CN104587464B - 一种基于氢氧化铝纳米粒的疫苗载体 - Google Patents

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Abstract

一种用作疫苗载体的铝盐佐剂，通过PEG衍生物材料与铝盐复合形成纳米粒，其不仅保留了铝盐强大的Th2体液免疫佐剂的性质，还能在体内高效传递到引流淋巴结，并且极易被树突状细胞（DC）摄取，进行有效的交叉呈递，诱导细胞免疫应答，具有强的Th1免疫应答。

Description

一种基于氢氧化铝纳米粒的疫苗载体
技术领域
本发明涉及一种基于铝盐佐剂的疫苗载体，具体涉及基于氢氧化铝纳米粒的体液免疫应答和细胞免疫应答的疫苗载体涉及制备方法。
背景技术
疫苗的出现改变了人类与疾病斗争时处于被动的局面，是人类公共健康史上最伟大的发现之一(Wayne C. Koff, Dennis R. Burton, et al. Accelerating next-generation vaccine development for global disease prevention. Science. 2013(340):1232910)。已经上市的疫苗绝大部分是通过体液免疫产生中和性抗体来保护机体，但许多全球流行的疾病如疟疾、肺结核、AIDS等仅靠中和性抗体并不能起到很好的保护作用。这些疾病中入侵机体的病原体需要依靠细胞免疫应答才能有效地清除（Wayne C.Koff, Dennis R. Burton, et al. Accelerating next-generation vaccinedevelopment for global disease prevention. Science. 2013(340):1232910.）。因此能同时诱导强大体液免疫和细胞免疫的疫苗亟待研究。
传统的疫苗采用减毒或者灭活病原体的策略制备，已经在大量疾病上取得了成功，如天花、脊髓灰质炎、破伤风、白喉等（Darrell J. Irvine, Melody A. Swartz,Gregory L. Szeto. Engineering synthetic vaccines using cues from naturalimmunity. Nat materials. 2013(12):978-990.）。但传统疫苗潜在的毒性问题使得其在使用上存在安全隐患。由于这种原因人们目光开始转向亚单位疫苗。亚单位疫苗是利用病原微生物表面的某种抗原（蛋白或者一段多肽）制成的，相比于传统的减毒、灭活疫苗，其具有更高的安全性。但亚单位疫苗在解决了安全性问题的同时带来了免疫原性降低的麻烦，即机体接种疫苗后不能产生有效的免疫应答，因此需要与佐剂合用。
在所有佐剂中铝盐佐剂是在人体上应用得最广泛的一种，自1926年铝盐佐剂的免疫效应第一次被Glenny描述以来（Glenny AT, Pope CG, Waddington H, Wallace U.Immunological notes XVII to XXIV. J Pathol. 1926(29):31–40.），至今已有超过80年的应用历史，临床上使用也超过30年，其有效性和安全性得到了充分验证。
但铝盐佐剂也存在明显的不足，即虽然能引起强大的Th2体液免疫应答，但是缺乏Th1细胞免疫应答。这使得铝佐剂的应用被限制在了针对细菌或者主要依靠产生中和性抗体来发挥作用的疫苗中，而在主要依靠Th1应答的疾病如HIV、肺结核、疟疾、肿瘤等疫苗的应用上无法取得满意的效果。并且传统铝盐佐剂使用时铝含量高，在注射部位不易代谢，往往会伴随有局部组织严重刺激性，注射部位长时间炎症、红肿、肉芽肿等副作用。（Erik B.Lindblad. Aluminium adjuvants in retrospect and prospect. Vaccine. 2004(22):3658–68.）
外源性的抗原进入体内要产生Th1型细胞免疫应答则需要CD8α+DC细胞来进行交叉呈递，形成抗原-MHC-I复合物，才能有效地激活CD8+T 细胞，从而产生细胞免疫应答（Megan K. L. MacLeod,Amy S. McKee, et al. Vaccine adjuvants aluminum andmonophosphoryl lipid A provide distinct signals to generate protectivecytotoxic memory CD8 T cells. PANS. 2011(108):7914-7919.）。而CD8α+DC存在于淋巴结等免疫器官中，在皮肤含量极少，因此传统的皮下、皮内、肌肉注射等方式难以实现这种交叉呈递。通过合适的载体将抗原传递到淋巴结，并且能有效地被CD8α+DC摄取，是一种很有潜力的实现交叉呈递、诱导有效细胞免疫应答的方式。
