CN102369242B - 包含疏水化聚氨基酸的聚离子复合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可简单制备，在生物体内显示高稳定性，且由于适当的生物体内分解性最终消失的聚离子复合物(PIC)，PIC纳米粒子，包括可简单地结合或组合和/或混合各种抗原蛋白质·肽的PIC纳米粒子的免疫疗法制剂，以及它们的制备方法。详细而言，提供一种包括含有疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽的聚离子复合物(PIC)，具有粒子形状的纳米粒子，PIC纳米粒子的免疫疗法制剂，以及一种PIC的制备方法，所述方法包括，向聚酸性氨基酸中导入疏水性氨基酸制备疏水化聚酸性氨基酸，随后，将制备的疏水化聚酸性氨基酸溶解于缓冲液中，再与溶解于缓冲液的碱性多肽进行混合的步骤。

Description

包含疏水化聚氨基酸的聚离子复合物及其用途
技术领域
本发明涉及药物传输系统(DDS)的领域。更详细而言，本发明涉及作为显示较高免疫诱导效果的载体或作为免疫疗法制剂有用的聚离子复合物以及具有粒子形状的聚离子复合物纳米粒子。
背景技术
用于最大限度发挥药物效果的药物传输系统(DDS)在医药品开发领域中必要不可或缺，用于运输药物的载体开发日益重要。利用高分子纳米集合体的载体系统，通过高分子链的精密分子设计可构建多功能性的高分子元件，作为DDS载体的应用被广泛期待。作为此处使用的高分子载体，已知有胶束，纳米凝胶粒子，纳米球体，纳米胶囊等，在这些纳米载体的制备中，利用了高分子链的分子间以及分子内的相互作用而导致的自发的集合作为粒子形成的驱动力。而且，对该白发的集合起作用的相互作用可举出疏水性相互作用，静电的相互作用，氢键，范德华力等(专利文献1～13)。
尤其是由具有相反电荷(阳离子以及阴离子)的高分子构成的聚离子复合物(以下，简称为“PIC”)以及具有粒子形状的PIC纳米粒子，具有仅以任意比例混合2种高分子即可简单制备的优点，使用了合成以及天然来源高分子的各种各样的PIC以及PIC纳米粒子被广泛报道(例如，专利文献14)。但是，由于这些PIC以及PIC纳米粒子以库仑力作为纳米粒子形成的驱动力，因此存在相对于缓冲溶液等中的高盐浓度、pH变化的稳定性较低，在生理环境下的使用受到限制的问题。
【专利文献1】日本特开2000-5296号公报
【专利文献2】日本特开2000-126585号公报
【专利文献3】日本特开2001-81237号公报
【专利文献4】日本特开2001-146556号公报
【专利文献5】日本特开2002-638号公报
【专利文献6】日本特开2004-294231号公报
【专利文献7】日本特开2004-352972号公报
【专利文献8】日本特开2005-8614号公报
【专利文献9】日本特开2006-67889号公报
【专利文献10】日本特表平05-84665号公报
【专利文献11】国际公开第06/25419号
【专利文献12】国际公开第06/90924号
【专利文献13】国际公开第08/62909号
【专利文献14】日本特开平10-77342号公报
发明内容
另一方面，用疏水化聚氨基酸制备的PIC以及PIC纳米粒子，在静电的相互作用下聚合物聚集，进而在疏水性相互作用下可形成稳定的结构，从而即使在生理环境下也可表现出功能。现有的PIC纳米粒子、高分子胶束在粒子形成后，通过将核心部(内部)以及壳部(外部)进行化学交联的方法，以达到生物体内的稳定化。
但是，这些方法存在随着交联条件的变化而PIC、PIC纳米粒子的结构、功能容易发生变化的问题。另外，考虑到在生物体内的使用，并且从生物体内分解性的观点出发，存在该交联方式受到限制的问题。
因此，需要开发一种即使在生物体内也可显示高稳定性且具有高功能性的PIC以及PIC纳米粒子。
