CN111920946A - 环二核苷酸修饰铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统及基于其的SARS-CoV-2亚单位疫苗 - Google Patents

环二核苷酸修饰铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统及基于其的SARS-CoV-2亚单位疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物制剂领域，公开了环二核苷酸修饰的铝纳米粒疫苗佐剂‑传递系统及基于该疫苗佐剂‑传递系统的SARS‑CoV‑2亚单位疫苗。CAN以铝纳米粒为载体，在铝纳米粒表面有环二核苷酸分子修饰。本发明以SARS‑CoV‑2刺突蛋白受体结合域(SCV2‑RBD)作为抗原，以环二核苷酸修饰铝纳米粒为疫苗佐剂‑传递系统(VADS)，构建了SARS‑CoV‑2亚单位疫苗；本发明的SARS‑CoV‑2亚单位疫苗安全性高，免疫诱导效力强，可以采用多种方式进行接种；尤其是，接种后能显著提高机体产生SCV2‑RBD抗原特异性抗体以及细胞毒性T细胞(CTL)水平。

Description

环二核苷酸修饰铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统及基于其的 SARS-CoV-2亚单位疫苗
技术领域
本发明涉及生物药物技术领域，具体涉及一种环二核苷酸修饰铝纳米粒疫苗佐剂- 传递系统及基于该VADS构建的SARS-CoV-2亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术
目前正在发展的SARS-CoV-2疫苗主要包括如下类型。1)灭活SARS-CoV-2疫苗：是采用物理或化学方法直接杀灭SARS-CoV-2病原体直接作为疫苗制剂。2)减毒SARS-CoV-2活疫苗：用人工定向诱变方法消除病原体致病性，或者将SARS-CoV-2表面抗原Spike蛋白基因整合无致病性病毒载体，如腺病毒等，作为疫苗制剂。减毒活疫苗的免疫诱导效果较好，但存在基因突变产生致病性的风险，以及载体病毒自身诱导产生的免疫负效应。 3)核酸疫苗：包括RNA、DNA两种疫苗，是将蛋白抗原表达基因通过脂质纳米载体传递至细胞，表达抗原刺激机体产生免疫。4)亚单位疫苗(纯抗原组分疫苗)：将SARS-CoV-2 纯化抗原，与疫苗佐剂-传递系统结合，制备为疫苗制剂。
上述不同类型SARS-CoV-2疫苗各具特点与优势，但也均存在自身缺陷，概括而言突出表现为以下两方面。发展安全、强效、易于构建的VADS，仍是制备SARS-CoV-2亚单位疫苗的关键。
铝盐是常用的VADS，应用于临床已经有90多年的历史。传统铝佐剂虽然能激活Th2细胞分泌IL-4，进而促进Th2型体液免疫应答产生抗体，但难以有效诱导细胞免疫应答，无法促进机体产生细胞毒性T细胞。此外，较强的局部刺激性也是铝盐佐剂突出弱点，也是有待于人们研究克服的重点。
综上，铝盐作为疫苗佐剂，在安全性和免疫刺激效力方面都有待进一步研发优化。
发明内容
本发明构建了一种环二核苷酸修饰的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统CAN，以及基于该CAN的SARS-CoV-2亚单位疫苗。具体技术方案概括如下：
一种环二核苷酸修饰的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：以铝纳米粒(AN) 为载体，所述铝纳米粒表面有环二核苷酸(CDN)分子修饰；AN:CDN的质量比为10～40:1；
优选AN:CDN的质量比为20:1。
优选地,所述环二核苷酸为环二单磷酸鸟苷(c-di-GMP，cyclic dimericguanosine monophosphate)，环二单磷酸腺苷(c-di-AMP，cyclic dimeric adenosinemonophosphate)， 2’3’-环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸(2’,3’-cGAMP，2’,3’-cyclic GMP-AMP)，或3’3’-环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸(3’3’-cGAMP，2’,3’-cyclic GMP-AMP)中的一种或多种；
优选2’3’-环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸。
优选地，所述铝纳米粒为氧化铝、磷酸铝或氢氧化铝铝纳米粒；
优选铝纳米粒粒径为100纳米以下。
上述任一所述的疫苗佐剂-传递系统的制备方法，其特征在于：取铝纳米粒溶液，在搅拌条件下加入环二核苷酸溶液，搅拌均匀，即得疫苗佐剂-传递系统—CAN；
优选铝纳米粒水溶液和环二核苷酸水溶液；
优选在室温下进行。
本发明还提供一种基于环二核苷酸修饰的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统的亚单位疫苗，其特征在于：CAN载体为上述任一项疫苗佐剂-传递系统，CAN载体上连接或吸附有疫苗抗原。
