CN111658780B - 一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体，并提供其制备方法。纳米粒通过一系列阴离子聚合物及其衍生物与铝盐复合形成氢氧化铝，在制备的过程中加入不同的抗原成分可将抗原包载。制备的疫苗可以高效地被抗原呈递细胞摄取，传递到淋巴结并诱导抗原特异性的免疫反应，具有广阔的疫苗应用前景。

Description

一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种基于阴离子聚合物及其衍生物材料的疫苗载体及其制备方法。

背景技术

疫苗接种是现代医学的伟大胜利之一，也是大多数疾病预防和根除的有效手段，用于控制多种感染性疾病甚至根除了天花。一般疫苗主要是减毒或灭活疫苗，免疫原性高但安全性低。而现在的研究主要集中于亚单位疫苗，因为其更纯净安全。但是相比减毒疫苗，安全性的提高伴随着免疫原性的降低。因此，佐剂成为疫苗中至关重要的组分，用以提升亚单位疫苗持久有效的免疫效应。使用疫苗递送载体，能够诱导有效的免疫响应和提供改善的稳定性,安全性和成本和有效性。在过去十年中，纳米级(<1000 nm)材料，如病毒样颗粒、脂质体、ISCOMS、聚合物和不可降解的纳米球，纳米粒等，作为疫苗抗原的递送载体而受到人们的关注，这种载体既可以稳定疫苗抗原，避免抗原的降解，其本身也有一定的佐剂效果，可以提高帮助抗原实现其免疫反应。

疫苗递送载体的大小会影响其分布并最终影响抗原应答。当由肌肉注射或皮下注射途径，大小为20–100 nm的粒子可穿过细胞外基质，直接进入淋巴管。而更大粒径的粒子一般被皮下的DC细胞摄取再迁移到淋巴结。后者的速度和递送抗原量远远低于前者。通过设计纳米粒的性质，可以使纳米粒直接靶向到淋巴结，被大量的免疫细胞（如DC细胞）所捕获，从而产生有效的免疫应答。

铝佐剂自从1926 年被成功地使用，可安全地给药，产生强大的免疫，因而用于多种人用疫苗。然而它不能刺激细胞内免疫反应，不能诱导Th1型免疫反应，且存在潜在的局部不良反应和超敏反应的危险，质量难控制且对佐剂的效果很难做出准确的评价。虽然铝佐剂无法有效诱导 Th1 型应答的特点限制了其应用范围，但其用于人体的安全有效性是被时间验证了的，因此我们认为构建氢氧化铝为核心的疫苗载体将会非常有潜力。

随着纳米技术的不断发展和进步，我们也将目光也投向了铝佐剂，将铝佐剂制备成纳米颗粒后，其粒径更小，比表面积急剧增大，具有表面反应，活性高、活性中心多、吸附能力强等特性，在相同铝含量的情况下，可吸附更多的抗原。

因此存在将氢氧化铝通过加入一定材料限制其聚集生长，从而制备成纳米级别颗粒用于疫苗递送的需要。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体。本发明通过一系列阴离子聚合物及其衍生物与铝盐复合形成氢氧化铝纳米粒，在制备的过程中加入不同的抗原成分可将抗原包载。制备的疫苗可以高效地被抗原呈递细胞摄取，传递到淋巴结并诱导抗原特异性的免疫反应。

氢氧化铝是一种两性化合物，其在 pH6~10 之间生成不溶于水的白色沉淀。现有技术中，通常使用高温煅烧、水热反应、反相微乳法等方法制备纳米级氢氧化铝，其反应条件剧烈，而且过程复杂繁琐，制得纳米级别的氢氧化铝易团聚，分散性能差，稳定性差，不适合于临床使用。本发明利用硫酸铝能在碱性条件生成氢氧化铝的特点，同时利用氢氧化铝带正电荷和阴离子聚合物材料带负电的特性，加入阴离子聚合物材料，使其与氢氧化铝之间通过静电作用，有效地限制氢氧化铝沉淀的聚集生长，从而制备稳定性好、易于分散的纳米级的氢氧化铝。在此制备过程中，阴离子聚合物材料是纳米氢氧化铝生成的关键。

本发明的目的之一是提供一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体，所述铝盐为硫酸铝，其中基于重量份计，阴离子聚合物材料：硫酸铝为0.06 ~4.8: 0.16-6.6。

