no presente documento, um “agonista de TLR7/8” refere-se a um agonista que afeta suas atividades biológicas através de sua interação com TLR7, TLR8 ou ambos. Tais atividades biológicas incluem, porém sem limitação, a indução de transdução de sinal mediada por TLR7 e/ou TLR8 para potencializar a inibição de respostas imunológicas por meio do sistema imunológico inato. C. AGONISTAS DE TLR4

[0296] São fornecidos no presente documento agonistas de TLR4 que podem ser usados nas composições descritas no presente documento. Em certas modalidades, um agonista de TLR4 usado nas composições no presente documento compreende um adjuvante de lipídio de glucopiranosila (GLA), tais como aqueles descrito nas Publicações de Patente nos US2007/021017, US2009/045033, US2010/037466 e US 2010/0310602, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[0297] Por exemplo, em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula (IV):

[0298] ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que:

[0299] L1, L2, L3, L4, L5 e L6 são iguais ou diferentes e, independentemente, -O-, -NH- ou -(CH2)-;

[0300] L7, L8, L9, e L10 são iguais ou diferentes e, independentemente, ausentes ou -C(=O)-;

[0301] Y1 é um grupo funcional ácido;

[0302] Y2 e Y3 são iguais ou diferentes e, independentemente, -OH, -SH ou um grupo funcional ácido;

[0303] Y4 é -OH ou -SH;

[0304] R1, R3, R5 e R6 são iguais ou diferentes e, independentemente, C8-13 alquila; e

[0305] R2 e R4 são iguais ou diferentes e, independentemente, C6-11 alquila.

[0306] Em algumas modalidades da estrutura de GLA sintético, R1, R3, R5 e R6 são C10 alquila; e R2 e R4 são C8 alquila. Em certas modalidades, R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila; e R2 e R4 são C9 alquila.

[0307] Por exemplo, em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula (V):

[0308] Em uma modalidade específica, R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquila; e R2 e R4 são C12-C20 alquila.

[0309] Em outra modalidade específica, o GLA tem a fórmula apresentada acima, em que R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila; e R2 e R4 são C13 alquila.

[0310] Em outra modalidade específica, o GLA tem a fórmula apresentada acima, em que R1, R3, R5 e R6 são C10 alquila; e R2 e R4 são C8 alquila.

[0311] Em outra modalidade específica, o GLA tem a fórmula apresentada acima, em que R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquila; e R2 e R4 são C9-C20 alquila. Em certas modalidades, R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila; e R2 e R4 são C9 alquila.

[0312] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula (V):

[0313] Em certas modalidades da estrutura de GLA acima, R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquila; e R2 e R4 são C9-C20 alquila. Em certas modalidades, R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila; e R2 e R4 são C9 alquila.

[0314] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula (VI):

[0315] Em certas modalidades da estrutura de GLA acima, R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquila; e R2 e R4 são C9-C20 alquila. Em certas modalidades, R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila; e R2 e R4 são C9 alquila.

[0316] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula (VII):

[0317] Em certas modalidades da estrutura de GLA acima, R1, R3, R5 e R6 são C11-C20 alquila; e R2 e R4 são C9-C20 alquila. Em certas modalidades, R1, R3, R5 e R6 são C11 alquila; e R2 e R4 são C9 alquila.

[0318] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula (SLA):

[0319] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula:

[0320] Em certas modalidades, o agonista de TLR4 é um adjuvante de GLA sintético que tem a seguinte estrutura de Fórmula:

[0321] Em outra modalidade, um derivado de lipídio A atenuado (ALD) é incorporado nas composições descritas no presente documento. ALDs são moléculas similares a lipídio A que foram alteradas ou construídas de modo que a molécula exiba efeitos adversos menores ou diferentes do lipídio A. Esses efeitos adversos incluem pirogenicidade, reatividade e toxicidade de Shwarzman local conforme avaliados no ensaio de dose letal a 50% de embrião de galinha (CELD50). ALDs úteis de acordo com a presente revelação incluem monofosforil lipídio A (MLA) e monofosforil lipídio A 3-desacilado (3D-MLA). MLA e 3D-MLA são conhecidos e não precisam ser descritos em detalhes no presente documento. Consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 4.436.727 emitida em 13 de março de 1984, atribuída a Ribi ImmunoChem Research, Inc., que revela monofosforil lipídio A e sua fabricação. A Patente no U.S. 4.912.094 e certificado de reexame B1 Patente no U.S. 4.912.094 por Myers, et at, também atribuída a Ribi ImmunoChem Research, Inc., incorpora monofosforil lipídio A 3-desacilado e um método para sua fabricação. As revelações de cada uma dessas patentes em relação a MLA e 3D-MLA estão incorporadas no presente documento a título de referência.

[0322] Nos compostos agonistas de TLR4 acima, a carga geral pode ser determinada de acordo com os grupos funcionais na molécula. Por exemplo, um grupo fosfato pode ser carregado negativamente neutro, dependendo do estado de ionização do grupo fosfato. D. NUCLEOTÍDEOS CPG

[0323] Em uma modalidade, o adjuvante é um oligonucleotídeo imunoestimulatório contendo dinucleotídeos CpG (por exemplo, Patente no U.S. 6.544.518). Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios contendo dinucleotídeos CpG não metilados (“CpG”) são conhecidos como sendo adjuvantes. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos CpG da presente revelação podem conter dois ou mais motivos de dinucleotídeo CpG separados por pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis ou mais nucleotídeos.

[0324] Os exemplos de sequências de oligonucleotídeos CpG são revelados nas seguintes publicações; para certas modalidades reveladas no presente documento, as sequências podem conter ligações internucleotídeo modificadas por fosforotioato:

[0325] CPG 7909: Cooper et al., “CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV- infected adults.” AIDS, 23 de setembro de 2005;19(14):1.473 a 1.479.

[0326] CpG 10101: Bayes et al., “Gateways to clinical trials.” Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. abril de 2005;27(3):193 a 219.

[0327] Vollmer J., “Progress in drug development of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9.” Expert Opinion on Biological Therapy. Maio de 2005; 5(5): 673 a 682

[0328] Os oligonucleotídeos CpG alternativos podem compreender variantes das sequências descritas nas publicações citadas acima que diferem pelo fato de que têm substituições, inserções, deleções e/ou adições de sequência de nucleotídeos irrelevantes às mesmas. Os oligonucleotídeos CpG utilizados, em certas modalidades da presente revelação, podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, o documento no EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser sintetizados com o uso de um sintetizador automatizado. Os oligonucleotídeos são tipicamente desoxinucleotídeos. Em uma modalidade, a ligação internucleotídeo no oligonucleotídeo é fosforoditioato, ou uma ligação de fosforoditioato, embora fosfodiésteres estejam também dentro do escopo das modalidades contempladas no presente. Os oligonucleotídeos que compreendem diferentes ligações internucleotídeo são também contemplados, por exemplo, fosfodiésteres de fosforoditioato misturados. Outras ligações internucleotídeo que estabilizam o oligonucleotídeo podem ser também usadas. III. ORGANISMOS E VÍRUS

[0329] Em algumas modalidades, o agente é um organismo. Assim, nessas modalidades, as composições descritas compreendem as partículas de nanoalume fornecidas no presente documento e compreendem, ainda, um organismo.

[0330] Por exemplo, a bactéria Mycobacterium tuberculosis causa tuberculose (TB). Atualmente, a vacinação com bactérias vivas é o método mais eficaz para induzir imunidade protetora contra tuberculose. A Mycobacterium mais comum empregada para esse propósito é Bacilo Calmette-Guerin (BCG), uma cepa avirulenta de Mycobacterium bovis. Assim, em algumas modalidades, a composição compreende uma partícula de nanoalume e uma Mycobacterium.

[0331] Em algumas modalidades, o agente é um vírus ou um genoma viral. Assim, nessas modalidades, as composições descritas compreendem as partículas de nanoalume fornecidas no presente documento e compreendem, ainda, uma partícula viral, envelope viral isolado ou genoma viral. B. ASSOCIAÇÃO COM A PARTÍCULA DE NANOALUME

[0332] Nas modalidades fornecidas no presente documento, os agentes das composições fornecidas no presente documento associam-se à partícula de nanoalume. Em algumas modalidades, os agentes das composições fornecidas no presente documento ligam-se à partícula de nanoalume. Em algumas modalidades, os agentes das composições fornecidas no presente documento são adsorvidos à partícula de nanoalume. Tal ligação ou adsorção refere-se a uma interação entre moléculas ou porções das mesmas que exibem afinidade ou capacidade de ligação mútua, tipicamente devido à ligação ou interação específica ou não específica, incluindo, porém sem limitação, interações bioquímicas, fisiológicas e/ou químicas. Em certas modalidades, a ligação a uma partícula de nanoalume pode ser determinada por espectroscopia UV ou eletroforese em gel.

[0333] A adsorção em partícula de nanoalume pode ocorrer, de modo geral, porém sem limitação, pelos seguintes mecanismos: interação eletrostática e troca de ligante. A interação eletrostática usa a presença de cargas opostas nos componentes sob usa certa condição de solução. A troca de ligante usa um grupo fosfato em um dos com para troca por um grupo hidroxila de outro componente. Para troca de ligante, os grupos fosfato e os grupos hidroxila acessíveis nos componentes são usados. Em algumas modalidades, para preparar uma composição com um agente, um antígeno ou um adjuvante, considera-se a carga e a presença de grupos fosfato e grupos hidroxila no agente. I. TROCA DE LIGANTE

[0334] Em certas modalidades, em relação ao mecanismo de troca de ligante, pode haver troca de ligante entre o agente e o agente e o sal de alumínio.

[0335] Em certas modalidades, pode haver troca de ligante entre um agente adjuvante e o sal de alumínio. Certos componentes na composição adjuvante compreendem grupos fosfato enquanto outros componentes determinados compreendem grupos hidroxila, possibilitando, assim, troca de ligante. Por exemplo, certos agonistas de TLR4 compreendem grupos fosfato. AdjuPhos® compreende grupos fosfato. Os grupos hidroxila estão presentes pelo menos nos seguintes componentes: antígenos, agonistas de TLR, lipídio/tensoativo e Alhydrogel®. II. INTERAÇÃO ELETROSTÁTICA

[0336] Em certas modalidades, em relação ao mecanismo de interação eletrostática, pode haver troca de ligante entre o agente e o agente e o sal de alumínio.

[0337] Em certas modalidades exemplificativas em relação ao mecanismo de interação eletrostática, uma composição de vacina é substancialmente carregada de modo neutro a cerca de pH fisiológico. Se o antígeno para a composição de vacina for carregado, os componentes para a composição adjuvante podem ser selecionados para neutralizar a carga do antígeno para fornecer uma composição de vacina carregada de modo substancialmente neutro. Se o antígeno para a composição de vacina for carregado de modo substancialmente neutro, os componentes para a composição adjuvante podem ser selecionados para manter a carga substancialmente neutra do antígeno para fornecer uma composição de vacina carregada de modo substancialmente neutro.

[0338] Conforme observado acima, cada um dos componentes na composição pode ser caracterizado por negativamente carregado, positivamente carregado ou neutralmente carregado. C. PRESERVAÇÃO DE DOSE

[0339] Em algumas modalidades, uma composição que compreende as partículas de nanoalume fornecidas no presente documento e que compreende, ainda, um agente exibe preservação de dose e/ou altos níveis de expressão in vivo. Em uma modalidade, o uso de uma composição que compreende qualquer uma das partículas de nanoalume fornecidas no presente documento permite o uso de pelo menos 5% menos, pelo menos 10% menos, pelo menos 20% menos, pelo menos 25% menos, pelo menos 30% menos, pelo menos 40% menos, pelo menos 50% menos, pelo menos 60% menos, pelo menos 75% menos, pelo menos 80% menos, pelo menos 90% menos, pelo menos 95% menos ou até mesmo pelo menos 99% menos do agente, em comparação à quantidade de agente que poderia ter sido usada para atingir o mesmo efeito biológico e/ou fisiológico, se uma composição que compreende qualquer uma das partículas de nanoalume fornecidas no presente documento não tiver sido usada para entrega. Em uma modalidade, o uso de uma composição que compreende qualquer uma das partículas de nanoalume fornecidas no presente documento permite o uso de uma dose de cerca de 10 μg, 5 μg, 2 μg, 1 μg, 10 ng ou 1 ng de um agente para atingir o efeito biológico e/ou fisiológico. Em uma modalidade particular, o uso de uma composição que compreende qualquer uma das partículas de nanoalume fornecidas no presente documento permite o uso de uma dose de um polipeptídeo de cerca de 10 μg, 5 μg, 2 μg, 1 μg ou 10 ng, 1 ng de um agente para atingir o efeito biológico e/ou fisiológico desejado. Em uma modalidade particular, o uso de uma composição que compreende qualquer uma das partículas de nanoalume fornecidas no presente documento permite o uso de uma dose de um polipeptídeo de cerca de 10 μg, 5 μg, 2 μg, 1 μg,10 ng ou 1 ng de um agente para atingir uma resposta imunológica. Em uma modalidade particular, o uso de uma composição que compreende qualquer uma das partículas de nanoalume fornecidas no presente documento permite o uso de uma dose de um polinucleotídeo de cerca de 10 μg, 5 μg, 2 μg, 1 μg, 10 ng ou 1 ng de um agente para atingir o efeito biológico e/ou fisiológico desejado. Em uma modalidade particular, o uso de uma composição que compreende qualquer uma das partículas de nanoalume fornecidas no presente documento permite o uso de uma dose de um polinucleotídeo de cerca de 10 μg, 5 μg, 2 μg, 1 μg ou 10 ng, 1 ng de um agente para atingir uma resposta imunológica. Em uma modalidade particular, o uso de uma composição que compreende qualquer uma das partículas de nanoalume fornecidas no presente documento permite o uso de uma dose de um polinucleotídeo de RNA de cerca de 100 ng, 50 ng, 30 ng, 10 ng ou 1 ng de um agente de RNA para atingir uma resposta imunológica. Em uma modalidade particular, o uso de uma composição que compreende qualquer uma das partículas de nanoalume fornecidas no presente documento permite o uso de uma dose de um polinucleotídeo de vetor de RNA de replicon de cerca de 10 μg, 5 μg, 2 μg, 1 μg,10 ng ou 1 ng de um agente para atingir uma resposta imunológica. Em uma modalidade particular, o uso de uma composição que compreende qualquer uma das partículas de nanoalume fornecidas no presente documento permite o uso de uma dose de um polinucleotídeo de vetor de mRNA de cerca de 10 μg, 5 μg, 2 μg, 1 μg,10 ng ou 1 ng de um agente para atingir uma resposta imunológica.

[0340] Em uma modalidade, a preservação de dose é atingida com 300 vezes menos RNA necessários para entregar o polinucleotídeo de RNA para atingir a expressão do antígeno de polipeptídeo para gerar uma resposta imunológica comparada ao RNA não uniforme. Em uma modalidade, a preservação de dose é atingida com 100 vezes menos RNA necessários para entregar o polinucleotídeo de RNA para atingir a expressão do antígeno de polipeptídeo para gerar uma resposta imunológica comparada ao RNA não uniforme. Em uma modalidade, a preservação de dose é atingida com 50 vezes menos RNA necessários para entregar o polinucleotídeo de RNA para atingir a expressão do antígeno de polipeptídeo para gerar uma resposta imunológica comparada ao RNA não uniforme. Em uma modalidade, a preservação de dose é atingida com 30 vezes menos RNA necessários para entregar o polinucleotídeo de RNA para atingir a expressão do antígeno de polipeptídeo para gerar uma resposta imunológica comparada ao RNA não uniforme. Em uma modalidade, a preservação de dose é atingida com 10 vezes menos RNA necessários para entregar o polinucleotídeo de RNA para atingir a expressão do antígeno de polipeptídeo para gerar uma resposta imunológica comparada ao RNA não uniforme. D. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0341] São fornecidas no presente documento composições farmacêuticas que compreendem as partículas de nanoalume e as composições descritas no presente documento. Em algumas modalidades, a composição que compreende uma partícula de nanoalume compreende, ainda, um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma composição de vacina. As composições descritas no presente documento podem ser administradas a um sujeito para qualquer propósito terapêutico ou diagnóstico. Em algumas modalidades, as composições descritas no presente documento são usadas para estimular uma resposta imunológica no sujeito (incluindo uma resposta não específica e uma resposta específica para antígeno). Nas modalidades fornecidas no presente documento, o sujeito é um mamífero (por exemplo, um animal, incluindo animais de fazenda (vacas, porcos, cabras, cavalos, etc.), animais de estimação (gatos, cães, etc.) e roedores (ratos, camundongos, etc.) ou um ser humano). Em particular, as formulações e as composições da presente invenção que promovem uma resposta imunológica de Th1 podem ser usadas para estimular tal resposta em um sujeito.

[0342] As composições farmacêuticas compreendem, de modo geral, composições descritas no presente documento e podem compreender, ainda, um ou mais componentes conforme fornecidos no presente documento que são selecionados dentre um antígeno, agonistas adicionais ou um construto de expressão recombinante, em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.

[0343] Nas modalidades fornecidas no presente documento, a composição farmacêutica pode ser filtrada através de um filtro de 0,45 mícron. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode ser filtrada através de um filtro de 0,20 mícron. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode ser filtrada através de um filtro de 0,22 mícron.

[0344] Em uma modalidade, a presente revelação refere-se a uma composição farmacêutica que compreende uma partícula de nanoalume que compreende um agonista de TLR7/8 ou um agonista de TLR4. Tal composição pode ser usada para “monoterapia”, em que o agonista de TLR7/8 ou o agonista de TLR 4, conforme descrito no presente documento, é formulado em uma composição e a composição é substancialmente desprovida de outros antígenos e é administrada a um sujeito a fim de estimular uma resposta imunológica, por exemplo, uma resposta imunológica não específica ou uma resposta imunológica específica para antígeno, para o propósito de diagnóstico, tratando ou prevenindo uma doença ou outra afecção, tal como uma infecção por um organismo.

[0345] Em outras modalidades, a composição farmacêutica é uma composição de vacina que compreende ambas as composições descritas no presente documento e um antígeno e pode compreender, ainda, um ou mais componentes, conforme fornecido no presente documento, em combinação com um carreador, um excipiente ou um diluente farmaceuticamente aceitável. Os carreadores ilustrativos serão não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas.

[0346] Os carreadores ilustrativos serão não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas.

[0347] Nas modalidades fornecidas no presente documento, uma dosagem de cerca de 1 ng/kg a cerca de 1 mg/kg da composição farmacêutica é administrada. Nas modalidades fornecidas no presente documento, uma dosagem de cerca de 1 ng a cerca de 1 mg da composição farmacêutica é administrada. Em algumas modalidades, uma dosagem de cerca de 500 μg, 200 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg, 20 μg, 15 μg, 10 μg, 5 μg, 2 μg, 1 μg, 10 ng ou 1 ng da composição farmacêutica é administrada. Será evidente para aqueles versados na técnica que o número e a frequência de administração dependerão da resposta do sujeito. “Carreadores farmaceuticamente aceitáveis” para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica e são descritos, por exemplo, em Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Por exemplo, solução salina estéril e solução salina tamponada com fosfato em pH fisiológico podem ser usadas. Conservantes, estabilizantes, corantes e mesmo agentes flavorizantes fornecidos na composição farmacêutica. Por exemplo, benzoato de sódio, ácido ascórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico podem ser adicionados como conservantes. Id. em 1.449. Adicionalmente, antioxidantes e agentes de suspensão podem ser usados. Id.

[0348] “Sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a sais dos compostos da presente revelação derivados da combinação de tais compostos e um ácido orgânico ou inorgânico (sais de adição ácidos) ou uma base orgânica ou inorgânica (sais de adição básicos). As composições da presente revelação podem ser usadas nas formas de sal ou base livre, com ambas as formas sendo consideradas dentro do escopo da presente revelação.

