CN102526724B - 氢氧化铝凝胶-多糖复合免疫佐剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种氢氧化铝凝胶-多糖复合免疫佐剂及其制备方法和用途。本发明所要解决的技术问题是提供一种性能良好的、新的免疫佐剂。解决该技术问题的技术方案是提供一种复合免疫佐剂。该复合免疫佐剂主要含有氢氧化铝凝胶和细菌来源的多糖。本发明氢氧化铝凝胶-多糖免疫佐剂具有免疫活性强、临床安全性高等优点，是一种优秀的针对各种抗原的复合免疫佐剂。本发明的氢氧化铝凝胶/多糖复合物作为佐剂制备的肝炎疫苗和肿瘤疫苗具有更强的免疫效果和抗肿瘤效果，为疫苗的开发和应用提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种氢氧化铝-多糖复合免疫佐剂及其制备方法和用途。
背景技术
佐剂作为改善机体对疫苗抗原的免疫应答已经有几十年应用的历史了。疫苗中加入佐剂目的是为了加强抗原的免疫原性和免疫保护效果，表现为增强特异性抗原的特异性体液免疫和/或细胞免疫反应，从而可以提高特异性抗体的产生或/和特异性细胞免疫功能，减少有效免疫接种所需的抗原量，减少需要加强免疫接种的频率，提高早期免疫应答和免疫功能不全者的应答成功率等等。
以氢氧化铝和磷酸铝为代表的铝佐剂至今仍然是我国被批准合法使用的人用疫苗佐剂。其主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用。将蛋白质和氢氧化铝或磷酸铝混合注射，能够使抗原保存在注射部位，即“库存效应”，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。氢氧化铝或磷酸铝对促进抗原的吸收具有重要作用，但铝盐佐剂的作用机理目前尚不完全清楚。一般认为铝胶体对蛋白质分子具有很好的吸附作用。
大量的临床免疫试验认为氢氧化铝胶体佐剂对Th2介导的体液免疫反应具有很强的激发作用，而对Th1介导的细胞免疫反应的作用较弱。如何提高铝佐剂的Th1介导的细胞免疫，既能有效地诱导机体产生体液免疫，又能有效地诱导细胞免疫则是目前免疫佐剂研究的重点与难点。本领域目前需要提供新的、性能良好的免疫佐剂，为疫苗的制备提供新的有效选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的、性能良好的复合免疫佐剂，为本领域提供一种新的有效选择。
解决该技术问题的技术方案是提供一种复合免疫佐剂。该复合免疫佐剂主要含有氢氧化铝凝胶和细菌来源的多糖。
其中，上述复合免疫佐剂所述细菌来源的多糖为大肠杆菌来源的多糖和伤寒杆菌来源的多糖。
其中，上述复合免疫佐剂中所述细菌来源的多糖和氢氧化铝凝胶的重量配比为1∶0.5～100。优选的，上述复合免疫佐剂中所述细菌来源的多糖和氢氧化铝凝胶的重量配比为1∶1～25。
其中，上述复合免疫佐剂中所述氢氧化铝凝胶为粒径为2μm～4μm的氢氧化铝颗粒。粒径3μm左右为佳。
本发明另外还提供了上述复合免疫佐添加抗原形成的免疫佐剂-抗原复合物。免疫佐剂-抗原复合物在本领域也可称为疫苗。
其中，上述免疫佐剂-抗原复合物中所述抗原的含量为复合免疫佐剂中细菌来源的多糖的重量配比为1∶0.02～500。
进一步的，上述免疫佐剂-抗原复合物中所述抗原的含量为复合免疫佐剂中细菌来源的多糖的重量配比为1∶1～200。
其中，上述免疫佐剂-抗原复合物中所述抗原为乙型肝炎表面抗原HBsAg蛋白或血管生成因子bFGF蛋白。