术语“阴离子聚合物”,按本领域广义的理解,指每个分子包含多个阴离子基团的聚合材料或聚合物。它包括含有多个阴离子基团如羧基、硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、亚磷酸根及其组合的天然或者内源性，半合成衍生，或者全合成的聚合物。

术语“阴离子聚合物衍生物”包括“阴离子衍生而来的聚合物”,指以前不是阴离子聚合物,由合适的衍生化反应物转变为阴离子聚合物，或者本身是阴离子聚合物，然后进行了衍生化仍然具有阴离子特性的聚合物。衍生反应的例子有羧基的羧甲基化反应、琥珀酰化反应、或马来酰化反应，硫酸盐，磺酸盐的硫酸化反应，磺化反应，亚磺化反应，磷酸盐，磷酸盐的磷化反应，磷酰化反应。

本发明的目的之一提供一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体，其特征在于所述天然或者内源性阴离子聚合物材料包括：γ-聚谷氨酸、粘多糖，聚甘露糖醛酸，聚古罗糖醛酸，透明质酸，软骨素，肝素、角质素、海藻酸、葡聚糖、硫酸木甘露聚糖、岩藻多糖、岩藻半乳聚糖、海藻酸盐、琼脂、吉兰糖胶、印度树胶、卡拉亚胶、黄耆胶、兰胶、黄原胶、角叉菜胶的一种或多种；所述半合成衍生阴离子聚合物材料包括：硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素、交联焦糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、羧甲基壳聚糖、透明质酸衍生物、硫酸鼠李多糖、硫酸纤维素、硫酸凝胶多糖和磷酸壳聚糖的一种或多种；所述全合成阴离子聚合物材料包括：聚阴离子多肽、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬氨酸接枝聚乙二醇、聚谷氨酸接枝聚乙二醇、聚卡波菲尔、羧乙烯聚合物、马来酸酐共聚物、硫醇化聚丙烯酸酯的一种或多种。

所述的阴离子聚合物可以进行衍生化修饰，但不限于PEG，羧基，硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、亚磷酸根修饰。

所述的阴离子聚合物可以是线性聚合物，交联聚合物，或支化共聚物。

所述的阴离子聚合物可以是均聚物或者共聚物，当阴离子聚合物是均聚物时，包含单一类型的重复单元。当阴离子聚合物是共聚物时，包含两个或者更多不同的重复单元。

作为优选的实施方案，本发明选择γ-聚谷氨酸，聚谷氨酸接枝聚乙二醇和硫酸软骨素三种阴离子聚合物材料。

本发明中的γ-聚谷氨酸为生物发酵得到，分子量为1000-100000道尔顿

其结构式如下式

结构式1

本发明中的聚谷氨酸接枝聚乙二醇，聚谷氨酸单元长度50-220；接枝的聚乙二醇单元长度500-1200，聚合物的分子量在30000-70000道尔顿。

其结构式如下式

结构式2

本发明中的硫酸软骨素结构如下式

结构式3

本发明的目的之一提供一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体，其特征在于阴离子聚合物及其衍生物的铝盐纳米粒通过直接吸附作用与抗原形成疫苗。

本发明的目的之一提供一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体，其特征在于所述抗原选自：蛋白质抗原：甲型肝炎，乙型肝炎或丙型肝炎抗原、破伤风类毒素、人乳头瘤病毒、白喉毒素、霍乱毒素、百日咳毒素、乙型脑炎病毒、流感病毒、结核、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、埃博拉病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗病毒、巨细胞病毒、疟疾抗原、肺炎链球菌、侵肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、A组链球菌抗原、或者其他重组蛋白抗原；免疫原性较弱的蛋白抗原，包括：牛血清白蛋白、溶菌酶、转铁蛋白、胰岛素、乳白蛋白、肌白蛋白、豆白蛋白、麦白蛋白、肌红蛋白、胶原蛋白、纤层蛋白；多肽抗原，包括：TRP2、HGP100、p15E、E6、E7、SIINFEKL、乙肝抗原表位肽S28-39、或者其他合成的多肽抗原及含有几种多肽序列的长多肽抗原；病毒或细菌裂解液抗原、病毒或细菌外膜囊泡抗原、肿瘤细胞裂解液抗原，肿瘤细胞膜囊泡抗原、肿瘤细胞外泌体抗原或者肿瘤模式抗原鸡卵清白蛋白（OVA）的一种或多种。