[0349] As composições farmacêuticas podem estar em qualquer forma que permita que a composição seja administrada a um paciente. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um sólido, um líquido ou um gás (aerossol). As vias de administração típicas incluem, sem limitação, oral, topical, parenteral (por exemplo, por via sublingual ou por via bucal), sublingual, retal, vaginal e intranasal (por exemplo, como uma aspersão). O termo parenteral conforme usado no presente documento inclui administração iontoforética (por exemplo, U.S. 7.033.598; 7.018.345; 6.970.739), sonoforética (por exemplo, U.S. 4.780.212; 4.767.402; 4.948.587; 5.618.275; 5.656.016; 5.722.397; 6.322.532; 6.018.678), térmica (por exemplo, U.S. 5.885.211; 6.685.699), transdérmica passiva (por exemplo, U.S. 3.598.122; 3.598.123; 4.286.592; 4.314.557; 4.379.454; 4.568.343; 5.464.387; Relatório descritivo da Patente no US 2232892; U.S. 6.871.477; 6.974.588; 6.676.961), por microagulha (por exemplo, U.S. 6.908.453; 5.457.041; 5.591.139; 6.033.928) e administração por injeção de jato e também injeções subcutâneas, técnicas de injeção ou infusão intravenosa, intramuscular, intrasternal, intracavernosa, intratecal, intrameatal, intrauretral. Em uma modalidade particular, uma composição conforme descrito no presente documento (incluindo composições de vacina e farmacêuticas) é administrada por via intradérmica por uma técnica selecionada dentre iontoforese, microcavitação, sonoforese ou microagulhas.

[0350] A composição farmacêutica pode ser formulada de modo a permitir que os ingredientes ativos contidos na mesma estejam biodisponíveis mediante administração da composição a um sujeito. As composições que serão administradas a um sujeito assumem a forma de uma ou mais unidades de dosagem, em que, por exemplo, um tablete pode ser uma unidade de dosagem única, e um recipiente de um ou mais compostos da presente revelação na forma de aerossol pode conter uma pluralidade de unidades de dosagem.

[0351] Para administração oral, um excipiente e/ou aglutinante podem estar presentes. Os exemplos são sacarose, caulim, glicerina, dextrinas de amido, alginato de sódio, carboximetilcelulose e etil celulose. Agentes corantes e/ou flavorizantes podem estar presentes. Um invólucro de revestimento pode ser empregado.

[0352] A composição pode estar na forma de um líquido, por exemplo, um elixir, um xarope, uma solução, uma emulsão ou uma suspensão. O líquido pode ser para administração oral ou para entrega por injeção, como dois exemplos. Quando destinadas à administração oral, as composições podem conter um ou mais dentre um agente adoçante, conservantes, corante/colorante e intensificador de sabor. Em uma composição destinada a ser administrada por injeção, um ou mais dentre um tensoativo, um conservante, um agente umectante, um agente dispersante, um agente suspensor, um tampão, um estabilizante e um agente isotônico podem estar incluídos.

[0353] Uma composição farmacêutica líquida, conforme usado no presente documento, seja na forma de uma solução, uma suspensão ou outra forma similar, pode incluir um ou mais dos seguintes carreadores ou excipientes: diluentes estéreis, tal como água para injeção, solução salina, de preferência, solução salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos, tais como esqualeno, ou esqualeno, óleo mineral, um mono-oleato de manida, colesterol e/ou mono ou diglicerídeos sintéticos que podem servir como o solvente ou o meio de suspensão, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, tal como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes, tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tal como ácido etilenodiaminatetra-acético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajuste de tonicidade, tal como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parenteral pode ser fechada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de múltiplas doses produzidos a partir de vidro ou plástico. Uma composição farmacêutica injetável é, de preferência, estéril.

[0354] Em outra modalidade, uma composição da presente revelação é formulada de uma maneira que pode ser aerossolizada.

[0355] Pode ser também desejável incluir outros componentes em uma composição farmacêutica, tal como veículos de entrega, incluindo, porém sem limitação, sais de alumínio, emulsões de água em óleo, veículos oleosos biodegradáveis, emulsões de óleo em água, microcápsulas biodegradáveis e lipossomas. Os exemplos de substâncias imunoestimulatórias adicionais (coadjuvantes) para uso em tais veículos são também descritos acima e podem incluir N-acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP), glucano, IL-12, GM-CSF, interferon gama e IL-12.

[0356] Embora qualquer carreador adequado conhecido por aqueles versados na técnica possa ser empregado nas composições farmacêuticas da presente revelação, o tipo de carreador variará dependendo do modo de administração e se uma liberação sustentada for desejada. Para administração parenteral, tal como injeção subcutânea, o carreador pode compreender água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, qualquer um dos carreadores acima ou um carreador sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose e carbonato de magnésio pode ser empregado. Microesferas biodegradáveis (por exemplo, galactídeo poliláctico) podem ser também empregadas como carreadores para as composições farmacêuticas da presente revelação. As microesferas biodegradáveis adequadas são reveladas, por exemplo, nas Patentes nos U.S. 4.897.268 e 5.075.109. Nesse sentido, é preferencial que a microesfera seja maior que aproximadamente 25 mícrons.

[0357] As composições farmacêuticas podem conter, também, diluentes, como tampões, antioxidantes, como ácido ascórbico, polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos), proteínas, aminoácidos, carboidratos incluindo glicose, sacarose ou dextrinas, agentes quelantes, como EDTA, glutationa e outros estabilizantes e excipientes. A solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica não específica são diluentes adequados exemplificativos. Por exemplo, um produto pode ser formulado como um liofilizado com o uso de soluções de excipiente apropriadas (por exemplo, sacarose) como diluentes.

[0358] Conforme descrito acima, em certas modalidades, a presente revelação inclui composições que podem ter capacidade de entregar moléculas de ácido nucleico que codificam antígenos desejados. Tais composições incluem vetores virais recombinantes (por exemplo, retrovírus (consultar os documentos nos WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 e WO 94/03622), adenovírus (consultar Berkner, Biotechniques 6:616 a 627, 1988; Li, et al, Hum. Gene Ther. 4:403 a 409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5:130 a 134, 1993; e Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215 a 219, 1994), vírus da varíola (consultar a Patente no U.S. 4.769.330; Patente no U.S. 5.017.487; e documento no WO 89/01973)), moléculas de ácido nucleico de construto de expressão recombinante em complexo com uma molécula policatiônica (consultar o documento no WO 93/03709) e ácidos nucleicos associados a lipossomas (consultar Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7.851, 1987). Em certas modalidades, o DNA pode estar ligado a adenovírus morto ou inativado (consultar Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147 a 154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094, 1992). Outras composições adequadas incluem ligante de DNA (consultar Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16.985 a 16.987, 1989) e combinações de lipídio e DNA (consultar Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7.413 a 7.417, 1989).

[0359] Em certas modalidades, uma composição líquida destinada à administração parenteral ou oral deve conter uma quantidade de composição de vacina de modo que uma dosagem adequada seja obtida. Tipicamente, essa quantidade é pelo menos 0,01% em peso de uma antígeno na composição. Quando destinada à administração oral, essa quantidade pode ser variada para estar entre 0,1 e cerca de 70% do peso da composição. As composições orais podem conter cerca de 4% e cerca de 50% do antígeno. As composições e preparações podem ser preparadas de modo que uma unidade de dosagem parenteral contenha entre 0,01 a 1% em peso de composição ativa.

[0360] A composição farmacêutica pode ser destinada à administração tópica, em cujo caso o carreador pode compreender adequadamente uma solução, uma emulsão, uma pomada ou uma base em gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais dos seguintes: petrolato, lanolina, polietilenoglicóis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes, tal como água e álcool, e emulsificantes e estabilizantes. Agentes espessores podem estar presentes em uma composição farmacêutica para administração tópica. Se destinada à administração transdérmica, a composição pode incluir um emplastro transdérmico ou um dispositivo de iontoforese. As formulações para uso tópico podem conter uma concentração do antígeno (por exemplo, composição de vacina de antígeno de GLA) ou GLA (por exemplo, composição adjuvante imunológica; GLA está disponível junto à Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; por exemplo, número do produto 699800) de cerca de 0,1 a cerca de 10% em p/v (peso por volume unitário).

[0361] A composição pode se destinar à administração retal, na forma, por exemplo, de um supositório, que derreterá no reto e liberará o fármaco. A composição para administração retal pode conter uma base oleaginosa como um excipiente não irritante adequado. Tais bases incluem, sem limitação, lanolina, manteiga de cacau e polietilenoglicol. Nos métodos da presente revelação, as composições de vacina/adjuvantes podem ser administradas através do uso de inserto (ou insertos), microesfera (ou microesferas), formulação (ou formulações) de liberação temporizada, emplastro (ou emplastros) ou formulação (ou formulações) de liberação rápida. V. USOS DE PARTÍCULAS DE NANOALUME E COMPOSIÇÕES A. PRODUTOS TERAPÊUTICOS

[0362] Em algumas modalidades, o agente é útil para propósitos terapêuticos. Assim, em algumas modalidades, as composições descritas compreendem as partículas de nanoalume fornecidas no presente documento e compreendem, ainda, um agente para o tratamento de uma doença, uma afecção ou um distúrbio.

[0363] Em algumas modalidades, o agente é útil para o tratamento ou a prevenção de alergia, câncer, doença infecciosa, autoimunidade ou vício.

[0364] Nas modalidades reveladas no presente documento, as composições compreendem antígenos de câncer. Em algumas modalidades, uma composição de vacina compreende um antígeno de câncer que será útil contra qualquer câncer caracterizado por expressão de antígeno associada a tumor, tal como expressão de HER-2/neu ou outros antígenos específicos para câncer ou associados a câncer.

[0365] As composições e os métodos de acordo com certas modalidades da presente revelação podem também ser usadas para a profilaxia ou a terapia de doenças autoimunes, que incluem doenças, afecções ou distúrbios, em que o sistema imunológico de um hospedeiro ou sujeito media de modo prejudicial uma resposta imunológica que é direcionada contra seus próprios tecidos, células, biomoléculas (por exemplo, peptídeos, polipeptídeos, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, proteolipídios, lipídios, glicolipídios, ácidos nucleicos, tais como RNA e DNA, oligossacarídeos, polissacarídeos, proteoglicanos, glicosaminoglicanos, ou similares, e outros componentes moleculares das células e tecidos do sujeito) ou epítopos (por exemplo, estruturas de reconhecimento imunologicamente definidas, tais como aquelas reconhecidas por uma região determinante de complementaridade (CDR) de região variável de anticorpo ou por um CDR de receptor de célula T.

[0366] As doenças autoimunes são, assim, caracterizadas por uma resposta imunológica anormal que envolve células ou anticorpos que são, em qualquer caso, direcionados contra tecidos autólogos normais. As doenças autoimunes em mamíferos podem ser, de modo geral, classificadas em uma de duas categorias diferentes: doença mediada por célula (isto é, célula T) ou distúrbios mediados por anticorpo. Os exemplos não limitantes de doenças autoimunes mediadas por célula incluem esclerose múltipla, artrite reumatoide, tiroidite de Hashimoto, diabetes mellitus tipo I (diabetes juvenil) e uvoretinite autoimune. Os distúrbios autoimunes mediados por anticorpo incluem, porém sem limitação, miastenia grave, lúpus eritematoso sistêmico (ou SLE), doença de Graves, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia autoimune, asma autoimune, crioglobulinemia, púrpura trombocitopênica trômbica, esclerose biliar primária e anemia perniciosa. O antígeno (ou antígenos) associado a: lúpus eritematoso sistêmico são proteínas de ácido ribonucleico nucleares pequenas (snRNP); doença de Graves é o receptor de tirotropina, tiroglobulina e outros componentes de células epiteliais da tiroide (Akamizu et al., 1996; Kellerman et al., 1995; Raju et al., 1997; e Texier et al., 1992); pênfigo são antígenos de pênfigo similares à caderina, tais como desmogleína 3 e outras moléculas de adesão (Memar et al., 1996: Stanley, 1995; Plott et al., 1994; e Hashimoto, 1993); e púrpura trombocitopênica trômbica são antígenos de plaquetas. (Consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 6.929.796; Gorski et al. (Eds.), Autoimmunity, 2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA; Radbruch e Lipsky, P.E. (Eds.) Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation (Curr. Top. Microbiol. and Immunol.) 2001, Springer, NY.)

[0367] A autoimunidade exerce um papel em mais de 80 doenças diferentes, incluindo diabetes tipo 1, esclerose múltipla, lúpus, artrite reumatoide, escleroderma e doenças da tireoide. Faltam estimativas quantitativas vigorosas de morbidade para a maioria das doenças autoimunes. Os estudos mais recentes realizados no final dos anos 90 revelam que as doenças autoimunes são a terceira maior enfermidade mais comum nos Estados Unidos; e as doenças autoimunes mais comuns afetam mais de 8,5 milhões de americanos. As estimativas atuais da prevalência da doença estão na faixa de 5 a 8 por cento da população dos Estados Unidos. A maioria das doenças autoimunes afetam desproporcionalmente mulheres. As mulheres têm 2,7 vezes mais probabilidade que os homens de adquirir uma doença autoimune. As mulheres são mais suscetíveis às doenças autoimunes; os homens parecem ter níveis mais altos de atividade de célula exterminadora natural do que as mulheres. (Jacobsen et al, Clinical Immunology and Immunopathology, 84:223 a 243, 1997.)

[0368] As composições fornecidas no presente documento que podem ser usadas para induzir imunidade protetora, por exemplo, contra tuberculose incluem o uso de polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção imunogênica de uma ou mais proteínas de Mycobacterium e moléculas de DNA e RNA que codificam tais polipeptídeos. Adicionalmente, tais compostos podem ser formulados em vacinas e/ou composições farmacêuticas para imunização contra infecção por Mycobacterium. (Patentes nos U.S. 6.949.246 e 6.555.653).

[0369] Em certas modalidades, as composições da presente revelação serão particularmente aplicáveis no tratamento do sujeito idoso e/ou com imunossupressão, incluindo sujeitos em diálise renal, sujeitos em quimioterapia e/ou radioterapia, receptores de transplante e similares. Tais indivíduos, de modo geral, exibem respostas imunológicas diminuídas a vacinas e, portanto, o uso das composições da presente revelação pode intensificar as respostas imunológicas atingidas nesses sujeitos.

[0370] Em outras modalidades, as composições da presente revelação incluem antígenos associados a doenças respiratórias, tais como aquelas causadas ou exacerbadas por infecção bacteriana (por exemplo, pneumocócica), para profilaxia e terapia de afecções, tais como doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD).

[0371] Adicionalmente a procedimentos in vivo diretos, procedimentos ex vivo podem ser usados em que as células são removidas de um hospedeiro, modificadas e colocadas no mesmo ou em outro animal hospedeiro. Será evidente que se pode utilizar qualquer uma das composições indicadas acima para introdução de moléculas de ácido nucleico que codificam antígeno em células de tecido em um contexto ex vivo. Os protocolos para métodos virais, físicos e químicos de absorção são bem conhecidos na técnica.

[0372] Consequentemente, a presente revelação é útil para intensificar ou produzir, em um hospedeiro, um pacientes ou em cultura celular, uma resposta imunológica. Conforme usado no presente documento, o termo “sujeito” refere-se a qualquer mamífero. Um paciente pode ser afligido com uma doença infecciosa, câncer, tal como câncer de mama ou uma doença autoimune, ou pode ser normal (isto é, sem doença e/ou infecção detectável). Uma “cultura celular” é qualquer preparação contendo células imunocompetentes ou células isoladas do sistema imunológico (incluindo, porém sem limitação, células T, macrófagos, monócitos, células B e células dendríticas). Tais células podem ser isoladas por qualquer uma dentre uma variedade de técnicas bem conhecidas por aqueles de habilidade comum na arte (por exemplo, centrifugação por densidade Ficoll-hypaque). As células podem (porém não precisam) ter sido isoladas de um paciente afligido com câncer e podem ser introduzidas em um paciente após o tratamento. B. VACINA

[0373] A presente revelação assim fornece composições para alterar (isto é, aumentar ou diminuir de uma maneira estatisticamente significativa, por exemplo, em relação a um controle adequado conforme será familiar às pessoas versadas na técnica) respostas imunológicas em um hospedeiro que podem montar uma resposta imunológica. Conforme será conhecido pelas pessoas que têm habilidade comum na técnica, uma resposta imunológica pode ser qualquer alteração ativa da situação imunológica de um hospedeiro, que pode incluir qualquer alteração na estrutura ou na função de um ou mais tecidos, órgãos, células ou moléculas que participam na manutenção e/ou regulação da situação imunológica do hospedeiro. Tipicamente, as respostas imunológicas podem ser detectadas por qualquer um de uma variedade de parâmetros bem conhecidos, incluindo, porém sem limitação, determinação in vivo ou in vitro de: imunoglobulinas ou anticorpos solúveis; mediadores solúveis, tais como citocinas, linfocinas, quimiocinas, hormônios, fatores de crescimento e similares assim como outro peptídeo pequeno solúvel, carboidrato, nucleotídeo e/ou mediadores de lipídio; mudanças de estado de ativação celular conforme determinado por propriedades estruturais ou funcionais alteradas de células do sistema imunológico, por exemplo, proliferação celular, mobilidade alterada, indução de atividade especializadas, tais como expressão gênica específica ou comportamento citolítico; diferenciação celular por células do sistema imunológico, incluindo perfis de expressão de antígeno de superfície alterados ou o início de apoptose (morte celular programada); ou qualquer outro critério pelo qual a presença de uma resposta imunológica possa ser detectada.

[0374] A determinação da indução de uma resposta imunológica pelas composições da presente revelação pode ser estabelecida por qualquer um dentre inúmeros ensaios imunológicos bem conhecidos com os quais aqueles que têm habilidade comum na técnica estarão prontamente familiarizados. Tais ensaios incluem, porém sem limitação, determinação in vivo ou in vitro de: anticorpos solúveis; mediadores solúveis, tais como citocinas, linfocinas, quimiocinas, hormônios, fatores de crescimento e similares assim como outro peptídeo pequeno solúvel, carboidrato, nucleotídeo e/ou mediadores de lipídio; mudanças de estado de ativação celular conforme determinado por propriedades estruturais ou funcionais alteradas de células do sistema imunológico, por exemplo, proliferação celular, mobilidade alterada, indução de atividade especializadas, tais como expressão gênica específica ou comportamento citolítico; diferenciação celular por células do sistema imunológico, incluindo perfis de expressão de antígeno de superfície alterados ou o início de apoptose (morte celular programada). Os procedimentos para realizar esses e ensaios similares são amplamente conhecidos e podem ser encontrados, por exemplo, em Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998; consultar também Current Protocols in Immunology, consultar também, por exemplo, Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986 Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell e Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, 1979 Freeman Publishing, San Francisco, CA; Green e Reed, 1998 Science 281:1.309 e referências citadas nos mesmos).

[0375] A detecção da proliferação de células T reativas a antígeno pode ser realizada por uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, a proliferação de células T pode ser detectada medindo-se a taxa de síntese de DNA, e a especificidade de antígeno pode ser determinada controlando-se os estímulos (tal como, por exemplo, células apresentadoras de antígeno pulsadas por antígeno de controle ou antígeno desejado específicas) aos quais as células T reativas a antígeno candidato são expostas. As células T que foram estimuladas a proliferar exibem uma taxa aumentada de síntese de DNA. Uma forma típica de mediar a taxa de síntese de DNA é, por exemplo, identificando por pulso culturas de células T com timidina titulada, um precursor de nucleosídeo que é incorporado em DNA recém- sintetizado. A quantidade de timidina titulada incorporada pode ser determinada com o uso de um espectrofotômetro de cintilação líquida. Outras formas de detectar a proliferação de células t incluem medir aumentos em produção de interleucina-2 (IL-2), fluxo de Ca2+ ou absorção de corante, tal como 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio. Alternativamente, a síntese de linfocinas (tal como interferon-gama) pode ser medida ou o número relativo de células T que pode responder a um antígeno particular pode ser quantificado.

