CN111939252B - 磷脂、CpG-ODN及环二核苷酸共修饰的铝纳米疫苗佐剂-传递系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物药物技术领域，特别是一种磷脂、CpG‑ODN及环二核苷酸共修饰的铝纳米疫苗佐剂‑传递系统及其制备方法，其纳米铝为载体，在铝纳米粒(AN)表面覆盖有磷脂(PL)双分子层，且由CpG寡核苷酸(CpG‑ODN)及环二核苷酸分子共修饰。该VADS对于接种部位刺激性小，安全性高，运载疫苗能够通过多种途径接种，提高疫苗诱导机体形成体液及细胞免疫效力，产生高滴度抗原特异性抗体及高水平细胞毒性T淋巴细胞，是一种安全、高效VADS。
Description
技术领域
本发明涉及生物药物技术领域，具体涉及一种磷脂、CpG-ODN及环二核苷酸共修饰的铝纳米疫苗佐剂-传递系统及其制备方法。
背景技术
疫苗是能够诱导机体产生抗体的免疫原物质，是用于防治传染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病的生物制剂。
目前疫苗主要包括灭活病原体、减毒活微生物、表达抗原的核酸、类毒素、以及基于纯抗原组分的亚单位疫苗等不同类型。灭活疫苗是采用物理或化学方法直接杀灭病原体，再添加佐剂等适当成分制成疫苗制剂。此类疫苗对机体刺激时间短，要获得持久免疫力往往需要重复接种。减毒活疫苗是用人工诱变、基因重组等方法消除病原体致病性，或从自然界筛选出无毒力但与病原体具有相同抗原的活微生物制成活疫苗。减毒活疫苗的免疫诱导效力强，但存在基因突变产生致病性等风险，安全性较差。核酸疫苗，是将表达病原体蛋白抗原的RNA或DNA制备疫苗制剂。类毒素一般为病原体外毒素成分，是将细菌外毒素经处理消除毒性而保留免疫原性的制剂。亚单位疫苗则是将纯抗原组分制备为疫苗制剂，一般免疫原性较弱，需要疫苗佐剂-传递系统(VADS)提高免疫诱导效力。
目前这些不同类型疫苗既各具特点也存在自身不足，突出表现为安全性隐患与免疫激活效力弱两个方面。安全性问题主要由于疫苗成分复杂，尤其是活疫苗，存在变异或恢复致病性风险。效力弱则是亚单位疫苗普遍问题，因为亚单位疫苗只含有抗原成分，缺乏病原体原有的保护成分、病原体相关分子模式(PAMP)等激活机体固有免疫系统的相关成分，往往不能诱导足够免疫反应。因此，亚单位疫苗及灭活疫苗往往需要疫苗佐剂-传递系统(vaccine adjuvant-delivery system,VADS)，以提高效力。
铝盐是最早用于临床的VADS，距离首次使用已经过去了90多年。目前许多疫苗，如百白破疫苗、流感嗜血杆菌疫苗等，仍含有铝盐佐剂。然而，铝佐剂虽然能激活Th2细胞分泌IL-4，进而促进Th2型体液免疫应答产生抗体，但难以有效诱导细胞免疫应答，无法促进机体产生细胞毒性T细胞。此外，较强的局部刺激性也是铝盐佐剂突出弱点，也是有待于人们研究克服的重点。
综上，铝盐作为疫苗佐剂，在安全性和免疫刺激效力方面都有待进一步研发优化。
发明内容
针对上述领域的需求和存在的问题，本发明构建了磷脂、CpG-ODN及环二核苷酸共修饰的铝纳米，用作安全、高效疫苗佐剂-传递系统(VADS)。具体技术方案概括如下：
一种磷脂、CpG-ODN及环二核苷酸共修饰的铝纳米疫苗佐剂-传递系统，其特征在于：以铝纳米粒为载体，在铝纳米粒表面覆盖有磷脂双分子层，且由CpG-ODN及环二核苷酸分子共修饰；
所述CpG-ODN分子是指含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸基序的单链寡脱氧核苷酸分子，其中含有20～30个核酸单体；
优选地，所述CpG-ODN分子的序列为：5’-TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG-3’。
所述环二核苷酸为环二单磷酸鸟苷(c-di-GMP，cyclic dimeric guanosinemonophosphate)，环二单磷酸腺苷(c-di-AMP，cyclic dimeric adenosinemonophosphate)，2’3’-环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸(2’,3’-cGAMP，2’,3’-cyclic GMP-AMP)，或3’3’-环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸(3’3’-cGAMP，2’,3’-cyclic GMP-AMP)中的一种或多种；优选2’,3’-cGAMP。
