CN111840542A - 被覆磷脂双分子层、单磷脂a及环二核苷酸的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物药物技术领域，公开了一种表面覆盖磷脂双分子层的单磷脂A及环二核苷酸共修饰铝纳米粒(PLAN‑MC)疫苗佐剂‑传递系统(VADS)及其制备方法，其佐剂为纳米铝，在铝纳米粒(AN)表面覆盖有磷脂(PL)双分子层，且由单磷脂A(MPLA)和环二核苷酸(cyclic di‑nucleotide,CDN)分子共修饰。该VADS对于接种部位刺激性小，适于多种接种途径，并且具有显著提高疫苗诱导机体形成抗原特异性抗体及细胞毒性T细胞的免疫功能。

Description

被覆磷脂双分子层、单磷脂A及环二核苷酸的铝纳米粒疫苗佐 剂-传递系统及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物药物技术领域，具体涉及一种被覆磷脂的单磷脂A及环二核苷酸共修饰的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统及其制备方法。
背景技术
疫苗是能够诱导机体产生抗体的免疫原物质，是用于防治传染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病的生物制剂。目前疫苗从主要成分性质上分类，包括如下5种类型。1)灭活疫苗：是采用物理或化学方法直接杀灭病原体，再添加适当辅助成分制成疫苗制剂。此种疫苗进入机体后不能生长繁殖，对机体刺激时间短，要获得持久免疫力需多次重复接种，或加入疫苗佐剂。2)减毒活疫苗：用人工定向诱变方法消除病原体致病性，或从自然界筛选出无毒力的活微生物制成活疫苗。如卡介苗(BCG，结核病)、麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗(小儿麻痹症)等。接种后在体内有生长繁殖能力，接近于自然感染，可激发机体对病原的持久免疫力。减毒活疫苗的免疫诱导效果较好，但存在基因突变产生致病性的风险，安全性较差。3)核酸疫苗：包括RNA、DNA两种疫苗，是将蛋白抗原的表达基因克隆在表达载体上，注入体内，使其抗原在体内表达后激发机体产生免疫反应，也存在安全性较低等弱点。4)类毒素(外毒素)：是将细菌外毒素经处理消除毒性而保留免疫原性，成为类毒素，通常加适量磷酸铝和氢氧化铝制备为疫苗制剂。常用的类毒素疫苗有白喉、破伤风等类毒素制剂等，一般用作治疗目的。5)亚单位疫苗(纯抗原组分疫苗)：将诱导机体产生免疫的病原体抗原制备为疫苗。亚单位疫苗免疫原性低，需要疫苗佐剂-传递系统。
目前这些不同类型疫苗既各具特点也存在自身不足，突出表现为安全性隐患与免疫激活效力弱两个方面。安全性问题主要由于疫苗成分复杂，尤其是活疫苗，存在变异或恢复致病性风险。效力弱则是亚单位疫苗普遍问题，因为亚单位疫苗只含有抗原成分，缺乏病原体原有的保护成分、病原体相关分子模式(PAMP)等激活机体固有免疫系统的相关成分，往往不能诱导足够免疫反应。
针对上述安全性及效力两个问题，疫苗研究人员发展了一些应对策略。其中，发展新型疫苗佐剂-传递系统(Vaccine adjuvant-Delivery system,VADS)，为提高疫苗效力的有效措施。除传统佐剂铝盐外，皂角苷，角鲨烯，CpG-ODN，cGAMP，乳剂，脂质体，无机纳米粒，高分子纳米载体(如GLPA纳米粒)等，均为目前积极研究的新型VADS。而多种佐剂活性分子与纳米粒子组合形成的VADS兼具佐剂、传递功能，受到广泛重视。这些VADS有效地保护了疫苗抗原(Ag)，提高了疫苗免疫诱导功能，有效地维护了人类健康。但现有疫苗及其佐剂传递系统也存在一些不足，在疫苗诱导效力、稳定性方面，有待于进一步提高。
铝盐是常用的VADS，应用于临床已经有90多年的历史，许多疫苗含有铝盐VADS，如百白破疫苗、流感嗜血杆菌疫苗等。铝佐剂虽然能激活Th2细胞分泌IL-4，进而促进Th2型体液免疫应答产生抗体，但难以有效诱导细胞免疫应答，无法促进机体产生细胞毒性T细胞。此外，铝佐剂还具有的局部刺激性较强等显著弱点此外，传统铝佐剂还有一个突出弱点是，具有较强局部刺激性，常导致接种部位出现炎症反应(Hem SL,Hogenesch H.,Relationship between physical and chemical properties of aluminum-containingadjuvants and immunopotentiation.Expert Rev Vaccines.2007Oct；6(5):685-98.)。