本发明的目的之一提供一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体，其特征在于包载抗原的同时，纳米粒本身具有一定的佐剂作用，也可加入不同的佐剂联合进一步提高免疫反应。佐剂选自：抗原相关分子模式类佐剂：Toll样受体激动剂：肽聚糖、脂磷壁酸、MPLA、咪喹莫特、瑞喹莫特、CpG-ODN、细菌鞭毛蛋白、Poly I:C；RIG-I样受体激动剂：3pRNA 、短的双链RNA ;NOD样受体激动剂：胞壁酰二肽（MDP）、N一乙酰葡萄糖胺；C-型凝集素受体：β-葡聚糖、海藻糖二硼酸盐；STING激动剂：cGAMP；细菌毒素及其衍生物：霍乱毒素（CT）、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、霍乱毒素B亚单位；皂苷类：QS21、番茄苷、Quil-A；细胞因子：GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ、Flt-3、淋巴细胞趋化因子；其他佐剂：热激蛋白、GTP-GDP、氟化钠、烷基聚丙烯酯多聚体、二甲基双十八烷基季胺溴化物（DDA）的一种或多种。

本发明的目的之一提供一种基于阴离子聚合物及其衍生物制备的疫苗载体，其特征在于包括以下步骤：

（1）向Hepes缓冲液中加入阴离子聚合物或其衍生物材料，混合均匀

（2）将硫酸铝和含或不含抗原溶液混合均匀，加入上述溶液中

（3）涡旋、超声或者通过微量注射泵进行混合。

作为优选的实施方案，以最终纳米粒体积1ml计算：

其中步骤（1）所述的阴离子聚合物及其衍生物的量为0.12-2.4mg，

其中步骤（1）所述的Hepes缓冲液的量为18.5-185umol，

其中步骤（2）所述的硫酸铝的量为0.33-3.3mg。

根据本发明按上述步骤制备出的纳米粒粒径为30~200nm，如表一的实施例结果所示。电位为+10~-30mv，其中步骤（3）的涡旋时间为5-60s。

其中步骤（3）的超声的功率为50-300W,时间为1-30min。

本发明所述的制备方法简单迅速，条件温和，无有机试剂的加入，不会造成蛋白的变性，可以有效地保持蛋白的构象和活性。

本发明选择OVA和HBsAg作为模型抗原，通过体内外实验证明，该疫苗载体可诱导抗原特异性的体液和细胞免疫。

作为本发明优选的实施方案之一，制备的疫苗载体可被DC2.4和Raw264.7两种抗原提呈细胞高效地摄取。

作为本发明优选的实施方案之一，制备的疫苗载体的铝含量为0.105mg/ml时，与铝含量为0.35-0.62mg/ml 的商品化乙肝疫苗（重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）深圳康泰）相比，产生的抗体IgG以及IgG2a亚型更优。

有益效果

本发明的疫苗载体使用阴离子材料修饰氢氧化铝，稳定性更高，不易聚集，分散性好，更适合于临床使用。

本发明的疫苗载体粒径为30-200nm，符合淋巴结递送的要求，能够有效地靶向淋巴结，实现疫苗的靶向递送。

本发明的疫苗载体可被抗原提呈细胞高效摄取，有利于下一步免疫应答的发生。

本发明的疫苗载体可以包载不同种类的抗原，且纳米粒本身有佐剂作用，可以帮助诱导抗原特异性的免疫反应，从而产生更强的免疫效果，二者具有协同作用。

本发明的疫苗载体制备方法简单，无有机溶剂的加入，重复性好，稳定性高。

本发明的疫苗载体铝含量低，铝含量远远低于商品化铝凝胶（Alhydrogel® 2%（美国 InvivoGene 公司），可以减少金属离子蓄积的危险和局部的副作用，毒性低，提高了患者的适应性；同时在铝含量远远低于商品化铝凝胶吸附疫苗（重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）深圳康泰）的情况下，诱导的免疫反应与商品化铝凝胶的免疫反应相当或更强，具有更好的免疫效果。