本发明还提供一种基于环二核苷酸修饰的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统的 SARS-CoV-2亚单位疫苗，其特征在于：CAN载体为任一上述疫苗佐剂-传递系统，CAN 载体上连接或附着有SARS-CoV-2抗原。
所述SARS-CoV-2抗原为SARS-CoV-2刺突蛋白SCV2-SP，或SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域SCV2-RBD；
优选SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域SCV2-RBD。
优选地，所述SARS-CoV-2抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述铝纳米粒(AN)与SARS-CoV-2抗原的质量比为10～40:1；
AN与SARS-CoV-2抗原的质量比优选10:1。
优选地，所述亚单位疫苗的剂型为液体制剂或冷冻干燥获得的冻干品。
上述任一SARS-CoV-2亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取铝纳米粒溶液，在搅拌条件下加入环二核苷酸溶液，搅拌均匀，即得疫苗佐剂-传递系统CAN；在搅拌条件下将SARS-CoV-2抗原溶液加入CAN溶液中，搅拌均匀，即得；
优选在室温下进行；
优选所述CAN溶液和SARS-CoV-2抗原溶液均为HEPES水溶液。
在细胞内，环二核苷酸(cyclic dinucleotide,CDN)分子能够有效激活STING分子，后者随即进一步激活干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)及核因子NF-κB，从而产生Ⅰ型干扰素，促进TH1型免疫应答提高细胞免疫。
铝具有强烈的亲磷性质，能够与含有磷酸基团的分子形成牢固的结合载体，CDN含有磷酸基团，本发明以表面结合CDN铝纳米粒载体为高能效疫苗佐剂-传递系统(VADS)，以SCV2-RBD为抗原，构建了SARS-CoV-2亚单位疫苗(其结构如图1所示)。
本发明的构建的疫苗佐剂-传递系统CAN和SARS-CoV-2亚单位疫苗，安全性高，适于多途径接种，可以通过腔道粘膜接种，及皮下、肌肉注射接种；免疫诱导效力强：铝纳米粒激活免疫系统产生体液免疫，而环二核苷酸能够激活STING通路，诱导Th1免疫反应，促进细胞免疫。
本申请涉及的词语缩写：
SARS-CoV-2，severe acute respiratory syndrome coronavirus-2(重急呼吸综合征冠状病毒-2)；
SCV2-RBD，SARS-CoV-2spike protein receptor binding domain(SARS-CoV-2病毒刺突蛋白受体结合域)；
CDN，cyclic di-nucleotide(环二核苷酸)；
2’,3’-cGAMP(2’,3’-环鸟腺单磷酸苷)；
AN，aluminum oxide nanoparticles(铝纳米粒)；
CAN,CDN-modified aluminum oxide nanoparticles(环二核苷酸修饰氧化铝纳米粒)；
VADS，vaccine adjuvant-delivery system(疫苗佐剂-传递系统)。
附图说明
图1为本发明构建的SARS-CoV-2亚单位疫苗的结构示意图。
图2为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG及肺灌洗液(BALF)IgA水平(n＝5)。
图3为接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-Ag CTL)(n＝5)。
图4为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)。
图5为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG水平(n＝5)。
图6为接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-Ag CTL)(n＝5)。
图7为接种不同疫苗小鼠脾细胞受到抗原再刺激分泌IFN-γ水平。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
试剂来源：
氧化铝纳米粒：采用铝氧化法，具体见参考文献(M Changmai,J Priyesh,MPurkait, Al2O3 nanoparticles synthesized using various oxidizing agents:Defluoridation performance, J Sci:Adv Mater device 2017,Volume 2,Issue 4,December 2017,Pages 483-492.)。