因此，在充分利用铝佐剂安全性和强效Th2免疫应答的性的前提下，提高其在Th1免疫应答上的不足，成为当前临床的迫切需要。
发明内容
本发明的目的之一提供一种用作疫苗载体的铝盐佐剂，其不仅保留了铝盐强大的Th2体液免疫佐剂的性质，还能在体内高效传递到引流淋巴结，并且极易被树突状细胞（DC）摄取，进行有效的交叉呈递，诱导细胞免疫应答，具有强的Th1免疫应答。
在疫苗研究中，淋巴结是免疫反应发生的重要场所，在整个免疫应答过程中起着非常重要的作用，没有到达淋巴结的抗原是无法诱导机体产生免疫应答的（Rolf M.Zinkernagel, et al . Antigen localisation regμlates immune responses in adose- and time-dependent fashion: a geographical view of immune reactivity.Immunol.Rev.1997(156):199–209.）。小粒径的纳米粒在体内能有效地传递到淋巴结，是很有潜力的疫苗载体（Theodora Fifis, Anita Gamvrellis, et al. Size-dependentimmunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccinesagainst tumors. J Immunol. 2004(173):3148-3154.）（Sai T Reddy, et al.Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticlevaccines. Nature biotechnology.2007(25):1159-1164.）。但是细胞摄取却是随着粒径增加而增加的（Hyungjin Kim，Tomofumi Uto, Mitsuru Akashi，et al. AmphiphilicPoly(Amino Acid) Nanoparticles Induce Size-Dependent Dendritic CellMaturation. Adv Funct Mater.2010(10):3925-3931.），因此良好的疫苗载体需要在淋巴结传递和细胞摄取之间找到平衡。
本发明的目的之一提供一种用作疫苗载体的铝盐佐剂，其优选为铝盐纳米粒，进一步优选为氢氧化铝纳米粒。
本发明的目的之一提供一种用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒，其能同时诱导体液免疫应答（Th2免疫应答）和细胞免疫应答（Th1免疫应答）。
本发明的目的之一提供一种用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒，其特征在于主要由PEG衍生物材料与氢氧化铝复合形成纳米粒；其中，所述的氢氧化铝优选是在制备过程中由铝盐如Al2(SO4)3等制备得到，这样能够优化PEG衍生物材料与氢氧化铝的相互作用，得到粒径合适的纳米粒。
作为本发明优选的实施方案之一，一种用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒，其特征在于主要由PEG衍生物材料与氢氧化铝复合形成纳米粒，其中基于重量份计，PEG衍生物材料：氢氧化铝为0.05~1.85：0.042~0.866，优选为0.75~1.11：0.125~0.173。
本发明用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒中铝含量极低，注射部位无炎症等副反应；优选地，其能特异性地被抗原提呈细胞（如DC）摄取，有利于免疫应答的产生，同时减少了被其他细胞摄取而产生的副作用。
本发明所述PEG衍生物材料是，但不仅限于， PEG-poly(AGE-Suc)（由本实验室前期合成，Hanmei Li, Xun Sun, et al. A Cell-Specifi c Poly(ethylene glycol)Derivative with a Wheat-like Structure for Efficient Gene Delivery. Mol. Pharmaceutics, 2012, 9 (11):2974–2985.）。
