CN114366809A - 一种铝纳米晶递送系统及其结合疫苗抗原分子自组装颗粒佐剂疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术与疫苗技术领域,尤其涉及一种表面覆盖Fc亲和蛋白的铝纳米晶递送系统及自组装颗粒佐剂疫苗的制备方法。其中铝纳米晶作为载体,在铝纳米晶表面覆盖有Fc亲和蛋白分子层与抗原分子,由重组Fc Tag的抗原通过与Fc亲和蛋白特异性结合,实现抗原自组装,形成类病毒颗粒疫苗,提升抗原密度。该疫苗对接种部位刺激小,安全性高,能够通过诱导体液及细胞免疫,产生高滴度的特异性抗体,是一种高效、便捷的自组装颗粒疫苗制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术与疫苗技术领域,特别涉及一种铝纳米晶疫苗递送系统及其制备方法以及基于铝纳米晶疫苗递送系统中的铝纳米晶表面包覆的Fc亲和蛋白特异性结合疫苗抗原分子的自组装颗粒佐剂疫苗。
背景技术
佐剂对于亚单位疫苗的功效至关重要。自1926年Glenny和其同事首先发现将铝盐(KAl(SO4)2·12H2O)与白喉类毒素结合能够提高疫苗效价以来,铝盐佐剂成为唯一的人用疫苗佐剂被广泛应用于疫苗制剂中。现有铝盐佐剂包括硫酸铝钾、磷酸铝、氢氧化铝。其中氢氧化铝佐剂应用最为广泛。可大大提高疫苗的免疫原性。
氢氧化铝佐剂的比表面积和均一性决定了铝佐剂对抗原的吸附效率。氢氧化铝佐剂颗粒越小,比表面积越大,可抗原吸附越多,更有利于提高疫苗的免疫原性。现有氢氧化铝佐剂一般激活体液免疫而很少有T细胞介导的免疫,这与氢氧化铝佐剂吸附抗原呈递方式有关。除了佐剂之外,抗原密度及在胞内的递呈水平、时空特性,对于抗体的产生也起到极为重要的作用(Nature Biomedical Engineering 2020,4(6),636-648.Advanced DrugDelivery Reviews 2020,158,91–115.)。微米级氢氧化铝佐剂吸附抗原后时,铝佐剂一般与抗原呈递细胞如树突状细胞(DC细胞)细胞膜结合,诱导脂笩的形成,引起下游通路的激活,未能干扰其呈递抗原在细胞内的命运,抗原则通过溶酶体途径处理后通过主要的组织相容性复合物II(MHC-II)呈递,而不是通过主要的组织相容性复合物I(MHC-I)的交叉呈递。将氢氧化铝佐剂纳米化可能会改变抗原呈递细胞对其的摄取,从而影响其吸附抗原的呈递方式。虽然通过铝佐剂吸附抗原给药是最常见的疫苗组合方式,但是,在血清或间质液存在的情况下,会由于竞争性吸附而使表面吸附的抗原迅速从铝佐剂表面解吸,影响疫苗的免疫反应能力(Nature Medicine.2020,26(3),430-440.)。同时,有的抗原与铝佐剂吸附过强,导致抗原构象改变,从而减缓和影响抗原特异性抗体产生。尽管铝佐剂的应用过程存在一些限制,但由于疫苗安全性的严格要求,使得新佐剂的成功开发需要经历漫长的过程和巨大的经费投入。因此,研制一种基于铝佐剂颗粒的亚单位疫苗通用递送平台,解决抗原佐剂非特异性吸附法对抗原的影响,同时提升抗原递呈细胞摄入抗原的剂量,将极具实用价值。发明人旨在公开一种能够结构稳定的铝纳米晶递送系统和基于铝纳米晶表面包覆的Fc亲和蛋白特异性结合抗原分子的自组装颗粒佐剂疫苗的制备方法。该方法是实现抗原自组装的铝佐剂通用递送平台,该平台对抗原带电性无选择性,能够便捷的通过结合抗原纯化常用的Fc亲和标签作为组装基元,构建自组装颗粒疫苗。
发明内容
本发明提供了一种铝纳米晶疫苗递送系统及其制备方法以及基于铝纳米晶疫苗递送系统中的铝纳米晶表面包覆的Fc亲和蛋白特异性结合疫苗抗原分子的自组装颗粒佐剂疫苗。本发明所提供的铝纳米晶能够通过改性分子有效结合Fc亲和蛋白构建铝纳米晶递送系统,并能有效载带免疫抗原进一步构建自组装颗粒佐剂疫苗,能够在显著提升载带抗原的稳定性,增加铝纳米晶表面携带抗原密度,能够有效将免疫抗原递送至淋巴结组织,并极大增强免疫抗原的细胞内在化,及极高效的激活免疫细胞,增强抗体产生水平。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种由铝纳米晶通过改性分子有效结合Fc亲和蛋白构建而成的铝纳米晶递送系统;