[0376] A detecção de produção de anticorpos específico para antígeno pode ser atingida, por exemplo, avaliando-se uma amostra (por exemplo, uma amostra contendo imunoglobulina, tal como soro, plasma ou sangue) de um hospedeiro tratado com uma vacina de acordo com a presente revelação com o uso de metodologias in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA), ensaios de imunossorvente ligados a enzima (ELISA), diálise de equilíbrio ou imunoblot de fase sólida, incluindo Western blot. Nas modalidades, ensaios ELISA podem incluir, ainda, imobilização de captura por antígeno do antígeno alvo com um anticorpo monoclonal de fase sólida específico para o antígeno, por exemplo, para intensificar a sensibilidade do ensaio. A elaboração de mediadores solúveis (por exemplo, citocinas, quimiocinas, linfocinas, prostaglandinas, etc.) pode ser também facilmente determinada por ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA), por exemplo, com o uso de métodos, aparelhos e reagentes que estão prontamente disponíveis junto às fontes comerciais (por exemplo, Sigma, St. Louis, MO; consultar também R & D Systems 2006 Catalog, R & D Systems, Minneapolis, MN).

[0377] Qualquer número de outros parâmetros imunológicos pode ser monitorado com o uso de ensaios de rotina que são bem conhecidos na técnica. Os mesmos podem incluir, por exemplo, ensaios de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), respostas de anticorpo in vitro secundárias, análise imunocitofluorimétrica de fluxo de várias subpopulações de células mononucleares linfoides ou do sangue periférico com o uso de sistemas de antígeno de marcador bem estabelecidos, imuno-histoquímica ou outros ensaios relevantes. Esses e outros ensaios podem ser encontrados, por exemplo, em Rose et al. (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunolog, 5a edição, 1997 American Society of Microbiology, Washington, DC.

[0378] Consequentemente, é contemplado que as composições fornecidas no presente documento poderão produzir ou intensificar em um hospedeiro pelo menos uma resposta imunológica que é selecionada dentre uma resposta de linfócito T do tipo TH1, uma resposta de linfócito T do tipo TH2, uma resposta de linfócito T citotóxica (CTL), uma resposta de anticorpo, uma resposta de citocina, uma resposta de linfocina, uma resposta de quimiocina e um resposta inflamatória. Em certas modalidades, a resposta imunológica pode compreender pelo menos uma dentre produção de uma ou uma pluralidade de citocinas, em que a citocina é selecionada dentre interferon- gama (IFN-Y), fator alfa de necrose tumoral (TNF-α), produção de uma ou uma pluralidade de interleucinas, em que a interleucina é selecionada dentre IL-1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 e IL-23, produção de uma ou uma pluralidade de quimiocinas, em que a quimiocina é selecionada dentre MIP-1α, MIP-1β, RANTES, CCL4 e CCL5, e uma resposta de linfócito que é selecionada dentre uma resposta de célula T de memória, uma resposta de célula B de memória, uma resposta de célula T efetora, uma resposta de célula T citotóxica e uma resposta de célula B efetora. Consultar, por exemplo, os documentos nos WO 94/00153; WO 95/17209; WO 96/02555; U.S. 6.692.752; U.S. 7.084.256; U.S. 6.977.073; U.S. 6.749.856; U.S. 6.733.763; U.S. 6.797.276; U.S. 6.752.995; U.S. 6.057.427; U.S. 6.472.515; U.S. 6.309.847; U.S. 6.969.704; U.S. 6.120.769; U.S. 5.993.800; U.S. 5.595.888; Smith et al., 1987 J Biol Chem. 262:6.951; Kriegler et al., 1988 Cell 53:4.553; Beutler et al., 1986 Nature 320:584; U.S. 6.991.791; U.S. 6.654.462; U.S. 6.375.944.

[0379] As formulações de nanoalume da presente invenção são úteis para o tratamento ou prevenção de doença, tal como coqueluche, tuberculose, lepra, malária, HIV, leishmaniose e gripe. Em particular, a capacidade das formulações de nanoalume para promover imunidade de Th1 torna as mesmas particularmente úteis nesse sentido. C. AGENTES DIAGNÓSTICOS

[0380] Em algumas modalidades, o agente é uma gente diagnóstico. Assim, nessas modalidades, as composições descritas compreendem as partículas de nanoalume fornecidas no presente documento e compreendem, ainda, um agente diagnóstico e são úteis para o diagnóstico de qualquer doença, afecção ou distúrbio.

[0381] Em algumas modalidades, os agentes diagnósticos são úteis para a detecção de câncer. As composições e os métodos são que conhecidos na técnica para identificar sujeitos que têm ou estão sob suspeita de estar em risco de desenvolver câncer são descritos no presente documento. O diagnóstico de câncer em um sujeito que tem ou está sob suspeita de estar em risco de ter câncer pode ser realizada por qualquer uma de uma ampla gama de metodologias aceitas na técnica, que podem variar dependendo de uma variedade de fatores, incluindo apresentação clínica, grau de progressão do câncer, o tipo de câncer e outros fatores. Os exemplos de diagnóstico de câncer incluem exame histopatológico, histocitoquímico, imuno-histocitoquímico e imuno-histopatológico de amostras de paciente (por exemplo, sangue, biopsia de pele, outra biopsia de tecido, espécimes cirúrgicos, etc.), testes de PCR para marcadores genéticos definidos (por exemplo, ácido nucleico), testes serológicos para antígenos associados a câncer em circulação ou células que portam tais antígenos ou para anticorpos de especificidade definida ou outras metodologias com as quais aqueles que são versados na técnica estão familiarizados. Consultar, por exemplo, as Patentes nos U.S. 6.734.172; 6.770.445; 6.893.820; 6.979.730; 7.060.802; 7.030.232; 6.933.123; 6.682.901; 6.587.792; 6.512.102; 7.078.180; 7.070.931; JP5-328975; Waslylyk et al., 1993 Eur. J Bioch. 211(7):18. Qualquer um ou mais desses agentes diagnósticos podem estar incluídos nas composições que compreendem as partículas de nanoalume descritas no presente documento.

[0382] Em algumas modalidades, os agentes diagnósticos são úteis para a detecção de uma doença autoimune. A detecção de um autoanticorpo assim permite a constatação ou o reconhecimento precoces da presença ou risco de desenvolver uma doença autoimune. Com base nessas conclusões, uma variedade de autoanticorpos contra autoantígenos foi revelada, e os autoanticorpos contra autoantígenos foram medidos em testes clínicos (por exemplo, as Patentes nos U.S. 6.919.210, 6.596.501, 7.012.134, 6.919.078) enquanto outros diagnósticos autoimunes podem envolver a detecção de um metabólito relevante (por exemplo, Patente no U.S. 4.659.659) ou reatividade imunológica (por exemplo, Patentes nos U.S. 4.614.722 e 5.147.785, 4.420.558, 5.298.396, 5.162.990, 4.420.461, 4.595.654, 5.846.758, 6.660.487). Assim, em algumas modalidades, as composições que compreendem qualquer uma das partículas de nanoalume descritas no presente documento, compreendem, ainda, um autoanticorpo útil para a detecção de um autoantígeno.

[0383] Em uma modalidade, os agentes diagnósticos são úteis para a detecção de doenças infecciosas. As composições e métodos são conhecidos na técnica para identificar sujeitos que têm ou estão sob suspeita de estar em risco de ter uma infecção com um patógeno infeccioso conforme descrito no presente documento.

[0384] Por exemplo, a bactéria Mycobacterium tuberculosis causa tuberculose (TB). Assim, em algumas modalidades, as composições que compreendem qualquer uma das partículas de nanoalume descritas no presente documento, compreendem, ainda, um agente para diagnosticar tuberculose. Os kits diagnósticos contendo tais polipeptídeos ou sequências de DNA e um reagente de detecção adequado podem ser usados para a detecção de infecção por Mycobacterium em pacientes e amostras biológicas. São também fornecidos anticorpos direcionados contra tais polipeptídeos.

[0385] Em algumas modalidades, as composições que compreendem qualquer uma das partículas de nanoalume descritas no presente documento compreendem, ainda, um agente para diagnosticar malária, com o uso de qualquer um dos agentes diagnósticos descritos abaixo. É conhecido um método para diagnóstico in vitro para malária em um indivíduo que compreende colocar um tecido ou um fluido biológico tomado de um indivíduo em contato com uma composição de molécula ou polipeptídeo, em que a dita composição de molécula ou polipeptídeo compreende uma ou mais sequências de peptídeos que possuem todos ou parte de um ou mais epítopos T das proteínas resultantes da atividade infecciosa de P. falciparum, sob condições que permitem que uma reação imunológica in vitro ocorra entre a dita composição e os anticorpos que podem estar presentes no tecido ou no fluido biológico e detecção in vitro de complexos de antígeno-anticorpo formados (consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 7.087.231).

[0386] A expressão e a purificação de um ectodomínio AMA-1 de Plasmodium falciparum (3D7) recombinante foram descritos. Os métodos anteriores reproduziram uma proteína altamente purificada que mantém o enovelamento e a ligação de dissulfeto da molécula nativa. O AMA-1 recombinante é útil como reagentes diagnósticos bem como na produção de anticorpos, e como uma proteína para uso sozinha ou como parte de uma vacina para prevenir malária. (Patente no U.S. 7.029.685)

[0387] Foram descritos na técnica polinucleotídeos que codificam antígenos de peptídeo malarial de P. vivax específico para espécie que são proteínas ou fragmentos secretados no plasma de um hospedeiro mamífero suscetível após a infecção, assim como anticorpos monoclonais ou policlonais direcionados contra esses antígenos. Os antígenos de peptídeo, os anticorpos monoclonais e/ou os anticorpos policlonais são utilizados em ensaios usados para diagnosticar malária, assim como para determinar se Plasmodium vivax é a espécie responsável pela infecção. (Patente no U.S. 6.706.872) Também foram relatados antígenos de peptídeo malarial de P. vivax específicos para espécie que são proteínas ou fragmentos de proteínas secretados no plasma de um hospedeiro mamífero suscetível após a infecção, assim como anticorpos monoclonais ou policlonais direcionados contra esses antígenos. Os antígenos de peptídeo, os anticorpos monoclonais e/ou os anticorpos policlonais são utilizados em ensaios usados para diagnosticar malária, assim como para determinar se Plasmodium vivax é a espécie responsável pela infecção (consultar, por exemplo, a Patente no U.S. 6.231.861).

[0388] Um ectodomínio AMA-1 de Plasmodium falciparum (3D7) recombinante também foi expresso por um método que produz uma proteína altamente purificada que mantém o enovelamento e a ligação em ponte de dissulfeto da molécula nativa. O AMA-1 recombinante é útil como um reagente diagnóstico, para uso na produção de anticorpos e como uma vacina. (Patente no U.S. 7.060.276) Similarmente, são conhecidas a expressão e a purificação de um MSP-142 de Plasmodium falciparum (3D7) recombinante, que mantém o enovelamento e a ligação em ponte de dissulfeto da molécula nativa. O MSP-142 recombinante é útil como um reagente diagnóstico, para uso na produção de anticorpos e como uma vacina. (Patente no U.S. 6.855.322)

[0389] Os métodos para diagnóstico para a detecção de infecções por malária humana para identificar um sujeito que tem ou sob suspeita de estar em risco de ter uma infecção com um patógeno infeccioso de malária são assim conhecidos de acordo com essas revelações e outras relacionadas. Especificamente, por exemplo, amostras de sangue são combinadas com um reagente contendo dinucleotídeo de 3-acetil piridina adenina (APAD), um substrato (por exemplo, um sal de lactado ou ácido láctico) e um tampão. O reagente é projetado para detectar a presença de uma enzima glicolítica exclusiva produzida pelo parasita da malária. Essa enzima é conhecida como ácido láctico desidrogenase parasita (PLDH). A PLDH é facilmente distinguível da LDH do hospedeiro com o uso do reagente descrito acima-. A combinação do reagente com uma amostra de sangue com parasita resulta na redução de APAD. Entretanto, a APAD não é reduzida pela LDH do hospedeiro. A APAD reduzida pode, então, ser detectada por várias técnicas, incluindo análise espectral, fluorimétrica, electroforética ou colorimétrica. A detecção da APAD reduzida da maneira anterior fornece uma indicação positiva de infecção por malária (por exemplo, Patente no U.S. 5.124.141). Em outra metodologia para diagnosticar malária, um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos característica derivada do antígeno de Plasmodium falciparum GLURP é reconhecido em uma amostra de teste por um anticorpo específico criado contra ou reativo com o polipeptídeo. (Patente no U.S. 5.231.168).

[0390] Em algumas modalidades, as composições que compreendem qualquer uma das partículas de nanoalume descritas no presente documento compreendem, ainda, um agente útil para diagnosticar malária, com o uso de qualquer um dos agentes diagnósticos leishmaniose abaixo. A leishmaniose é uma doença parasítica amplamente difundida com epidemia frequente no subcontinente indiano, África e América Latina e é uma prioridade da Organização Mundial de Saúde para desenvolvimento de vacina. Um complexo de diferentes doenças, os parasitas Leishmania causa infecções fatais de órgãos internos, assim como doença de pele séria. Uma das formas mais devastadoras de leishmaniose é uma infecção desfigurante do nariz e da boca. O número de casos de leishmaniose é crescente e está agora fora de controle em muitas áreas. A leishmaniose está também em ascensão em alguns países desenvolvidos, especificamente sul da Europa, como resultado de infecção por HIV. Os fármacos disponíveis são tóxicos, dispendiosos e exigem injeções diárias a longo prazo.

[0391] A leishmaniose são parasitas protozoários que habitam macrófagos ou os glóbulos brancos do sistema imunológico. Os parasitas são transmitidos pela mordida de insetos sugadores de sangue pequenos (mosquitos pólvora), que são difíceis de controlar, visto que habitam vastas áreas do planeta.

[0392] A leishmaniose visceral é a mais perigosa das três manifestações da doença. Estima-se que cerca de 500.000 novos casos da forma visceral (calazar ou “a doença mortal”) ocorram a cada ano. Mais de 200 milhões de pessoas estão atualmente em risco de contrair leishmaniose visceral. Mais de 90 por cento dos casos de leishmaniose visceral ocorrem na Índia, Bangladeche, Sudão, Brasil e Nepal. A maioria das mortes ocorre em crianças. Aqueles com as formas cutâneas são frequentemente deixados permanentemente desfigurados.

[0393] As infecções por Leishmania são difíceis de diagnosticar e tipicamente envolvem análise histopatológica de espécimes de biopsia de tecido. Diversos ensaios diagnósticos imunológicos e serológicos têm sido, no entanto, desenvolvidos. (Patente no U.S. 7.008.774; Senaldi et al., (1996) J. Immunol. Methods 193:9 5; Zijlstra, et al., (1997) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 91:671 a 673; Badaro, et al., (1996) J. Inf. Dis. 173:758 a 761; Choudhary, S., et al., (1992) J. Comm. Dis. 24:32 a 36; Badaro, R., et al., (1986) Am. J. Trop. Med. Hyg. 35:72 a 78; Choudhary, A., et al., (1990) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 84:363 a 366; e Reed, S. G., et al., (1990) Am. J. Trop. Med. Hyg. 43:632 a 639). Os promastigotas liberam produtos metabólicos no meio de cultura para produzir meio condicionado. Esses produtos metabólicos são imunogênicos ao hospedeiro. Consultar Schnur, L. F., et al., (1972) lsrl. J. Med. Sci. 8:932 a 942; Sergeiev, V. P., et al., (1969) Med. Parasitol. 38:208 a 212; ElOn, J., et al., (1979) Exper. Parasitol. 47:254 a 269; and Bray, R. S., et al., (1966) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 60(605):609; Patente no U.S. 6.846.648, Patente no U.S. 5.912.166; Patente no U.S. 5.719.263; Patente no U.S. 5.411.865).

[0394] Em algumas modalidades, as composições que compreendem qualquer uma das partículas de nanoalume descritas no presente documento compreendem, ainda, um agente útil para diagnosticar HIV, com o uso de qualquer um dos agentes diagnósticos descritos abaixo. Os métodos para diagnosticar infecções por HIV são conhecidos, incluindo por cultura de vírus, PCR de sequências de ácidos nucleicos definitivas de espécimes de paciente e testes de anticorpo quanto à presença de anticorpos anti-HIV em soros de pacientes (consultar, por exemplo, Patentes nos U.S. 6.979.535, 6.544.728, 6.316.183, 6.261.762, 4.743.540.). VI. KITS

[0395] São também contemplados, em certas modalidades, kits que compreendem as composições descritas no presente documento que compreendem partículas de nanoalume, que podem ser fornecidas em um ou mais recipientes. Em uma modalidade, todos os componentes das composições estão presentes juntos em um recipiente único, mas as modalidades não se destinam a ser assim limitadas e também contemplam dois ou mais recipientes em que, por exemplo, uma composição adjuvante imunológica é separada e não está em contato com o componente de antígeno. A título de teoria não limitante, acredita-se que, em alguns casos, a administração apenas da composição adjuvante imunológica pode ser realizada beneficamente, enquanto, em outros casos, tal administração pode ser beneficamente separada temporal e/ou espacialmente (por exemplo, em um sítio anatômico diferente) de administração do antígeno, enquanto, em ainda outros casos, é beneficamente conduzida a administração ao sujeito de uma composição de vacina conforme descrito no presente documento e contendo tanto antígeno quanto composição adjuvante e, opcionalmente, outros componentes descritos no presente documento também.

[0396] Em algumas modalidades, um frasco do kit compreende uma composição que compreende partículas de nanoalume.

[0397] Em algumas modalidades, um frasco do kit compreende uma composição que compreende partículas de nanoalume, e um segundo frasco do kit contém um agente bioativo. Em algumas modalidades, o kit compreende um terceiro frasco contendo um adjuvante.

[0398] Em algumas modalidades, um frasco do kit compreende uma composição que compreende partículas de nanoalume, e um segundo frasco do kit contém um adjuvante. Em algumas modalidades, o kit compreende um terceiro frasco contendo um agente bioativo.

[0399] Os kits da presente revelação podem compreender, ainda, instruções para uso conforme descrito no presente documento ou instruções para misturar os materiais contidos nos frascos. Em algumas modalidades, o material no frasco é seco ou liofilizado. Em algumas modalidades, o material no frasco é líquido.

[0400] Um recipiente de acordo com tais modalidades de kit pode ser qualquer recipiente, vaso, receptáculo, ampola, tubo, copo, caixa, garrafa, frasco, jarra, prato, cavidade de um aparelho de cavidade única ou múltiplas cavidades, reservatório, tanque adequado ou similares, ou outro dispositivo em que as composições reveladas no presente documento podem ser colocadas, armazenadas e/ou transportadas e acessadas para remover o conteúdo. Tipicamente, tal recipiente pode ser produzido a partir de um material que é compatível com o uso pretendido e do qual a recuperação do conteúdo contido pode ser prontamente atingida. Os exemplos não limitantes de tais recipientes incluem tubos e ampolas vedadas ou revedáveis de vidro e/ou plástico, incluindo aqueles que têm um septo de borracha ou outros meios de vedação que são compatíveis com a retirada do conteúdo com o uso de uma agulha e seringa. Tais recipientes podem, por exemplo, ser produzidos a partir de vidro ou um plástico ou resina quimicamente compatível, que pode ser produzido a partir de, ou pode ser revestido com, um material que permite a recuperação eficaz de material do recipiente e/ou protege o material, por exemplo, de condições degradantes, tal como extremos de temperatura e luz ultravioleta, ou da introdução de contaminantes indesejados, incluindo contaminantes microbianos. Os recipientes são, de preferência, estéreis ou esterilizáveis e produzidos a partir de materiais que serão compatíveis com qualquer carreador, excipiente, solvente, veículo ou similares, tais como podem ser usados para suspender ou dissolver as composições de vacina e/ou composições adjuvantes imunológicas e/ou antígenos e/ou construtos de expressão recombinante, etc. descritos no presente documento.