在Th1型免疫应答佐剂的研究中，与TLR样受体家族有关的一系列佐剂显示出了良好的潜力，如双链RNA (Poly I:C)(TLR3)，LPS、MPLA(TLR4)，Imiquiod (TLR7)，CpG-OND(TLR9)等，这些佐剂在实验室、临床前以及临床实验上均有积极结果的报道（Derek T. O’Hagan, Nicholas M. Valiante. Recent advances in the discovery and delivery ofvaccine adjuvants.Nat Rev Immunol. 2003(2):727-735. ）。本发明人因此利用Th1型免疫佐剂与氢氧化铝纳米粒复合，这种复合物在体内能同时诱导强效的Th1应答和Th2应答。
本发明的目的之一提供一种用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒，其特征在于主要由Th1型免疫佐剂、PEG衍生物材料与氢氧化铝，复合形成纳米粒；其中，所述的氢氧化铝优选是在制备过程中由铝盐如Al2(SO4)3等制备得到。
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的一种用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒，其特征在于用Th1型免疫佐剂、PEG衍生物材料与氢氧化铝复合形成纳米粒，其中基于重量份计，PEG衍生物材料：氢氧化铝：Th1型免疫佐剂为0.05~1.85：0.042~0.866：0.001~0.5，优选为 0.75~1.11：0.125~0.173：0.008~0.03。
本发明所述的基于氢氧化铝纳米粒的疫苗载体，优选是多肽、蛋白或者多糖等抗原载体。
本发明的目的之一提供了一种链接（或包裹）OVA（模型抗原）的氢氧化铝纳米粒，所述氢氧化铝纳米粒通过二硫键与OVA（模型抗原）链接。
本发明的目的之一提供了一种具有Th1型免疫佐剂且链接（或包裹）OVA（模型抗原）的氢氧化铝纳米粒，其中，所述氢氧化铝纳米粒是通过二硫键、酰胺键、酯键等与OVA（模型抗原）链接，其结构如图1所示。
本发明中的PEG-poly(AGE-Suc)，PEG单元长度在20~120之间，优选为50~90个单位，poly（AGE-Suc）单元长度在1~50之间，优选为5~15个单元，优选后聚合物分子量约为3000~7000道尔顿。其结构式如下式：
本发明Th1型佐剂包括：RNA (Poly I:C)、MPLA、CpG-OND、Imiquiod等，优选为CpG-OND。
本发明的OVA与PEG-poly(AGE-Suc)的链接包括二硫键、酰胺键、酯键等，优选是二硫键。
本发明的目的之一提供一种氢氧化铝纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）向Hepes缓冲液中加入PEG-poly(AGE-Suc)溶液，搅拌均匀；
（2）吸取Al2(SO4)3溶液加入到上述混合溶液中；
（3）搅拌20-50s，优选30s，即得。
作为优选的实施方案，以最终纳米粒体积为1ml时计算：
其中，步骤（1）所述PEG-poly(AGE-Suc)的量为0.05~1.85mg。
其中，步骤（1）所述HEPES缓冲液为18.5~185μmol。
其中，步骤（2）所述Al2(SO4)3溶液为0.27~5.55μmol；其中所述Al2(SO4)3溶液中铝含量换算为最终Al(OH)3的量为0.042~0.866mg。
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的PEG-poly(AGE-Suc)量优选为0.75~1.11mg。
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的HEPES缓冲液优选为30~45μmol。
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的Al2(SO4)3溶液优选为0.8~1.11μmol；则换算成Al(OH)3的量为0.125~0.173mg。
本发明的目的之一提供一种具有Th1型免疫佐剂和OVA的氢氧化铝纳米粒的制备方法，优选包括以下步骤：
（1）向Hepes缓冲液中加入PEG-poly(AGE-Suc)-OVA溶液（或者，PEG-poly(AGE-Suc)溶液与OVA溶液的混合物）、Th1型佐剂溶液，搅拌均匀；
（2）吸取Al2(SO4)3溶液加入到上述混合溶液中；
（3）搅拌20-50s，优选30s，即得。
作为优选的实施方案，以最终纳米粒体积为1ml时计算：
其中，步骤（1）所述PEG-poly(AGE-Suc)-OVA量为0.05~1.85mg；或者，步骤（1）所述PEG-poly(AGE-Suc)溶液与OVA溶液的混合物中PEG-poly(AGE-Suc)量为0.05~1.85mg，OVA量为20~400μg。