所述磷脂为磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、鞘磷脂(SP)中一种或多种；优选相变温度低的磷脂酰胆碱(PC)。
所述磷脂双分子层中还含有荷电脂质分子，用于调节载体荷电性质；
优选，所述荷电脂质分子为1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷；
磷脂双分子层中，磷脂与荷电脂质分子的质量比为6～12:1。
上述任一疫苗佐剂-传递系统，所述铝纳米粒为氧化铝、磷酸铝或氢氧化铝铝纳米粒；
优选地，铝纳米粒粒径为100纳米以下；
本发明的另一方面，还提供上述疫苗佐剂-传递系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)将AN与CpG-ODN及CDN水溶液混合，形成CpG-ODN/CDN共修饰AN，即AN-CGC；
(2)将得到的AN-CGC溶液与磷脂材料混合，形成磷脂分子覆盖AN-CGC，即形成PLAN-CGC；
优选地，磷脂材料是磷脂固体薄膜、或磷脂的乙醇溶液、或脂质体溶液；
材料质量比满足：AN/CpG-ODN/CDN＝50:2～5:1～2，AN/PL＝10:1～2；
优选地，AN/CpG-ODN/CDN＝50:5:1，AN/PL＝5:1；
优选地，当磷脂相变温度低于室温时，步骤(2)在室温下进行；当磷脂相变温度高于室温时，步骤(2)在高于磷脂相变温度5℃以上温度下进行；
优选地，所述脂质体溶液是用HEPES缓冲溶液配制得到。
本发明的再一方面，提供VADS运载疫苗，是在上述任一疫苗佐剂-传递系统的分子上连接或吸附有疫苗成分。
优选地，疫苗成分为病原体抗原(Ag)或灭活病原体；
优选地，所述VADS运载疫苗的剂型为液体制剂或冷冻干燥获得的冻干品。
本发明也提供上述VADS运载疫苗的制备方法，包括如下步骤：
获得前述任一疫苗佐剂-传递系统PLAN-CGC；
然后将病原体抗原或灭活病原体吸附于PLAN-CGC表面，即得Ag-PLAN-CGC；
优选地，病原体抗原溶于HEPES缓冲液；AN/病原体抗原或灭活病原体的质量比为40:1～4。
本发明提供另一种上述VADS运载疫苗的制备方法，包括如下步骤：
取铝纳米粒水溶液，在搅拌条件下加入CpG-ODN及CDN水溶液，搅拌均匀，即形成CpG-ODN及CDN共修饰的铝纳米粒AN-CGC；
然后在搅拌条件下，将病原体抗原溶液缓慢滴加到AN-CGC溶液混合，形成Ag-AN-CGC，
再与磷脂材料混合，搅拌至混合均匀，即形成Ag-PLAN-CGC；
优选地，病原体抗原溶于HEPES缓冲液；AN/Ag的质量比为10:1。
本发明以传统佐剂铝盐(Alum)为基础，利用铝亲磷性构建了表面覆盖磷脂双分子层的CpG-ODN及CDN共修饰铝纳米粒(phospholipid bilayer-coated aluminumnanoparticles co-modified with CpG-ODN and CDN，PLAN-CGC)，用作VADS(见说明书附图1)。
由于表面覆盖了生物相容性磷脂双分子层，PLAN-CGC能够降低传统铝盐局部刺激性，具有多重佐剂功能和改善的铝佐剂功能，促进形成抗体免疫，免疫诱导效力强。
PLAN-CGC表面结合CpG-ODN及CDN分子能够同时激活TLR4及STING通路，促进形成TH1/TH2免疫应答，有效提升细胞免疫(形成细胞毒性T细胞)
实验数据表明本发明的PLAN-CGC生物相容性高，适于腔道粘膜、皮下、皮内/肌肉注射等多途径接种；安全性高，并且能够促进细胞摄取疫苗；具有多重佐剂功能，尤其适于发展亚单位疫苗，提高效力。
本申请涉及的词语缩写：
CpG-ODN，unmethylated CpG motif-containing oligodeoxynucleotide(含非甲基化CpG motif基序的寡脱氧核苷酸)；
CDN,cyclic di-nucleotide(环二核苷酸)；
PLAN-CGC,phospholipid bilayer-coated aluminum nanoparticle co-modified with CpG-ODN and CDN(表面覆盖磷脂双分子层的CpG-ODN/CDN共修饰铝纳米粒)；