[0401] Os Exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração e não a título de limitação. EXEMPLOS EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES DE NANOALUME COM PEG E PAA

[0402] Preparação de Formulações de Nanoalume. Hidróxido de alumínio 2% ou Al(OH)3, hidróxido de alumínio, oxi-hidróxido de alumínio 2% (Alhydrogel® 85) foram adquiridos junto à EM Sargeant como uma suspensão úmida de gel. Os seguintes lipídios foram adquiridos junto à Corden Pharma (Liestal, Suíça): Distearoilglicerofosfoetanolamina (DSPE), N-Carbonil- metoxipolietilenoglicol-750)-1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoethanolamina (mPEG750-DSPE), N-(Caronil-metoxipolietilenoglicol-2000)-1,2-distearoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (mPEG2000-DSPE), N-(Carbonil- metoxipolietilenoglicol-5000)-1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (mPEG5000-DSPE), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi(polietilenoglicol)-2000] (mPEG2000-DPPE), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-5000] (mPEG5000-DPPE), N- (Carbonil-metoxipolietilenoglicol-2000)-1,2-dimuristoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (mPEG2000-DMPE)e N-(Carbonil-metoxipolietilenoglicol- 5000)-1,2-dimyristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (mPEG5000-DMPE). Alhydrogel® ‘85’ foi adquirido junto à EM Sergeant Pulp and Chemical Company (Clifton, New Jersey) e fabricados pela Brenntag (Mulheim an der Ruhr, Alemanha). Poli(ácido acrílico) (PAA) foi adquirido junto à Sigma Aldrich.

[0403] Preparação de formulações de nanoalume. Em resumo, nanoalume com PEG foi fabricado diluindo-se 40 ml de Alhydrogel® (10 mg/ml de alumínio) em 60 ml de água e aquecimento em banho de água Crest Powersonic CP230D (Trenton, NJ) a ~ 60 °C por 2 horas. DSPE ou fosfolipídio de DSPE peguilado foi adicionado à solução de Alhydrogel® aquecida nas concentrações indicadas, na faixa de ~0,5 a 30 mg/ml de fosfolipídio (Tabela 3). Todas das formulações foram retornadas ao banho de água ~60 °C para dissolver agregados de fosfolipídio visíveis. O Microfluidics M110P (Newton, MA), equipado com uma câmara de interação F12Y de diamante seguida por um módulo de processamento auxiliar H30Z de cerâmica, foi usado para processar as formulações a 206,84 MPa (30.000 psi) por até 10 passagens com água gelada em recirculação para impedir o aumento de temperatura durante o processamento. Alíquotas de 50 μl foram removidas entre passagens selecionadas para caracterização de tamanho de partícula por dispersão dinâmica de luz. A formulação remanescente foi coletada após a 10a passagens e colocada em um cronograma de estabilidade para monitorar o tamanho de partícula. As formulações selecionadas fabricadas no microfluidizador 110P foram filtradas através de uma membrana Supor de 0,2 μm antes da avaliação de atividade biológica in vivo. As formulações selecionadas foram processadas com o uso de misturador de alto cisalhamento Silverson (East Longmeadow, MA) por 5 minutos a 5.000 rpm em vez de microfluidização.

[0404] Para formulações de nanoalume com PAA, PAA com um peso molecular médio de 2.000 foi adquirido junto à Sigma Aldrich. A solução de estoque a 50% em peso em água foi diluída em água para produzir 30% em peso em água. 16 g do PAA a 30% em peso foram combinados com 160 g de uma solução estoque de 10 mg/ml de Alhydrogel® e o pH ajustado a 6,6 com NaOH 10 M. As formulações foram processadas com o uso de um microfluidizador 110P a 206,84 MPa (30.000 PSI), 4 °C por 1, 3, 6, 10, 15 ou 20 passagens.

[0405] Análise de Partícula de Formulações de nanoalume. As formulações foram caracterizadas quanto ao tamanho de partícula por dispersão dinâmica de luz (DLS) com o uso do Nano-S ou Nano- ZS Malvern Instruments (Worcestershire, RU) Zetasizer e por análise de partícula por difração de laser com o uso do Beckman Coulter (Brea, Califórnia) LS230. As informações de tamanho de partícula foram também obtidas por análise de sedimentação e cryoTEM (descrito abaixo). Para análise por DLS, formulações de alume foram diluídas a 1:100 vezes em água em um cadinho descartável de poliestireno de 1,5 ml. As medições por DLS foram realizadas em triplicata e os valores foram relatados como o diâmetro médio de partícula baseado em intensidade de difusão, média Z. As amostras passadas na DLS foram medidas contra padrões de poliestireno (índice de refração de poliestireno = 1,55 a 1,59) de 60 e 200 nm; alumínio tem um índice de refração de 1,24. Para medições baseadas em difração de laser, amostras de alume estavam diretamente na câmara de amostra preenchida com água em que um valor de Dispersão Diferencial de Intensidade de Polarização (PIDS) entre 50% ± 5% foi atingido. A opção Desvios (estabelece linha de base de ruído elétrico medindo as tensões do circuito enquanto o laser está desligado) foi ajustada em 60 segundos, Medição de Fundo em 90 segundos, durações de rodada em intervalos de 90 segundos e velocidade de bomba em 50%. Antes e entre a análise da amostra, o LS230 foi desborbulhado três vezes.

[0406] Análise de Sedimentação. O perfilamento óptico por dispersão de laser foi conduzido com o uso do LUM GmbH (Boulder, Colorado) LUMiReader, equipado com três lasers de comprimentos de onda 470 nm, 630 nm e 870 nm. As taxas de deposição de partícula foram determinadas com base nas alterações no perfil de transmissão de luz laser de um corte transversal vertical do cadinho de amostra. 4 ml de formulação não diluída foram adicionados diretamente a um vidro cilíndrico para análise. As amostras foram medidas a 25 °C por 2 a 4 horas a um ângulo de inclinação máximo de 30° com varreduras de medição coletadas a cada 60 segundos. Além disso, com base no método de análise de múltiplos comprimentos de onda (2), as taxas de deposição de partícula poderiam ser usadas para calcular a distribuições de tamanho de partícula baseada em volume para partículas maiores que ~0,5 μm.

[0407] Adsorção de Antígeno. A ligação de antígeno às formulações de nanoalume foi avaliada por mancha de prata SDS-PAGE. Antes da centrifugação, as amostras foram misturadas na seguinte ordem: formulação de alume, ligante de TLR, antígeno e diluente (solução salina ou solução de glicerol). As amostras foram, então, centrifugadas na Ultra Centrífuga Beckman Coulter (Brea, Califórnia) Optima Max-XP por 30 minutos a 35.000 x g a 4 °C. 30 μl de amostra foram misturados com 10 μl de Tampão de Amostra LDS reduzido 4X, seguindo o qual 20 μl foram carregados em um gel SDS-PAGE de 12 faixas com 8 μl de Padrão Pré-manchado SeeBlue2. Cada gel passou por 55 minutos a 190 V e, então, colocado em uma solução de fixação de 50:40:10 de EtOH:CH3COOH:H2O por um mínimo de 2 horas ou até de um dia para o outro. O gel foi, então, manchado de acordo com as orientações fornecidas pelo Kit ProteoSilver Plus Silver Stain da Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO).

[0408] Adsorção de Ligante de TLR. A ligação de ligante de TLR-9 às formulações de nanoalume foi avaliada por mancha de prata SDS-PAGE com o uso da mesma preparação de centrifugação e diluição, condições de gel e kit de manchamento. A presença de uma faixa marrom escuro entre a faixa de 3 a 6 kDa indicou que ligante de TLR-9 estava presente no gel. A ligação de ligante de TLR-4 às formulações de nanoalume foi avaliada centrifugando-se o ligante de TLR-4 com as formulações de nanoalume e testando-se o sobrenadante quanto à presença de ligante de TLR-4 não ligado diluído a 1:5 em fase móvel A (75:15:10 [v:v:v] de metanol:clorofórmio:água com acetato de amônio 20 mM e ácido acético 1%). Cada amostra de sobrenadante foi injetada em volume de 50 μl em uma coluna Waters Co. (Milford, MA) Xbridge BEH Shielf RP18 fixada a uma HPLC Agilent Modelo 1100 (Santa Clara, CA). Um gradiente que consiste em fases móveis A e B (1:1 [v:v] de metanol:clorofórmio com acetato de amônio 20 mM e ácido acético 1%) foi executado durante 25 minutos. A detecção foi realizada por um Detector de Aerossol Carregado (CAD) ESA Biosciences (Chelmsford, MA) Coronoa. A quantificação foi realizada com o uso de um padrão de GLA infectado em diferentes volumes em fase móvel B para criar uma curva padrão.

[0409] XRD. A análise mediante difração de raios X por pó foi realizada em quatro amostras enviadas ao Triclinic Labs (West Lafayette, IN) para determinar o efeito de processamento variado sobre a mesma composição de lipídio peguilado/Alhydrogel®. As amostras foram ultracentrifugadas e análises mediante difração de raios X por pó (XRPD) foram executadas dos sólidos ainda úmidos e líquidos sobrenadantes. O sistema de difração de raios X Rigaku Smart-Lab (The Woodlands, TX) foi configurado para geometria de Bragg-Brentano de reflexão com o uso de um feixe de raios X de fonte em linha. A fonte de raios S é um tubo de foco fino longo de cobre que foi operado a 40 kV e 444 mA. A fonte fornece um perfil de feixe incidente na amostra que muda de uma linha estreita em ângulos altos para um retângulo amplo em ângulos baixos. Fendas de condicionamento de feixe são usadas na fonte de raios X em linha para garantir que o tamanho máximo de feixe seja menor que 10 mm ao longo tanto da linha quanto da normal em relação à linha. A geometria de Bragg-Brentano é uma geometria de para focalização controlada por divergência passiva e fendas de recebimento com a própria amostra que atua como o componente de focalização para os elementos ópticos. A resolução inerente de geometria de Bragg-Brentano é controlada em parte pelo raio de difratômetro e pela largura da fenda de recebimento usada. Tipicamente, o Rigaku Smart-Lab é operado para gerar larguras de pico de 0,1 °2θ ou menos. A divergência axial do feixe de raios X é controlada por fendas de Soller de 5,0° em ambos os caminhos de feixe difratados. As amostras foram colocadas em retentores de silício de baixo fundo com o uso de pressão manual leve para manter as superfícies da amostra plantas e niveladas com a superfície de referência do retentor. Cada amostra foi analisada de 2 a 40 °2θ com o uso de uma varredura contínua de 6 °2θ por minuto com um tamanho de etapa efetivo 0,02 °2θ. Cada conjunto de dados foi digitalmente filtrado para remover respostas de baixa frequência. O exame dos padrões resultantes permitiu a identificação de duas respostas cristalinas distintamente diferentes: picos do estilo gaussiano e picos do estilo lorentziano. Os picos do estilo gaussiano estão normalmente associados ao material microcristalino e são usados para designar materiais contendo regiões tanto cristalinas quanto amorfas. Os picos do estilo lorentziano estão normalmente associados a materiais nanocristalinos e contêm cristalitos que têm tamanho de nanômetro. ANÁLISE CRYOEM DE FORMULAÇÕES DE NANOALUME

[0410] Análise CryoEM foi realizada por NanoImaging Services. Em resumo, as amostras para análise por EM foram conservadas em gelo vitrificado sustentado por filmes de carbono holey em grades de cobre de 400 mesh. Cada amostra foi preparada aplicando-se uma gota de 3 μl de suspensão de amostra a uma grade limpa, secando-se com papel de filtro e prosseguindo-se imediatamente com vitrificação em etano líquido. As grades foram armazenadas sob nitrogênio líquido até serem transferidas para o microscópio eletrônico para imaginologia. A microscopia eletrônica foi realizada com o uso de um microscópio eletrônico FEI Tecnai T12, operando a 120 keV equipado com uma câmera FEI Eagle 4k x 4k CCD. As grades de gelo vítreo foram transferidas para o microscópio eletrônico com o uso de um crioestágio que mantém as grades a uma temperatura abaixo de -170 °C. As imagens de cada grade foram adquiridas em múltiplas escalas para avaliar a distribuição geral do espécime. Após identificar as áreas alvo potencialmente adequadas para imaginologia em magnificações menores, imagens de alta magnificação foram adquiridas em magnificações normais de 110.000x (0,10 nm/pixel), 52.000x (0,21 nm/pixel) e 21.000x (0.50 nm/pixel). As imagens foram adquiridas a uma desfocagem negativa nominal de -2 μm (110.000x), -3 μm a -2 μm (52.000x) e -5 μm (21.000x) e doses de elétron de ~9 a 42 e/Â2. GERAÇÃO DE FORMULAÇÕES DE NANOALUME- DESENVOLVIMENTO DE AGENTES DE DIMENSIONAMENTO AGENTES DE DIMENSIONAMENTO DE NANOALUMES COM PEG-FOSFOLIPÍDIO PEGUILADO

[0411] Oxi-hidróxido de alumínio (alume) em solução agrega-se de modo geral em arranjos ou folhas cristalinas típicas maiores. O alhydrogel® não processado forma arranjos ou folhas cristalinas típicas maiores de moléculas de hidróxido de alumínio de 1 mícron ou maiores em formulações de alume não processadas. Em dados não mostrados, os experimentos foram realizados para determinar se a moagem ou o processamento por microfluidização de soluções de hidróxido de alumínio sozinhas sob várias condições poderia resultar em formulações de nanoalume; entretanto, não foi possível determinar uma condição sob a qual a microfluidização de hidróxido de alumínio de estoque sozinha poderia produzir uma formulação de nanoalume estável.

[0412] Sem o desejo de se vincular à teoria, foi teorizado que a adição de um agente de dimensionamento ou um agente de estabilização pode ser necessária para impedir ou romper a agregação das moléculas de hidróxido de alumínio. Os fosfolipídios são rotineiramente adicionados como emulsificantes e estabilizantes de microesferas em soluções aquosas e foram inicialmente escolhidos como agentes de dimensionamento. Experimentos iniciais foram realizados para testar se a inclusão de agentes de dimensionamento, tais como fosfolipídios, durante a moagem ou o processamento das soluções de alume poderia resultar em formulações de nanoalume. Os experimentos foram realizados na inclusão de uma única espécie de fosfolipídios DSPE, DPPE e DMPE com diferentes comprimentos de cadeia de acila de 18, 16 e 14 carbonos, respectivamente. Em dados não mostrados, os fosfolipídios testados não mostraram ser agentes de dimensionamento eficazes e não impediram a agregação das moléculas de alume.

[0413] Experimentos adicionais foram realizados para determinar se a adição de uma porção química de polietilenoglicol ligada ao fosfolipídio poderia criar um agente de dimensionamento eficaz. A fim de avaliar se a inclusão de um agente de dimensionamento poderia romper a agregação das moléculas de alume para produzir uma formulação de alume, uma solução de estoque PEG5000-DSPE foi moída por microfluidização a 30k PSI por 10 passagens e misturados imediatamente em bancada com a solução de hidróxido de alumínio para produzir uma formulação de 8 mg/ml de PEG5000-DSPE:4 mg/ml de Alhydrogel®. A análise CryoEM da formulação de fosfolipídio:hidróxido de alumínio peguilada microfluidizada misturada por adição demostrou que misturar por adição hidróxido de alumínio com o lipídio peguilado microfluidizado não interrompe a formação dos agregados cristalinos maiores de alume e não produz uma formulação de nanolume.

[0414] Experimentos subsequentes foram realizados para determinar se as formulações de nanoalume poderiam ser produzidas por adição do agente de dimensionamento durante a moagem ou o processamento da formulação de alume de estoque. Uma série de experimentos foi realizada para avaliar fosfolipídios peguilados DSPE, DPPE e DMPE com uma faixa de porções químicas de polietilenoglicol de peso molecular (na faixa de 750 a 5.000 kD Mr) ligadas a uma variedade de fosfolipídios com diferentes comprimentos de cadeia de acila (DSPE, DPPE, DMPE que têm comprimentos de cadeia de acila de 18 carbonos, 16 carbonos e 14 carbonos, respectivamente) misturados por adição com formulações de alume de estoque durante o processo de moagem e dimensionamento sob várias condições que foram realizados para determinar se a adição do agente de dimensionamento durante a moagem ou o processamento do alume poderia produzir uma formulação de nanoalume. As formulações foram analisadas quanto ao tamanho de partícula por análise Malvern e análise cryoEM. Moer ou processar alume na presença de um agente de dimensionamento, tal como um fosfolipídio peguilado produziu formulações de nanoalume com tamanhos de partícula na faixa de aproximadamente 400 a 70 nm (Tabela 4 e dados não mostrados).

[0415] A análise de dados apresentada demostra que o método e as condições usadas para moer o alume na presença do agente de dimensionamento pode produzir formulação de nanoalume que tem diferentes tamanhos de partícula definidos. O alume não processado tem um tamanho de aproximadamente 1.000 a 10.000 nm (Tabela 4). Misturar alume na presença de PEG-DSPE de 5.000 kD de peso molecular como um agente de dimensionamento (por exemplo, 8 mg:4 mg de agente de dimensionamento:alume), com um misturador Silverson a 5.000 rpm por 5 minutos produz uma formulação de nanoalume com uma tamanho médio de partícula de aproximadamente 400 nm (Tabela 3 e dados não mostrados). A microfluidização a 68,95 MPa (10k PSI) para 1 passagem de um alume misturado por adição a PEG-DSPE de 5.000kD de peso molecular (por exemplo, 8 mg:4 mg de agente de dimensionamento:alume) produz uma formulação de nanoalume com um tamanho médio de partícula de aproximadamente 120 a 130 nm. Processar a solução de PEG-DSPE de 5.000 kD de peso molecular de alume misturado por adição por 6,10, 15 ou até 20 passagens produz formulações de nanoalume com um tamanho médio de partícula de 70 nm (Tabela 3 e dados não mostrados). Os dados na Tabela 4 assim como os dados não apresentados demonstram que alterar o processamento alterando o equipamento de moagem ou dimensionamento (por exemplo, um misturadores silverson ou microfluidizador) ou condições de moagem (por exemplo, para um microfluidizador variando-se a pressão ou o número de passagens) de alume na presença do agente de dimensionamento pode produzir uma formulação de nanoalume que tem uma faixa de tamanhos de nanopartícula (400 nm, 120 nm, 70 nm). Com base nos dados apresentados, um versado na técnica poderia moer ou processar alume na presença de um agente de dimensionamento tal como um lipídio peguilado com o uso de técnicas bem conhecidas e equipamento tal como uma fonte de energia alta ou alta entrada de energia para atingir uma formulação de nanoalume de uma faixa de tamanho desejada.

[0416] Uma análise adicional dos dados na Tabela 4 e dos dados não mostrados demonstra que uma faixa ampla de pesos moleculares das porções químicas de PEG ligadas ao fosfolipídio de DSPE produz agentes de dimensionamento eficazes. Conforme demonstrado na Tabela 4 e dados não mostrados, variar o comprimento de PEG de 750 a 2.000 a 5.000k D (Tabela 3 e dados não mostrados) não afetou o tamanho de partícula da formulação de nanoalume quando moído sob as condições de moagem determinadas para produzir uma formulação de nanoalume de tamanho de partícula de 70 nm. Assim, os agentes de dimensionamento de fosfolipídio peguilado da presente revelação podem compreender uma faixa ampla de porções químicas de polietilenoglicol de peso molecular.

[0417] Os experimentos foram realizados para determinar se variar a razão entre alume e os agentes de dimensionamento de fosfolipídio peguilado poderia ser usado para controlar o tamanho de partícula da formulação de nanoalume.