氢氧化铝纳米粒：采用酸碱中和法自制，具体见参考文献(Li X,Aldayel A,CuiZ.2014. Aluminum hydroxide nanoparticles show a stronger vaccine adjuvantactivity than traditional aluminum hydroxide microparticles.J ControlRelease.173:148–157.)。
传统氢氧化铝佐剂
Figure RE-GDA0002694880010000031
购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号vac-alu-250。
2’,3’-环鸟腺单磷酸苷(2’,3’-cGAMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号 tlrl-nagpap,CAS NO:1441190-66-4。
本发明各实施例中选用SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域SCV2-RBD(SARS-CoV-2spike protein receptor binding domain)作为疫苗抗原；购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号his-sars2-rbd。
SCV2-RBD-His氨基酸序列(SCV2-SP全序列319-541部分，末端连接组氨酸)如SEQID NO:1所示：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFR KSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF(GSGHHHHHH)
SCV2-RBD水溶液：上述SCV2-RBD溶于HEPES缓冲液中配制而得，浓度为1mg/mL。
其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，可商购获得。
实施例1:基于CAN-VADS发展的SARS-CoV-2亚单位疫苗(溶液制剂)
取含有平均粒径为80纳米的氧化铝纳米粒(AN)纯水(4mg/mL)适量，在室温、200rpm(200转/分钟)搅拌条件下，按照0.5mL/min速度缓慢滴加2’,3’-cGAMP水溶液(0.4mg/mL)，至AN/2’,3’-cGAMP质量比为20:1，继续搅拌20min，形成表面结合cGAMP 的铝纳米粒，即CAN(cGAMP-surficially modified AN)。
接着在室温、200rpm搅拌条件下，按照0.5mL/min速度缓慢滴加SCV2-RBD抗原水溶液(0.8mg/mL)，至AN/SCV2-RBD质量比为10:1，继续搅拌20分钟，形成 SCV2-RBD-CAN。
随后加入20mM HEPES(pH＝7.0)缓冲液及蔗糖(最终浓度为5％，w/v)，使SCV2-RBD抗原浓度为0.1μg/μL，即为SARS-CoV-2亚单位疫苗制剂。
对所制备的SCV2-RBD-CAN亚单位疫苗进行表征。首先以动态光散射(DLS)检测粒径，条件为25℃，水介质，90度角，仪器为Zetasizer Nano ZS90(Malvern Panalytical 公司)。结果表明：平均粒径为80纳米氧化铝纳米粒(AN)，制备为SCV2-RBD-CAN 平均粒径增大为93纳米(n＝3)。
采用micro-Bradford protocol方法，对于SCV2-RBD进行定量测定(具体步骤见参考文献(S Zuo,P Lundahl,A micro-Bradford membrane protein assay,Anal Biochem284(1) (2000)162-4.)，以下列公式计算包封率(载体表面结合率)。
AE(％)＝(total SCV2-RBD-free SCV2-RBD)/total SCV2-RBD×100％
检测结果表明，CAN对于SCV2-RBD抗原结合率AE为98％(n＝3)。
按照5μg/50μL SCV2-RBD抗原剂量，通过吸入给小鼠接种SCV2-RBD-CAN(n＝5)。
对照组小鼠按相同剂量接种，生理盐水组(空白)吸入接种，SCV2-RBD+商品传统氢氧化铝佐剂组肌肉注射接种(吸入接种佐剂凝胶会阻塞呼吸道致小鼠死亡)， SCV2-RBD+AN。所有组别均为间隔4周，接种2次。
接种后，各组接种小鼠体重、行为无异常，说明CAN-VADS及其开发的疫苗无明显毒副作用。
二次接种3周后，检测实验组和对照组小鼠免疫应答反应，包括ELISA检测小鼠血清抗原特异性抗体(IgG)水平及肺灌洗液(BALF)IgA水平，流式细胞分析检测细胞毒性T细胞(CTL,即荧光标记SIINFEKLH-I+CD8+T cell)水平，以及ELISA检测抗原再刺激免疫鼠脾细胞分泌IFN-γ水平(各参数具体检测方法见参考文献(Wang N,Zhen Y,Jin Y, Wang X,LiN,Jiang S,Wang T.Combining different types of multifunctional liposomesloaded with ammonium bicarbonate to fabricate microneedle arrays as a vaginalmucosal vaccine adjuvant-dual delivery system(VADDS).J ControlRelease.2017Jan 28；246:12-29.)。检测结果如图2,3,4所显示。