相比现有技术，本发明具有以下优点：

用阴离子聚合物材料和铝盐复合形成的氢氧化铝纳米粒作为疫苗载体，扩大了可用于包载铝盐的材料的范围，提高了普适性。

用阴离子聚合物材料和铝盐复合形成的氢氧化铝纳米粒作为疫苗载体，可以在使用无PEG修饰的材料时形成稳定的纳米粒，纳米粒分散性好，稳定性高。

本发明所用的阴离子聚合物材料具有良好的生物相容性，毒性小，安全性高。例如其中的硫酸软骨素，其是一种生物相容性很好的粘多糖，广泛存在于人和动物的软骨组织，作为一种食品用于治疗骨关节炎；同时FDA批准其可以作为的皮肤代替品，在我国也已有上市的硫酸软骨素片以及硫酸软骨素注射液，其安全性远远高于合成高分子材料，且价廉易得。

本发明方法简单，且超声和注射泵的方法可用于大规模生产，有利于工业转化，具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1为γ-聚谷氨酸-纳米粒粒径图。

图2为聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg纳米粒的粒径图。

图3为硫酸软骨素-纳米粒粒径图。

图4为γ-聚谷氨酸-纳米粒电镜图。

图5为聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg纳米粒的电镜图。

图6为硫酸软骨素-纳米粒电镜图。

图7 为DC2.4和Raw264.7细胞对抗原和载抗原的γ-聚谷氨酸-纳米粒（PGA）的摄取情况。

图8 为DC2.4和Raw264.7细胞对抗原和载抗原的硫酸软骨素-纳米粒（ASN）的摄取情况。

图9为γ-聚谷氨酸-纳米粒（PGA）在淋巴结的滞留情况。

图10为γ-聚谷氨酸-纳米粒（PGA）的CTL结果。

图11为γ-聚谷氨酸-纳米粒（PGA）的免疫抗体。

图12为聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg纳米粒（PGN）的免疫抗体。

图13 为硫酸软骨素-纳米粒（ASN）的免疫抗体。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1

基于γ-聚谷氨酸材料氢氧化铝纳米粒的制备：往345μl 80mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入125μl 1mg/ml的γ-聚谷氨酸，混合均匀，吸取550μl 1.76 mmol/L的硫酸铝溶液，加入上述溶液中，超声5min,功率为120w，即得。

实施例2

基于γ-聚谷氨酸材料氢氧化铝纳米粒的制备：往360μl 100mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入120μl 8mg/ml的γ-聚谷氨酸，混合均匀，吸取555μl 17.56 mmol/L的硫酸铝溶液，加入上述溶液中，超声10min,功率为150w，即得。

实施例3

基于γ-聚谷氨酸材料氢氧化铝纳米粒-OVA的制备：往370μl 100mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入130μl 20mg/ml的γ-聚谷氨酸，混合均匀，450μl吸取2.16mmol/L的硫酸铝溶液和100μl 4mg/ml OVA溶液混合均匀，加入上述溶液中，超声8min,功率为100w，即得。

实施例4

基于γ-聚谷氨酸材料氢氧化铝纳米粒-OVA的制备：往400μl 70mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入140μl 7.5mg/ml的γ-聚谷氨酸，混合均匀，吸取460μl 1.4 mmol/L的硫酸铝溶液和100μl 1mg/ml OVA溶液混合均匀，加入上述溶液中，超声6min,功率为150w，即得。

实施例5

基于γ-聚谷氨酸材料氢氧化铝纳米粒-OVA-CpG的制备：往380μl 80mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入 110μl 10mg/ml的γ-聚谷氨酸，混合均匀，吸取500μl 2 mmol/L的硫酸铝溶液和100μl 2mg/ml OVA溶液以及10μl 2mg/ml CpG溶液混合均匀，加入上述溶液中，超声5min,功率为120w，即得。

实施例6

基于γ-聚谷氨酸材料氢氧化铝纳米粒-OVA-CpG的制备：往400μl 50mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入 100μl 5mg/ml的γ-聚谷氨酸，混合均匀，吸取560μl 1.5 mmol/L的硫酸铝溶液和50μl 4mg/ml OVA溶液以及 10 μl 500ug/ml CpG溶液混合均匀，加入上述溶液中，超声15min,功率为100w，即得。

实施例7

基于聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料氢氧化铝纳米粒的制备：往340μl 100mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入 125μl 2.5mg/ml的聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料，混合均匀，吸取560μl 1.6 mmol/L的硫酸铝溶液加入上述混合液中，涡旋30s即得。

实施例8

基于聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料氢氧化铝纳米粒的制备：往 360μl 80mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入110μl 7.5mg/ml的聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料，混合均匀，吸取555μl 2 mmol/L的硫酸铝溶液加入上述混合液中，涡旋30s即得。