c-di-AMP(环二腺苷酸，MW＝702)；c-di-GMP(环二鸟苷酸，MW＝734)；c-GAMP(环鸟腺苷酸，MW＝712)；
VADS，vaccine adjuvant-delivery system(疫苗佐剂-传递系统)；
SPC,soy phosphatidylcholine(豆磷脂酰胆碱胆碱)；PE，phosphatidylethanolamine(磷脂酰乙醇胺)；
DOTAP,1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane(1,2-二油酰基-三甲胺基丙烷)；CHO，cholesterol(胆固醇)。
附图说明
图1为本发明以PC、2’3’-cGAMP为例构建的PLAN-CGC VADS结构示意图。
图2为实施例1中接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG水平(n＝5)。
图3为实施例1中接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-AgCTL)(n＝5)。
图4为实施例1中接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)。
图5为实施例2中接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG及肺灌洗液(BALF)IgA水平(n＝5)。
图6为实施例2中接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-AgCTL)(n＝5)。
图7为实施例2中接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
试剂来源：
磷酸铝纳米粒：采用微乳化-混合法自制，具体见参考文献(J.Li,Y.C.Chen,Y.C.Tseng,S.Mozumdar,L.Huang,Biodegradable calcium phosphate nanoparticlewith lipid coating for systemic siRNA delivery,J.Control.Release,142(3)(2010),pp.416-421)。
氢氧化铝纳米粒：采用酸碱中和法自制，具体见参考文献(Li X,Aldayel A,CuiZ.2014.Aluminum hydroxide nanoparticles show a stronger vaccine adjuvantactivitythan traditional aluminum hydroxide microparticles.J ControlRelease.173:148–157.)。
氧化铝纳米粒：采用铝氧化法，具体见参考文献(M Changmai,J Priyesh,MPurkait,Al2O3 nanoparticles synthesized using various oxidizing agents:Defluoridation performance,J Sci:Adv Mater device 2017,Volume 2,Issue 4,December 2017,Pages 483-492.)。
环二单磷酸鸟苷(c-di-GMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-nacdg，CAS NO:61093-23-0。
环二单磷酸腺苷(c-di-AMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-nacda，CAS NO:54447-84-6。
2’,3’-环鸟腺单磷酸苷(2’,3’-cGAMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-nagpap,CAS NO:1441190-66-4。
3’3’-环鸟腺单磷酸苷(3’,3’-cGAMP)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号tlrl-napgpa，CAS NO:20137-01-3。
卵清蛋白(ovalbumin,OVA):购自Sigma-Aldrich(中国上海)货号A5378-10G。