本发明另外还提供了制备上述的免疫佐剂-抗原复合物的方法。该方法包括以下步骤：
a、取所需量的氢氧化铝凝胶用水稀释；
b、加入所需的多糖，混匀；
c、加入所需抗原，混匀。
进一步的，上述的所需抗原为HBsAg或bFGF。
本发明同时提供了上述免疫佐剂-抗原复合物在制备疫苗中的用途。所述疫苗为预防和/或治疗性疫苗。比如当抗原为HBsAg等肝炎抗原时，可以制备成为肝炎疫苗，比如当抗原为血管生成因子(如bFGF)或者肿瘤特异性抗原时，可以制备预防和/或治疗性肿瘤疫苗。
根据本发明的第一个方面，为了开发更优秀的免疫佐剂。本发明前期研究了氢氧化铝凝胶、水凝胶(Hydrogel)、脂质体、Lipid A、甘露聚糖、多糖(细菌来源)等佐剂。偶然发现氢氧化铝凝胶/细菌多糖(Al-PS)组合作为佐剂，既能有效地诱导机体产生体液免疫，又能有效地诱导细胞免疫。
为了构建好的可用于免疫佐剂的氢氧化铝多糖考察了多种氢氧化铝多糖配方。本发明进一步对不同种类的多糖进行筛选，发现使用大肠杆菌来源的多糖和伤寒杆菌来源的多糖与氢氧化铝的复合物作为佐剂制成的疫苗，在肝炎疫苗模型中，体内产生了针对HBsAg的高滴度的抗体；在肿瘤疫苗模型中，体内产生了针对bFGF的抗体，且能有效抑制肿瘤生长与转移。
同时，为了取得更好的效果，对氢氧化铝和多糖使用剂量进行了筛选，完成了对氢氧化铝和多糖配方的优化。免疫试验中通过与标准佐剂——弗氏佐剂比较，本发明氢氧化铝多糖作为佐剂产生的抗体滴度也令人满意。在以bFGF作为抗原的动物肿瘤模型实验中，用氢氧化铝多糖包裹bFGF制备得到的bFGF氢氧化铝多糖疫苗也能得到该免疫效果，甚至更好。同时，bFGF氢氧化铝多糖疫苗的抑制肿瘤转移的效果也不低于弗氏佐剂。
本发明得到了新型的疫苗佐剂-氢氧化铝凝胶/多糖复合免疫佐剂，可适用于肝炎等传染病疫苗和肿瘤疫苗的研发。其作用机制初步分析可能为氢氧化铝凝胶中铝盐与抗原结合形成抗原贮存库，使抗原得以缓慢稳定地释放，铝盐佐剂能诱导、激发体液免疫，多糖则能激活T、B、MΦ、NK、CTL、LAK等免疫细胞活性，这样既可以激发体液免疫，又能够激发细胞免疫。
本发明的有益效果为：本发明创造性地开发出了氢氧化铝-多糖复合佐剂，具有免疫活性强、临床安全性高等优点，和单独的氢氧化铝或细菌多糖作为佐剂时具有协同效果，是一种优秀的针对各种抗原的氢氧化铝-多糖复合免疫佐剂。试验表明，使用本发明的氢氧化铝多糖作为佐剂制备疫苗，可具有更高的免疫效果和抗肿瘤效果，为疫苗的开发和应用提供了新的选择。
附图说明：
图1为HBsAg蛋白与氢氧化铝凝胶/E.coli.多糖复合物免疫后，各组小鼠的抗体滴度产生情况。
图2为HBsAg蛋白与氢氧化铝凝胶/E.coli.多糖复合物免疫后，ELISPOT检测淋巴细胞产生IL-4和IFN-γ的情况。
图3为HBsAg蛋白与氢氧化铝凝胶/伤寒杆菌多糖复合物免疫后，各组小鼠的抗体滴度产生情况。
图4为HBsAg蛋白与氢氧化铝凝胶/伤寒杆菌多糖复合物免疫后，ELISPOT检测淋巴细胞产生IL-4和IFN-γ的情况。
图5为bFGF-氢氧化铝凝胶/E.coli.多糖复合物免疫后，各组小鼠的抗体滴度产生情况。
图6为bFGF-氢氧化铝凝胶/E.coli.多糖复合物免疫后，各组小鼠的IFN-γ表达水平测定结果。
图7为bFGF-氢氧化铝凝胶/伤寒杆菌多糖复合物免疫后，各组小鼠的抗体滴度产生情况。
图8为bFGF-氢氧化铝凝胶/伤寒杆菌多糖复合物免疫后，各组小鼠的IFN-γ表达水平测定结果。