实施例9

基于聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料氢氧化铝纳米粒的制备：往 350μl 100mmol/LpH为8的Hepes缓冲液中加入 100μl 10mg/ml的聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料，混合均匀，吸取500μl 5.5 mmol/L的硫酸铝溶液加入上述混合液中，涡旋30s即得。

实施例10

基于聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料氢氧化铝-HBsAg纳米粒的制备：往 345μl100mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入 110μl 10mg/ml的聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料，混合均匀，吸取300μl 6.6 mmol/L的硫酸铝溶液和 220μl 50ug/ml HBsAg溶液混合均匀，加入上述混合液中，涡旋30s即得。

实施例11

基于聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料氢氧化铝-HBsAg纳米粒的制备：往 400μl90mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入 125μl 10mg/ml的聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料，混合均匀，吸取290μl 9mmol/L的硫酸铝溶液和 200μl 400ug/ml HBsAg溶液混合均匀，加入上述混合液中，涡旋30s即得。

实施例12

基于聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料氢氧化铝-HBsAg纳米粒的制备：往 400μl100mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入 125μl 12mg/ml的聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料，混合均匀，吸取250μl 10mmol/L的硫酸铝溶液和 250μl 20ug/ml HBsAg溶液混合均匀，加入上述混合液中，涡旋30s即得。

实施例13

基于聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料氢氧化铝-HBsAg纳米粒的制备：往380μl90mmol/L pH为8的Hepes缓冲液中加入 120μl 10mg/ml的聚谷氨酸接枝聚乙二醇材料，混合均匀，吸取280μl 8mmol/L的硫酸铝溶液和 240μl 10ug/ml HBsAg溶液混合均匀，加入上述混合液中，涡旋30s即得。

实施例14

基于硫酸软骨素氢氧化铝纳米粒的制备：往 340μl 100mmol/L pH为7.6的Hepes缓冲液中加入 220μl 10mg/ml的硫酸软骨素材料，混合均匀，吸取400μl 10mmol/L的硫酸铝溶液，加入上述混合液中，涡旋30s即得。

实施例15

基于硫酸软骨素氢氧化铝纳米粒的制备：往 400μl 100mmol/L pH为7.6的Hepes缓冲液中加入 200μl 10mg/ml的硫酸软骨素材料，混合均匀，吸取380μl 10mmol/L的硫酸铝溶液，加入上述混合液中，涡旋30s即得。

实施例16

基于硫酸软骨素氢氧化铝-OVA纳米粒的制备：往 400μl 100mmol/L pH为7.6的Hepes缓冲液中加入300μl 10mg/ml的硫酸软骨素材料，混合均匀，吸取340μl 10mmol/L的硫酸铝溶液和60μl 1mg/ml的OVA溶液混合均匀，加入上述混合液中，涡旋30s即得。

实施例17

基于硫酸软骨素氢氧化铝-OVA-CpG纳米粒的制备：往 360μl 100mmol/L pH为7.6的Hepes缓冲液中加入280μl 10mg/ml的硫酸软骨素材料，混合均匀，吸取350μl 10mmol/L的硫酸铝溶液和70μl 0.85mg/ml的OVA溶液以及 20μl 2mg/ml CpG溶液混合均匀，加入上述混合液中，涡旋30s即得。

实施例18

基于硫酸软骨素氢氧化铝-OVA纳米粒的制备：往20ml 100mmol/L pH为7.8的Hepes缓冲液中加入10ml 10mg/ml的硫酸软骨素材料以及3ml的1mg/ml OVA溶液，混合均匀加入1号注射器，33ml 6.06mmol/L硫酸铝溶液加入2号注射器，两个注射器同时通过微量注射泵以20ml/min的速度通过异型三通道微流体装置，收集混合后的液体，即为纳米粒。

实施例19

基于硫酸软骨素氢氧化铝-OVA纳米粒的制备：往20ml 100mmol/L pH为7.8的Hepes缓冲液中加入10ml 10mg/ml的硫酸软骨素材料以及3ml的1mg/ml OVA溶液，混合均匀加入1号注射器，33ml 4.04mmol/L硫酸铝溶液加入2号注射器，两个注射器同时通过微量注射泵以50ml/min的速度通过异型三通道微流体装置，收集混合后的液体，即为纳米粒。