其中，步骤（1）所述Th1型佐剂量为1~500μg。
其中，步骤（1）所述HEPES缓冲液为18.5~185μmol。
其中，步骤（2）所述Al2(SO4)3溶液为0.27~5.55μmol；其中所述Al2(SO4)3溶液中铝含量换算为最终Al(OH)3的量为0.042~0.866mg。
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的PEG-poly(AGE-Suc)-OVA用量优选为0.75~1.11mg。
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的PEG-poly(AGE-Suc)溶液与OVA溶液的混合物中PEG-poly(AGE-Suc)量优选为0.75~1.11mg，OVA量为40~80μg。
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的CpG-ODN用量优选为8~30μg。
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的HEPES缓冲液优选为30~45μmol。
作为本发明优选的实施方案之一，本发明所述的Al2(SO4)3溶液优选为0.8~1.11μmol，则换算成Al(OH)3的量为0.125~0.173mg。
根据本发明，按上述步骤制备出来的氢氧化铝纳米粒，通过马尔文Nano-ZS 90粒径仪测得约为50~140nm，电位-1mV~-15mV。
本发明的目的之一还提供了链接或包裹OVA（模型抗原）的氢氧化铝纳米粒的疫苗载体。
本发明的目的之一还提供一种采用所述氢氧化铝纳米粒（含/不含Th1型佐剂）链接或包裹OVA（模型抗原）的方法。
本发明的目的之一还提供了一种铝盐在制备同时有效诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的佐剂中的用途。
本发明的目的之一还提供了一种铝盐佐剂在制备疫苗载体中的用途，所述铝盐佐剂同时有效诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。
本发明的目的之一提供了一种链接（或包裹）OVA（模型抗原）的氢氧化铝纳米粒，所述OVA链接（或包裹）在氢氧化铝纳米粒外（内）部。
本发明的目的之一提供了一种具有Th1型免疫佐剂且链接（或包裹）OVA（模型抗原）的氢氧化铝纳米粒，其中，所述OVA链接（或包裹）在氢氧化铝纳米粒外（内）部。
本发明所述制备方式简单、快速，条件温和。
本发明选择OVA作为模型抗原，通过体内外实验证明氢氧化铝纳米粒能有效诱导体内体液免疫应答和细胞免疫应答。
作为本发明优选的实施方案之一，所制备的氢氧化铝纳米粒容易被DC细胞摄取，但不会被B16、L929等其他细胞摄取，从而在保证免疫效果的情况下减少其他副作用。
作为本发明优选的实施方案之一，所制备样品铝含量为1.25μg时，与铝含量为125μg的商品化铝凝胶相比，产生的IgG抗体应答相当或者更优。
作为本发明优选的实施方案之一，所制备样品铝含量为1.25μg时，产生的CTL反应极其显著（P<0.001），优于铝含量为125μg的商品化铝凝胶。
作为本发明优选的实施方案之一，所制备样品能够应用于冻干粉针剂、注射剂、滴鼻剂、喷雾剂、微针、贴片等剂型。
有益效果
本发明的用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒，其能同时诱导体液免疫应答（Th2免疫应答）和细胞免疫应答（Th1免疫应答）。更为重要地，其使用时铝含量极低，注射部位无炎症等副反应。
本发明的氢氧化铝纳米粒，其能特异性地被抗原提呈细胞（如DC）摄取，有利于免疫应答的产生，同时减少了被其他细胞摄取而产生的副作用。
本发明的氢氧化铝纳米粒，其在铝含量远低于传统铝凝胶的情况下仍然保持了铝盐佐剂强效Th2免疫佐剂的性质，所诱导抗体滴度与传统铝凝胶相同或更优。
本发明的目的之一提供一种新的氢氧化铝纳米粒的制备方法，制备方法简单，重复性好，稳定性高。
本发明将Th1型免疫佐剂与Th2型铝盐免疫佐剂置于同一个纳米粒中，在体内能和抗原共传递到相同的免疫细胞，有利于迅速有效的产生免疫应答；与其他将抗原与佐剂物理混合使用相比，此纳米粒产生免疫应答的能力更强，更有效，并且能减少如CpG-ODN等佐剂全身分布带来的系统性副作用。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为链接有OVA（模型抗原）的含Th1型免疫佐剂的氢氧化铝纳米粒疫苗载体的结构图。