[0418] Os dados apresentados na Tabela 4 indicam que variar a razão entre agente de dimensionamento e alume pode ser usado para afetar o tamanho de partícula da formulação de nanoalume. Por exemplo, para produzir de modo reproduzível nanoalumes com tamanhos médios de partícula de aproximadamente 300 a 400 nm para um DSPE-PEG5000, o agente de dimensionamento pode ser produzido a uma razão de 1:1 entre alume e agente de dimensionamento enquanto o aumento de agente de dimensionamento a 1:1,5 ou 1:2 reproduzível produz nanoalumes de aproximadamente 100 nm ou 70 a 80 nm, respectivamente. Comparando-se o agente de dimensionamento DSPE-PEG2000, os agentes de dimensionamento DPPE-PEG-5000 ou PAA200 demonstram que as razões ideais entre alume e agente de dimensionamento na faixa de 1:2 a 1:3 produz de modo reproduzível nanoalumes de alumes de 70 a 80 nm. Adicionalmente, os dados na Tabela 4 e os dados não mostrados demonstram que o comprimento de cadeia de acila do fosfolipídio peguilado não afetou a capacidade de o agente de dimensionamento produzir nanoalumes da faixa de tamanho desejada. Variando-se os comprimentos de cadeia de acila de 18 carbonos (18C DSPE), 16 carbonos (16C DPPE) e 14 carbonos (14C DMPE) do fosfolipídio peguilado quando misturado com a formulação de alume e moído pelo mesmo processo, todos produziram formulações de nanoalume que têm o mesmo tamanho de partícula (Tabela 4 e dados não mostrados). Assim, os agentes de dimensionamento de fosfolipídio peguilados da presente revelação podem compreender fosfolipídios com diferentes comprimentos de cadeia de acila. REDUÇÃO DE PH POR MEIO DE HCL, HNO3, E 'ÁCIDO PROPRIÔNICO CONCENTRADOS

[0419] Uma redução drástica do pH de alume com o uso de ácido concentrado quando submetido à moagem por meio de ultrassonicação por cinco minutos produziu as formulações de nanoalume da presente revelação. Tanto ácido clorídrico quanto nítrico concentrado adicionado para atingir um pH final de 1,0 foram testados e ambos produziram formulações de nanoalume de 324 nm (dados não mostrados) com alta polidispersidade. Assim, soluções ácidas concentradas podem ser adequadas como agentes de dimensionamento para produzir formulações de nanoalume para certos aspectos da presente revelação. Entretanto, visto que um pH final de 1,0 para a formulação de nanoalume pode não ser vantajoso para todos os aspectos da presente revelação, incluindo entrega de proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos, ácidos adicionais, com um perfil de pH geral mais baixo foram avaliados adicionalmente.

[0420] Em resumo, ácido oleico 4 mM foi misturado com água para obter 30 ml de emulsão. Essa mistura foi tratada com sonda ultrassônica (a 40% de potência) por 10 min. Volumes iguais de um de uma solução de estoque de Alhydrogel® a 1,6% em peso foram misturados com um volume igual da solução de ácido oleico emulsificada para produzir uma formulação de Alhydrogel®:formulação de ácido oleico 0,8% em volume:ácido oleico 2 mM que foi sonicada adicionalmente por 10 min com o uso de sonda ultrassônica na potência de 40%. O nanoalume resultante teve um tamanho de partícula de 194 nm e um pH final de 2,4. Assim, para certos aspectos, ácido oleico é um agente de dimensionamento adequado para formulações de nanoalume.

[0421] Alume foi sonicado conforme descrito acima com agitação e a adição de 5% de ácido acético até o pH ter sido ajustado em 6,1, 5,1 ou 4,5. Ácido acético como um agente de dimensionamento produziu formulações de nanoalume eficazes com tamanhos médios de partícula de aproximadamente 100 a 130 nm. Adicionalmente, as nanopartículas da formulação foram positivamente carregadas conforme medido por potencial zeta. Assim, para alguns aspectos da presente revelação, ácido acético pode ser um agente de dimensionamento eficaz para produzir nanoalumes da presente revelação. NANOALUMES COM PAA-ÁCIDO POLIACRÍLICO (PAA) COMO UM AGENTE DE DIMENSIONAMENTO

[0422] Para experimentos iniciais, o uso de PAA como um agente de dimensionamento para produzir nanoalumes foi avaliado misturando-se sob forte agitação 40 g de 0,4% em peso de alume com uma solução a 20% em peso de PAA e o pH ajustado em pH 6,0 com hidróxido de amônio concentrado, resultando em nanoalumes de tamanhos de partícula de aproximadamente 140 nm com nanopartículas negativamente carregadas conforme medido por potencial zeta.

[0423] Para experimentos subsequentes, em resumo, 20% em peso de PAA foram misturados com uma solução estoque de alume, p pH ajustado em 6,6 com hidróxido de sódio e moídos com o uso de microfluidizador 110P. Com base nos dados de desenvolvimento das formulações de nanoalume com PEG, a formulação foi moída por meio de microfluidização com recirculação a 4 °C e avaliada a 206,84 MPa (30.000 psi) por 3, 6, 10 e 15 passagens, respectivamente. 3 ou 6 passagens produziram nanoalumes com tamanhos de partícula de aproximadamente 100 nm sem efeito perceptível em tamanho de partícula observado entre 3 e 6 passagens. Aumentar o número de passagens de 10 a 15 produziu consistentemente nanoalumes de aproximadamente 70 a 85 nm de tamanho de partícula e boa polidispersidade. Para experimentos subsequentes, 10 passagens foram utilizadas. Os dados indicam que PAA é um agente de dimensionamento eficaz para formulações de nanoalume. ESTABILIDADE E CARACTERIZAÇÃO DE FORMULAÇÕES DE NANOALUME

[0424] Os dados mostraram que a formulação de nanoalume pode ser gerada por moagem na presença de agentes de dimensionamento adequados tais como lipídios peguilados e ácido poliacrílico. Entretanto, para comercialização como uma formulação de entrega para fármacos ou produtos biológicos, uma característica desejável da formulação é aquela de que o tamanho de partícula deve ser estável ao longo do tempo. Os experimentos foram realizados para determinar se formulações aquosas de nanoalume com PEG ou nanoalume com PAA eram estáveis e mantido o tamanho de partícula inicial ou não aumentaram de tamanho ou agregado além de um tamanho médio de 200 nm quando moídas a um tamanho de partícula inicial de 70 nm. Em resumo, as formulações de nanoalume com PEG e nanoalumes com PAA foram preparadas conforme anteriormente descrito e armazenado a 4 °C conforme indicado. Amostras em triplicata foram removidas em 1 semana, 2 semanas e 1, 3, 6, 9 e 12 meses após a preparação e avaliadas quanto ao tamanho de partícula e polidispersidade conforme descrito no presente documento. Os dados na Figura 1B para as formulações de nanoalume com PAA demonstram que as formulações de nanoalume com PAA são incrivelmente estáveis e mantêm um tamanho médio de partícula de aproximadamente 75 nm durante 1, 3 e 6 meses conforme testado e além de 12 meses (dados não mostrados). Similarmente, as formulações de nanoalume com PEG mostradas em 1C são também notavelmente estáveis e mantêm um tamanho médio de partícula de cerca de 75 nm por um período de 1, 3, 6, 9 e até 12 meses quando medido por dispersão dinâmica de luz com um Malvern Zetasizer.

[0425] A estabilidade a longo prazo a 2 a 8 °C é uma característica importante para formulações de vacina, mas a manutenção de armazenamento de cadeia fria pode ser um fator limitante para entrega de vacinas para saúde global. Testou-se se a formulação de nanoalume da presente revelação era termoestável durante uma faixa de temperaturas (25 °C, 37 °C e 65 °C) durante um período de tempo de 4 semanas. Em resumo, as amostras em triplicata foram armazenadas à temperatura desejada e avaliadas quanto a alterações em tamanho médio de partícula e polidispersidade conforme medido por dispersão dinâmica de luz com o uso de um Malvern zetasizer. Analisou-se, ainda, o efeito que o comprimento de PEG e o comprimento de cadeia de acila poderiam ter sobre a termoestabilidade das formulações aquosas de nanoalume avaliando-se PEG5000-DSPE (comprimento de cadeia de acila de 18 carbonos), PEG2000-DMPE (comprimento de cadeia de acila de 14 carbonos), PEG2000- DPPE (comprimento de cadeia de acila de 16 carbonos) PEG750-DSPE (comprimento de cadeia de acila de 18 carbonos) e PEG200-DSPE (comprimento de cadeia de acila de 18 carbonos). Os dados na Figura 1D-F demonstram que PEG2000-DSPE foi extremamente estável a temperaturas de até 25 °C e 37 °C com pouca a nenhuma agregação ou alteração no tamanho de partícula em 0, 2 ou 4 semanas e, até mesmo a 60 °C, foi estável por até 2 semanas. Até mesmo em 4 semanas a 60 °C, a formulação de PEG2000-DSPE nanoalume demonstrou apenas um ligeiro aumento no tamanho de partícula e ainda teve um tamanho médio de partícula de 114 nm indicando que agentes de dimensionamento contendo nanoalumes podem não exigir armazenamento de corrente fria. As formulações de nanoalume de PEG5000-DSPE (comprimento de PEG 5000 e comprimento de cadeia de acila de 18C), PEG2000-DPPE (comprimento de PEG 2000 e comprimento de cadeia de acila de 16C) e PEG750-DSPE (comprimento de PEG 750 e comprimento de cadeia de acila de 18C) demonstraram termoestabilidade a 25 °C e 37 °C por 0, 2 e 4 semanas, mas a 60 °C foram termolábeis e demonstraram agregação de partícula em 2 e 4 semanas com tamanhos médios de partícula maiores do que 2.000 nm. De forma interessante, a formulação de PEG2000-DMPE nanoalume (comprimento de PEG 2.000 e comprimento de cadeia de acila de 14C) foi estável a 25 °C por até 4 semanas e a 37 °C por 2 semanas, mas a 37 °C e 60 °C não foi estável e demonstrou agregação de partícula com tamanhos médios de partícula maiores do que 2.000 nm. Assim, as formulações de nanoalume da presente revelação demonstram termoestabilidade intensificada. A termoestabilidade das formulações de nanoalume podem não apenas permitir um maior acesso global a áreas sem armazenamento de corrente fria específico, mas também pode reduzir o custo geral da formulação. Nas legendas da figura, QG194 é PEG5000- DSPE; QG195 é PEG2000-DMPE; QG196 é PEG2000-DPPE; QG197 é PEG750-DSPE; QG198 é PEG2000-DSPE.

[0426] A fim de avaliar adicionalmente a estabilidade do nanoalume, avaliou-se o efeito da ciclagem de congelamento- descongelamento na estabilidade coloidal de alume e formulações de nanoalume. Os tamanhos de partícula pré-congelada das formulação foram medidos com o uso de Horiba LA-960 para formulação de alume e Malvern Zetasizer para formulações de nanoalume. As formulações foram congeladas em um banho de gelo seco/acetona, então, descongeladas em um banho de água de 37 °C. Os tamanhos de partícula foram medidos e comparados antes e depois do ciclo de congelamento-descongelamento. O tamanho médio de partícula de Alhydrogel® 85 (alume) aumentou 160% após um ciclo de congelamento-descongelamento, indicando falha de estabilizante coloidal. O tamanho médio de partícula de (nanoalume-poli(ácido acrílico)) não mostrou nenhuma alteração significativa no tamanho de partícula após 3 ciclos de congelamento-descongelamento. O tamanho médio de partícula de nanoalume- PEG aumentou 273% após 1 ciclo de congelamento-descongelamento, indicando falha da estabilizante coloidal. O adjuvante Alhydrogel® 85 é coloidalmente instável após um ciclo de congelamento-descongelamento, sugerindo resistência insatisfatória aos efeitos desestabilizantes do congelamento. Por outro lado, nanoalume estabilizado com poli(ácido acrílico) mostra excelente estabilidade após ciclos de congelamento-descongelamento repetidos, que podem facilitar a criopreservação a longo prazo de formulações de nanoalume-PAA.

[0427] Alume é um adjuvante atrativo que foi descrito como ligando ou adsorvendo antígenos de proteína através das interações eletrostáticas (envolvendo ferro Al3+ ou contraíon negativamente carregado) [11], coordenação de íon metálico e ligação ao hidrogênio com moléculas de água e grupos hidroxila [9], [10] e [12]; e, em alguns casos, interações hidrofóbicas [13]. Há algum debate no campo em relação ao grau, se houver, em que adsorção de proteína é exigida para a propriedade de adjuvante de alume. Foi testado se nanoalumes da presente revelação com uma área superficial e tamanho de partícula muito menores em comparação a alume adsorveriam antígenos eficientemente. Em suma, antes da centrifugação, as amostras foram misturadas na seguinte ordem: formulação de alume, ligante de TLR (GLA ou CpG 5 μg), antígeno (proteína de fusão TB ID93 (0,5 μg) e diluente (solução salina ou solução de glicerol). As amostras foram centrifugadas 30 minutos a 350.000 x g a 4 °C e 30 μl de amostra do sobrenadante não peletizado foram misturados com 10 μl de Tampão de Amostra de LDS 4X reduzido. 20 μl foram carregados em um gel SDS-PAGE de 12 faixas com 8 μl de Padrão Pré- manchado SeeBlue2. Cada gel passou por 55 minutos a 190 V e, então, colocado em uma solução de fixação de 50:40:10 de EtOH:CH3COOH:H2O por um mínimo de 2 horas ou até de um dia para o outro. O gel, foi então, manchado com o Kit ProteoSilver Plus Silver Stain para determinar se ID93 estava presente no sobrenadante ou foi peletizado devido à adsorção a alume. Os dados demonstraram (dados não mostrados) que os agentes de dimensionamento presentes nas formulações de nanoalume não interferem com a ligação ou associação de antígeno ou adjuvantes e são adequados como veículos de entrega para agentes bioativos da presente revelação. A fim de confirmar que o agente de dimensionamento, PEG-5000 DSPE, não interferiria com a adsorção de proteína a alume ou interferiria com o ensaio em geral, a proteína de fusão ID93 foi misturada por adição com o adjuvante TLR4, GLA e alume. A ausência da banda de ID93 de 62 Kd no gel confirma que DSPE-PEG5000 não bloqueia a adsorção do antígeno às partículas de alume de tamanho micrométrico (0,5 a 1,0 mícron). As formulações de nanoalume da presente revelação com tamanhos de partícula menores do que 100 nm contendo o agente de dimensionamento PEG DSPE de diferentes comprimentos de PEG de 5.000, 2.000 ou 750 ou um comprimento de PEG fixo de 2.000 ligado a fosfolipídios de diferentes comprimentos de cadeia de acila de 18 carbonos (DSPE), 16 carbonos (DPPE) ou 14 carbonos (DMPE) têm a mesma capacidade para adsorver a proteína de fusão ID93 conforme demonstrado pela ausência da banda ID93 de 62 Kd no gel (dados não mostrados). Assim, a redução na área superficial média ou tamanho de partícula de uma formulação de nanoalume não resulta em uma adsorção diminuída de antígenos de proteína tornando os mesmos formulações particularmente úteis para vacinas.

[0428] Caracterizou-se, a seguir, a concentração do hidróxido de alumínio presente nas partículas de nanoalume da presente revelação. Em suma, as formulações de nanoalume contendo agentes de dimensionamento de comprimentos de PEG variados (5.000, 2.000, 750) ou fosfolipídios com comprimentos de cadeia de acila variados (18 C-DSPE, 16C- DPPE ou 14C DMPE foram processados conforme descrito no presente documento e o teor de alumínio foi avaliado por teste ICP-OES (Figura 2). Os dados na Figura 2 demonstram que formulações de nanoalume que compreendem agentes de dimensionamento variados contêm o teor de alume previsto quando preparadas com agentes de dimensionamento de PEG de diferentes comprimentos de PEG a fosfolipídios de comprimentos de cadeia de acila variados. As formulações de nanoalume compreendidas de agentes de dimensionamento com fosfolipídios de 18C (DSPE) e comprimentos de PEG variados de 5.000 (amostra 1), 2.000 (amostras 2 a 4) e 750 (amostra 5) produzidas a partir de estoque 4 mg/ml de formulações de alume e os agentes de dimensionamento indicados moídos por microfluidização a 206,84 MPa (30.000 psi) por 10 passagens a 4 °C contêm quantidades aproximadamente equivalentes do valor de partida previsto de 4 mg/ml como medida por teste ICP- OES na faixa de 3,9 mg/ml para PEG750-DSPE (amostra 5) a 4,5 mg/ml para PEG2000-DPPE (amostra 3). De modo interessante, tanto o alume moído na ausência do agente de dimensionamento quanto alume não processado continham teor de alume diminuído (3,2 mg/ml para amostra 6 e 3,4 mg/ml para amostra 7, respectivamente).

[0429] Os dados demonstram que o processamento ou a moagem de hidróxido de alumínio (Alhydrogel®) na presença de um agente de dimensionamento apropriado pode produzir uma formulação de nanoalume estável para entrega dos agentes da presente revelação. Os agentes de dimensionamento da presente revelação incluem, sem limitação, fosfolipídios peguilados e PAA. EXEMPLO 2. USO DE FORMULAÇÕES DE PEG5000 E PAA NANOALUME PARA ENTREGA DE PROTEÍNAS OU PEPTÍDEOS (POR EXEMPLO, ID97) PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNOLÓGICA

[0430] Para avaliar o potencial para modificações a hidróxido de alumínio (Alhydrogel®) que resultam em partículas de alume menores na escala de 100 nm para promover uma resposta imunológica distorcida por Th1, foram gerados dois adjuvantes de nanoalume, um com base em ácido poliacrílico (PAA) e um com base em PEG5000. Para testar o potencial adjuvante desses candidatos, foram imunizados camundongos C57Bl/6 fêmeas de 8 semanas de idade (5 por grupo) adquiridos junto ao The Jackson Laboratory com o antígeno recombinante, ID97 - uma fusão recombinante de quatro proteínas de Mycobacterium tuberculosis: Rv1886, Rv3478, Rv3619 e Rv2875. ID97 foi entregue ou sozinho ou com adjuvante alume (100 μg), PAA, nanoalumePAA 1:1 (100 μg de alume, tamanho de partícula de 70 nm), nanoalumePEG (100 μg de alume, tamanho de partícula de 70 nm) ou o adjuvante de agonista de TLR4 GLA-SE como um controle positivo para indução de Th1. Os camundongos foram imunizados uma vez por via intramuscular. Sete dias após a imunização, a resposta de célula T CD4+ T específica para ID97 foi avaliada estimulando-se esplenócitos com ID97 na presença do inibidor de Golgi Brefeldina A ou deixando células não estimuladas. As células foram, então, manchadas para expressão de superfície de CD4, CD8 e CD44, assim como expressão intracelular de CD154, IFN-Y, TNF, IL-2, GM-CSF, IL-5 e IL-17A. As respostas específicas para antígeno foram calculadas como a frequência de células T CD4+ que produz uma resposta nas amostras estimuladas com ID97 menos as amostras não estimuladas. A Figura 3A mostra os resultados para respostas de Th1 em cada grupo. Conforme esperado, os grupos sem adjuvante, com adjuvante alume e com adjuvante PAA mostram uma baixa frequência de células T CD4+ T específicas para ID97 com base na expressão de recuperação de CD154 (um marcador para especificidade de antígeno, mas não específico para comprometimento por Th1, TH2 ou Th17). Surpreendentemente, o nanoalume à base de PAA induziu uma resposta de célula T CD4+ robusta que foi caracterizada pela produção das citocinas de marco de Th1 IFN-Y, TNF e IL- 2. O nível da resposta foi similar a este alcançado com o adjuvante de controle positivo GLA-SE. A qualidade da resposta humoral foi também avaliada 7 dias após a imunização. Apenas o nanoalume à base de PAA e o controle positivo GLA-SE aumentaram as titulações de IgG2c e IgG específicas para ID97 (Figura 3B a D). A comutação de classe para IgG2c é influenciada pela indução de células Th1 que produzem IFN-Y, assim, essa distorção é favorável a nanoalume à base de PAA que aumenta as respostas de Th1. Surpreendentemente, nanoalume à base de PAA também promoveu titulações de anticorpo IgG1, diferentemente de GLA-SE, sugerindo que o mesmo pode ter um modo de ação exclusivo. PAA nanoalume tem propriedades adjuvantes surpreendentes para programar respostas de TH1. Ademais, essas respostas não são apenas uma propriedade do componente de PAA na medida em que este não tinha atividade adjuvante de Th1 por si próprio.