实施例20

纳米粒粒径测定：使用 Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析仪测定实施例1-19的γ-聚谷氨酸-纳米粒、聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg、硫酸软骨素-纳米粒的粒径分布，分别取1ml的实施例1-19的纳米粒溶液，将样品放入样品池内，测定温度设为 25 ˚C，其结果如表一所示，结果显示纳米粒粒径在100nm左右，PDI符合要求，分布均一。

表1 1-19实施例的粒径测定结果

实施例21

γ-聚谷氨酸-纳米粒的粒径测定：使用 Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析仪测定实施例1的γ-聚谷氨酸-纳米粒的粒径分布。取1ml的纳米粒溶液，将样品放入样品池内，测定温度设为 25 ˚C，结果如图1所示。纳米粒粒径在100nm左右，分布均一。

实施例22

聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg纳米粒的粒径测定：使用 Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析仪测定实施例11的聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg纳米粒的粒径分布。取1ml的纳米粒溶液，将样品放入样品池内，测定温度设为 25 ˚C，结果如图2所示。纳米粒粒径在100nm左右，分布均一。

实施例23

硫酸软骨素-纳米粒的粒径测定：使用 Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析仪测定实施例16的硫酸软骨素-纳米粒的粒径分布。取1ml的纳米粒溶液，将样品放入样品池内，测定温度设为 25 ˚C，结果如图3所示。纳米粒粒径在100nm左右，分布均一。

实施例24

γ-聚谷氨酸-纳米粒照透射电镜：将实施例1的γ-聚谷氨酸-纳米粒样品置于铜网上，静置5min，然后用磷钨酸染色1min，之后用滤纸吸走铜网上多余的染液，室温晾干样品，在200kv条件下，透射电镜观察样品。结果如图4所示，由实验结果可知纳米粒均为圆整的颗粒，粒径在100nm以下。

实施例25

聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg纳米粒照透射电镜：将实施例11的聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg纳米粒样品置于铜网上，静置5min，然后用磷钨酸染色1min，之后用滤纸吸走铜网上多余的染液，室温晾干样品，在200kv条件下，透射电镜观察样品。结果如图5所示，由实验结果可知纳米粒均为圆整的颗粒，粒径在100nm以下。

实施例26

硫酸软骨素-纳米粒照透射电镜：将实施例16的硫酸软骨素-纳米粒样品置于铜网上，静置5min，然后用磷钨酸染色1min，之后用滤纸吸走铜网上多余的染液，室温晾干样品，在200kv条件下，透射电镜观察样品。结果如图6所示，由实验结果可知纳米粒均为圆整的颗粒，粒径在100nm以下。

实施例27

γ-聚谷氨酸-纳米粒在DC2.4和Raw264.7细胞的摄取：在十二孔板中，每孔种入 1×10⁶个DC2.4或Raw264.7两种细胞，放入孵箱 4~6 小时，细胞贴壁后，向每孔中加入 50μlFITC标记的OVA，或用FITC标记的OVA制备的实施例1的γ-聚谷氨酸-纳米粒。37度条件下摄取 1 小时后，弃去上清液，用 PBS 轻轻冲洗细胞表面 2 次，再用胰酶消化细胞（ DC2.4直接吹打），2000rpm，3min离心洗涤细胞 2 次，最后用 400μl PBS 重悬细胞，用流式细胞仪检测。结果如图7a和7b所示，γ-聚谷氨酸-纳米粒可被抗原呈递细胞高效地摄取，在DC2.4细胞上的摄取率远远高于游离的OVA，具有显著性差异(P < 0.0001)；在Raw264.7细胞上的摄取率远远高于游离的OVA，具有显著性差异（P < 0.001），可见通过纳米粒包裹抗原显著提高了抗原的摄取效率。

实施例28

硫酸软骨素-纳米粒在DC2.4和Raw264.7细胞的摄取：在十二孔板中，每孔种入 1×10⁶个DC2.4或Raw264.7两种细胞，放入孵箱 4~6 小时，细胞贴壁后，向每孔中加入50μlFITC-OVA，或用FITC标记的OVA制备的实施例16的硫酸软骨素-纳米粒，37度条件下摄取 1小时后，弃去上清液，用 PBS 轻轻冲洗细胞表面 2 次，再用胰酶消化细胞（ DC2.4 直接吹打），2000rpm，3min离心洗涤细胞 2 次，最后用 400μl PBS 重悬细胞，用流式细胞仪检测。结果如图8a和8b所示，硫酸软骨素-纳米粒可被抗原呈递细胞高效摄取，在DC2.4细胞上的摄取率远远高于游离的OVA，具有显著性差异(P < 0.0001)；在Raw264.7细胞上的摄取率远远高于游离的OVA，具有显著性差异（P < 0.0001），可见通过纳米粒包裹抗原显著提高了免疫细胞对抗原的摄取效率。