图2为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG及肺灌洗液(BALF)IgA水平(n＝5)。 AM为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN为氧化铝纳米粒；检测时血清IgG 进行1:3200倍稀释；检测BALF液IgA进行了1:400倍稀释；***p<0.01。
图3为接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-Ag CTL)(n＝5)。 AM，为氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN为氧化铝纳米粒；***p<0.01。
图4为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)。AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN为氧化铝纳米粒；***p<0.01。
由免疫反应检测结果可见，与后两对照组相比较，产生的抗原特异性抗体IgG水平分别提高了4.2和2.3倍，而肺灌洗液(BALF)IgA水平分别提高了20和2.2倍，产生细胞毒性T细胞(CTL)分别提高了9.2和2.8倍，免疫小鼠脾细胞抗原再刺激分泌IFN-γ水平分别提高了4.5和2.8倍。可见，基于CAN-VADS的SARS-CoV-2亚单位疫苗具有较强的免疫诱导效力，适于黏膜接种，能够高效率诱导接种鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答。
实施例2:基于CAN-VADS发展的SARS-CoV-2亚单位疫苗(冻干制剂)
取含有平均粒径为80纳米的氢氧化铝纳米粒(AN)纯水(4mg/mL)适量，在室温、200rpm(200转/分钟)搅拌条件下，按照0.5mL/min速度缓慢滴加2’,3’-cGAMP 水溶液(0.4mg/mL)，至AN/2’,3’-cGAMP质量比为20:1，继续搅拌20min，形成表面结合cGAMP的铝纳米粒，即CAN(cGAMP-superficially modified AN)。
接着在室温、200rpm搅拌条件下，按照低于0.5mL/min速度，向CAN水溶液中缓慢滴加SCV2-RBD抗原水溶液(0.8mg/mL)，至AN/SCV2-RBD质量比为10:1，继续搅拌20分钟，形成SCV2-RBD-CAN。
随后加入20mM HEPES(pH＝7.0)缓冲液及蔗糖(最终浓度为5％，w/v)，使SCV2-RBD抗原浓度为0.1μg/μL。
将制备的SCV2-RBD-CAN水溶液，按照每瓶50μg抗原0.5mL体积，分装入冻干西丁瓶，进行冷冻干燥。
冻干条件：-65℃冷冻4小时，-40℃抽真空(气压<10帕斯卡)除溶剂4小时，-30℃抽真空2小时，-20℃抽真空2小时，室温抽真空4小时。
得到冻干品进行稳定性考察：室温储存1周；4℃储存6个月。
按照实施例1对于冻干前后SCV2-RBD-CAN进行表征。
样品加入与冻干前相同体积纯水水化，按照实施例1对于冻干前后SCV2-RBD-CAN进行表征。结果表明SCV2-RBD-CAN冻干前粒径为92纳米，冻干后粒径为93纳米，室温储存1周及4℃储存6个月后，粒径无明显变化。AE冻干前为99％，冻干后、储存后无明显变化，具体结果列于表1。由此可见，SCV2-RBD-CAN冻干品稳定性较高。
表1.SCV2-RBD-CAN粒径(size)、抗原结合率(AE)、ζ电位及稳定性考察(n＝3)。
Figure RE-GDA0002694880010000061
注:NP，纳米颗粒,FD-SCV2-RBD-CAN，冻干的SCV2-RBD-CAN
按照5μg/50μL SCV2-RBD抗原剂量，通过肌肉注射给小鼠接种SCV2-RBD-CAN(n＝5)。
对照组小鼠按相同剂量、相同方式接种：生理盐水组(空白)，SCV2-RBD+商品传统氢氧化铝佐剂组肌肉注射接种，SCV2-RBD+氢氧化铝纳米粒(AN)。所有组别均为间隔4周，接种2次。
二次接种3周后，按照实施例1方法检测接种疫苗小鼠产生的免疫应答，结果见图5-7。
图5为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG水平(n＝5)。AM为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN为氢氧化铝纳米粒；检测时血清IgG进行1:3200倍稀释；***p<0.01。
图6为接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-Ag CTL)(n＝5)。 AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN为氢氧化铝纳米粒；***p<0.01。