在这种状沉下，本发明者们对即使在生物体内也可显示高稳定性且还具有适当的生物体内分解性的PIC以及PIC纳米粒子进行了专心研究，结果发现，通过将导入了疏水性氨基酸残基的具有负电荷的水溶性聚氨基酸(疏水化聚酸性氨基酸)和具有正电荷的聚氨基酸(碱性多肽)混合得到的PIC以及PIC纳米粒子满足这些要件，此外，将抗原与所述PIC纳米粒子结合或组合，而向生物体给药后，显示了很高的免疫诱导活性，从而完成了本发明。
即，本发明为，
[1]一种聚离子复合物(PIC)，所述聚离子复合物包含疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽。
[2]一种PIC，所述PIC以20∶1～1∶20(重量比)包含疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽。
[3]根据[1]或[2]所述的PIC，所述疏水化聚酸性氨基酸包含通式(I)所表示的结构单元A和通式(II)所表示的结构单元B，
式中，R1为非取代型或取代型的苯基或吲哚基；R2为直链型或支链型的碳数1～5的烷基、烯基或炔基；l＝1或2；m+n＝40～40000。
结构单元A和结构单元B的摩尔比m∶n为10∶90～90∶10。
[4]根据[1]-[3]中任意一项所述的PIC，所述碱性多肽为平均分子量1.0×103～1.0×104的聚(ε-赖氨酸)。
[5]根据[1]-[3]中任意一项所述的PIC，所述碱性多肽为精蛋白。
[6]根据[1]-[5]中任意一项所述的PIC，所述摩尔比((m)∶(n))为15∶85～85∶15。
[7]根据[1]-[6]中任意一项所述的PIC，所述PIC具有粒子形状。
[8]根据[7]所述的PIC，平均粒径为0.01μm～1μm。
[9]一种PIC的制备方法，所述方法包括：
(1)通过向聚酸性氨基酸中导入疏水性氨基酸，制备疏水化聚酸性氨基酸的步骤；
(2)将制备的疏水化聚酸性氨基酸在缓冲液中溶解，与溶解于缓冲液中的碱性多肽进行混合的步骤。
[10]根据[9]所述的制备方法，其特征在于，疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽以20∶1～1∶20(重量比)进行混合。
[11]根据[9]或[10]所述的制备方法，所述碱性多肽为平均分子量1.0×103～1.0×104的聚(ε-赖氨酸)。
[12]根据[9]或[10]所述的制备方法，所述碱性多肽为精蛋白。
[13]根据[9]-[12]中任意一项所述的制备方法，其特征在于，疏水化聚酸性氨基酸中的疏水性氨基酸的未导入聚酸性氨基酸以通式(I)表示：
导入了疏水性氨基酸的聚酸性氨基酸以通式(II)表示：
[式中，R1为非取代型或取代型的苯基或吲哚基；
R2为直链型或支链型的具有碳数1～5的烷基，烯基或炔基；l＝1或2；m+n＝40～40,000]
摩尔比((m)∶(n))为15∶85～85∶15。
[14]根据[9]-[13]中任意一项所述的制备方法，其特征在于，不使用有机溶剂。
[15]根据[9]-[14]中任意一项所述的制备方法，其特征在于，制备的PIC具有粒子形状。
[16]根据[15]所述的制备方法，其特征在于，平均粒径为0.01μm～1μm。
[17]一种免疫疗法制剂，所述免疫疗法制剂包括结合或组合和/或混合了抗原的[7]或[8]所述的PIC。
[18]根据[17]所述的免疫疗法制剂，所述制剂可惹起体液免疫以及细胞性免疫。
[19]根据[17]或[18]所述的免疫疗法制剂，所述抗原为卵白蛋白。
[20]根据[17]或[18]所述的免疫疗法制剂，所述抗原为流感·血球凝集素。
[21]一种免疫疗法制剂的制备方法，其特征在于，将抗原与[7]或[8]所述的PIC结合或组合和/或混合。
[22]根据[21]所述的免疫疗法制剂的制备方法，所述抗原为卵白蛋白。
[23]根据[21]所述的免疫疗法制剂的制备方法，所述抗原为流感·血球凝集素。
根据本发明可提供一种能够简单制备，在生物体内显示高稳定性，且由于适当的生物体内分解性最终消失的PIC以及PIC纳米粒子。另外，根据本发明还可提供一种包括可简单地结合或组合和/或混合各种抗原蛋白质·肽的PIC以及PIC纳米粒子的、针对感染症·癌·自身免疫疾病等的免疫疗法制剂。