实施例29

γ-聚谷氨酸-纳米粒在淋巴结的滞留研究：对 C57BL/6 小鼠脚掌注射 25μlFITC标记的OVA制备的实施例1的γ-聚谷氨酸-纳米粒溶液，于给药4小时和20小时后, 断颈处死小鼠，分离腘弯处淋巴结。用 1ml 注射器针头适当刺破淋巴结，置于1mg/ml D 型胶原酶溶液中 37˚C 消化 30 分钟，于细胞筛网上研磨淋巴结，得到的细胞离心洗涤 2 遍，50μl 流式染色缓冲液重悬细胞，加入 50μl 含 1μg 抗小鼠 CD11c PE 抗体的流式染色缓冲液，吹打均匀， 4˚C 染色 40 分钟，离心洗涤细胞 2 遍， 400μl PBS 重悬，流式细胞仪检测。结果如图9a所示，纳米粒在4小时就已到达淋巴结，约5% FITC阳性细胞被检测到，说明γ-聚谷氨酸-纳米粒具有淋巴结靶向能力。20小时时，淋巴结内仍能检测到约1% FITC阳性细胞，说明γ-聚谷氨酸-纳米粒在淋巴结中体现了一定的滞留能力。流式抗体对 DC 细胞特征表面分子 CD11c 的染色，从淋巴结细胞群中区分出了 DC 细胞，其中 FITC+CD11c+双阳性信号即为摄取了γ-聚谷氨酸纳米粒的 DC 细胞，如图9b所示，在淋巴结内大部分纳米粒是被DC细胞摄取的，这也为下一步的免疫应答的发生提供了有利条件。

实施例30

γ-聚谷氨酸-纳米粒的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）实验和免疫抗体检测：第0天和第7天免疫，小鼠脚掌注射25μl的实施例5的γ-聚谷氨酸-纳米粒（每只5ug OVA, 0.5ugCpG），第14天通过CFSE染色的方法检测体内CTL反应。结果如图10所示，γ-聚谷氨酸-纳米粒可以产生较强的抗原特异性细胞免疫反应，其CTL显著高于游离OVA+CpG组,具有显著性差异（P < 0.001）。

实施例31

γ-聚谷氨酸-纳米粒的免疫抗体检测：0，7，14天免疫，小鼠脚掌注射25μl的实施例5的γ-聚谷氨酸-纳米粒，（每只5ug OVA, 0.5ug CpG），第21天眼眶取血，检测血清中OVA特异性抗体。结果如图11所示，其中图11a、图11b和图11c分别是IgG、IgG1和IgG2a的抗体检测结果。由实验结果可知，γ-聚谷氨酸-纳米粒可以产生较强的抗原特异性免疫反应，IgG水平显著高于游离的OVA+CpG组，具有显著性差异（P < 0.001），表征Th1型免疫应答的IgG2a水平也显著高于游离的OVA+CpG组，具有显著性差异（P < 0.01）。

实施例32

聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg纳米粒的免疫抗体检测：第0，14，28天免疫，小鼠脚掌分别注射25μl的实施例11的聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg，其剂量按每只小鼠2ugHBsAg，35天眼眶取血，检测血清中HBsAg特异性抗体。结果如图12，其中Free代表游离抗原组，Vaccine代表市售疫苗组（重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）深圳康泰,生产批号：B201701001），PGN代表聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg纳米粒组，图12a、图12b和图12c三个图分别是IgG、IgG1和IgG2a两种亚型的抗体检测结果。由实验结果可知，聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg纳米粒可以产生较强的抗原特异性免疫反应，IgG 水平显著高于游离的抗原组（P < 0.0001）和市售疫苗组（P < 0.001）, IgG2a水平也显著高于游离抗原组（P <0.0001）和市售疫苗组（P < 0.01）；IgG1水平显著高于游离抗原组（P<0.01），和市售疫苗组相当。聚谷氨酸接枝聚乙二醇-HBsAg纳米粒能够诱导比游离抗原和市售商品化铝凝胶吸附疫苗更强的抗体水平，说明其本身具有一定的佐剂作用。