其中,所述铝纳米晶通过以下步骤制备:
向铝盐溶液中加入修饰分子溶液,搅拌充分混合,得到混合液;
将所述混合液加入碱性溶液中,得到反应液,调节所述反应液的pH为5.5~8.0,进行反应,静置,离心取沉淀,得到所述铝纳米晶。
其中,所述铝盐为氯化铝,硝酸铝,硫酸铝,醋酸铝中的一种以上;所述铝盐溶液所用溶剂为纯水,或浓度为0.01mol/L的醋酸钠溶液;所述铝盐浓度为0.01~0.5mol/L;搅拌速度为100~1400rpm,搅拌时间为10分钟~5小时。
所述修饰分子为L-O-磷酸丝氨酸、柠檬酸、乙二酸、水杨酸、ATP中的一种以上;所述修饰分子溶液的浓度为0.01~0.5mol/L;在所述混合液中,所述铝盐与修饰分子的摩尔比为10:1~1:10。
所述碱性溶液为NaOH、KOH、氨水中的一种以上;所述碱性溶液的浓度为0.01~0.5mol/L;所述混合液中加入碱性溶液的速率为1~20mL/min。
进一步地,所述反应的温度为25~90℃;所述反应的时间为10分钟~10小时;所述静置的时间为1~12小时。
进一步地,所述铝纳米晶的平均粒径为5~500nm,其表面可以无改性分子,也可以带有能够通过主客体配合、化学选择性共价修饰连接Fc亲和蛋白的基团的改性分子。
其中,所述改性分子包括能够对所述铝纳米晶的表面功能基团进行氨基、羧基、巯基官能团功能化、化学选择性的共价修饰基团功能化;更进一步的,所述改性分子具体为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、叠氮化合物、炔烃中的一种以上。
进一步地,对应的改性分子包括可实现共价键结合Fc亲和蛋白的对应反应物,如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/(N-羟基琥珀酰亚胺)NHS反应的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等。
本发明还提供了一种铝纳米晶递送系统的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将铝纳米晶和改性分子加入溶剂中,搅拌反应,得到混合液1;
(2)将Fc亲和蛋白和改性分子加入溶剂中,搅拌反应,得到混合液2;
(3)将步骤(1)所述混合液1和步骤(2)所述混合液2混合均匀,进行反应,离心洗涤,取沉淀,重悬,得到所述铝纳米晶递送系统。
具体的,所述溶剂具体为注射水、超纯水、生理盐水、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液;所述铝纳米晶与所述溶剂的质量体积比为0.5-60mg/mL;所述铝纳米晶中的铝离子与改性分子的摩尔比为1:(0.001~1000);所述步骤(1)中搅拌反应的温度为4-25℃,搅拌反应的时间为0.5-24h,搅拌反应的搅拌速率为100-600rpm;所述步骤(2)中的搅拌反应的温度为4-25℃,搅拌反应的时间为0.5-24h;所述步骤(3)中反应的时间为0.5-24h,离心洗涤2次,重悬至pH为7.4-9的缓冲液中。
基于此,本发明还提供了一种铝纳米晶递送系统结合抗原分子自组装颗粒佐剂疫苗,具体为由前述方法制备得到的铝纳米晶表面包覆有Fc亲和蛋白及特异性结合的自组装疫苗抗原分子。
其中,Fc亲和蛋白为对Fc区域具有高度亲和能力的G蛋白和/或A蛋白;所述G蛋白和/或A蛋白可以为细菌蛋白或重组蛋白;
所述细菌蛋白为来自于G类链球菌和金黄色葡萄球菌的细菌蛋白;
所述重组蛋白可以是通过基因重组进行任意改造,但仍保持Fc亲和能力的,具体为重组蛋白A/蛋白G、C端重组半胱氨酸、磷酸丝氨酸的蛋白A或蛋白G,以及来源于蛋白A和/或G的多肽片段;