[0431] Para elucidar o mecanismos pelo qual o nanoalume à base de PAA aumenta a imunidade de Th1 para antígenos de vacina, avaliou-se a concentração de citocinas de aumento de Th1 chave nos linfonodos de drenagem de camundongos imunizados 1 dia após a imunização intramuscular (Figura 4A a C). IL-12p70 e IL-18 são ambos cruciais para induzir IFN-y e IP-10 é uma citocina induzível por IFN-y precoce. Em comparação com a imunização com solução salina ou alume, o nanoalume à base de PAA aumentou a expressão tanto de IL-18 quanto de IL-12p70 em 1 dia após a imunização. Isso provavelmente aumentou a expressão precoce de IFN-yas, a expressão de IP-10 foi também aumentada nos animais que receberam nanoalume à base de PAA. O nanoalume à base de PEG também aumentou IL- 18, mas não a expressão de IL-12p70 ou IP-10 indicando adicionalmente as propriedades exclusivas do nanoalume à base de PAA. Para determinar se essa indução de IL-18 precoce foi importante para a programação de Th1, determinou- se o perfil de célula T Th1CD4+ em camundongos C57Bl/6 do tipo selvagem e camundongos IL-18R-/- que são insensíveis a IL-18. Em comparação com os camundongos do tipo selvagem, nanoalume à base de PAA falhou em induzir uma resposta de Th1 ao antígeno ID97 (Figura 5).

[0432] Tomados juntos, esses dados sustentam a constatação de que adjuvantes de nanoalume à base de PAA e potencialmente outros adjuvantes à base de nanopartícula alume têm propriedades adjuvantes exclusivas em comparação ao alume. Essas propriedades incluem especificamente a indução de citocinas inatas que programam a imunidade de Th1 incluindo IL-18 e IL-12p70 assim como citocinas responsivas a IFN-Y, tais como IP-10. Em comparação adicional com alume, o nanoalume à base de PAA e potencialmente outros nanoalumes aumentam a indução de células T CD4+ com um perfil de Th1 (secreção de IFN-y, TNF e IL-2 mediante estimulação de antígeno) e aumentam a comutação de classe de IgG2c e titulações de anticorpo específicas para antígeno. Esses processos dependem da ativação do eixo geométrico de sinalização de IL-18:IL18R. O aumento de respostas de Th1 para antígenos de vacina dependeu primariamente da inclusão de agonistas de Receptor similar a toll (TLR), tais como MPL, GLA, SLA, CpG, poliIC:LC ou Pam2CSK4. Para conhecimento, esse é o primeiro adjuvante contendo não TLR que pode promover imunidade de Th1 de modo robusto. Isso tem muitas aplicações adjuvantes de vacina potenciais contra doenças, tais como coqueluche, tuberculose, lepra, malária, HIV, leishmaniose e gripe.

[0433] Nos dados não mostrados, as formulações de PAA nanoalume com o antígeno de vacina de TB ID93 também demonstraram atividade adjuvante do tipo Th1 intensificada em comparação com alume não processado. EXEMPLO 3. USO DE FORMULAÇÕES DE PAA NANOALUME PARA ENTREGAR AGENTES DE ÁCIDO NUCLEICO.

[0434] Com base na fabricação dos nanoalumes de estabilidade melhorada, não dispendiosa e receptiva à larga escala terminalmente esterilizável da presente revelação, avaliou-se se as formulações de nanoalume tinham a capacidade para entrega eficiente de RNA. O desempenho das formulações de nanoalume contra uma emulsão catiônica descrita na técnica foi submetido a teste de desempenho. Em suma, a emulsão catiônica foi preparada conforme descrito na técnica (5) com a emulsão resultante 0,5% em p/vol de Span 85, 5,0% em v/vol de Esqualeno, 0,4 % em p/vol de DOTAP e 0,5% em p/vol de Tween 80. O RNA de replicon foi derivado de um genoma alfaviral modificado em que as proteínas estruturais incluindo capsídeo e a glicoproteína E (C-E3-E2-6K-E1) são removidas e substituídas por um gene de luciferase. Em suma, o vetor de expressão de RNA foi um vetor de RNA de replicon que expressa luciferase acionado por um promotor subgenômico construído a partir de um genoma alfaviral modificado deletado de proteínas estruturais incluindo capsídeo e glicoproteína E (C-E3-E2-6K-E1), mas contendo todos os genes não estruturais (ns1-ns5), necessários para replicação e expressão do RNA na célula. Para analisar luciferase in vivo como entregue pelo replicon de RNA e o PAA nanoalume, camundongos C57/BL6 foram anestesiados, raspados e imunizados por via intramuscular (i.m.) na coxa com 250 ul da formulação indicada mais e menos RNA nas doses indicadas. A dose de RNA (concentração) foi confirmada antes da injeção por medição com o uso de um espectrofotômetro Nanodrop. Os camundongos imunizados foram submetidos à anestesia, raspados e a expressão de RNA foi avaliada com o uso de um imageador IVIS Illumina II por sessenta segundos em 24 horas, 4 dias e 7 dias após a injeção. Os animais foram imageados, e unidades de luminescência relativa em uma escala logarítmica foram obtidas. Os exemplos no presente documento são apresentados utilizando as formulações de PAA nanoalume, mas não devem ser interpretados como limitando o escopo aos nanoalumes revelados no presente documento.

[0435] Camundongos Imunizados com Vetores de Expressão de replicon de RNA Formulados com Nanoalume Expressam RNA In Vivo. Para avaliar a capacidade de nanoalumes entregarem RNA, camundongos receberam injeção (3 camundongos por grupo) conforme descrito com 250 ul de formulação de PAA nanoalume 1:3 ou uma formulação de emulsão catiônica de controle conforme descrito no presente documento e RNA de replicon em uma dose de 1 ug ou 0,1 μg. Os controles incluíram um veículo de solução salina, emulsão catiônica, PAA nanoalume ou RNA de replicon nu em uma dose de 30 μg, 1 μg ou 0,1 μg. A expressão de RNA de replicon não formulada não foi detectável em 24 horas exceto em um animal que recebeu a dose mais alta de 30 μg de RNA de replicon de luciferase (dados não mostrados). Entretanto, nos dias 4 e 7, todos os animais imunizados com 30 μg de vetor de RNA de replicon de luciferase não formulado tinham expressão detectável em comparação com os controles de veículo (solução salina) (dados não mostrados). Nenhum dos animais que receberam 1 μg ou 0,1 μg do RNA de replicon nu teve qualquer expressão detectável. Em uma dose 30 vezes mais baixa de RNA (1 μg do replicon de RNA) misturada por adição com a formulação de emulsão catiônica de controle, todos os três animais em 24 horas, 4 dias ou 7 dias após entrega tiveram expressão de luciferase detectável (dados não mostrados) demonstrando que a emulsão catiônica intensificou a entrega do replicon de RNA resultando na preservação de dose conforme definido pelo efeito de ter expressão equivalente ou maior do replicon de RNA em comparação com o material não formulado. A mesma dose 30 vezes mais baixa de RNA (1 μg de replicon de RNA) misturada por adição com uma formulação de PAA nanoalume também demonstrou expressão de luciferase em um dentre os três animais em 24 horas e em todos os animais imunizados em 4 dias e 7 dias, respectivamente (dados não mostrados). Em uma dose 300 vezes mais baixa de RNA (100 ng de replicon de RNA) misturada por adição com a formulação catiônica de controle, 3 dos 3 animais em 24 horas e 2 dos 3 animais no dia 4 ou dia 7 expressaram luciferase detectável (dados não mostrados). Em uma dose 300 vezes mais baixa de RNA (100 ng de replicon de RNA) misturada por adição com a formulação de PAA nanoalume 1 dos 3 animais em 24 horas e 2 dos 3 animais no dia 4 ou dia 7 expressaram luciferase detectável (dados não mostrados).

[0436] Os dados de imagem descritos acima foram quantificados por meio do software Circular ROI junto à Living Image e são apresentados graficamente nas Figuras 6A a C. Os dados de luminescência relativa foram expressos em uma escala logarítmica, agrupados de acordo com a formulação (não formulado, emulsão catiônica de controle e PAA nanoalume nos painéis esquerdo, central e direito, respectivamente) e pela dose do vetor de replicon entregue 0 μg (mcg), 1 μg (mcg) e 0,1 μg (mcg) respectivamente) em 24 horas (Figura 6A), 4 dias (Figura 6B) e 7 dias (Figura 6C). Os dados demonstram que em 24 horas após a injeção o replicon de RNA misturado por adição com a emulsão catiônica em doses 30 e 300 vezes (1 ou 0,1 ug) mais baixas que RNA não formulado (30 μg) demonstrou expressão equivalente ao RNA não formulado. Em 24 horas, o RNA de replicon formulado com PAA nanoalume nas mesmas doses 30 e 300 vezes (1 ou 0,1 μg) mais baixas do que RNA não formulado (30 μg) demonstrou uma expressão mais baixa (Figura 6A) em comparação com a emulsão catiônica, mas nos dias 4 e 7 após a injeção, o RNA misturado por adição com a emulsão catiônica de controle ou o PAA nanoalume demonstrou expressão aproximadamente equivalente (Figura 6B e C) em ambas as doses de 1 μg (mcg) e 0,1 μg (mcg). Os dados demonstram que as formulações de PAA nanoalume têm a capacidade de entrega e expressão de vetores de RNA replicon e têm preservação de dose em comparação com o RNA não formulado.

[0437] Testou-se, a seguir, se o agente de dimensionamento, PAA, na formulação de nanoalume afetou a entrega ou expressão dos vetores de replicon de RNA (Figura 7). A fim de determinar se PAA sozinho foi responsável pela expressão de luciferase a partir do vetor de replicon de RNA, os camundongos foram imunizados com o replicon de RNA não formulado (7A), PAA sozinho mais o replicon de RNA (7B), emulsão catiônica de controle mais replicon de RNA (7C) ou PAA nanoalume mais replicon de RNA (7D) a uma dose de 30 μg para replicon não formulado ou 1 μg e 100 ng para os replicons de RNA formulados. A expressão de luciferase foi avaliada com o uso de um imageador IVIS Illumina II e os dados de imagem foram quantificados por meio de Circular ROI conforme descrito em 24 horas após a injeção. Os dados demonstram que PAA sozinho (7B) não entregam e/ou induzem um nível exprimível de um replicon de RNA em doses de 0,1 ou 1,0 μg enquanto que as mesmas doses do replicon de RNA formulado ou misturado por adição com a emulsão catiônica de controle ou PAA nanoalume demonstram expressão detectável de luciferase em níveis aproximadamente equivalentes à entrega 30 a 300 vezes mais alta do replicon de RNA não formulado. Os dados demonstram que o agente de dimensionamento sozinho, PAA, não tem a capacidade para entregar e/ou induzir um nível exprimível de proteína a partir do replicon de RNA.

[0438] Os experimentos anteriores demonstraram que as formulações de nanoalume da presente revelação têm a capacidade para entregar um replicon de RNA que é exprimível e demonstra propriedades de preservação de dose em comparação com um replicon de RNA nu. Determinou- se, a seguir, se a formulação de nanoalume poderia entregar eficientemente um RNA mensageiro (Figura 8). Para testar isso, adquiriu-se um mRNA FLuc mRNA com cap (Cap 0) e poliadenilado otimizado para sistemas de mamífero e modificado com pseudouridina e 5-metilcitidina que imita um mRNA maduro completamente processado (Luc mRNA) junto à Trilink Biotechnologies. O mRNA expressa uma proteína luciferase, originalmente isolada do vagalume, Photinus pyralis. Em suma, os camundongos (3 por grupo) foram imunizados conforme descrito com RNA não formulado, mRNA formulado com PAA nanoalume ou mRNA formulado com emulsão catiônica de controle em doses de RNA de 10 μg, 1 ug ou 0,1 μg e RNA. A expressão de RNA avaliada com o uso de um imageador IVIS Illumina II em 6 horas, 24 horas (Figura 8A) e 5 dias (Figura 8B) e os dados imageados foram quantificados por meio de Circular ROI. Os dados na Figura 8A em 24 horas após a injeção demonstram que os animais que receberam mRNA não formulado (grupo esquerdo) tinham expressão detectável de luciferase no nível de dose de mRNA de 10 μg e 1 μg, mas não em 0,1 μg. Entretanto, tanto a formulação catiônica de controle quanto a formulação de nanoalume com PAA (grupos intermediário e da extrema direita da Figura 8A) não apenas expressam níveis equivalentes do mRNA em todas as doses (10 μg, 1 μg e 0,1 μg) em comparação uma à outra, mas também demonstram níveis de expressão aumentados (> 30 vezes) na dose de 1 μg em comparação com o mRNA não formulado e têm níveis de expressão detectáveis na dose de RNA de 0,1 μg, demonstrando propriedades de preservação de dose da formulação de nanoalume. Em 5 dias após a injeção (Figura 8B), o mRNA não formulado demonstra uma expressão detectável de LUC na dose de RNA de 10 μg, embora a níveis mais baixos, mas nenhuma expressão de mRNA de luciferase é detectada nas doses mais baixas de 1 μg e 0,1 μg. De modo interessante, 5 dias após a injeção, os camundongos que recebem o mRNA formulado catiônico de controle não demonstram nenhuma expressão detectável do mRNA em qualquer uma das doses entregues, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg (grupo esquerdo e central). Entretanto, os camundongos que recebem o mRNA formulado com PAA Nanoalume (grupos da direita) não apenas expressão níveis >10 vezes mais altos de mRNA na dose de 10 μg, mas também demonstram expressão detectável na dose de 1 μg demonstrando propriedades de preservação de dose da formulação de nanoalume até mesmo em 5 dias após a entrega do mRNA. Comparou-se, então, a cinética de expressão dos animais que recebem emulsão catiônica não formulada ou mRNA formulado com nanoalume com PAA na dose de 10 μg de mRNA (Figura 8C) em 6 horas, 24 horas e 5 dias após a entrega in vivo. Os dados demonstram que os animais que foram imunizados com mRNA formulado com formulações de nanoalume tiveram níveis de expressão aumentados e de estado relativamente estável do mRNA durante cinco dias (□) em comparação com mRNA não formulado (•) ou o mRNA formulado com emulsão catiônica de controle (Δ), que teve um declínio rápido em expressão.

[0439] O declínio da expressão de mRNA no dia 5 quando entregue por lipossomas catiônicos de controle foi relatado na literatura e não foi inesperado, entretanto, a expressão persistente do mRNA não formulado ou do mRNA formulado com nanoalume foi surpreendente e interessante, em 5 dias, ainda havia um efeito de preservação de dose de 10 vezes observado. O nível de expressão da dose de 10 μg foi aproximadamente equivalente à dose de RNA de 1 μg para o mRNA formulado com nanoalume. Sem ater-se à teoria, foi hipotetizado que as formulações de nanoalume da presente revelação pode estabilizar o construto de mRNA.

[0440] Com base na estabilidade surpreendente da expressão in vivo do mRNA formulado com os nanoalumes da presente revelação, examinou-se adicionalmente se os nanoalumes da presente revelação estabilizaram RNA in vitro. A fim de testar isso, foi misturado por adição 1 μg do replicon de RNA com formulações catiônica de controle ou de PAA e essa mistura por adição foi armazenada como uma preparação de frasco único a 4 °C por 1 hora, 4 horas ou 24 horas. O RNA de replicon não formulado armazenado a 4 °C por 1 hora, 4 horas ou 24 horas serviu como o controle. Essas formulações de frasco único misturadas por adição foram, então, usadas para imunizar camundongos (3 por grupo) e a expressão de RNA foi avaliada com o uso de um imageador IVIS Illumina II e os dados quantificados por meio de Circular ROI 1 dia (Figura 9A) e 5 dias (Figura 9B) após a entrega in vivo. Os dados demonstram que replicons de RNA não formulados não tinham nenhuma expressão detectável quando armazenados a 4 °C por 4 ou 24 horas após a mistura por adição se avaliados 24 horas ou 5 dias após a entrega in vivo. Entretanto, a expressão detectável é demonstrada se o replicon de RNA for administrado ou imediatamente (tempo 0) ou 1 hora após o armazenamento a 4 °C quando avaliado em 24 horas ou 5 dias após a entrega in vivo não formulado, formulado com lipossomas catiônicos ou formulado com PAA nanoalume. O RNA não formulado não tinha nenhuma expressão detectável quando armazenado a 4 °C por 4 horas ou 24 horas devido à instabilidade relativa de RNA conforme foi relatado na literatura. Comparando os dados para o replicon de RNA não formulado com os dados para o replicon de RNA catiônico de controle ou formulado com nanoalume, o replicon de RNA, quando misturado por adição e armazenado como um frasco único a 4 °C por 1, 4 ou 24 horas antes da administração in vivo, demonstrou expressão aproximadamente equivalente conforme medido em 1 dia (Figura 9A) ou 5 dias (Figura 9B). Os dados foram adicionalmente analisados analisando-se plotagens de dispersão (Figura 9C a E) comparando diretamente os dados para a formulação catiônica de controle, PAA nanoalume e RNA de replicon não formulado, respectivamente. O RNA, quando administrado imediatamente após a mistura por adição com o RNA de replicon (T=0, 9C), administrado 4 horas após a mistura por adição e armazenamento a 4 °C (T=1 h, 9D) ou misturado por adição e armazenado por 24 horas (T=24 h, 9E) a 4 °C, teve níveis de expressão comparáveis no dia 5 após a administração, demonstrando que o RNA formulado com nanoalume é estável quando misturado por adição como uma formulação de frasco único a 4 °C por até 24 horas.

[0441] Com o uso de genes-repórter que codificam RNA nos exemplos apresentados no presente documento, foi demonstrado que os nanoalumes da presente revelação: (1) têm a capacidade para entrega de uma forma exprimível in vivo de um agente de polinucleotídeo e especificamente um agente de RNA a forma de RNA entregue for um mRNA ou construto de RNA de vetor de expressão; (2) as formulações de nanoalume permitem a entrega de preservação de dose para os vetores de RNA, significando que a expressão equivalente do RNA é alcançada para as formulações de nanoalume em doses do RNA pelo menos 30 a 300 vezes mais baixas do que RNA não formulado; e (3) as formulações de nanoalume da presente revelação intensificam a estabilidade do agente de RNA tanto in vivo quanto in vitro. Tendo desenvolvido e caracterizado as propriedades da entrega de nanoformulação de RNA, avaliou- se a capacidade de as formulações de nanoalume entregarem um RNA que resulta na estimulação de uma resposta imunológica em um hospedeiro.

[0442] A fim de avaliar a capacidade de um antígeno de RNA entregue por uma formulação de nanoalume das presentes modalidades, analisou-se a resposta imunológica em camundongos imunizados com um replicon de RNA que expressa o polipeptídeo de fusão EMCH formulado com os nanoalumes do presente revelação.