综上，铝盐作为疫苗佐剂，在安全性和免疫刺激效力方面都有待进一步研发优化。
发明内容
针对上述领域的需求和存在的问题，本发明构建了表面覆盖磷脂双分子层的单磷脂A及环二核苷酸共修饰的铝纳米粒(PLAN-CDN)，用作安全、高效疫苗佐剂-传递系统(VADS)。具体技术方案概括如下：
一种被覆磷脂的单磷脂A及环二核苷酸共修饰的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统，以铝纳米粒为载体，在铝纳米粒(AN)表面覆盖有磷脂(PL)双分子层，且由单磷脂A(MPLA)及环二核苷酸(CDN)共修饰。
优选地所述磷脂含有由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂中一种或多种组成的主成分，以及作为部分辅助成分以调节载体荷电性质的荷电脂质材料。
优选地，所述磷脂含有磷脂酰胆碱(PC)以及荷电脂质材料DOTAP(1,2-二油酰基-三甲胺基丙烷)。
优选，磷脂中，所述主成分与荷电脂质材料的质量比为10:1。
优选地，所述环二核苷酸选自环二单磷酸鸟苷(c-di-GMP，cyclic dimericguanosine monophosphate)，环二单磷酸腺苷(c-di-AMP，cyclic dimeric adenosinemonophosphate)，2’3’-环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸(2’,3’-cGAMP，2’,3’-cyclic GMP-AMP)，或3’3’-环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸(3’3’-cGAMP，2’,3’-cyclic GMP-AMP)中一种或多种；优2’,3’-cGAMP。
上述任一疫苗佐剂-传递系统，所述铝纳米粒为氧化铝、磷酸铝或氢氧化铝；
优选地，铝纳米粒粒径为100纳米以下。
本发明的另一方面，还提供上述疫苗佐剂-传递系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)取铝纳米粒水溶液，加入MPLA、CDN搅拌混匀，形成MPLA/CDN修饰AN，即AN-MC；
优选地，所述MPLA为固体薄膜，或乙醇溶液，或分散于纯水或HEPES缓冲液的胶束；
优选地，所述CDN的溶剂为纯水或HEPES缓冲液；
(2)在温度高于磷脂相变温度以上的条件下，将AN-MC与磷脂材料混合，搅拌混匀，即得疫苗佐剂-传递系统PLAN-MC；
优选地，磷脂材料是固体薄膜，或磷脂乙醇溶液，或分散于纯水或HEPES缓冲液的脂质体。
在上述技术方案中，铝纳米粒、单磷脂A、环二核苷酸、磷脂的质量比为50:2～5:1～2:5～10；
优选铝纳米粒、单磷脂A、环二核苷酸、磷脂的质量比为50:5:2:10。
本发明的再一方面，提供一种VADS运载疫苗，是在上述任一疫苗佐剂-传递系统的分子上连接或吸附有疫苗成分。
优选地，疫苗成分为病原体抗原(Ag)或灭活病原体；
优选地，所述VADS运载疫苗的剂型为液体制剂或冷冻干燥获得的冻干品。
本发明也提供上述VADS运载疫苗的制备方法，其特征在于：
获得上述任一PLAN-MC；然后直接与病原体抗原混匀得到PLAN-MC-Ag；优选，当疫苗成分为灭活病原体时，将灭活病原体吸附于PLAN-MC表面，即得；
或者采用以下步骤：
(1)取铝纳米粒水溶液，加入单磷脂A、环二核苷酸搅拌混匀，形成单磷脂A、环二核苷酸修饰AN，即AN-MC；其中优选所述单磷脂A为固体薄膜，或乙醇溶液，或分散于纯水或HEPES缓冲液的胶束；优选所述环二核苷酸的溶剂为纯水或HEPES缓冲液；
(2)然后将病原体抗原吸附于AN-MC表面形成AN-MC-Ag，
(3)在温度高于磷脂相变温度以上的条件下，将AN-MC与磷脂材料混合，搅拌混匀，即得疫苗佐剂-传递系统PLAN-MC。
MPLA(monophosphoryl lipidA，单磷脂A)是革兰氏阴性菌外膜成分脂多糖(LPS)水解产物，是一类含有一个磷酸基团糖脂化合物，是安全的TLR4强效激活剂，MPLA激活抗原提呈细胞(APC)TLR4及其下游通路，激活NF-κB核因子，产生Ⅰ型干扰素促进TH1型免疫应答，提高机体细胞免疫。