图7为接种不同疫苗小鼠脾细胞受到抗原再刺激分泌IFN-γ水平。AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN为氢氧化铝纳米粒；***p<0.01。
由免疫反应检测结果可见，与后两对照组相比较，产生的抗原特异性抗体IgG水平分别提高了2.4和1.6倍，产生细胞毒性T细胞(CTL)分别提高了12.8和2.7倍，免疫小鼠脾细胞抗原再刺激分泌IFN-γ水平分别提高了4.9和2.5倍。可见，基于CAN-VADS 的SARS-CoV-2亚单位疫苗冻干品，稳定性较高，同时具有较强的免疫诱导效力，能够高效率诱导接种鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答。
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<110> 合肥诺为尔基因科技服务有限公司
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苗
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<210> 1
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<212> PRT
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<220>
<223> SARS-CoV2刺突蛋白受体结合域SCV2-RBD
<400> 1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly
210 215 220
Ser Gly His His His His His His
225 230

Claims (10)

1.一种环二核苷酸修饰铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：以铝纳米粒为载体，所述铝纳米粒表面有环二核苷酸分子修饰；
优选AN:CDN的质量比为10～40:1。
2.如权利要求1所述的疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：所述环二核苷酸为环二单磷酸鸟苷，环二单磷酸腺苷，2’3’-环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸，和3’3’-环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸中的一种或多种；
优选2’3’-环单磷酸鸟苷-单磷酸腺苷。
3.如权利要求1或2所述的疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：所述铝纳米粒为氧化铝、磷酸铝或氢氧化铝铝纳米粒；
优选粒径为100纳米以下铝纳米粒。
4.如权利要求1至3任一项所述的疫苗佐剂-传递系统的制备方法，其特征在于：取铝纳米粒溶液，在搅拌条件下加入环二核苷酸溶液，搅拌均匀，即得疫苗佐剂-传递系统—CAN；
优选铝纳米粒水溶液和环二核苷酸水溶液；
优选在室温下进行。
5.一种基于环二核苷酸修饰的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统的亚单位疫苗，其特征在于：CAN载体为权利要求1至3任一项所述的疫苗佐剂-传递系统，CAN载体上连接或吸附有疫苗抗原。
6.一种基于环二核苷酸修饰的铝纳米粒疫苗佐剂-传递系统的SARS-CoV-2亚单位疫苗，其特征在于：CAN载体为权利要求1至3任一项所述的疫苗佐剂-传递系统，CAN载体上连接或吸附有SARS-CoV-2抗原。
7.如权利要求6所述的SARS-CoV-2亚单位疫苗，其特征在于：所述SARS-CoV-2抗原为SARS-CoV-2刺突蛋白SCV2-SP，或SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域SCV2-RBD；
优选SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域SCV2-RBD。
8.如权利要求6至7任一项所述的SARS-CoV-2亚单位疫苗，其特征在于：所述铝纳米粒与SARS-CoV-2抗原的质量比为10～40:1；
优选铝纳米粒与SARS-CoV-2抗原的质量比为10:1。
9.如权利要求6至8任一项所述的SARS-CoV-2亚单位疫苗，其特征在于：所述亚单位疫苗的剂型为液体制剂或冷冻干燥获得的冻干品制剂；
优选冷冻干燥制剂。
10.权利要求6至9任一项所述的SARS-CoV-2亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取铝纳米粒溶液，在搅拌条件下加入环二核苷酸溶液，搅拌均匀，即得疫苗佐剂-传递系统CAN；在搅拌条件下将SARS-CoV-2抗原溶液加入CAN溶液中，搅拌均匀，即得；
优选在室温下进行；
优选所述CAN溶液和SARS-CoV-2抗原溶液均为HEPES水溶液。
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