所述蛋白A和/或G的多肽片段可以是由不同氨基酸序列构成的重组肽、化学合成的多肽序列。
具体地,所选Fc亲和蛋白,其种属来源可以是人、鼠、兔、猪、羊。
所述Fc亲和蛋白与铝纳米晶的组合方式可以是铝纳米晶通过非共价方式,如静电或主客体配位作用吸附,或共价修饰、化学选择性特异结合等形式与Fc亲和蛋白进行组合。
其中,所述疫苗抗原分子为包括含有Fc片段的病原体亚单位抗原、重组亚单位抗原、抗原表位肽、核酸抗原的一种及以上。
所述病原体包括病毒、细菌和/或寄生虫;
所述病毒选自DNA病毒和/或RNA病毒;优选地所述病毒选自:冠状病毒科、疱疹病毒科、弹状病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、小RNA病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、乳头瘤病毒科、痘病毒科、和逆转录病毒科,更优选地所述病毒选自:新型冠状病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、水疱性口炎病毒、牛痘病毒、HIV和HBV;
所述细菌选自革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌,优选地所述细菌选自,优选地所述细菌选自肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、沙门氏菌、脑膜炎双球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、绿脓假单胞菌和波美不动杆菌、结核杆菌、幽门螺杆菌;
所述寄生虫选自疟原虫、弓形虫、锥虫、血吸虫、丝虫和利什曼原虫的其中一种或多种。
本发明还提供了一种上述铝纳米晶递送系统结合疫苗抗原分子自组装颗粒佐剂疫苗的制备方法,具体为将含有Fc片段的疫苗抗原分子与所述铝纳米晶递送系统溶液混合均匀,得到表面覆盖Fc亲和蛋白的铝纳米晶与抗原自组装的颗粒疫苗。
具体地,在4-25℃条件下置于旋转式摇床混合10-60分钟使其均匀;其中,铝纳米晶的浓度为0.5-60mg/mL,抗原浓度为5~200mg/ml,疫苗抗原分子与铝纳米晶的中铝离子的质量比为1:(0.1-100)。
自组装颗粒佐剂疫苗的施用方法,包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、粘膜施用及其任意组合。
本发明具有的技术效果为:
本发明所提供的铝纳米晶能够有效结合Fc亲和蛋白,并能有效载带免疫抗原,能够在较少的抗原剂量和较低的注射使用量时,获得更加优异的免疫治疗效果;高效的激活免疫细胞,实现平衡的体液和细胞免疫。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1、2、3中获得铝纳米晶的TEM图像;
图2为本发明实施例1中获得铝纳米晶的XRD图像;
图3为本发明实施例9获得的佐剂的BMDCs的激活水平及MHC表达水平;
图4为本发明实施例10中疫苗免疫后19、35和56天小鼠血清RBD特异性IgG抗体滴度;
图5为本发明实施例10中疫苗免疫后56天小鼠血清的假病毒中和抗体滴度。
图6为本发明铝纳米晶的表面Fc结合蛋白修饰及抗原自组装过程示意图
具体实施方式
本发明公开了一种铝纳米晶疫苗递送系统及其制备方法以及基于铝纳米晶疫苗递送系统中的铝纳米晶表面包覆的Fc亲和蛋白特异性结合疫苗抗原分子的自组装颗粒佐剂疫苗。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明的铝纳米晶疫苗递送系统及其制备方法以及基于铝纳米晶疫苗递送系统中的铝纳米晶表面包覆的Fc亲和蛋白特异性结合疫苗抗原分子的自组装颗粒佐剂疫苗,以及在疫苗免疫增效中的应用中所用原料或试剂均可由市场购得。