在细胞内，环二核苷酸(cyclic dinucleotide,CDN)分子能够有效激活STING分子，后者随即进一步激活干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)及核因子NF-κB，也提高Ⅰ型干扰素生成，促进TH1型免疫应答，增强机体细胞免疫。
磷脂是组成生物膜的两性分子，含有磷酸极性基团及非极性的疏水烃链，因而在水溶液中由于疏水作用能够自排形成双分子层结构。磷脂具有良好的生物相容性，可以提高制剂生物安全性及促进细胞摄取作用。
铝具有强烈的亲磷性质，铝纳米粒能够与含有磷酸基团的分子牢固结合，形成功能分子修饰载体。磷脂是生物膜主要成分，含有磷酸基团，而具有佐剂功能分子的MPLA及CDN也均含有磷酸基团，这些性质使得磷佐剂MPLA、CDN、及磷脂分子能够很好地结合结合于铝纳米粒表面。
本发明以传统佐剂铝盐(Alum)为基础，利用了磷脂在水溶液中由于疏水作用能够自排形成双分子层结构的特性，以及铝具有强烈的亲磷性质能够与含有磷酸基团的分子形成牢固的结合载体的特性，构建了表面覆盖磷脂双分子层的MPLA及CDN共修饰铝纳米粒(phospholipidbilayer-coated aluminum nanoparticles co-modified with MPLA andCDN，PLAN-MC)，用作VADS(以cGAMP为例其结构如图1所示)。
本发明的有益效果是：构建的PLAN-MC能够降低传统铝佐剂局部刺激性，促进形成抗体免疫；表面被覆磷脂双分子层高生物相容性与促进细胞摄取作用；结合MPLA及CDN分子同时激活TLR4及STING通路。因而，PLAN-MC能够促进形成TH1/TH2免疫应答，提升体液(产生抗体)及细胞免疫(形成细胞毒性T细胞)。PLAN-MC生物相容性高，适于腔道粘膜、皮下、皮内/肌肉注射等多途径接种；安全性高，并且能够促进细胞摄取疫苗；具有多重佐剂功能，适于发展亚单位疫苗，提高效力；为快速制备疫苗以防治迅速扩散的传染性疾病(如SARS-COV2)奠定基础。
附图说明
图1是本发明的PLAN-MC结构示意图。
图2为实施例1中接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG水平(n＝5)。
图3为实施例1中接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-AgCTL)(n＝5)。
图4为实施例1中接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)。
图5为实施例2中接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG及肺灌洗液(BALF)IgA水平(n＝5)。
图6为实施例2中接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-AgCTL)(n＝5)。
图7为实施例2中接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
本专利涉及的词语缩写：PL,phospholipid(磷脂)；MPLA,monophosphoryl lipidA(单磷脂A)；CDN,cyclic di-nucleotide(环二核苷酸)；AN,aluminum nanoparticle(铝纳米粒)；PLAN-MC,phospholipidbilayer-coated aluminum nanoparticle co-modifiedwith MPLAand CDN(表面覆盖磷脂双分子层的MPLA/CDN共修饰铝纳米粒)；c-di-AMP(环二腺苷酸，MW＝702)；c-di-GMP(环二鸟苷酸，MW＝734)；c-GAMP(环鸟腺苷酸，MW＝712)；VADS，vaccine adjuvant-delivery system(疫苗佐剂-传递系统)。SPC,soyphosphatidylcholine(豆磷脂酰胆碱胆碱)；DOPE，
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(1’2’-二油酰磷脂酰乙醇胺)；DOTAP,
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(1,2-二油酰基-三甲胺基丙烷)；CHO，cholesterol(胆固醇)。