实施例33

硫酸软骨素-纳米粒的免疫抗体检测：第0、7、14天免疫，小鼠脚掌注射25μl的实施例17的硫酸软骨素-纳米粒，（每只1.5ugOVA, 1ug CpG），第21天眼眶取血，检测血清中OVA特异性抗体。结果如图13所示，其中图13a、图13b和图13c三个图分别是IgG、IgG1和IgG2a两种亚型的抗体检测结果。由实验结果可知，硫酸软骨素-纳米粒可以产生较强的抗原特异性免疫反应，IgG水平显著高于游离的OVA+CpG组，具有显著性差异（P < 0.01），IgG1和IgG2a水平也显著高于游离的OVA+CpG组（P<0.01）。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种基于阴离子聚合物及其衍生物的铝盐纳米粒疫苗载体，其特征在于使用阴离子聚合物或其衍生物材料和铝盐复合形成疫苗载体，同时包载抗原和佐剂，所述阴离子聚合物或其衍生物为硫酸软骨素、聚谷氨酸接枝聚乙二醇、γ-聚谷氨酸的一种或多种。

2.如权利要求1所述的阴离子聚合物及其衍生物的铝盐纳米粒疫苗载体，其中所述铝盐为硫酸铝，基于重量份计，阴离子聚合物材料：硫酸铝为0.06 ~4.8: 0.16-6.6。

3.如权利要求1-2任一所述的基于阴离子聚合物及其衍生物的铝盐纳米粒疫苗载体，其特征在于所述抗原选自：蛋白质抗原：甲型肝炎，乙型肝炎或丙型肝炎抗原、破伤风类毒素、人乳头瘤病毒、白喉毒素、霍乱毒素、百日咳毒素、乙型脑炎病毒、流感病毒、结核、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、埃博拉病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗病毒、巨细胞病毒、疟疾抗原、肺炎链球菌、侵肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌、霍乱弧菌、A组链球菌抗原、或者其他重组蛋白抗原；免疫原性较弱的蛋白抗原，包括：牛血清白蛋白、溶菌酶、转铁蛋白、胰岛素、乳白蛋白、肌白蛋白、豆白蛋白、麦白蛋白、肌红蛋白、胶原蛋白、纤层蛋白；多肽抗原，包括：TRP2、HGP100、p15E、E6、E7、SIINFEKL、乙肝抗原表位肽S28-39、或者其他合成的多肽抗原及含有几种多肽序列的长多肽抗原；病毒或细菌裂解液抗原、病毒或细菌外膜囊泡抗原、肿瘤细胞裂解液抗原，肿瘤细胞膜囊泡抗原、肿瘤细胞外泌体抗原或者肿瘤模式抗原鸡卵清白蛋白OVA的一种或多种。

4.如权利要求1-2任一所述的基于阴离子聚合物及其衍生物的铝盐纳米粒疫苗载体，其特征在于所述佐剂选自：抗原相关分子模式类佐剂：Toll样受体激动剂：肽聚糖、脂磷壁酸、MPLA、咪喹莫特、瑞喹莫特、CpG-ODN、细菌鞭毛蛋白、Poly I:C；RIG-I样受体激动剂：3pRNA、短的双链RNA；NOD样受体激动剂：胞壁酰二肽MDP、N一乙酰葡萄糖胺 ；C-型凝集素受体：β-葡聚糖、海藻糖二硼酸盐；STING激动剂：cGAMP；细菌毒素及其衍生物：霍乱毒素CT、大肠杆菌不耐热肠毒素LT、霍乱毒素B亚单位；皂苷类：QS21、番茄苷、Quil-A；细胞因子：GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ、Flt-3、淋巴细胞趋化因子；其他佐剂：热激蛋白、GTP-GDP、氟化钠、烷基聚丙烯酯多聚体、二甲基双十八烷基季胺溴化物DDA的一种或多种。

5.如权利要求1-4任一所述的基于阴离子聚合物及其衍生物的铝盐纳米粒疫苗载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）向Hepes缓冲液中加入阴离子聚合物或其衍生物材料，混合均匀，

（2）将铝盐硫酸铝和抗原、佐剂溶液混合均匀，加入上述溶液中，

（3）涡旋、超声或者通过微量注射泵进行混合。

6.如权利要求5所述的基于阴离子聚合物及其衍生物的铝盐纳米粒疫苗载体的制备方法，其特征在于超声的功率为50-300W,时间为1-30min。

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