豆磷脂酰胆碱(soy phosphatidylcholine,SPC)：购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司，CAS号8030-76-0。
本发明示例性实施例中采用的CpG-ODN为：Class-C CpG-ODN 2395，具有硫代磷酸酯全修饰的[5’-TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG-3’],(22mer)，InvivoGen(San Diego,CA,USA)公司出品，产品货号：tlrl-2395-1。
传统磷酸铝佐剂(adjuvant)：购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号vac-phos-250。
传统氢氧化铝佐剂购自InvivoGen(San Diego,CA,USA)，货号vac-alu-250。
其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，可商购获得。
实施例1:表面覆盖SPC/DOTAP/CpG-ODN/cGAMP氢氧化铝纳米粒VADS及其构建的亚单位疫苗
取含有平均粒径80纳米氢氧化铝纳米粒(AN)的纯水溶液适量(AN浓度为1％，w/v)，在室温、200rpm(每分钟200转)搅拌条件下，按照AN/CpG-ODN/cGAMP＝50:5:2质量比，缓慢滴加含有CpG-ODN(0.2％，w/v)及2’3’-cGAMP纯水溶液(0.08％,w/v)，继续搅拌20min，形成AN-CGC(表面结合CpG-ODN与cGAMP的氢氧化铝纳米粒)。
另按照SPC/DOTAP质量比10:1取脂质材料，置于梨形玻璃瓶，加氯仿溶解，35℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成SPC/DOTAP薄膜。
以含有AN-CGC纯水溶液水化附着于容器内壁的SPC/DOTAP薄膜，控制AN/SPC质量比例为(5:1)，形成PLAN-CGC。
再按照AN/OVA＝20:1质量比例，在室温、200rpm搅拌条件下，缓慢滴加模型抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA)HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲溶液，继续搅拌20分钟，加入NaCl调为等渗，即得到OVA-PLAN-CGC亚单位疫苗。
动态光散射(DLS)检测表明：平均粒径为80纳米氢氧化铝AN，制备为OVA-PLAN-CGC平均粒径为95纳米。检测条件为25℃，水介质，90度角，仪器为Zetasizer Nano ZS90(Malvern Panalytical公司)。
采用micro-Bradford protocol方法，对于OVA进行定量测定(具体步骤见参考文献(S Zuo,P Lundahl,A micro-Bradford membrane protein assay,Anal Biochem 284(1)(2000)162-4.)，以下列公式计算包封率(载体表面结合率)AE为90％。
AE(％)＝(总OVA-游离OVA)/总OVA×100％。
制备表面结合CpG-ODN的氢氧化铝纳米粒(AN-CpG)作为对照，制备方法与前面制备AN-CGC的方法相同，只是未添加cGAMP。
按照2μg/50μL OVA剂量，通过肌肉注射给小鼠接种。3对照组小鼠按相同剂量、相同方式分别接种生理盐水(Saline)，OVA+商品传统氢氧化铝佐剂，OVA+表面结合CpG-ODN的氢氧化铝纳米粒(AN-CpG)。
接种3周后，检测实验组和对照组小鼠免疫应答反应。以ELISA检测小鼠血清抗原特异性抗体(IgG)水平，流式细胞分析检测细胞毒性T细胞(CTL,即荧光标记SIINFEKLH-I+CD8+T cell)水平，以及ELISA检测抗原再刺激免疫鼠脾细胞分泌IFN-γ水平(各参数具体检测方法见参考文献(Wang N,Zhen Y,Jin Y,Wang X,Li N,Jiang S,Wang T.Combiningdifferent types of multifunctional liposomes loaded with ammonium bicarbonateto fabricate microneedle arrays as a vaginal mucosal vaccine adjuvant-dualdelivery system(VADDS).J Control Release.2017Jan 28；246:12-29.)。检测结果如图2、3、4所显示。