本发明实施例所使用的铝纳米晶佐剂为自制,实验方案见实施例1。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
将AlCl3·6H2O溶于0.01mol/LNaAc中,配制成铝离子含量0.055mol/L的铝盐溶液;得到的铝盐溶液再与0.05mol/L的L-O-磷酸丝氨酸(购自Sigma-Aldrich,CAS号407-41-0)搅拌2小时充分混合后,通过蠕动泵以7ml/min速度加入NaOH溶液,调节混合反应液的pH值至7左右。其中Al3+与含L-O-磷酸丝氨酸之间的摩尔比为1:2;反应完成后,静置7小时,离心后洗涤,最后高压蒸汽灭菌或经过滤膜除菌,制得铝纳米晶。
实施例2
将AlCl3·6H2O溶于0.01mol/LNaAc中,配制成铝离子含量0.45mol/L的铝盐溶液;得到的铝盐溶液再与0.35mol/L的柠檬酸钠搅拌5小时充分混合后,通过蠕动泵以1ml/min速度加入NaOH溶液,调节混合反应液的pH值至5.5左右。其中Al3+与柠檬酸钠之间的摩尔比为1:6;反应完成后,静置1小时,离心后洗涤,最后高压蒸汽灭菌或经过滤膜除菌,制得铝纳米晶。
实施例3
将AlCl3·6H2O溶于纯水中,配制成铝离子含量0.01mol/L的铝盐溶液;得到的铝盐溶液再与0.02mol/L的水杨酸搅拌5小时充分混合后,通过蠕动泵以9ml/min速度加入氨水溶液,调节混合反应液的pH值至7.5左右。其中Al3+与水杨酸之间的摩尔比为7:1;反应完成后,静置5小时,离心后洗涤,最后高压蒸汽灭菌或经过滤膜除菌,制得铝纳米晶。
对比例1
将AlCl3·6H2O溶于0.01mol/LNaAc中,配制成铝离子含量0.055mol/L的铝盐溶液,之后通过蠕动泵以7ml/min速度加入NaOH溶液混合,调节混合反应液的pH值至7左右。反应完成后,室温静置5小时,离心后洗涤,最后高压蒸汽灭菌或通过过滤膜除菌,制得无修饰分子参与的铝纳米晶。
实施例4
(1)铝纳米晶的理化性质表征
25℃条件下,将铝纳米晶的浓度稀释至10μg/ml,滴在普通碳支持膜上,在电镜下观察铝纳米晶的结构,透射电镜(FEI公司,型号Tecnai G220S-TWIN)下显示为颗粒状。如图1所示,图1为实施例1得到的不同摩尔比的铝元素与修饰分子比例时,得到的纳米颗粒的TEM图像,其中图1A为实施例1产物电镜图像,图1B为对比例1无修饰分子时产物电镜图像,图1C为实施例2产物电镜图像,图1D为实施例3产物电镜图像。
由图1可知,存在修饰分子时,得到的铝纳米晶佐剂平均尺寸较小,实施例1得到的纳米晶平均尺寸为20纳米,实施例2得到的纳米晶平均尺寸为57.1纳米,实施例3得到的纳米晶平均尺寸为25.3纳米,而当无修饰分子时,得到的产物为簇在一起的平均尺寸约为350纳米棒的聚集颗粒。由此可知修饰分子存在下,得到的铝纳米晶尺寸更加均匀,分散性更加好,溶液稳定性更加好。
(2)对所述铝纳米晶进行XRD表征
将实施例1制备好的铝纳米晶取10mL冻干,得到粉末样品,将粉末样品进行XRD表征,之后用Jade进行分析,如图2所示。图2为实施例1得到的产物纳米颗粒的XRD图像。
由图2可知,可得到铝纳米晶对应为氢氧化铝结构。
(3)对所述铝纳米晶进行粒径和表面电荷进行表征
25℃条件下,将铝纳米晶的浓度稀释至10μg/ml,用纳米粒度仪测试铝纳米晶的粒径和Zeta电位(购自Malvern公司,ZetasizerNano ZS型号),结果如表1所示。
实施例1、2、3制备的铝纳米晶颗粒的理化性质如表1所示。
表1修饰分子存在与否得到的两种铝纳米晶的理化特性
表1可知,本发明所有实施例均得到纳米尺寸的铝纳米晶,其中实施例1得到的铝纳米晶尺寸分布更加均一,水中稳定性更好一些,所以选择实施例1得到的铝纳米晶进行后继实验。
实施例5
表面覆盖Fc亲和蛋白的铝纳米晶递送系统的制备方法:
(1)将实施例1得到的铝纳米晶和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)共同加入生理盐水中,铝纳米晶浓度为10mg/ml,EDC浓度为0.02mol/L,500rpm转速搅拌下,反应8h,得到第I溶液,最终EDC与铝元素摩尔比为1:100;
(2)将Fc亲和蛋白(SPA,货号P6031,金黄色葡萄球菌A蛋白,购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照1:5的摩尔比例混合加入水溶液中,并搅拌反应12h,得到第II溶液。
将第II溶液加入到第I溶液中,使得加入的NHS与EDC比例为1:1.2,25度下继续反应8小时,离心洗涤2次之后,重悬至pH为7.4的磷酸盐缓冲液中,即得到表面覆盖Fc亲和蛋白(SPA)的铝纳米晶递送系统溶液。
实施例6
表面覆盖Fc亲和蛋白的铝纳米晶递送系统的制备方法:
(1)将实施例1得到的铝纳米晶和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)共同加入生理盐水中,铝纳米晶浓度为10mg/ml,EDC浓度为0.l mol/L,1000rpm转速搅拌下,反应10h,得到第I溶液,最终EDC与铝元素摩尔比为1:1;
(2)将Fc亲和蛋白与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照1:5的摩尔比例混合加入水溶液中,并搅拌反应12h,得到第II溶液。
将第II溶液加入到第I溶液中,使得加入的NHS与EDC比例为1:1.2,4度下继续反应8小时,离心洗涤2次之后,重悬至pH为7.4的磷酸盐缓冲液中,即得到表面覆盖Fc亲和蛋白的铝纳米晶递送系统溶液。
实施例7
表面覆盖Fc亲和蛋白的铝纳米晶递送系统的制备方法:
(1)将实施例1得到的铝纳米晶和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)共同加入生理盐水中,铝纳米晶浓度为10mg/ml,EDC浓度为0.06mol/L,400rpm转速搅拌下,反应6h,得到第I溶液,最终EDC与铝元素摩尔比为10:1;
(2)将Fc亲和蛋白与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照1:20的摩尔比例混合加入水溶液中,并搅拌反应12h,得到第II溶液。
将第II溶液加入到第I溶液中,使得加入的NHS与EDC比例为11:1,10度下继续反应8小时,离心洗涤2次之后,重悬至pH为7.4的磷酸盐缓冲液中,即得到表面覆盖Fc亲和蛋白的铝纳米晶递送系统溶液。
实施例8
对铝纳米晶递送系统的蛋白组装能力进行表征:
为了验证实施例5、6、7制备佐剂对含Fc蛋白组装能力,本实施例通过对荧光标记IgG进行组装能力定量测试。取用磷酸缓冲液稀释铝纳米晶递送系统溶液至1mg/ml(体积0.1ml),调节pH至7左右,分别与10μg FITC-IgG(GoatAnti-Mouse IgG H&L(FITC),购自abcam,货号:ab6785)的磷酸缓冲液等体积混匀,室温放置1h;离心收集上清,测量520nm荧光强度,再按下式计算组装效率。
吸附率(%)=(10μg FITC-IgG荧光强度-上清液荧光强度)/FITC-IgG荧光强度×100%。
铝纳米晶递送系统的组装效率,如表2所示。
表2
检测项目 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 |
蛋白组装能力% | >99% | >90% | >83% |
实施例5得到的纳米晶递送系统对含Fc蛋白的组装性能最好,故后继实施例选取实施例5得到的纳米晶递送系统。
实施例9
铝纳米晶递送系统与含Fc片段抗原分子的自组装颗粒佐剂疫苗,组装方法如图6所示。