试剂来源：
本发明采用的MPLA：phosphorylated hexa-acyl disaccharide(PHAD,MW＝1763)，购自Avanti Polar Lipids,Inc.，货号：699800；CAS No:1246298-63-4。
磷酸铝纳米粒：采用微乳化-混合法自制，具体见参考文献(J.Li,Y.C.Chen,Y.C.Tseng,S.Mozumdar,L.Huang,Biodegradable calcium phosphate nanoparticlewith lipid coating for systemic siRNAdelivery,J.Control.Release,142(3)(2010),pp.416-421)。
氢氧化铝纳米粒：采用酸碱中和法自制，具体见参考文献(Li X,AldayelA,CuiZ.2014.Aluminum hydroxide nanoparticles show a stronger vaccine adjuvantactivity than traditional aluminum hydroxide microparticles.J ControlRelease.173:148–157.)。
氧化铝纳米粒：采用铝氧化法，具体见参考文献(M Changmai,J Priyesh,MPurkait,Al2O3 nanoparticles synthesized using various oxidizing agents:Defluoridation performance,J Sci:Adv Mater device 2017,Volume 2,Issue 4,December 2017,Pages 483-492.)。
环二单磷酸鸟苷(c-di-GMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-nacdg，CAS NO:61093-23-0。
环二单磷酸腺苷(c-di-AMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-nacda，CAS NO:54447-84-6。
2’,3’-环鸟腺单磷酸苷(2’,3’-cGAMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-nagpap,CAS NO:1441190-66-4。
3’3’-环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸(3’3’-cGAMP，2’,3’-cyclic GMP-AMP)，购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-nacga-1,CAS NO:849214-04-6。
卵清蛋白(ovalbumin,OVA):购自Sigma-Aldrich(中国上海)货号A5378-10G。
豆磷脂酰胆碱胆碱(soyphosphatidylcholine,SPC)：购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司，CAS号8030-76-0。
1’2’-二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)
购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司，CAS号4004-05-1。
1,2-二油酰基-三甲胺基丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP)：购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司，CAS号132172-61-3。
传统磷酸铝佐剂(Adju-
Figure BDA0002621004550000071
adjuvant)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号vac-phos-250。
传统氢氧化铝佐剂
Figure BDA0002621004550000072
购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号vac-alu-250。