图2为氢氧化铝纳米粒-OVA-CpG纳米粒粒径数据。
图3为氢氧化铝纳米粒-OVA-CpG纳米粒电镜照片。
图4为氢氧化铝纳米粒摄取情况。
图5为BMDC成熟诱导。
图6为氢氧化铝纳米粒淋巴结分布情况。
图7为体内CTL实验。
图8为血液中IgG滴度。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
实施例1
PEG-poly(AGE-Suc)与OVA的链接
将1mg OVA（购自Sigma）溶于2ml含有25mmol/L DTT（二硫苏糖醇）的PBS中，室温搅拌两小时，用PD-10脱盐小柱（购自GE Healthcare）除去未反应DTT等小分子物质，得到断开二硫键的OVA，冻干备用。将PEG-poly(AGE-Suc)与连接剂SPDP（购自PierceBiotechnology）按摩尔比PEG-poly(AGE-Suc)：SPDP=1:1.2溶于1.5ml PBS-EDTA缓冲液中（成分为100 mmol/L Na3PO4, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH=7.5），室温搅拌45min，用PD-10脱盐小柱除去未反应SPDP等。将断二硫键OVA溶于1ml PBS-EDTA中，然后加入到上述除盐后的PEG-poly(AGE-Suc)溶液中（摩尔比PEG-poly(AGE-Suc)：OVA=1.2:1），搅拌过夜。用双蒸水做流动相，通过PD-10脱盐小柱除去小分子物质及PBS-EDTA溶液，冻干。
实施例2
PEG-poly(AGE-Suc)与FITC（异硫氰酸荧光素）链接
将PEG-poly(AGE-Suc)与FITC（购自Sigma）按摩尔比1:1.8溶于10ml Na2CO3-NaHCO3缓冲液中（pH=9.6），避光搅拌16h，用1000Da透析袋避光透析3天，冻干。
实施例3
氢氧化铝-OVA-CpG纳米粒的制备
往370μl 100mmol/L pH=7.6 HEPES缓冲液（37μmol）中加入185μl 5mg/ml PEG-poly(AGE-Suc)-OVA溶液（实施例1，以下相同）（0.925mg），10μl 1782μg/ml CpG-ODN（购自上海生工）（17.82μg），搅拌混匀；吸取555μl 1.67mmol/L Al2(SO4)3溶液（0.927μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，得到氢氧化铝-OVA-CpG纳米粒。用马尔文Nano-ZS 90粒径仪检测粒径，结果参见图2。取少量样品，用透射电镜检测，结果参见图3。
实施例4
包裹OVA的氢氧化铝-CpG纳米粒的制备
往370μl 100mmol/L pH=7.6 HEPES缓冲液（37μmol）中加入185μl 5mg/ml PEG-poly(AGE-Suc)溶液（0.925mg），20μ1 4mg/ml OVA溶液（80μg），10μl 1782μg/ml CpG-ODN（17.82μg），搅拌混匀；吸取555μl 1.67mmol/L Al2(SO4)3溶液（0.927μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，用凝胶柱除去未被包裹OVA，得到包裹OVA的氢氧化铝-CpG纳米粒。
实施例5
氢氧化铝-CpG纳米粒的制备
往370μl 100mmol/L pH=7.6 HEPES缓冲液（37μmol）中加入185μl 5mg/ml PEG-poly(AGE-Suc)溶液（0.925mg），10μl 1782μg/ml CpG-ODN（17.82μg），搅拌混匀；吸取555μl1.67mmol/L Al2(SO4)3溶液（0.927μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，得到氢氧化铝-CpG纳米粒。
实施例6
不含Th1佐剂氢氧化铝-FITC纳米粒的制备
往370μl 100mmol/L pH=7.6 HEPES缓冲液（37μmol）中加入185μl 5mg/ml FITC-PEG-poly(AGE-Suc)溶液（实施例2）（0.925mg），搅拌混匀；吸取555μl 1.67mmol/L Al2(SO4)3溶液（0.927μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，得到不含Th1佐剂氢氧化铝-FITC纳米粒。
实施例7