附图说明
图1是本发明的PIC纳米粒子的扫描电子显微镜(SEM)照片。
图2是表示本发明的PIC纳米粒子的经时稳定性图。
图3是表示本发明的卵白蛋白-结合PIC纳米粒子的细胞性免疫诱导效果图。
图4是表示本发明的卵白蛋白-结合PIC纳米粒子的细胞性免疫诱导效果图。
图5A是表示基于本发明的卵白蛋白-结合PIC纳米粒子而获得的细胞性免疫活化效果图(PBS)。
图5B是表示基于本发明的卵白蛋白-结合PIC纳米粒子而获得的细胞性免疫活化效果图(卵白蛋白)。
图5C是表示基于本发明的卵白蛋白-结合PIC纳米粒子而获得的细胞性免疫活化效果图(卵白蛋白-结合PIC纳米粒子)。
图5D是表示基于本发明的卵白蛋白-结合PIC纳米粒子而获得的细胞性免疫活化效果图(卵白蛋白以及氢氧化铝)。
图6是表示在改变碱性多肽的情况下的本发明的PIC纳米粒子的细胞性免疫诱导效果图。
图7A是表示在改变碱性多肽的情况下的本发明的PIC纳米粒子的细胞性免疫活化效果图(PBS)。
图7B是表示在改变碱性多肽的情况下的本发明的PIC纳米粒子的细胞性免疫活化效果图(使用了ε-PL的PIC纳米粒子1倍浓度)。
图7C是表示在改变碱性多肽的情况下的本发明的PIC纳米粒子的细胞性免疫活化效果图(使用了ε-PL的PIC纳米粒子1/10倍浓度)。
图7D是表示在改变碱性多肽的情况下的本发明的PIC纳米粒子的细胞性免疫活化效果图(使用了精蛋白的PIC纳米粒子1倍浓度)。
图7E是表示在改变碱性多肽的情况下的本发明的PIC纳米粒子的细胞性免疫活化效果图(使用了精蛋白的PIC纳米粒子1/10倍浓度)。
图8是表示基于本发明的卵白蛋白-结合PIC纳米粒子而获得的体液免疫活化效果图。
图9是表示基于本发明的PIC纳米粒子而获得的的对流感(A/广岛株)血球凝集素(HA)的抗体效价升高效果图。
图10是表示基于本发明的PIC纳米粒子而获得的对流感(A/所罗门株)HA的抗体效价升高效果图。
图11是表示基于本发明的PIC纳米粒子而获得的对流感(B/马来西亚株)HA的抗体效价升高效果图。
图12是表示基于本发明的PIC纳米粒子而获得的对各种流感株HA混合物的细胞性免疫活化效果图。
具体实施方式
在第1实施方式中，本发明提供一种包含疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽的聚离子复合物(PIC)。
在本发明中使用的疏水化聚酸性氨基酸包含通式(I)所表示的结构单元A和通式(II)所表示的结构单元B，
[式中，R1为非取代型或取代型的苯基或吲哚基；
R2为直链型或支链型的具有碳数1～5的烷基、烯基或炔基；l＝1或2；m+n＝40～40,000]，
结构单元(A)和结构单元(B)的摩尔比((m)∶(n))为10∶90～90∶10。另外，一般而言，也可是将聚酸性氨基酸的羧基，部分地与芳香族氨基酸的烷基、烯基或炔基酯的氨基形成酰胺键而得到的化合物，所述聚酸性氨基酸为将pKa为约7以下，优选为约6以下，更优选为约4以下的酸性氨基酸进行聚合得到的。作为此处使用的酸性氨基酸，例如可举出谷氨酸、天冬酰胺酸或它们的衍生物，聚酸性氨基酸可以是其中1种聚合而成的，也可是它们中的2种以上的无规共聚物、交替共聚物、周期性共聚物或嵌段共聚物，优选为仅由谷氨酸聚合的微生物来源的聚(γ-谷氨酸)。聚酸性氨基酸的聚合度通常为约40～40,000，优选为约400～15,000，更优选为约800～8,000，最优选为约1,500～6,000，平均分子量通常为约5.0×103～5.0×106，优选为约5.0×104～2.0×106，更优选为约1.0×105～1.0×106，最优选为约2.0×105～8.0×105。另外，作为与得到的聚酸性氨基酸结合的芳香族氨基酸酯的例子，可举出苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或它们的衍生物的直链型或支链型的碳数1～5的烷基、烯基或炔基酯，可将它们中的1种以上与聚酸性氨基酸的羧基形成酰胺键。聚酸性氨基酸的结构单元(A)和结构单元(B)的摩尔比((m)∶(n))通常为约10∶90～90∶10，优选为约15∶85～85∶15，更优选为约20∶80～80∶20，更优选为约30∶70～80∶20，最优选为约45∶55～80∶20。