其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，可商购获得。
实施例1:表面覆盖SPC/DOTAP/MPLA/cGAMP氢氧化铝纳米粒VADS及其构建的亚单位疫苗
取含有平均粒径80纳米氢氧化铝纳米粒(AN)的纯水溶液适量(AN浓度为0.5％，w/v)，在25℃、搅拌条件下，按照AN/MPLA/cGAMP＝50:3:1质量比，滴加含有MPLA胶束(水化MPLA薄膜形成)及2’3’-cGAMP的纯水溶液，继续搅拌20min，形成AN-MC(表面结合MPLA与cGAMP氢氧化铝纳米粒)。
另按照SPC/DOTAP质量比10:1取脂质材料，置于梨形玻璃瓶，加氯仿溶解，35℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成SPC/DOTAP薄膜。
以含有AN-MC纯水溶液水化附着于容器内壁的SPC/DOTAP薄膜，控制AN/SPC-DOTAP质量比例为(50:6)，形成PLAN-MC。
再按照AN/OVA＝20:1质量比例，在25℃、搅拌条件下，加入模型抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA)，继续搅拌20分钟，得到OVA-PLAN-MC，以HEPES缓冲溶液调为等渗，即制备为OVA-PLAN-MC亚单位疫苗。
动态光散射(DLS)检测表明：平均粒径为80纳米的氢氧化铝AN，制备为OVA-PLAN-MC的平均粒径为96纳米。检测条件为25℃，水介质，90度角，仪器为ZetasizerNano ZS90(Malvern Panalytical公司)。
采用micro-Bradfordprotocol方法，对于OVA进行定量测定(具体步骤见参考文献(S Zuo,P Lundahl,Amicro-Bradford membrane protein assay,Anal Biochem 284(1)(2000)162-4.)，以下列公式计算包封率(载体表面结合率)AE为93％。
AE(％)＝(总OVA-游离OVA)/总OVA×100％
按照1μg/50μL OVA剂量，通过肌肉注射给小鼠接种。3对照组小鼠按相同剂量、相同方式分别接种HEPES生理盐水(Saline)，OVA+商品氢氧化铝佐剂，OVA+表面结合MPLA的氢氧化铝纳米粒(AN-MA，类似于GSK佐剂系统AS04)。表面结合MPLA的氢氧化铝纳米粒(AN-MA)是利用AN和MPLA参照前面制备AN-MC的方法制备得到，AN/MPLA质量比为50:3。
接种3周后，检测实验组和对照组(saline、OVA-AM、OVA-AN-MA)小鼠的免疫应答反应，包括ELISA检测小鼠血清抗原特异性抗体(IgG)水平，流式细胞分析检测细胞毒性T细胞(CTL,即荧光标记SIINFEKLH-I+CD8+T cell)水平，以及ELISA检测抗原再刺激免疫鼠脾细胞分泌IFN-γ水平(各参数具体检测方法见参考文献(WangN,ZhenY,JinY,Wang X,Li N,Jiang S,Wang T.Combining different types of multifunctional liposomes loadedwith ammoniumbicarbonate to fabricate microneedle arrays as a vaginal mucosalvaccine adjuvant-dual delivery system(VADDS).J Control Release.2017 Jan28；246:12-29.)。检测结果如图2、3、4所显示。
图2为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG水平(n＝5)；AM为传统氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-MA，为MPLA修饰氢氧化铝纳米粒；检测时血清进行1:3200倍稀释，***p<0.01。
图3为接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-Ag CTL)(n＝5)；AM，为传统氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-MA，为MPLA修饰氢氧化铝纳米粒；***p<0.01。