往370μl 100mmol/L HEPES缓冲液（37μmol）中加入185μl 6mg/ml PEG-poly(AGE-Suc)-OVA溶液（1.11mg），10μl 3500μg/ml CpG-ODN(35μg)，搅拌混匀；吸取555μl1.67mmol/L Al2(SO4)3溶液（0.927μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，得到氢氧化铝纳米粒。
实施例8
往400μl 100mmol/L HEPES缓冲液（40μmol）中加入185μl 6mg/ml PEG-poly(AGE-Suc)-OVA溶液（1.11mg），10μl 20mg/ml CpG-ODN(200μg)，搅拌混匀；吸取500μl 2mmol/LAl2(SO4)3溶液（1μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，得到氢氧化铝纳米粒。
实施例9
往300μl 100mmol/L HEPES缓冲液（30μmol）中加入185μl 4mg/ml PEG-poly(AGE-Suc)-OVA溶液（0.74mg），10μl 500μg/ml CpG-ODN(5μg)，搅拌混匀；吸取300μl 2mmol/LAl2(SO4)3溶液（0.6μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，得到氢氧化铝纳米粒。
实施例10
往370μl 50mmol/L HEPES缓冲液（18.5μmol）中加入185μl 1mg/ml PEG-poly(AGE-Suc)-OVA溶液（0.185mg），10μl 1000μg/ml CpG-ODN(10μg)，搅拌混匀；吸取500μl0.5mmol/L Al2(SO4)3溶液（0.25μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，得到氢氧化铝纳米粒。
实施例11
往370μl 50mmol/L HEPES缓冲液（18.5μmol）中加入185μl 0.5mg/ml PEG-poly(AGE-Suc)-OVA溶液（0.09mg），10μl 10mg/ml Poly I:C(购自InvivoGen) (100μg)，搅拌混匀；吸取500μl 0.5mmol/L Al2(SO4)3溶液（0.25μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，得到氢氧化铝纳米粒。
实施例12
往370μl 150mmol/L HEPES缓冲液（55.5μmol）中加入185μl 8mg/ml PEG-poly(AGE-Suc)-OVA溶液（1.48mg），10μl 1000μg/ml Poly I:C(10μg)，搅拌混匀；吸取555μl0.5mmol/L Al2(SO4)3溶液（0.28μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，得到氢氧化铝纳米粒。
实施例13
往370μl 300mmol/L HEPES缓冲液（100μmol）中加入185μl 6mg/ml PEG-poly(AGE-Suc)-OVA溶液（1.11mg），10μl 20mg/mlMPLA（购自InvivoGen）(200μg)，搅拌混匀；吸取500μl 6mmol/L Al2(SO4)3溶液（3μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，得到氢氧化铝纳米粒。
实施例14
往370μl 200mmol/L HEPES缓冲液（74μmol）中加入185μl 10mg/ml PEG-poly(AGE-Suc)-OVA溶液（1.85mg），10μl 40mg/ml MPLA(400μg)，搅拌混匀；吸取400μl 10mmol/L Al2(SO4)3溶液（4μmol），加入到上述混合溶液中，搅拌30s，得到氢氧化铝纳米粒。
实施例15
氢氧化铝纳米粒在DC2.4、BMDC、B16、L929上的摄取
在6孔板中接种5×105/孔 DC2.4、B16或L929细胞，1×106/孔 BMDC细胞，4个复孔，每孔用1ml 1640完全培养基培养，向其中加入100μl 用FITC-PEG-poly(AGE-Suc)（实施例2）制备的氢氧化铝纳米粒（实施例6），37℃，5% CO2培养环境中摄取1h，PBS洗涤3次后，用流式细胞仪检测，结果参见图4。由实验结果可知所制备氢氧化铝纳米粒极易被DC细胞摄取，有利于免疫应答的产生；同时几乎不被其他细胞摄取，有利于降低毒副作用。
实施例16
氢氧化铝纳米粒体外BMDC成熟诱导