图9为bFGF-氢氧化铝/E.coli.多糖复合物免疫后，各组小鼠的肿瘤生长曲线比较。
图10为bFGF-氢氧化铝/E.coli.多糖复合物免疫后，小鼠肺部肿瘤结节比较结果。
图11为bFGF-氢氧化铝/E.coli.多糖复合物免疫后，小鼠肺部重量比较结果。
图12为bFGF-氢氧化铝/伤寒杆菌多糖复合物免疫后，各组小鼠的肿瘤生长曲线比较。
图13为bFGF-氢氧化铝/伤寒杆菌多糖复合物免疫后，小鼠肺部肿瘤结节比较结果。
图14为bFGF-氢氧化铝/伤寒杆菌多糖复合物免疫后，小鼠肺部重量比较结果。
以上各图中，“E多”为大肠杆菌多糖，“伤多”为伤寒杆菌多糖，“AL”为氢氧化铝凝胶。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明方法进行进一步说明。
以下实施例使用的材料：铝佐剂(Alhydrogel，氢氧化铝凝胶)购自丹麦Brenntag Biosector(白色悬浊液，78.0g/mol，粒径3μm)，HBs Ag(乙型肝炎表面抗原)购自美国ARP公司(American Rearch Products)，E.coli多糖、伤寒杆菌多糖购自美国Sigma公司，bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)购自美国R&D公司，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自SouthernBiotech公司，C57BL/6小鼠购自重庆腾鑫实验动物中心。
实施例一复合佐剂的筛选及制备
本发明对脂质体、氢氧化铝凝胶、水凝胶、甘露聚糖、多糖(大肠杆菌来源或伤寒杆菌来源)等单独或联合作为佐剂加入抗原进行了比较，发现氢氧化铝凝胶/细菌多糖(Al-PS)组合作为复合佐剂，既能有效地诱导机体产生体液免疫，又能有效地诱导细胞免疫。
这种复合佐剂采用了两种成分：其中氢氧化铝凝胶佐剂，是一类含Al3+的无机盐，具有良好的吸附作用，能将可溶性抗原吸附于铝胶分子表面；也是良好的沉淀剂，可以浓缩抗原，减少注射剂量。氢氧化铝凝胶成本低廉、使用方便、无毒，是应用最广的一种佐剂，也是至今唯一被FDA批准可用于人类疫苗的佐剂。而多糖，尤其是细菌来源的多糖作为一种天然来源的佐剂，也受到越来越多的关注，多糖不但能激活T、B、MΦ、NK、CTL、LAK等免疫细胞活性，激活网状内皮系统(RES)吞噬、清除老化细胞、异物及病原体，还能促进IL-1，IL-2，TNF-α，INF-7等生成，调节抗体和补体形成，提高抗肿瘤免疫力能力。细菌来源的多糖作为免疫增强剂已经应用于临床，并显示出良好的安全性。
本发明在氢氧化铝型乙型肝炎疫苗的基础上添加多糖佐剂，使得抗体的转阳率提高，转阳时间提前，并获得了滴度更高的抗体；还采用氢氧化铝凝胶/多糖(Al-PS)新型佐剂制备了一种新型bFGF疫苗(Al-PS-bFGF)，并证实了这一新型佐剂疫苗抗LL2肺癌的有效性。
制备上述的免疫佐剂-抗原复合物的方法包括以下步骤：
a、取所需量的氢氧化铝用水稀释；
b、加入所需量的多糖，混匀；
c、加入所需量的抗原，如HBsAg或bFGF，混匀。
经过进一步的筛选试验，细菌来源多糖和氢氧化铝凝胶的重量配比可为1∶0.5～1∶100。优选为1∶1～1∶25，均能有好的免疫佐剂的效果，本发明中多糖和氢氧化铝凝胶重量配比是指固体物质间的重量配比。
氢氧化铝凝胶一般使用为粒径为2μm～4μm的氢氧化铝颗粒。优选为粒径3μm左右的氢氧化铝颗粒。