图2为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG水平(n＝5)。AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-CpG，为CpG-ODN修饰氢氧化铝纳米粒；检测时血清进行1:3200倍稀释，***p<0.01。
图3为接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-Ag CTL)(n＝5)。AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-CpG，为CpG-ODN修饰氢氧化铝纳米粒；***p<0.01。
图4为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)。AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-CpG，为CpG-ODN修饰氢氧化铝纳米粒；为CpG-ODN修饰氢氧化铝纳米粒；***p<0.01。
可见，与后两对照组相比较，接种本发明的OVA-PLAN-CGC的小鼠，产生的抗原特异性抗体IgG水平分别提高了2.4倍和1.5倍，产生细胞毒性T细胞(CTL)提高了7.0倍和1.9倍，免疫小鼠脾细胞抗原再刺激分泌IFN-γ水平比例提高了5.6倍和2.4倍。可见，PLAN-CGC是强效VADS，能够显著高效诱导接种鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答。
实施例2:表面覆盖SPC/CpG-ODN/cGAMP氧化铝纳米粒VADS及其构建的亚单位疫苗
取含有平均粒径50纳米氧化铝纳米粒(AN)的纯水溶液适量(AN浓度1％，w/v)，在室温、200rpm搅拌条件下，按照AN/CpG-ODN/cGAMP＝50:5:2最终质量比，滴加含有CpG-ODN(0.2％，w/v)及2’,3’-cGAMP(0.08％，w/v)纯水溶液，继续搅拌20min，形成AN-CGC。
再按照AN/OVA质量比20:1，在室温、200rpm搅拌条件下，缓慢滴加OVA(0.025％，w/v)的HEPES缓冲溶液，继续搅拌20分钟，得到OVA-AN-CGC。
在室温、搅拌条件下，采用0.1％(PL浓度，w/v)SPC脂质体(采用薄膜分散法制备)的HEPES缓冲溶液，滴入OVA-AN-CGC水溶液，至AN/SPC质量比例为5:1，继续搅拌20分钟，形成OVA-PLAN-CGC亚单位疫苗的液体制剂。
加入蔗糖至浓度到达5％，进行冷冻干燥，得到OVA-PLAN-CGC疫苗冻干品，冷冻保藏。
取出冷冻保藏的冻干品进行实验，接种前，加入与冻干前相同体积的纯水水化，获得OVA-PLAN-CGC冻干品溶液。
将OVA-PLAN-CGC液体制剂和OVA-PLAN-CGC冻干品溶液分别按照实施例1方法进行表征，结果分析冻干前后OVA-PLAN-CGC粒径、结合率无明显变化，OVA-PLAN-CGC平均粒径约为65纳米，对于OVA结合率为100％。
按照5μg/50μL OVA剂量，通过吸入小鼠肺部黏膜接种OVA-PLAN-CGC液体制剂。3对照组小鼠接种相同剂量，生理盐水(Saline)组小鼠吸入接种；OVA+商品传统氢氧化铝佐剂组小鼠，肌肉注射接种(吸入则接种氢氧化铝凝胶阻塞气道致小鼠死亡)；OVA+表面结合CpG-ODN氧化铝纳米粒(AN-CpG)吸入接种。
接种3周后，按照实施例1方法检测实验组和对照组小鼠免疫应答反应，结果如图5、6、7所示。
图5为接种不同处方疫苗小鼠血清抗体IgG及肺灌洗液(BALF)IgA水平(n＝5)。AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-CpG，为CpG-ODN修饰氧化铝纳米粒；检测时血清IgG进行1:3200倍稀释；检测肺冲洗液IgA进行了1:400倍稀释；**p<0.05,***p<0.01。