图4为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)；AM为传统氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-MA，为MPLA修饰氢氧化铝纳米粒；***p<0.01。
从结果可见，与后两对照组相比较，接种本发明的产生的OVA-PLAN-MC的小鼠，抗原特异性抗体IgG水平分别提高了2.6倍和1.7倍，产生细胞毒性T细胞(CTL)提高了7.7倍和2.1倍，免疫小鼠脾细胞抗原再刺激分泌IFN-γ水平比例提高了4.1倍和2.0倍。可见，PLAN-MC是强效VADS，能够显著高效诱导接种鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答。
实施例2:表面覆盖SPC/MPLA/cGAMP氧化铝纳米粒VADS及其构建的亚单位疫苗
取含有平均粒径35纳米氧化铝纳米粒(AN)的纯水溶液适量(AN浓度0.5％，w/v)，在25℃、搅拌条件下，按照AN/MPLA/cGAMP＝50:2:1最终质量比，滴加含有MPLA胶束(水化MPLA薄膜形成)及2’,3’-cGAMP的纯水溶液，继续搅拌20min，形成AN-MC。
再按照AN/OVA质量比为25:1，在25℃、搅拌条件下，加入OVA，继续搅拌20分钟，得到OVA-AN-MC。
在25℃、搅拌条件下，将2％(w/v)SPC脂质体(薄膜分散法制备)水溶液滴入含有OVA-AN-MC的水溶液，至AN/SPC质量比例为5:1，继续搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-MC，以HEPES缓冲溶液调为等渗，即制备为OVA-PLAN-MC亚单位疫苗。
按照实施例1方法进行表征，结果OVA-PLAN-MC平均粒径为47纳米，对于OVA包封率为100％。
按照2μg/50μL OVA剂量，通过吸入小鼠肺部黏膜接种。3对照组小鼠接种相同剂量，生理盐水(Saline)HEPES组小鼠吸入接种；OVA+商品氢氧化铝佐剂组小鼠，肌肉注射接种(吸入则接种氢氧化铝凝胶阻塞气道致小鼠死亡)；OVA+表面结合MPLA氧化铝纳米粒(AN-MA，类似于GSK佐剂系统AS04)吸入接种。
接种3周后，按照实施例1方法检测实验组和对照组小鼠的免疫应答反应，结果如图5、6、7所示。
图5为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG及肺灌洗液(BALF)IgA水平(n＝5)；AM，为传统氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-MA为MPLA修饰氧化铝纳米粒；检测时血清IgG进行1:3200倍稀释；检测肺冲洗液IgA进行了1:400倍稀释；**p<0.05,***p<0.01。
图6为是接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-Ag CTL)(n＝5)；AM为传统氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-MA为MPLA修饰氧化铝纳米粒；***p<0.01。
图7为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)；AM为传统氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-MA为MPLA修饰氢氧化铝纳米粒；***p<0.01。
从结果可见，和两对照组(OVA+传统氢氧化铝佐剂；OVA+AN-MA)相比，接种本发明的产生的OVA-PLAN-MC的小鼠，产生血清抗OVA特异性抗体IgG分别提高了3.1倍和2.2倍，肺冲洗液IgA抗体分别提高了9.0倍和2.2倍；产生CTL分别提高了5.3倍和2.1倍；免疫鼠脾细胞再次受抗原刺激产生IFN-γ，分别提高了4.3倍和2.6倍。
这表明小鼠既产生了TH1/TH2混合型系统免疫，也产生了很强的粘膜免疫。因而，PLAN-MC制备的疫苗有望能够防治通过呼吸系统入侵的病原体(如SARS-CoV-2)感染。
实施例3:表面覆盖SPC/DOTAP的MPLA/c-di-GMP共修饰磷酸铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统