而经过筛选，上述免疫佐剂-抗原复合物中所述抗原的含量与复合免疫佐剂中细菌来源的多糖的重量配比为1∶0.02～1∶500，优选为1∶1～1∶200。
显然，本领域技术人员在使用不同抗原制备疫苗时，可以在上述范围内合理调整抗原和免疫佐剂中细菌来源的多糖的比例。也可以根据需要合理调整复合免疫佐剂中氢氧化铝凝胶和细菌来源多糖的重量配比。
比如，本发明中实例中，当使用HBsAg作为抗原时：
免疫佐剂-抗原复合物中HBsAg含量与复合免疫佐剂中细菌来源的多糖的重量配比可为1∶1～500，优选为1∶10～200。
而此时细菌来源多糖和氢氧化铝凝胶的重量配比可为1∶0.5～5，优选为1∶1～1.25。
使用bFGF时：
免疫佐剂-抗原复合物中bFGF含量与复合免疫佐剂中细菌来源的多糖的重量配比可为1∶0.02～50(50∶1～1∶50)，优选为1∶0.1～10。最优选的比例为1∶1。
而此时细菌来源多糖和氢氧化铝凝胶的重量配比可为1∶5～1∶100，优选为1∶10～1∶50。最优选为1∶25。
实施例二本发明使用E.coli多糖或伤寒多糖作为乙肝疫苗佐剂的动物免疫试验
一、分组
1.单独蛋白组：HBsAg蛋白0.1μg/小鼠/次；
2.Al(OH)3组：HBsAg蛋白0.1μg+Al(OH)3 25μg/小鼠/次；
3.E.coli多糖组：HBsAg蛋白0.1μg+E.coli多糖20μg/小鼠/次；
4.Al(OH)3+E.coli多糖组：HBsAg蛋白0.1μg+Al(OH)3 25μg+E.coli多糖20μg/小鼠/次；
5.PBS组：PBS+Al(OH)325μg+E.coli多糖20μg/小鼠/次。
按上述分组分别免疫6周龄C57BL/6小鼠(每组五只)，两周免疫一次，共三次。分别在免疫后0、1、3、5、7、9、13、17周尾静脉采血，分离血清，置于-20℃保存待测。
二、阳转率的测定
通过ELISA法检测各组小鼠血清中的抗体阳转率。检测方法如下：将HBsAg蛋白用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至5μg/ml，在96孔板中每孔加入100μl，4℃过夜。PBST(PBS+0.5％Tween20)洗涤3次。5％脱脂奶粉37℃封闭1小时，PBST洗涤3次。1、3、5周的血清样品用5％脱脂奶粉1∶100稀释，每孔加100μl稀释的血清样品，37℃孵育1小时。PBST洗涤5次。其后，每孔加入100μL HRP标记羊抗小鼠IgG(1∶3000稀释)，37℃孵育1小时。PBST洗涤5次。各反应孔中加入临时配制的TMB溶液(KPL公司)100μl，室温显色20分钟后，加入0.5M H2SO4 100μl终止反应，450nm波长读数。
各组的抗体阳转率见表1，结果表明单独免疫HBsAg蛋白效果不佳，三次免疫后阳转率只有20％；以Al(OH)3为佐剂可以提高抗体的阳转，三次免疫后的阳转率可达到100％；E.coli多糖作为佐剂可以使阳转率提高，两次免疫后的阳转率从20％提高到80％，三次后达到100％；以Al(OH)3+E.coli多糖复合佐剂效果更好，两次免疫后即可使100％的小鼠阳转。
表1各组的抗HBsAg的阳转率(％)
结果表明，Al(OH)3+E.coli多糖复合佐剂能有效刺激免疫，与国际通用佐剂相比，提前2周达到百分之百的阳转率。
三、抗体滴度的测定