[0443] Construção do Polipeptídeo de Fusão EMCH. O polipeptídeo de fusão denominado EMCH foi gerado pela ligação em tandem de um quadro de leitura aberto de polinucleotídeos que codificam um códon de iniciação de metionina (ATG) adicionado à extremidade 5’ de um fragmento da terminação carboxila do polipeptídeo HSP70 mitocondrial putativo (8E ou 8), um fragmento carboxil-terminal do quadro de leitura aberto de polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo de malato desidrogenase, o fragmento carboxil-terminal do polipeptídeo de cisteína proteinase B (CpB, CPB ou C) e um quadro de leitura aberto de polinucleotídeos que codificam um fragmento da terminação amino do polipeptídeo H2BN de histona (H2BN, h2Bn ou H). EMCH tem uma sequência de 2.631 polinucleotídeos que codifica os aminoácidos 509 a 660 da terminação carboxila do polipeptídeo HSP70 mitocondrial putativo (8E ou 8) de polinucleotídeo de L. infantum, 460 a 1.425 que codifica os aminoácidos 1 a 322 da terminação carbóxi do gene de malato desidrogenase de L. infantum, o polinucleotídeo 1.426 a 2.295 que codifica os aminoácidos 154 a 443 do fragmento terminal carboxila do polipeptídeo cisteína proteinase B (B) e polinucleotídeos 2.297 a 2.631 que codifica os aminoácidos 1 a 111 da terminação amino do polipeptídeo histona H2BN (H) de L infantum. O polipeptídeos de fusão de 877 aminoácidos foi expresso em E.coli e purificado por cromatografia em coluna. Os componentes de ácidos nucleicos e métodos para preparar e usar são descritos mais completamente no documento no WO2014/160985 que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

[0444] Em resumo, os camundongos foram imunizados com 10 μg ou 0,1 μg de um vetor de replicon de RNA de alfavírus que codifica o polinucleotídeo de RNA de fusão de Leishmania, EMCH, como um controle de RNA nu não formulado, replicon de RNA misturado por adição com lipossomas catiônicos de controle ou replicon de RNA misturado por adição com formulações de nanoalume com PAA de RNA no momento 0 e todos os grupos foram reforçados três semanas depois. Os esplenócitos foram coletados e analisados quanto às respostas de célula T específicas para antígeno de recuperação conforme determinado por manchamento de citocina intracelular após estimulação in vivo com o polipeptídeo EMCH quatro semanas após o último reforço. A produção de citocinas a partir de esplenócitos de camundongos imunizados foi analisada quanto a células T de memória CD44hi CD4+ específicas para EMCH conforme medido por citometria de fluxo. Os esplenócitos estimulados com antígeno foram identificados por manchamento de citocina intracelular com base na expressão de CD3 e CD4 e foram, ainda, reunidos em células de alto CD44. As células T de alto CD44 CD4+ foram, ainda, manchadas para CD154, IL2, TNFα, GM-CSF, IL-17 e IL-5 intracelulares. As células T de alto CD44 CD4+ específicas para EMCH exibiram respostas de célula T polifuncionais positivas para IFN-Y, TNFα e IL-2 típicas de respostas de leishmania específicas para antígeno. Os dados (10A a D) demonstram que a imunização com doses 100 vezes mais baixas de EMCH RNA, 0,1 ug, formulado com lipossomas catiônicos de controle ou nanoalume com PAA gera porcentagens aproximadamente equivalentes de células T com manchamento positivo para citocina único CD4+ alto CD44 CD154, IFN-Y, IL-2 ou TNFα como 10 μg de RNA não formulado. A dose de 0,1 μg de replicon de RNA não formulado demonstra pouco ou nenhum manchamento detectável. Assim, as formulações de nanoalume da presente revelação podem entregar um RNA que codifica um antígeno de patógeno como uma formulação de vacina que estimula uma resposta imunológica em um hospedeiro vacinado.

[0445] Caracterizou-se, ainda, a qualidade da resposta imunológica ao polipeptídeo de Leishmania expresso pelo vetor de RNA quando entregue formulado com o nanoalume da presente revelação. Um marco de uma resposta imunológica protetora contra leishmaniose inclui a presença de células T específicas para antígeno polifuncionais que secretam múltiplas citocinas. Foram analisadas células T de alto CD4+ CD44 quanto às respostas de células T polifuncionais. Os dados (Figura 10E) demonstram que os camundongos imunizados com 100 ng de replicon do RNA EMCH formulado com nanoalume com PAA (barra hachurada) ou formulado com a emulsão catiônica de controle (barra com listras laterais) tiveram números equivalentes de células T de alto IFN Y, IL-2 e TNFα CD4+ CD44 triplo positivas em relação aos animais imunizados com 10 μg de RNA não formulado (barra preta sólida). As células duplo positivas que expressam IFN-Y e IL-2 ou IL-2 e TNFα também estavam presentes. Os dados demonstram que formulações de PAA podem entregar RNA que é expresso em níveis suficientes para gerar respostas imunológicas específicas para antígeno relevantes. EXEMPLO 4. USO DE FORMULAÇÕES DE NANOALUME COM PEG (PEGS DE VÁRIOS COMPRIMENTOS) PARA A ENTREGA DE PROTEÍNAS OI PEPTÍDEOS (ID93) PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNOLÓGICA

[0446] Os experimentos foram realizados para testar se as formulações de nanoalume da presente revelação poderiam entregar um agente de proteína ou polipeptídeo sozinho ou em composição com outros agentes (especificamente agonistas de TLR) para estimular uma resposta imunológica em um hospedeiro.

[0447] Modelos de Animal. Em resumo, animais experimentais e camundongos CB57BL/6 fêmeas com 6 a 8 semanas de vida foram adquiridos junto ao The Jackson Laboratory ou Charles River e mantidos em condições Livres de Patógeno específicas.

[0448] ID93 é uma proteína de fusão que incorpora quatro peptídeos de M. tuberculosis Rv1813, Rv2620, and Rv2608 e Rv3619, produzidos conforme anteriormente descrito [14].

[0449] O esplenócitos foram isolados de quatro a cinco animais por regime de tratamento. Os glóbulos vermelhos foram lisados com o uso de Tampão de Lise de Glóbulo Vermelho (eBioscience) e ressuspensos em RPMI 1640, FBS 10%. As células viáveis totais foram enumeradas com o uso do ensaio ViaCount com um sistema PCA (Guava Technologies), colocadas em placa a 2 x 106 células/cavidade em placas de 96 cavidades e estimuladas por 2 horas com meios ou ID93 (10 μg/ml) a 37 °C. GolgiPlug (BD Biosciences) foi adicionado, e as células foram incubadas por mais 8 horas a 37 °C. As células foram lavadas e a superfície manchada com anticorpos identificados com fluorocromo para CD4 (clone GK1.5), CD44 (clone IM7) e CD8 (clone 53-6. 7) (BioLegend e eBioscience) na presença de CD16/32 anticamundongo por 20 minutos a 4 °C. As células foram lavadas e permeabilizadas com Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) por 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas duas vezes com Perm/Wash (BD Biosciences) e manchadas intracelularmente com anticorpos identificados com fluorocromo a CD154 (clone MR1), clone de IFN-Y XMG-1.2), TNF (MP6- XT22), GM-CSF (MP1-22E9), IL-17A (clone TC11-18H10) e IL-5 (TRFK5) (BioLegend e eBioscience) por 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas e ressuspensas em PBS. Até 106 eventos foram coletados em um citômetro de fluxo LSRFortessa de quatro lasers (BD Biosciences). As células foram reunidas como singletos > linfócitos > CD4+ CD8- > CD44hi > positivo para citocina. As frequências de resposta específica para ID93 foram determinadas subtraindo-se a frequência de positivos para resposta de células não estimuladas de células estimuladas com ID93 em amostras correlacionadas. RESPOSTAS DE ANTICORPO

[0450] Os soros de camundongos foram preparados por coleta de sangue retro-orbital em tubos de coleta de soro microtainer (VWR International, West Chester, PA), seguidos por centrifugação a 10.000 rpm por 5 minutos. Cada amostra de soro foi, então, analisada por ELISA de captura de anticorpo. Em resumo, placas de ELISA (Nunc, Rochester, NY) foram revestidas com 2 μg/ml do antígeno recombinante ID93 em tampão de bicarbonato 0,1 M e bloqueadas com 1% de BSA-PBS. Então, em ordem consecutiva e após lavagens em PBS/Tween20, soro diluído em série, amostras, IgG1 ou IgG2c- HRP anticamundongo (todos da Southern Biotech, Birmingham, AL) e ABTS- H2O2 (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) foram adicionados às placas. As placas foram analisadas a 405 nm (ELX808, Bio-Tek Instruments Inc, Winooski, VT). As titulações de ponto médio foram calculadas com o uso do software Prism (GraphPad Software, Inc.) para determinar a curva de resposta à dose sigmoidal com o uso do método de ajuste de mínimos quadrados.

[0451] Os dados publicados anteriormente no modelo de Mycobacterium tuberculosis demonstraram que os camundongos imunizados com polipeptídeos de fusão ID93 formulados com respostas de IgG2c específico para ID-93 maiores induzidas por GLA/SE, indicativas de uma resposta polarizada de Th1 (Baldwin 2012). Os dados publicados também indicam que as formulações de alume, entretanto, induziram, de modo geral, uma resposta de Th2 maior conforme demonstrado por respostas de anticorpo IgG1 maiores. Foi avaliado se alterar o tamanho médio de partícula da formulação de nanoalume poderia afetar a qualidade da resposta imunológica gerada ao polipeptídeos de fusão ID93. A fim de avaliar o mesmo, os animais foram imunizados no dia zero por via intramuscular no quadriceps com 0,5 μg de ID93 misturado por adição com 100 μg mícron de alume (por exemplo, alume não processado que está comercialmente disponível) que serviu como a formulação de controle ou 0,5 μg de ID93 misturado por adição com 100 □ de formulações de nanoalume com PEG (PEG 5000-DSPE como o agente de dimensionamento moído de modo que as formulações resultantes tenham tamanhos médios de partícula de 400 nm, 130 nm ou 75nm) mais ou menos 5 μg do agonista de TLR4 SLA no dia zero. No dia 21 após a imunização, os animais foram sangrados e os soros coletados e analisados quanto às respostas de anticorpo específico para ID93 conforme descrito. As titulações de ponto médio de anticorpo para IgG1 específico para ID93 no dia 21 (Figura 11A) e para IgG2c (Figura 11B) demonstram que os animais imunizados com ID93 misturado por adição com a formulação de SLA- SE geram ambas as titulações de anticorpo IgG1 e IgG2c específico para ID93 com um ligeiro aumento na titulação de IgG2c indicativa de uma resposta de Th1 conforme anteriormente descrito. A imunização de camundongos com o polipeptídeo de fusão ID93 sozinho não resultou em titulações de anticorpo IgG1 ou IgG2c mensuráveis conforme esperado. A imunização com formulações de alume que têm tamanhos de partícula de 1 a 10 mícrons demonstrou uma polarização pronunciada a uma resposta de Th2 conforme indicado por altas titulações de anticorpo IgG1 e baixas titulações de IgG2c conforme previsto na literatura. Esses controles foram comparados às formulações de nanoalume com PEG que compreendem PEG-5000 DSPE como o agente de dimensionamento moído ou dimensionado variando-se os métodos (mistura de silverson a 5.000 rpm por 5 minutos, microfluidização a 68,95 MPa (10.000 PSI) por uma passagem ou 10 passagens a 206,84 MPa (30.000 PSI) conforme descrito no Exemplo 1 para produzir nanoalumes de tamanhos de partícula de 400 nm, 130 nm ou 75 nm, respectivamente. Os dados demonstram (Figura 11A) que as formulações de nanoalume com PEG de 400 nm induzem a mesma titulação de IgG1 de ponto final que as formulações de alumínio não processadas. As formulações de nanoalume com PEG com tamanho de partícula de 130 nm e 75 nm também produziram altas titulações de ponto médio de IgG1 no dia 21 embora reduzida aproximadamente à metade em comparação com o alume ou o nanoalume com PEG de tamanho de partícula de 400 nm. Os dados demonstram que nenhuma das formulações de nanoalume com PEG testadas resultou em titulações de anticorpo IgG2c ID93 mensuráveis em camundongos imunizados. A fim de determinar se a adição do agonista de TLR4 à formulação de nanoalume misturada por adição poderia polarizar a resposta para produzir uma resposta de Th1 conforme pedida por IgG2c, os camundongos foram também imunizados com o agonista de TLR 4, SLA mais o antígeno ID93 e as formulações de nanoalume com PEG. Os dados demonstram que a mistura por adição do agonista de TLR4 SLA com a formulação de alume ou uma formulação de nanoalume com PEG de tamanho de partícula de 400 nm teve um efeito desprezível sobre a titulação de ponto médio de respostas de IgG1 específicas para ID93, mas a mistura por adição de SLA com os nanoalumes com PEG com tamanho de partícula de 130 nm ou 75 nm tendeu a aumentar nas respostas de IgG1 específicas para ID93 de ponto médio. Similarmente, os dados apresentados na Figura 11B que analisa as titulação de ponto médio do dia 21 de IgG2c específico para antígeno ID93 demonstraram que as titulações de ID93 IgG2c são induzidas quando SLA é adicionado às formulações de nanoalume com PEG de tamanho de partícula de 400 nm, 130 nm ou 75 nm em comparação com titulações não detectáveis em animais imunizados com ID93/nanoalumes com PEG na ausência de SLA. Os dados indicam que os nanoalumes com PEG podem produzir uma resposta imunológica polarizada de Th2, mas formulações de nanoalume com PEG com tamanhos de partícula de 130 nm ou menos tiveram titulações de ID93 IgG1 que são reduzidas aproximadamente à metade em comparação com alume ou nanoalume com PEG 400 nm. De modo interessante, a adição de um agonista de a TLR 4, SLA, quase restaurou a magnitude da resposta polarizada de Th2 àquela da formulação de alume tradicional. Adicionalmente, embora nenhuma titulação de anticorpo IgG2c específica para ID93 foi detectada para camundongos imunizados com os nanoalumes ID93PEG, a adição do agonista de TLR4, SLA, às composições de vacina de ID93/nanoalume com PEG não resultou na produção de IgG2c, indicando alguma polarização da resposta para Th1 por SLA.

[0452] Camundongos imunizados com formulações de nanoalume com PEG que compreendem agentes de dimensionamento de fosfolipídio peguilado com diferentes comprimentos de PEG ou o mesmo comprimento de PEG ligado a Fosfolipídios de Diferentes Comprimentos de Cadeia de Acila e Misturados por Adição com Peptídeo de Fusão TB ID93 mais o agonista de TLR4 SLA produzem resposta específicas para antígeno. A Tabela 5 apresenta uma tabela dos grupos experimentais que compara a adsorção de 0,5 μg da proteína de fusão ID93 a 100 μg de formulações de alume com tamanho de partícula de 1 a 10 μm tradicionais misturados em bancada com PEG-5000 DSPE (sem moagem ou processamento) mais 5 μg do agonista de TLR4 SLA com formulações de nanoalume microfluidizadas que compreendem o agente de dimensionamento PEG-DSPE que tem diferentes comprimentos de PEG de 5.000, 2.000 ou 750 adsorvidos a 0,5 μg da proteína de fusão ID93 mais 5 μg de SLA e formulações de nanoalume com um agente de dimensionamento de fosfolipídio peguilado que tem um comprimento de PEG de 2.000 e fosfolipídios de diferentes comprimentos de cadeia de acila de 18 carbonos (DSPE), 16 carbonos (DPPE) e 14 carbonos (DMPE). TABELA 5

[0453] Os camundongos imunizados com uma dose de 5 μg do agonista de TLR SLA e 0,5 μg da proteína de fusão ID93 adsorvida a 100 ug de formulações de nanoalume com PEG (PEG-DSPE como o agente de dimensionamento) com comprimentos de PEG de 5.000, 2.000 ou 750 e tamanhos de partícula de aproximadamente 70 nm produziram titulações de anticorpo IgG1 específico para antígeno ID93 medidas como titulação de ponto médio no dia 21. A Figura 12A demonstra que titulações de IgG1 equivalentes são produzidas em camundongos imunizados com formulações de alume com tamanho de partícula de 1 a 10 μm tradicionais e formulações de nanoalume de 70 nm que compreendem o agente de dimensionamento PEG-DSPE com comprimentos de PEG de 5.000, 2.000 ou 750 ou comprimentos de PEG de 2.000 ligados a comprimentos de cadeia de acila de fosfolipídio de 18(DSPE) ou 16 (DPPE) carbonos. As formulações de nanoalume que têm um fosfolipídio com um comprimento de cadeia de acila de 14 carbonos (DMPE) e um comprimento de PEG 2.000 tiveram titulações de IgG1 reduzidas em aproximadamente metade em comparação com as outras formulações de nanoalume. A Figura 12B demonstra que uma dose de 100 ug de uma formulação de nanoalume de tamanho de partícula de 70 nm que compreende o agente de dimensionamento PEG-DSPE com comprimentos de PEG de 5.000, 2.000 ou 750 ou comprimentos de PEG de 2.000 ligado a comprimentos de cadeia de acila de fosfolipídio de 18(DSPE) ou 16 (DPPE) carbonos adsorvido a 0,5 μgI de D93 mais 5 μg do agonista de TLR4, SLA, produz titulações de anticorpo IgG2c específico para antígeno indicativas de uma polarização de Th1 embora a resposta seja aproximadamente metade daquela vista com uma formulação de alume de tamanhos de partícula de 1 a 10 μm. As formulações de nanoalume que têm um fosfolipídio com um comprimento de cadeia de acila de 14 carbonos (DMPE) e um comprimento de PEG de 2.000 não demonstram qualquer ID93 IgG2c perceptível. A Figura 12C demonstra que formulações de nanoalume ID93 induzem células T CD4+ específicas para antígeno. A produção de citocinas de camundongos imunizados foi analisada quanto a células T de memória CD44hi CD4+ específicas para ID93 conforme medido por citometria de fluxo. Os esplenócitos de camundongos vacinados estimulados com ID93 por 12 horas na presença de GolgiStop e esplenócitos estimulados com ID93 foram identificados por manchamento de citocina intracelular com base em expressão de CD3 e CD4 e foram, ainda, reunidos em células de alto CD44. As células T de alto CD44 CD4+ foram, ainda, manchadas para CD154, IFN-Y, TNF, GM-CSF, IL-17 e IL-5 intracelulares. As células T de alto CD44 CD4+ específicas para ID93 exibiram respostas de célula T polifuncional positivas para TNFα e IL-5 típicas de respostas de ID93 específicas para antígeno, demonstrando que esses nanoalumes podem ser um veículo eficaz para o agonista de TLR4 SLA induzir imunidade a Th1 ao antígeno ID93. EXEMPLO 4. GERAÇÃO DE FORMULAÇÕES DE NANOALUME COM QUITOSANO, DEXTRANO E POLI(ALILAMINA).

[0454] Os adjuvantes contendo alumínio têm sido administrados em seres humanos e animais desde meados dos anos 20. O termo alume é usado amplamente para classificar de modo geral qualquer adjuvante à base de alumínio usado em vacinas, mas os mesmos quimicamente são principalmente oxi-hidróxido de alumínio (AlO(OH)) ou fosfatos de alumínio (AlPO4 também denominado Al(OH)x(PO4)y). AlO(OH) é pouco cristalino conforme evidenciado a partir de seu padrão de difração de raios X (XRD), a estrutura de cristal é pseudoboemita, que é uma das muitas fases metastáveis da fase de corindo estável (α-Al2O3). A superfície de AlO(OH) é catiônica e, assim, mais adequada para adsorção de antígenos aniônicos. A imaginologia por TEM mostra nanopartículas fibrosas com dimensões médias calculadas de 4,5 x 2,2 x 10 nm, que formam agregados com uma distribuição de tamanho ampla de 5 a 10 mícrons em suspensão. Fosfato de alumínio, ao contrário de seu nome, consiste em contraíons tanto de fosfato quanto de hidróxido em quantidades não estequiométricas, tem uma carga de superfície negativa (aniônica) líquida e, assim, mais adequada para adsorção de antígenos catiônicos. Diferente de AlO(OH), fosfatos de alumínio é anidro a raios X e consiste em partículas em formato de disco de ~50 nm que formam agregados frouxos de aproximadamente 4 μm de diâmetro mediano. São descritos no presente documento exemplos de adjuvantes de nanopartícula à base de alumínio (nanoalume) fabricados com o uso de alume de tamanho mícron comercialmente disponível (por exemplo, Alhydrogel® ou AdjuPhos®) como material de partida e microfluidizando-se os mesmos na presença de agentes estabilizantes.