取含有磷酸铝纳米粒(AN，平均粒径90纳米)的纯水溶液(AN浓度0.5％，w/v)适量，在25℃、搅拌条件下，按照AN/MPLA/c-di-GMP＝50:5:1质量比，滴加含有MPLA胶束及c-di-GMP纯水溶液，继续搅拌20min，形成AN-MC纯水溶液。另按照SPC:DOTAP质量比8:1取脂质材料，置于梨形玻璃瓶，加氯仿溶解，35℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成SPC/DOTAP薄膜。
以AN-MC纯水溶液水化附着于容器内壁的SPC/DOTAP薄膜，控制AN/SPC/DOTAP质量比例为50:3.7:0.3，形成PLAN-MC；再按照AN/OVA＝25:1质量比例，在25℃、搅拌条件下，加入模型抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA)，继续搅拌20分钟，得到OVA-PLAN-MC；以HEPES缓冲溶液调为等渗，即制备为以OVA-PLAN-MC为VADS的亚单位疫苗。
动态光散射(DLS)检测表明，OVA-PLAN-MC平均粒径为98纳米，对于OVA与纳米载体结合率为92％。
按照1μg/50μL OVA剂量，通过肌肉注射给小鼠接种本发明的OVA-PLAN-MC。
接种3周后，按照实施例1的方法检测实验组和对照组小鼠(OVA+传统磷酸铝佐剂，等剂量、同样方式接种；OVA+磷酸铝纳米粒，等剂量、同样方式接种)的免疫应答反应。
结果显示，与等剂量、同样方式接种的两对照组小鼠相比较，接种本发明OVA-PLAN-MC的小鼠，产生的抗原特异性抗体水平分别提高了9.6倍和7.5倍，产生细胞毒性T细胞(CTL)提高了7.4倍和4.7倍，IgG2a/IgG1水平比例提高了3.2倍和2.3倍。可见，PLAN-MC是强效VADS，能够显著高效诱导接种鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答。
实施例4:表面覆盖DOPE的MPLA/c-di-AMP共修饰氧化铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统
取含有氧化铝纳米粒(平均粒径35纳米)的纯水溶液(AN浓度0.5％，w/v)适量，在25℃、搅拌条件下，按照AN/MPLA/c-di-AMP＝50:2:1最终质量比，滴加含有MPLA胶束及c-di-AMP纯水溶液，继续搅拌20min；再按照AN/OVA质量比50:1，在25℃、搅拌条件下，加入模型抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA)，继续搅拌20分钟，得到AN-MC-OVA水溶液；在25℃、搅拌条件下，将2％(w/v)DOPE脂质体HEPES水溶液滴入AN-MC-OVA水溶液，至AN/DOPE质量比例为50:6，继续搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-MC；以HEPES缓冲溶液调为等渗，即制备为OVA-PLAN-MC亚单位疫苗。
动态光散射(DLS)检测表明，OVA-PLAN-MC平均粒径为43纳米，对于OVA包封率为99％。
按照2μg/50μL OVA剂量，通过吸入小鼠肺部黏膜接种本发明OVA-PLAN-MC。
接种3周后，按照实施例1的方法检测实验组和对照组小鼠(OVA+氢氧化铝传统佐剂，等剂量肌肉注射接种(吸入接种会致小鼠死亡)；OVA+氧化铝纳米粒，等剂量吸入肺部接种)的免疫应答反应。
结果分析发现，与对照组相比较，接种本发明OVA-PLAN-MC的小鼠，产生抗OVA特异性抗体提高了15.6倍和8.9倍，CTL提高了10.3倍和8.4，IgG2a/IgG1比值提高了5.9倍和3.7倍。同时在鼠肺洗液均检测到了IgA，其平均滴度水平分别是对照组的13.4倍和6.2倍，表明小鼠既产生了TH1/TH2混合型系统免疫，也产生了很强的粘膜免疫。因而，PLAN-MC制备的疫苗有望能够防治通过呼吸系统入侵的病原体感染。
实施例5:表面覆盖SPC/MPLA/cGAMP氧化铝纳米粒的冻干品疫苗佐剂-传递系统
将实施例2得到的OVA-PLAN-MC溶液，加入蔗糖，蔗糖终浓度达到5％(w/v)，通过冷冻干燥获得冻干品，冷冻保藏。
取出冷冻保藏的冻干品进行实验，接种前，加入与冻干前相同体积的纯水水化，获得OVA-PLAN-MC溶液，动态光散射(DLS)检测VADS粒径、包封率无明显变化。