通过ELISA法检测各组小鼠不同时间段血清中的抗体滴度。方法同上，血清样品用5％脱脂奶粉做等二倍稀释。各组抗体滴度的检测结果见图1，E.coli多糖作为佐剂能有效地刺激抗体的产生，单独使用E.coli多糖组和Al(OH)3+E.coli多糖复合佐剂组均能有效刺激抗体的产生，随着免疫次数的增加，抗体滴度逐渐上升，单独使用E.coli多糖组最高能达到1∶105，Al(OH)3+E.coli多糖复合佐剂组效果更佳，可达到1∶106。而单独HBsAg组的滴度最高只能达到1∶103，国际通用佐剂——Al(OH)3组的滴度最高只能达到1∶104。与Al(OH)3组相比，E.coli多糖组和Al(OH)3+E.coli多糖复合佐剂组均存在统计学差异(P＜0.05)，Al(OH)3+E.coli多糖复合佐剂组与E.coli多糖组之间也存在统计学差异(P＜0.05)。
四、细胞因子IL-4和IFN-γ的测定
IL-4和IFN-γ的测定采用ELISPOT试剂盒(R&D公司)进行。具体如下：小鼠末次免疫后一周处死，取出脾脏。将脾脏放在200目尼龙网上研磨，培养基(DMEM+5％FBS+双抗生素)混悬，用小鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，测定细胞密度，将细胞数稀释至5×106细胞/ml。96孔板中每孔加入100μl细胞液，再加入0.5μg HBsAg刺激，置于CO2孵箱培养48小时，用ELISPOT检测试剂盒测定分泌IL-4及IFN-γ的细胞数量。数据统计分析采用CTL公司的Immunospot S5Micro Analyzer及软件。
分析结果见图2，单独HBsAg和Al(OH)3佐剂组只能刺激少量的淋巴细胞分泌IL-4，基本没有IFN-γ的分泌；加入E.coli多糖后能有效刺激分泌IL-4和IFN-γ淋巴细胞的产生，单独采用E.coli多糖组和Al(OH)3+E.coli多糖复合佐剂组均有效，P＜0.05，复合Al(OH)3的效果更佳。结果显示，E.coli多糖能有效刺激机体的体液免疫和细胞免疫。
以伤寒杆菌多糖替代大肠杆菌多糖(E.coli多糖)也能达到相同的效果。添加伤寒杆菌多糖的分组和用量与E.coli.多糖一致，免疫方案与采血点均相同，检测方案一致。结果如下：各组抗体阳转率的结果见表2，与E.coli.多糖一样，伤寒杆菌多糖同样能有效刺激机体免疫，使抗HBsAg抗体的阳转率大大提前。抗体滴度测定结果见图3，伤寒杆菌多糖复合Al(OH)3佐剂组能有效刺激抗体的产生，三次免疫后抗体滴度可达到1∶106，与Al(OH)3组和伤寒杆菌多糖组相比均存在统计学差异(P＜0.05)。IL-4和IFN-γ的测定结果见图4，伤寒多糖同样刺激分泌IL-4和IFN-γ淋巴细胞的产生，具有统计学差异，能有效刺激机体的体液免疫和细胞免疫。
表2各组的抗HBsAg的阳转率(％)
综上所述，本发明的氢氧化铝凝胶/多糖复合佐剂能有效、快速刺激免疫，能超过国际目前通用的乙肝疫苗佐剂的免疫效应，抗体产生时间大大提前，抗体滴度大大提高。
实施例三本发明使用E.coli多糖或伤寒杆菌多糖作为bFGF佐剂的动物免疫试验
一、分组
1.bFGF+Al(OH)3组：bFGF蛋白20μg+Al(OH)3 500μg/小鼠/次；
2.bFGF+E.coli多糖组：bFGF蛋白20μg+E.coli多糖20μg/小鼠/次；
3.bFGF+Al(OH)3+E.coli多糖组：bFGF蛋白20μg+Al(OH)3 500μg+E.coli多糖20μg/小鼠/次；
4.bFGF+弗氏佐剂组：bFGF蛋白20μg+弗氏佐剂/小鼠/次；