[0455] Nanoalume-quitosano com o uso de adjuvante de AdjuPhos® (Al(OH)x(PO4)y). O seguinte descreve um método geral para sintetizar nanoalume com o uso de AdjuPhos® como o precursor de alume e um quitosano de baixo peso molecular (50.000 a 190.000 Da com base na viscosidade de 0,02 a 0,3 Pa^s (20 a 300 cP) de solução a 1 % em peso em ácido acético a 1% e 25 °C) com 75 a 85% de grau de desacetilação (DD) como agente estabilizante. MATERIAIS

[0456] A concentração de adjuvante de AdjuPhos® (10 ml a 5 mg de Al/ml; 50 mg de Al) foi mantida constante e estabilizada com quantidade variáveis de quitosano. Antes da mistura, uma quantidade predeterminada de quitosano foi dissolvida em 40 ml de tampão moderadamente ácido de acetato de sódio 0,12 M/ácido acético 0,02 M, pH = 5,4. Após dissolver completamente, a solução de quitosano (40 ml) foi misturada com 10 ml de AdjuPhos® (50 mg de alumínio), misturados por 5 minutos em misturador de alto cisalhamento silverson a 5.000 rpm e, então, microfluidizado a 206,84 MPa (30.000 psi) por 22 passagens distintas em in microfluidizador de alto cisalhamento LM20 (Microfluidics). O material microfluidizado era visualmente turvo, mas translúcido. A composição de vários nanoalumes derivados de Adjuphos® estabilizado com quitosano é fornecida na Tabela 6 abaixo. O diâmetro hidrodinâmico reduziu com o número de passagens conforme mostrado na Figura 13A. Para o mesmo processo de homogeneização, o diâmetro hidrodinâmico tendeu a diminuir com o aumento de fração de quitosano (13B). Em média, o potencial zeta de formulações de nanoalume-quitosano foi +20 mV. TABELA 6. COMPOSIÇÕES DE NANOALUMES FABRICADOS COM O USO DE ADJUPHOS® COMO MATERIAL DE PARTIDA E QUITOSANO DE BAIXO PESO MOLECULAR (~120.000 DA, MÍNIMO 85% DE DD) COMO AGENTE ESTABILIZANTE.

[0457] Nanoalume-Dextrano com o uso de adjuvante de Alhydrogel® (AlO(OH)). O seguinte descreve um método geral para sintetizar nanoalume com o uso de Alhydrogel® como o precursor de alume e sulfato de dextrano (40.000 Da) como o agente estabilizante. MATERIAIS

[0458] A concentração de adjuvante de Alhydrogel® (10 ml a 10 mg de Al/ml; 100 mg de alumínio) foi mantida constante e estabilizada com quantidade variáveis de sulfato de dextrano. Antes da mistura, uma quantidade predeterminada de sulfato de dextrano foi dissolvida em 40 ml de água DI. 10 ml de Alhydrogel® (100 mg de Al) foram adicionados a 40 ml de solução de sulfato de dextrano, misturados por 5 minutos em misturador de alto cisalhamento silverson a 5.000 rpm e, então, microfluidizado a 206,84 MPa (30.000 psi) por 15 passagens distintas em in microfluidizador de alto cisalhamento LM20 (Microfluidics). O material microfluidizado foi transparente a translúcido e esterilizado por filtração com membrana PES de 200 nm. A composição de vários nanoalumes derivados de Alhydrogel® estabilizado com sulfato de dextrano é fornecida na Tabela 7 abaixo. O diâmetro hidrodinâmico reduziu com o número de passagens conforme mostrado na Figura 14A. Em média, o potencial zeta de formulações de nanoalume-dextrano foi -40 mV. Os dados de estabilidade de partícula disponíveis no momento deste relatório não mostram alteração significativa em tamanho de nanoalume-dextrano (lote QG774 mostrado como exemplo) até 3 meses após a data de fabricação (Figura 14B). TABELA 7. COMPOSIÇÃO DE NANOALUMES FABRICADOS COM O USO DE ALHYDROGEL COMO MATERIAL DE ALUME DE PARTIDA E SULFATO DE DEXTRANO (40 KDA) COMO AGENTE ESTABILIZANTE

[0459] Nanoalume-quitosano com o uso de adjuvante de Alhydrogel® (AlO(OH)). O seguinte descreve um método geral para sintetizar nanoalume com o uso de Alhydrogel® como o precursor de alume e quitosano (15.000 Da, mínimo 85% de DD) como o agente estabilizante. MATERIAIS

[0460] Alhydrogel nativo (AlO(OH)) tem uma carga de superfície catiônica e, assim, repele eletrostaticamente quitosano, que também é catiônico. A fim de adsorver quitosano a Alhydrogel®, o último precisa passar por modificação de superfície por meio de troca de ligante de fosfato. Para troca de fosfato, Alhydrogel® (10 mg de Al/ml) foi misturado com PBS 10x à razão em volume de 1:2 e deixado reagir por 24 a 48 horas a 37 °C em um agitador orbital. Alhydrogel® com troca de fosfato (PE-Alhydrogel®) foi centrifugado a 2.500 rpm por 15 minutos e o sobrenadante transparente decantado. O PE-Alhydrogel® peletizado foi, então, disperso em água DI e a etapa de centrifugação- decantação foi repetida 3 vezes para remover por lavagem o tampão de fosfato. O pélete de PE-Alhydrogel® lavado final foi disperso em água DI a uma concentração de 10 mg de Al/ml e armazenado à temperatura ambiente. A medição de potencial zeta de Alhydrogel® antes e depois da troca de fosfato confirmou que a carga de superfície foi suficientemente transformada de catiônica em aniônica (Figura 15A). Uma solução de quitosano a 2% em p/v em ácido acético a 1% em v/v foi preparada como uma solução de estoque para mistura com PE-Alhydrogel®. 10 ml de PE-Alhydrogel® (100 mg de Al) foram misturados com quantidades variáveis de quitosano preparadas diluindo-se a solução estoque de quitosano 2% com água DI. As condições de mistura exemplificativas são listadas na Tabela 8. TABELA 8. EXEMPLOS DE CONDIÇÕES DE MISTURA DE PE-ALHYDROGEL® E QUITOSANO.

[0461] Cada 50 ml de mistura de PE-Alhydrogel® e quitosano foi homogeneizado com misturador de alto cisalhamento silverson a 5.000 rpm por 5 minutos, então, microfluidizado a 206,84 MPa (30.000 psi) em modo contínuo por 5 minutos a 110 ml/min com o uso do microfluidizador M110P (Microfluidics). O material microfluidizado era branco opalescente e quase transparente. A composição de lotes exemplificativos sintetizados é fornecida na Tabela 9. O tamanho de partícula de material de nanoalume-quitosano pré- filtrado de DLS é mostrado na Figura 15B. Em geral, o diâmetro em média Z foi positivamente relacionado à quantidade de quitosano usada. As formulações foram filtradas com membrana PES de 200 nm, quando a filtração foi possível, e armazenadas a 4 °C. Em média, o potencial zeta de formulações de nanoalume-quitosano foi +20 mV. TABELA 9. COMPOSIÇÕES DE NANOALUME DERIVADO DE ALHYDROGEL® ESTABILIZADO COM QUITOSANO (15 KDA, MÍNIMO 85% DE DD).

[0462] O diâmetro hidrodinâmico em média z aumenta ao longo do tempo mas, dependendo da quantidade de quitosano usada, estabiliza-se em torno de 300 a 500 nm. Em segundo lugar, a taxa de aumento de tamanho é dependente de temperatura - o tamanho aumentar mais rapidamente em temperaturas mais altas - sugerindo que o aumento de tamanho é endotérmico e potencialmente acionado por um aumento em entalpia.

[0463] Nanoalume-poli(alilamina) com o uso de adjuvante de Alhydrogel® (AlO(OH). O seguinte descreve um método geral para sintetizar nanoalume com o uso de Alhydrogel® como o precursor de alume e poli(alilamina) (15.000 Da) como o agente estabilizante. MATERIAIS

[0464] Alhydrogel® nativo (AlO(OH)) tem uma carga de superfície catiônica e, assim, repele eletrostaticamente poli(alilamina), que também é catiônico. A fim de adsorver poli(alilamina) a Alhydrogel®, o último precisa passar por modificação de superfície por meio de troca de ligante de fosfato. Para troca de fosfato, Alhydrogel® (10 mg de Al/ml) foi misturado com PBS 10x à razão em volume de 1:2 e deixado reagir por 24 a 48 horas a 37 °C em um agitador orbital. Alhydrogel® com troca de fosfato (PE-Alhydrogel®) foi centrifugado a 2.500 rpm por 15 minutos e o sobrenadante transparente decantado. O PE-Alhydrogel® peletizado foi, então, disperso em água DI e a etapa de centrifugação-decantação foi repetida 3 vezes para remover por lavagem o tampão de fosfato. O pélete de PE-alhydrogel lavado final foi disperso em água DI a uma concentração de 10 mg de Al/ml e armazenado à temperatura ambiente. A medição de potencial zeta de Alhydrogel® antes e depois da troca de fosfato confirmou que a carga de superfície foi suficientemente transformada de catiônica em aniônica. Para sintetizar nanoalume estabilizado com poli(alilamina), 10 ml de PE-alhydrogel (100 mg de Al) foram misturados com quantidades variáveis de 15% em p/v de poli(alilamina); as razões de mistura exemplificativas são resumidas na Tabela 10. Visto que a forma de base livre de poli(alilamina) foi usada, o pH da mistura de PE-alhydrogel e poli(alilamina) estava entre 8 e 11 e, assim, exigiu ajuste a 7 com o uso de HCl 6 M. TABELA 10. EXEMPLOS DE RAZÕES DE MISTURA USADAS PARA PREPARAR NANOALUME DERIVADO DE ALHYDROGEL® ESTABILIZADO COM POLI(ALILAMINA).

[0465] Para produzir nanoalume estável, a mistura de PE-Alhydrogel® e poli(alilamina) foi misturada por 5 minutos com o uso do misturador de alto cisalhamento Silverson a 5.000 rpm e, então, microfluidizada a 206,84 MPa (30.000 psi) por 5 minutos a 110 ml/min com o uso do microfluidizador M110P (Microfluidics). O material microfluidizado era quase transparente e foi esterilizada por filtração com membrana PES de 200 nm. O tamanho de partícula de nanoalume, mostrado na Figura 16, aumentou com o teor de poli(alilamina). Em média, o potencial zeta de formulações de nanoalume-poli(alilamina) foi em torno de +20 mV. A composição de formulações de nanoalume-poli(alilamina) exemplificativas preparada é fornecida na Tabela 11. TABELA 11. EXEMPLOS DE FORMULAÇÕES DE NANOALUME DERIVADAS DE ALHYDROGEL® ESTABILIZADAS COM POLI(ALILAMINA)

[0466] Nanoalume-poli(alilamina) para formular vacinas à base de RNA. Para avaliar a compatibilidade de nanoalume- poli(alilamina) de formar complexo com RNA, misturou-se 1 μg de um RNA autorreplicante de 10 kb, que codifica um antígeno de Zika, com formulações de nanoalume-poli(alilamina) diluídas contendo 1 mg/ml (lote QG860), 2 mg/ml (lote QG859) ou 20 mg/ml (lote QG854) de poli(alilamina). As amostras de RNA em complexo com nanoalume, juntamente com controles de RNA nu, foram avaliadas em um ensaio de retardamento de gel (GRA) para avaliar a capacidade de cada formulação para ligar RNA e a capacidade de carregamento. QG859 (2 mg/ml de poli(alilamina) não diluída) ligou 100% de RNA em diluição a 1/200 (0,01 mg/ml de poli(alilamina)). Similarmente, QG860 (1 mg/ml de poli(alilamina) não diluída) ligou 100% de RNA em diluição a 1/100 (0,01 mg/ml de poli(alilamina)). Ambas as formulações mostraram características de ligação similares que se correlacionam com a quantidade de poli(alilamina). Por outro lado, QG854 (20 mg/ml de poli(alilamina) não diluída) ligou quase 100% de RNA mesmo em diluição a 1/4.000 (0,005 mg/ml de poli(alilamina)). REFERÊNCIAS 1. Shah RR, Dodd S, Schaefer M, Ugozzoli M, Singh M, Otten GR, Amiji MM, O'Hagan DT, Brito LA. The Development of Self-Emulsifying Oil-in-Water Emulsion Adjuvant and an Evaluation of the Impact of Droplet Size on Performance. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2015 2. Weichert R, editor. Determination of Extinction Efficiency and Particle Size Distribution by Photosedimentation using Light of Different Wavelengths. Particle Size Analysis 1981 Proc 4 th Conf held at Loughborough Univ of Technology, 21 a 24 de setembro de 1981 Editado por N G Stanley-Wood e T Allen Chichester, Wiley, 1982; 1981. 4. Xiang SD, Scholzen A, Minigo G, David C, Aspostolopoulos v, Mottram PL, Plebanski M. Pathogen Recognition and Development of Particulate Vaccines: Does Size Matter? Methods. 2006: 1 a 9. 5. Kalkanidis M, Pietersiz GA, Ziang SD, Mottram PL, Crimeen-Irwin B, Ardipradja K, Plebanski M. Methods for Nano-Particle Based Vaccine Formulation and Evaluation of their Immunogenicity. Methods. 2006: 20 a 29 6. Fung HWM, Mikasa TJT, Vergara J, Sivananthan SJ, Guderian JA, Duthie MS, Vedvick TS, Fox CB. Optimizing Manufacturing and Composition of a TLR4 Nanosuspension: Physicochemical Stability and Vaccine Adjuvant Activity. Journal of Nanobiotechnology. 2013: 11 a 43. 7. Weichert R, editor. Determination of Extinction Efficiency and Particle Size Distribution by Photosedimentation using Light of Different Wavelengths. Particle Size Analysis 1981 Proc 4 th Conf held at Loughborough Univ of Technology, 21 a 24 de setembro de 1981 Editado por N G Stanley-Wood e T Allen Chichester, Wiley, 1982; 1981. 8. Schwendener RA. Liposomes as vaccine delivery systems: a review of the recent advances Ther Adv Vaccines. Novembro de 2014; 2(6): 159 a 182. 9. A.L. Nail, J.L. White, S.L. Hem, Structure of aluminum hydroxide I: initial precipitate. J Pharm Sci, 65 (1976), páginas 1.188 a 1.191. 10. E.B. Lindblad. Aluminium adjuvants D.E.S. Stewart-Tull (Ed.), The theory and practical application of adjuvants, John Wiley & Sons, Ltd, New York (1995), páginas 21 a 35. 11. S.J. Seeber, J.L. White, S.L. Hem. Predicting the adsorption of proteins by aluminum-containing adjuvantsVaccine, 9 (1991), páginas 201 a 203. 12. S. Iyer, R.S. Robin Robinett, H. HogenEsch, S.L. Hem.Mechanism of adsorption of hepatitis B surface antigen by aluminum hydroxide adjuvant Vaccine, 22 (2004), páginas 1.475 a 1.479. 13. J.V. Rinella Jr., R.F. Workman, M.A. Hermondson, J.L. White, S.L. Hem. Elutability of proteins from aluminum-containing vaccine adjuvants by treatment with surfactants J Colloid Interface Sci, 197 (1998), páginas 48 a 56. 14. Baldwin, et.al., 2009, Bertholet, et.al., A Defined Tuberculosis Vaccine Candidate Boosts BCG and Protects Against MultidrugResistant Mycobacterium tuberculosis 2010Sci Transl Med 2, 53ra74 (2010)); Baldwin, et.al. The Importance of Adjuvant Formulation in the Development of a Tuberculosis Vaccine. The Journal of Immunology, 2012, 188: 000-000.

Claims

1. Partícula de nanoalume caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um sal; e (b) um agente de dimensionamento, em que o agente de dimensionamento é ácido poliacrílico (PAA); em que uma razão em peso do sal de alumínio para o agente de dimensionamento é de 1:2 - 1:3 e em que o tamanho da partícula está na faixa de 1 nm a 450 nm.

2. Partícula de nanoalume, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o sal de alumínio é selecionado a partir do grupo que consiste em hidróxido de alumínio, gel de hidróxido de alumínio, AlPO4, AlO(OH), Al(OH)(PO4) e KAl(SO4)2.

3. Partícula de nanoalume, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o peso molecular médio do PAA está na faixa de 750 Daltons a 7.000 Daltons.

4. Partícula de nanoalume, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a partícula de nanoalume é caracterizada pelo fato de que está em uma formulação líquida que é esterilizada por filtração; opcionalmente em que a partícula de nanoalume é estável em uma formulação líquida de 0 °C a 8 °C por 1 mês, 6 meses ou 1 ano, ou em que a partícula de nanoalume é estável em uma formulação líquida a 37 °C por 1 mês.

5. Método para produzir uma partícula de nanoalume caracterizado pelo fato de que compreende: moagem de um sal de alumínio em uma fonte de alta energia na presença de um agente de dimensionamento na proporção em peso de 1:2 - 1:3, em que o agente de dimensionamento é ácido poliacrílico (PAA); e ajustar o pH a um valor inferior a 7.0; de modo que uma partícula de nanoalume seja produzida, e em que o tamanho da partícula de nanoalume está na faixa de 1 nm a 450 nm.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a moagem é realizada por microfluidizador, uma extrusora, um sonicador, um misturador de alto cisalhamento (por exemplo, misturador silverson) ou um homogeneizador.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a fonte de alta energia é gerada a partir de um microfluidizador e uma mistura de alto cisalhamento, e a mistura que compreende o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é passada através do microfluidizador de uma passagem a 30 passagens; ou em que a fonte de alta energia é gerada a partir de um microfluidizador, e a mistura que compreende o sal de alumínio e o agente de dimensionamento é passada através do microfluidizador de uma passagem a 15 passagens.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a moagem é realizada por 10-15 passagens através de um microfluidizador.

9. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a moagem é realizada a uma temperatura de 4 ° C.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que o sal de alumínio é compreendido por partículas de 0,5 a 10 μm de tamanho ou 0,5 a 20 μm de tamanho; opcionalmente em que o sal de alumínio é selecionado a partir do grupo que consiste em hidróxido de alumínio, gel de hidróxido de alumínio, AlPO4, AlO(OH), Al(OH)x(PO4)y e KAl(SO4)2.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9 caracterizado pelo fato de que: o peso molecular médio do PAA está na faixa de 750 Daltons a 7.000 Daltons.

12. Composição caracterizada pelo fato de que compreende a partícula de nanoalume, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, um agente bioativo; opcionalmente em que mais de 75% do agente bioativo está associado à partícula de nanoalume na composição, conforme determinado por eletroforese em gel.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o agente bioativo é um polipeptídeo, um polinucleotídeo, um antígeno, um adjuvante, um agente diagnóstico, um agente terapêutico ou um organismo; em que o polipeptídeo é opcionalmente uma proteína de fusão, uma proteína de comprimento completo, um peptídeo ou um mimético de peptídeo; em que o polinucleotídeo é opcionalmente DNA ou RNA que opcionalmente codifica um polipeptídeo; em que o antígeno é opcionalmente um agonista de Rig-I ou ID97.

15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, em que a composição é caracterizada pelo fato de que compreende, ainda, um adjuvante, em que o adjuvante é opcionalmente selecionado a partir do grupo que consiste em um AS-2, monofosforil lipídio A, monofosforil lipídio A 3-de-O-acilado, IFA, QS21, CWS, TOM, AGPs, oligonucleotídeos contendo CpG, agonistas de receptor tipo Toll (TLR), Leif, saponinas, miméticos de saponina, lipídio A biológico e sintético, imiquimod, gardiquimod, resiquimod, poli I:C, flagelina, GLA, SLA, STING e combinações dos mesmos.

16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, em que a composição é caracterizada pelo fato de que: (a) é uma formulação líquida, que opcionalmente é capaz de ser filtrada através de um filtro com tamanho de 0,45 mícron ou um filtro com tamanho de 0,20 mícron; e/ou (b) é capaz de ser esterilizada terminalmente antes do enfrascamento; e/ou (c) é estável a 0 °C a 8 °C por 1 mês, 6 meses ou 1 ano; e/ou (d) é estável a 37 °C por 1 mês.