室温搅拌下,向100微升1mg/ml实施例5得到的铝纳米晶递送系统溶液中,加入10μg含有Fc片段的新冠病毒重组RBD抗原(购自义翘神州,货号40591-V05H1),在pH为8.5的缓冲液中进行亲和自组装,注射器反复抽打100下,混合均匀后,置于旋转式摇床混合30分钟,得到基于铝纳米晶递送系统与含Fc片段的新冠RBD重组亚单位抗原分子的自组装颗粒佐剂疫苗。
实施例10
自组装颗粒佐剂疫苗的BMDCs激活和抗原呈递能力评估
将BMDC细胞以每孔3×105个细胞接种在6孔板中,并使其生长过夜。然后分组,分别加入100微升的处置液:①、生理盐水(Ctr组)、②、10微克新冠病毒重组RBD抗原(RBD组)、③、商业铝佐剂Alum与10微克新冠病毒重组RBD抗原(Alum-RBD组)、④、实施例9所制备的自组装颗粒佐剂疫苗(AlN-RBD组)处理细胞。进一步孵育24小时后,收集细胞并用抗CD11c、抗CD80和抗CD86、抗MHC-l、抗MHC-Ⅱ的流式染色液对细胞进行染色。用流式细胞分析仪测定BMDCs表面共刺激因子CD80、CD86和抗原识别信号MHC-1、MHC-Ⅱ的表达水平,如图3所示。图3为实施例9得到的自组装颗粒佐剂疫苗的BMDCs激活和抗原呈递能力评估。
由图3可知,与商业铝佐剂相比,自组装颗粒佐剂疫苗有更好的BMDCs激活效果,且有更高的抗原呈递能力。
实施例11
实施例9所构建的自组装颗粒佐剂疫苗接种。
A)在遵循国家动物保健协议的前提下,选取6-8周龄的BALB/c小鼠进行接种3次,每组小鼠数量为5只,一共有五组,分别是①、Ctr组:对照组(生理盐水);②、Ag组:10μg RBD抗原;③、Alum-Ag组:载带10μg RBD抗原的50μg铝佐剂(Invivogen公司,adjuvant 2%,CAS:21645-51-2);④、AlN-Ag组:实施例9所构建的自组装颗粒佐剂疫苗药物,即载带10μg RBD抗原(Ag)的铝纳米晶载带系统颗粒组。以第一次小鼠大腿肌肉注射接种为第0天,第二次接种为第21天,并于第19、35和56天收集血清样品。
B)通过传统的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)评估步骤A中疫苗诱导的小鼠血清中IgG水平。首先,对小鼠血清进行连续等比稀释;将稀释的血清加到RBD抗原的预包被(2μg/ml)的96孔酶标板中,37℃静置2h;清洗后加入稀释的HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(稀释度1:2000),每孔100μl。37℃静置1.5h;清洗后加入TMB显色液,一起孵育,加入终止液停止反应;使用酶标仪读取OD450处吸光度。特异性IgG抗体滴度见图4。图4为实施例9所构建的自组装颗粒佐剂疫苗引起的抗体反应评估。
有图4可知,自组装颗粒佐剂疫苗可以在小鼠体内有效增强新冠疫苗引起的抗体反应。在同等抗原剂量下,自组装颗粒佐剂疫苗抗体滴度水平远超商业铝佐剂组,纯抗原组以及对照组。
实施例12
实施例11的步骤A得到的疫苗免疫后56天小鼠血清样本进行假病毒感染中和试验,具体过程如下:将含有假病毒(50μl;购买自Sino Biological公司,货号:PSV001)的上清液与连续稀释的小鼠血清在37℃下预孵育1小时,然后添加到表达ACE2的293T细胞(5×104细胞)中。24小时后加入新鲜培养基,然后使用市售细胞裂解缓冲液裂解细胞。加入荧光素酶底物后,在发光计(Bio-Tech)中测定相对荧光素酶活性。计算假病毒中和效率,并表示为50%中和抗体滴度。RBD组、Alum-RBD组和AlN-RBD组的设置如实施例10。
见图5,图5为实施例9构建的纳米疫苗药物针对假病毒的血清中和效果对比。
由图5可知,实施例9得到的纳米疫苗药物即使在相对较低的抗体载带量的情况下,仍可诱导显著增强的针对新型冠状病毒的中和抗体应答。
以上所述仅是本申请的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
Claims (10)