按照5μg/50μL OVA剂量，通过皮下注射给小鼠接种，3周后按实施例1的方法检测实验组与等剂量同样方式接种的两对照组(OVA+传统氢氧化铝佐剂；OVA+氧化铝纳米粒)的免疫应答反应。
从结果可见，接种本发明冻干品的小鼠，相对于对照组，产生OVA特异性抗体提高了12.1倍和7.9倍，CTL提高了9.4倍和6.1倍，IgG2a/IgG1比值提高了4.3倍和2.7倍，IFN-γ提高了2.5倍和1.7倍，表明接种鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答。

Claims (10)

1.一种被覆磷脂的单磷脂A及环二核苷酸共修饰的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：以铝纳米粒为载体，在铝纳米粒表面覆盖有磷脂双分子层，且由单磷脂A及环二核苷酸共修饰。
2.如权利要求1所述的疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：所述磷脂含有由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂中一种或多种组成的主成分，以及作为部分辅助成分以调节载体荷电性质的荷电脂质材料。
3.如权利要求2所述的疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：所述磷脂含有磷脂酰胆碱以及荷电脂质材料DOTAP；
优选，磷脂中，所述主成分与荷电脂质材料的质量比为10:1。
4.如权利要求1-3任一所述的疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：所述环二核苷酸选自环二单磷酸鸟苷，环二单磷酸腺苷，环单磷酸鸟苷-单磷酸腺苷中的一种或多种；优选2’,3’-cGAMP。
5.如权利要求1至4任一项所述的疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：所述铝纳米粒为氧化铝、磷酸铝或氢氧化铝；
优选铝纳米粒粒径为100纳米以下。
6.如权利要求1至5任一项所述的疫苗佐剂-传递系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取铝纳米粒水溶液，加入单磷脂A、环二核苷酸搅拌混匀，形成单磷脂A/环二核苷酸修饰AN，即AN-MC；
优选所述MPLA为固体薄膜，或乙醇溶液，或分散于纯水或HEPES缓冲液的胶束；
优选所述环二核苷酸的溶剂为纯水或HEPES缓冲液；
(2)在温度高于磷脂相变温度以上的条件下，将AN-MC与磷脂材料混合，搅拌混匀，即得疫苗佐剂-传递系统PLAN-MC；
优选磷脂材料是固体薄膜，或磷脂乙醇溶液，或分散于纯水或HEPES缓冲液的脂质体。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，铝纳米粒、单磷脂A、环二核苷酸、磷脂的质量比为50:2～5:1～2:5～10；
优选铝纳米粒、单磷脂A、环二核苷酸、磷脂的质量比为50:5:2:10。
8.一种VADS运载疫苗，其特征在于：是在权利要求1至5任一项所述的疫苗佐剂-传递系统的分子上连接或吸附有疫苗成分。
9.如权利要求8所述的VADS运载疫苗，其特征在于：疫苗成分为病原体抗原或灭活病原体；
优选所述VADS运载疫苗的剂型为液体制剂或冷冻干燥获得的冻干品。
10.权利要求8或9所述的VADS运载疫苗的制备方法，其特征在于：
获得权利要求1-5任一所述的PLAN-MC；然后直接与病原体抗原混匀得到PLAN-MC-Ag；优选，当疫苗成分为灭活病原体时，将灭活病原体吸附于PLAN-MC表面，即得；
或者采用以下步骤：
(1)取铝纳米粒水溶液，加入单磷脂A、环二核苷酸搅拌混匀，形成单磷脂A、环二核苷酸修饰AN，即AN-MC；其中优选所述单磷脂A为固体薄膜，或乙醇溶液，或分散于纯水或HEPES缓冲液的胶束；优选所述环二核苷酸的溶剂为纯水或HEPES缓冲液；
(2)然后将病原体抗原吸附于AN-MC表面形成AN-MC-Ag，
(3)在温度高于磷脂相变温度以上的条件下，将AN-MC与磷脂材料混合，搅拌混匀，即得疫苗佐剂-传递系统PLAN-MC。
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