在12孔板中接种1×106/孔 BMDC细胞，4个复孔，向其中加入50μl氢氧化铝纳米粒（实施例5），商品化铝凝胶（购自InvivoGene）与PEG-poly(AGE-Suc)物理混合物（其中铝和PEG衍生物材料的量与氢氧化铝纳米粒相同），终浓度2μg/ml LPS，PBS。37℃，5% CO2培养环境中培养24h，细胞洗涤，加入抗小鼠CD40/CD80/CD86抗体，4℃ 1h孵育染色，洗涤3三遍，用流式检测。结果如图5。由实验结果可知氢氧化铝纳米粒具有很强的佐剂效应，能有效诱导BMDC成熟，有利于免疫应答的产生。
实施例17
氢氧化铝纳米粒淋巴结分布
C57BL/6小鼠脚掌注射25μl FITC-PEG-poly(AGE-Suc)制备的氢氧化铝纳米粒（实施例6），分别在12h、24h、36h处死小鼠，取腘弯处淋巴结，冰冻切片，用DAPI（购自Sigma）染细胞核，通过激光共聚焦显微镜观察，结果参见图6。由实验结果可知氢氧化铝纳米粒在体内能快速有效的传递到引流淋巴结，为迅速有效的产生免疫应答提供了可能。
实施例18
C57BL/6小鼠体内免疫实验
用BCA试剂盒（购自Pierce）检测氢氧化铝-OVA-CpG纳米粒（实施例3）上OVA的含量，用Quant-iT™ OliGreen® （购自Life Technologies）检测CpG含量。在第0天，C57BL/6小鼠脚掌注射25μl氢氧化铝-OVA-CpG纳米粒（OVA含量为1.5μg，CpG含量为445ng，铝含量为1.25 μg ），25μl吸附有等量OVA和CpG的商品化铝凝胶（OVA含量为1.5μg，CpG含量为445ng，铝含量为125μg）；在第14天，小鼠脚掌注射纳米粒或铝凝胶25μl，加强免疫。在第28天眼眶取血，检测血液中OVA特异性IgG含量，并通过CFSE染色法检测体内细胞毒性T细胞（CTL）反应，结果参见图7和图8。由实验结果可知此纳米粒保留甚至加强了传统铝盐佐剂所具有的Th2型佐剂作用，并且产生了强大的CTL反应，弥补了传统铝盐佐剂在Th1型免疫应答上的不足。
以上结论说明本发明中的氢氧化铝纳米粒在体内能有效传递到引流淋巴结，并很快被树突状细胞摄取，诱导强效的体液免疫应答和细胞免疫应答。有效的解决了传统铝盐佐剂细胞免疫应答弱的缺点，并且在远低于传统铝凝胶中铝含量的情况下，减少了铝盐带来的副作用，保留了其强效体液免疫应答佐剂的特点。

Claims (9)

1.一种用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒，其特征在于主要由Th1型免疫佐剂、PEG-poly(AGE-Suc)与氢氧化铝复合形成纳米粒；其中基于重量份计，PEG-poly(AGE-Suc)：氢氧化铝：Th1型免疫佐剂为0.05～1.85：0.042～0.866：0.001～0.5。
2.根据权利要求1所述的用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒，其特征在于，基于重量份计，PEG-poly(AGE-Suc)：氢氧化铝：Th1型免疫佐剂为0.75～1.11：0.125～0.173：0.008～0.03。
3.权利要求1或2所述的用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒在制备同时有效诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的佐剂中的用途。
4.权利要求1或2所述的用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒在制备疫苗载体中的应用。
5.权利要求1或2所述的用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒，其特征在于其通过二硫键、酰胺键、酯键链接抗原，或者其直接包裹抗原。
6.一种制备权利要求1所述的用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)向Hepes缓冲液中加入PEG-poly(AGE-Suc)溶液，搅拌均匀；
(2)吸取Al2(SO4)3溶液加入到上述混合溶液中；
(3)搅拌20-50s，即得。
7.一种采用权利要求1所述的用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒链接或包裹抗原的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)向Hepes缓冲液中加入PEG-poly(AGE-Suc)-抗原溶液或者PEG-poly(AGE-Suc)溶液与抗原溶液的混合物、Th1型佐剂，搅拌均匀；