1.一种铝纳米晶递送系统,其特征在于:由铝纳米晶通过改性分子有效结合Fc亲和蛋白构建而成。
2.根据权利要求1所述的铝纳米晶递送系统,其特征在于,所述铝纳米晶通过以下步骤制备:
将铝盐溶液与修饰分子溶液搅拌充分混合,得到混合液;
向所述混合液中加入碱性溶液,得到反应液,调节所述反应液至预置的pH,进行反应,静置,离心取沉淀,得到所述铝纳米晶。
3.根据权利要求2所述的铝纳米晶递送系统,其特征在于,所述铝盐溶液的溶质为氯化铝、硝酸铝、硫酸铝和醋酸铝中的一种以上;所述铝盐溶液所用溶剂为纯水,或浓度为0.01mol/L的醋酸钠溶液;所述铝盐溶液的浓度为0.01~0.5mol/L;所述搅拌的速度为100~1400rpm,所述搅拌的时间为10分钟~5小时;
所述修饰分子选自L-O-磷酸丝氨酸、柠檬酸、乙二酸、水杨酸和ATP中的一种以上;所述修饰分子溶液的浓度为0.01~0.5mol/L;在所述混合液中,所述铝盐与所述修饰分子的摩尔比为10:1~1:10;
所述碱性溶液为NaOH、KOH和氨水中的一种以上;所述碱性溶液的浓度为0.01~0.5mol/L;所述混合液中加入碱性溶液的速率为1~20mL/min;所述pH为5.0~8.0;所述反应的温度为25~90℃;所述反应的时间为10分钟~10小时;所述静置的时间为1~12小时。
4.根据权利要求1所述的铝纳米晶递送系统,其特征在于,所述改性分子包括能够对所述铝纳米晶的表面功能基团进行氨基、羧基、巯基官能团功能化、化学选择性的共价修饰基团功能化。
5.根据权利要求4所述的铝纳米晶递送系统,其特征在于,所述改性分子选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、叠氮化合物和炔烃中的一种以上。
6.一种如权利要求1所述铝纳米晶递送系统的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将铝纳米晶和改性分子加入溶剂中,搅拌反应,得到混合液1;
(2)将Fc亲和蛋白和改性分子加入溶剂中,搅拌反应,得到混合液2;
(3)将步骤(1)所述混合液1和步骤(2)所述混合液2混合均匀,进行反应,离心洗涤,取沉淀,重悬,得到所述铝纳米晶递送系统。
7.根据权利要求6所述的铝纳米晶递送系统的制备方法,其特征在于,所述溶剂选自注射水、超纯水、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液和生理盐水中的一种或多种;所述铝纳米晶与所述溶剂的质量体积比为0.5-60mg/mL;所述铝纳米晶中的铝离子与所述改性分子的摩尔比为1:(0.001~1000);
所述步骤(1)中搅拌反应的温度为4-25℃,所述搅拌反应的时间为0.5-24h,所述搅拌反应的搅拌速率为100-600rpm;
所述步骤(2)中的搅拌反应的温度为4-25℃,所述搅拌反应的时间为0.5-24h;
所述步骤(3)中反应的时间为0.5-24h,离心洗涤2次,重悬至pH为7.4-9的缓冲液中。
8.一种铝纳米晶递送系统结合疫苗疫苗抗原分子自组装颗粒佐剂疫苗,其特征在于,铝纳米晶递送系统由权利要求1-7任一项的制备方法获得,所述铝纳米晶表面包覆有Fc亲和蛋白及特异性结合的自组装疫苗抗原分子。
9.根据权利要求8所述的一种铝纳米晶递送系统结合疫苗抗原分子自组装颗粒佐剂疫苗,其特征在于,所述Fc亲和蛋白为对Fc区域具有高度亲和能力的G蛋白和/或A蛋白;所述疫苗抗原分子为包括含有Fc片段提取的病原体亚单位抗原、重组亚单位抗原、抗原表位肽和核酸抗原的一种以上。
10.一种如权利要求8或9所述铝纳米晶递送系统结合疫苗抗原分子自组装颗粒佐剂疫苗的制备方法,其特征在于,将含有Fc片段的疫苗抗原分子与所述铝纳米晶递送系统溶液混合均匀,得到表面覆盖Fc亲和蛋白的铝纳米晶与抗原自组装的颗粒疫苗。
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