5.PBS组：PBS+Al(OH)3 500μg+E.coli多糖20μg/小鼠/次。
按上述分组分别免疫6周龄C57BL/6小鼠(每组七只)，两周免疫一次，共三次。分别在免疫后0、1、2、3、4、5、6周尾静脉采血，分离血清，置于-20℃保存待测，分别检测体液免疫和细胞免疫情况。
二、抗体滴度的测定
通过ELISA法检测各组小鼠不同时间段血清中的抗体滴度。ELISA检测方法同上，每孔包被0.5μg bFGF蛋白，血清样品用5％脱脂奶粉做等二倍稀释。各组抗体滴度的检测结果见图5。
单独免疫bFGF蛋白的免疫效果很差，抗体滴度最高只能达到1∶80；添加E.coli多糖后，可刺激抗体的产生，抗体滴度可达到1∶800；使用Al(OH)3+E.coli多糖复合佐剂组能有效刺激抗体的产生，抗体滴度最高能达到1∶104，与佐剂金标准——弗氏佐剂的免疫效果一致。
三、细胞因子IFN-γ的测定
细胞免疫的检测方法采用体外培养淋巴细胞检测细胞因子——γ-干扰素表达。具体如下，小鼠末次免疫后两周处死，取出脾脏。将脾脏放在200目尼龙网上研磨，培养基(DMEM+5％FBS+双抗生素)混悬，过尼龙毛柱，得到脾淋巴细胞，测定细胞密度，将细胞数稀释至2×107个。24孔板中每孔加入1ml细胞液，再加入1ml 20μg/ml bFGF蛋白溶液，置于CO2孵箱培养48小时，取细胞混悬液，2000×g离心3分钟，收集上清液，用ELISA检测试剂盒测定IFN-γ的含量。
各组IFN-γ的表达水平见图6，结果表明IFN-γ水平以bFGF+Al(OH)3+E.coli多糖复合佐剂组最高，与PBS组和bFGF+Al(OH)3佐剂组相比存在显著性差异(P＜0.01)，与bFGF+E.coli多糖复合佐剂组和弗氏佐剂组相比存在具有统计学意义的差异(P＜0.05)。IFN-γ的表达说明机体通过免疫bFGF诱发了针对bFGF的细胞免疫过程，本试验也说明Al(OH)3+E.coli多糖复合佐剂能诱导有效的细胞免疫。
结果表明，本发明的Al(OH)3+E.coli多糖佐剂配方能达到甚至超过国际通用的疫苗佐剂的金标准-弗氏佐剂的免疫效应，包括体液免疫和细胞免疫。而在多个指标上均优于单独使用多糖或氢氧化铝凝胶的效果之和，具有协同效应。
以伤寒杆菌多糖替代大肠杆菌多糖(E.coli多糖)也能达到相同的效果。添加伤寒杆菌多糖分组及用量与E.coli.多糖一致，免疫方案与采血点均相同，检测方案一致。结果如下：各组抗体滴度测定结果见图7，与E.coli.多糖一样，伤寒杆菌多糖同样能有效刺激机体免疫，抗体滴度最高能达到1∶104，与佐剂金标准——弗氏佐剂的免疫效果一致。IFN-γ的测定结果见图8伤寒多糖同样刺激IFN-γ的表达，具有统计学差异，能有效刺激机体的细胞免疫。而在多个指标上均优于单独使用多糖或氢氧化铝凝胶的效果之和，具有协同效应。
实施例四本发明新型佐剂肿瘤疫苗的动物保护试验
一、分组
动物保护试验分成皮下移植瘤和肺转移两种模型进行。
1、PBS组：PBS+Al(OH)3500μg+E.coli多糖20μg/小鼠/次；
2.bFGF+Al(OH)3组：bFGF蛋白20μg+Al(OH)3 500μg/小鼠/次；
3.bFGF+E.coli多糖组：bFGF蛋白20μg+E.coli多糖20μg/小鼠/次；
4.bFGF+Al(OH)3+E.coli多糖组：bFGF蛋白20μg+Al(OH)3 500μg+E.coli多糖20μg/小鼠/次；
5.bFGF+弗氏佐剂组：bFGF蛋白20μg+弗氏佐剂/小鼠/次。