(2)吸取Al2(SO4)3溶液加入到上述混合溶液中；
(3)搅拌20-50s，即得。
8.一种采用权利要求1或2所述的用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒链接抗原的方法，其特征包括其特征在于其通过二硫键、酰胺键、酯键链接抗原。
9.一种采用权利要求1或2所述的用作疫苗载体的氢氧化铝纳米粒包裹抗原的方法，其特征包括其特征在于其直接包裹抗原。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3463300A1 (en) * 2016-06-01 2019-04-10 Infectious Disease Research Institute Nanoalum particles containing a sizing agent
CN109694484B (zh) * 2017-10-20 2021-08-27 四川大学华西医院 一种免疫佐剂及其制备方法
CN111658780B (zh) * 2019-10-14 2021-10-12 四川大学 一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体
CN111658617A (zh) * 2019-10-14 2020-09-15 四川大学 一种含铝佐剂疫苗的冻干制剂及其制备方法和用途
CN111701018A (zh) * 2020-06-22 2020-09-25 合肥诺为尔基因科技服务有限公司 环二核苷酸修饰铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统
CN111671894B (zh) * 2020-06-29 2022-08-23 四川大学 一种基于铝佐剂的疫苗递送系统及其制备方法
CN114366809A (zh) * 2022-01-12 2022-04-19 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院 一种铝纳米晶递送系统及其结合疫苗抗原分子自组装颗粒佐剂疫苗
CN114522241A (zh) * 2022-02-18 2022-05-24 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院 一种铝纳米晶复合免疫药物及其制备方法和应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100345761C (zh) * 2005-05-18 2007-10-31 中国石油化工股份有限公司 一种纳米氧化铝的制备方法
CN1824305A (zh) * 2005-12-29 2006-08-30 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 一种可以提高疫苗效果的纳米铝佐剂的制备方法及用途
CN101991850A (zh) * 2010-11-05 2011-03-30 东南大学 纳米氢氧化铝佐剂的制备工艺
CN102526724B (zh) * 2011-01-14 2015-07-22 四川大学 氢氧化铝凝胶-多糖复合免疫佐剂及其制备方法和用途
FR2977800B1 (fr) * 2011-07-13 2014-03-14 Sanofi Pasteur Composition vaccinale avec des nanoparticules d'hydroxyde d'aluminium
GB201205237D0 (en) * 2012-03-26 2012-05-09 Univ Edinburgh Adjuvant
CN102580079B (zh) * 2012-03-30 2015-09-23 河南农业大学 猪细小病毒纳米铝胶佐剂灭活疫苗及其制备方法
CN103372217B (zh) * 2012-04-28 2014-12-10 中国科学院深圳先进技术研究院 聚合物纳米载体制剂及其制备方法和应用
CN102988982B (zh) * 2012-12-14 2014-07-23 山东滨州沃华生物工程有限公司 一种氢氧化铝纳米胶佐剂的制备方法
CN104055736A (zh) * 2014-07-08 2014-09-24 安徽医科大学 包封纳米铝的载体及其应用

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