图6为是接种不同疫苗小鼠产生的抗原特异性细胞毒性T细胞(anti-Ag CTL)(n＝5)。AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-CpG，为CpG-ODN修饰氧化铝纳米粒；***p<0.01。
图7为接种不同处方疫苗小鼠脾细胞再次接受抗原刺激产生IFN-γ水平(n＝5)。AM，为氢氧化铝佐剂(aluminum microparticles)；AN-CpG，为CpG-ODN修饰氧化铝纳米粒；***p<0.01。
可见，与两对照组(OVA+传统氢氧化铝佐剂；OVA+AN-CpG)相比，接种本发明的OVA-PLAN-CGC的小鼠，产生血清抗OVA特异性抗体IgG分别提高了2.8倍和2.1倍，肺冲洗液IgA抗体分别提高了8.7倍和2.3倍；产生CTL分别提高了5.3倍和2.1倍；免疫鼠脾细胞再次受抗原刺激产生IFN-γ，分别提高了4.2倍和2.5倍。这表明小鼠既产生了TH1/TH2混合型系统免疫，也产生了很强的粘膜免疫。
因而，PLAN-CGC制备的疫苗适于肺黏膜接种，有望能够防治通过呼吸系统入侵的病原体(如SARS-CoV-2)感染。
Claims (1)
1.一种VADS运载疫苗，其特征在于，是在磷脂、CpG-ODN及环二核苷酸共修饰的铝纳米疫苗佐剂-传递系统的分子上连接或吸附有疫苗成分；所述磷脂、CpG-ODN及环二核苷酸共修饰的铝纳米疫苗佐剂-传递系统是以铝纳米粒为载体，在铝纳米粒表面覆盖有磷脂双分子层，且由CpG-ODN及环二核苷酸分子共修饰；
所述的VADS运载疫苗的制备方法包括如下步骤：
S11、取含有平均粒径80纳米AN1的纯水溶液适量，AN1的浓度为1％w/v，在室温、200rpm搅拌条件下，按照AN1/CpG-ODN/2’,3’-cGAMP＝50:5:2的质量比，缓慢滴加CpG-ODN的浓度为0.2％w/v，2’,3’-cGAMP的浓度为0.08％w/v的纯水溶液，继续搅拌20min，形成AN1-CGC纯水溶液；
S12、按照SPC/DOTAP＝10:1的质量比取SPC和DOTAP，置于梨形玻璃瓶，加氯仿溶解，35℃旋转蒸发除去有机溶剂，形成SPC/DOTAP薄膜；
S13、以AN1-CGC纯水溶液水化附着于容器内壁的SPC/DOTAP薄膜，控制AN1与SPC的质量比为5:1，形成PLAN-CGC纯水溶液；
S14、按照AN1/OVA＝20:1的质量比，在室温、200rpm搅拌条件下，向PLAN-CGC纯水溶液中缓慢滴加OVA的HEPES缓冲溶液，继续搅拌20分钟，加入NaCl调为等渗，即得；
或者，所述的VADS运载疫苗的制备方法包括如下步骤：
S21、取含有平均粒径50纳米AN2的纯水溶液适量，AN2的浓度为1％w/v，在室温、200rpm搅拌条件下，按照AN2/CpG-ODN/2’,3’-cGAMP＝50:5:2的质量比，滴加CpG-ODN的浓度为0.2％w/v，2’,3’-cGAMP的浓度为0.08％w/v的纯水溶液，继续搅拌20min，形成AN2-CGC纯水溶液；
S22、按照AN2/OVA＝20:1的质量比，在室温、200rpm搅拌条件下，向AN2-CGC纯水溶液中缓慢滴加浓度为0.025％w/v的OVA的HEPES缓冲溶液，继续搅拌20分钟，得到OVA-AN2-CGC水溶液；
S23、在室温、搅拌条件下，向SPC脂质体的HEPES缓冲溶液中滴入OVA-AN2-CGC水溶液至AN2与SPC的质量比为5:1，所述SPC脂质体的HEPES缓冲溶液中的磷脂浓度为0.1％w/v，所述SPC脂质体采用薄膜分散法制备，继续搅拌20分钟，即得；或者进一步加入蔗糖至浓度到达5％，进行冷冻干燥，即得；
所述AN1为氢氧化铝纳米粒；所述AN2为氧化铝纳米粒；所述DOTAP为1,2-二油酰-3-三甲铵基丙烷；所述OVA为卵清蛋白；所述HEPES为羟乙基哌嗪乙硫磺酸；所述SPC为大豆卵磷脂；所述HEPES为羟乙基哌嗪乙硫磺酸；所述2’,3’-cGAMP为2’,3’-环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸；所述CpG-ODN分子的序列为：5’-TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG-3’。
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