按上述分组分别免疫6周龄C57BL/6小鼠(每组七只)，两周免疫一次，共三次。二、皮下移植瘤模型的动物保护试验
末次免疫后两周小鼠皮下接种5×105个Lewis肺癌细胞(LL/2)，5天时可扪及肿瘤，每隔3天用游标卡尺测量肿瘤长、宽径，动态监测体积变化，肿瘤体积按以下方法计算：体积(mm3)＝0.52×长(length)×宽2(width2)。肿瘤生长抑制用方差分析，P＜0.05则认为有统计学意义。
治疗组肿瘤生长缓慢，而对照组肿瘤生长较快，各组肿瘤体积生长曲线比较图见图9。结果表明bFGF+Al(OH)3+E.coli多糖组、bFGF+弗氏佐剂组与PBS组相比，抑瘤率分别为55.47和37.66％，bFGF+Al(OH)3+E.coli多糖组效果优于bFGF+弗氏佐剂组，且与PBS组相比，具有显著性差异(P＜0.05)。
三、肺转移模型的动物保护试验
末次免疫2周后，皮下尾静脉接种3×105个Lewis肺癌细胞(LL/2)。接种肿瘤后四周处死小鼠并解剖，取出肺，称重。
肺部外观比较结果显示，bFGF+Al(OH)3+E.coli多糖组及弗氏佐剂组的转移灶明显少于PBS组，结果见图10，具有显著性差异(P＜0.05)。小鼠肺部重量比较结果见图11，bFGF+Al(OH)3+E.coli多糖组及弗氏佐剂组的肺重量与PBS组相比有显著性差异(P＜0.05)，bFGF+Al(OH)3+E.coli多糖组的肺重量小于FA组。结果表明，本发明的佐剂制备的肿瘤疫苗能有效抑制肿瘤的转移，效果好于用弗氏佐剂制备的bFGF疫苗。
以伤寒杆菌多糖替代大肠杆菌多糖(E.coli多糖)也能达到相同的效果。添加伤寒杆菌多糖分组与E.coli.多糖一致，免疫与肿瘤细胞接种方案相同，检测手段一致。结果如下：在皮下移植瘤模型中各组肿瘤生长曲线见图12，在肺转移模型中各组肺节结数计数结果见图13，肺重比较结果见图14，与E.coli.多糖一样，伤寒杆菌多糖同样能有效抑制肿瘤的生长及转移。
上述实例表明，使用本发明的新型Al(OH)3/细菌来源多糖复合佐剂加bFGF制成的复合物的免疫效果和抑制肿瘤转移的效果较好，且在多个指标均优于单独使用多糖或氢氧化铝凝胶的效果之和，具有协同效应，优于使用弗氏佐剂的水平，并且安全性更好，可作为一种新型的抗肿瘤或其它与血管发生相关疾病的抗血管生成疫苗。本发明技术简单易行，可行性强，具有广阔的应用前景。
Claims (2)
1.复合免疫佐剂，其特征在于：由氢氧化铝凝胶和细菌来源的多糖制成；所述细菌来源的多糖为大肠杆菌来源的多糖或伤寒杆菌来源的多糖；所述复合免疫佐剂由以下方法制成：a、取所需量的氢氧化铝用水稀释；b、加入所需的多糖，混匀；所述细菌来源的多糖和氢氧化铝凝胶的重量配比为1︰1～25，多糖和氢氧化铝凝胶的重量配比是指固体物质间的重量配比。
2.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于：所述氢氧化铝凝胶为粒径为2μm～4μm的氢氧化铝颗粒。
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| CN201210011211.6A CN102526724B (zh) | 2011-01-14 | 2012-01-13 | 氢氧化铝凝胶-多糖复合免疫佐剂及其制备方法和用途 |
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