另外，酸性氨基酸的聚合方法，芳香族氨基酸的酯化方法，向聚酸性氨基酸中导入芳香族氨基酸酯的方法，控制聚合度、导入率的方法等可根据本技术领域中公知的方法进行。
作为本发明中使用的碱性多肽，可通过将pKa为约7以上，优选为约7.5以上，更优选为约8以上的碱性氨基酸进行聚合，或以天然多肽的形式得到。作为此处使用的碱性氨基酸，例如可举出赖氨酸、羟基赖氨酸、精氨酸、组氨酸或者它们的衍生物，碱性多肽可以是它们中的1种聚合而成的，也可以是它们的2种以上的无规共聚物、交替共聚物、周期性共聚物或嵌段共聚物，优选为仅由赖氨酸聚合的微生物来源的聚(ε-赖氨酸)。另外，作为天然的碱性多肽，包括精蛋白。碱性多肽的聚合度通常为约8～80，优选为约10～70，更优选为约20～60，最优选为约30～50，平均分子量通常为约1.0×103～1.0×104，优选为约1.3×103～9.0×103，更优选为约2.5×103～7.5×103，最优选为约3.8×103～6.4×103。
本发明所述的PIC仅通过将上述的疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽溶解于纯水、生理盐水以及缓冲液中，并进行混合即可容易地制备。另外，在一优选的实施方式中，PIC为具有粒子形状的PIC纳米粒子，所述PIC纳米粒子也包括在本发明的范围中。使用的缓冲液，只要可使上述的疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽不发生改性地均一溶解即可，并无特别限制，例如可举出pH6～8.5的磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。PIC以及PIC纳米粒子可通过在这样相同或相异的缓冲液中分别溶解疏水化聚酸性氨基酸以及碱性多肽，在常温下混合而进行制备。混合各溶液的比率可为等量。混合的疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽的比率(疏水化聚酸性氨基酸∶碱性多肽)以重量比计通常为约20∶1～1∶20，优选为约10∶1～1∶10，更优选为约8∶1～1∶8，最优选为约6∶1～1∶6至约6∶1～1∶1，特别最优选为约6∶1～3∶1。另外，在一种实施方式中，本发明的PIC以及PIC纳米粒子的制备可在不使用有机溶剂下进行。
本发明所述的PIC纳米粒子的粒径的平均粒径通常为约0.01～1μm，优选为约0.02～0.8μm，更优选为约0.05～0.6μm，最优选为约0.1～0.4μm。当PIC纳米粒子的粒径低于0.01μm时，作为抗原载体的能力下降，另一方面，当超过1μm时佐剂活性下降，因而不优选。
PIC纳米粒子的平均粒径可通过改变疏水化聚酸性氨基酸链中的疏水性氨基酸残基的比例和/或疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽的分子量以及它们的混合比率而进行控制。生成的PIC纳米粒子的平均粒径可通过动态光散射(DLS)法进行测定。
另外，在第2实施方式中，本发明提供一种包括将上述那样得到的PIC纳米粒子与抗原结合或组合而制备的抗原-结合PIC纳米粒子的免疫疗法制剂。在本发明的免疫疗法制剂中，作为抗原的载体以及佐剂，使用的是上述那样得到的PIC纳米粒子，其最终由生物体内的分解酵分解代谢，而成为无毒化或低毒化。另一方面，作为抗原，虽无特别限定，但例如可举出卵白蛋白等食品中含有的蛋白质抗原、恶性肿瘤抗原、病原性的病毒或细菌等的病原体抗原等，作为恶性肿瘤，包括乳癌、肺癌、胃癌、大肠癌、肝脏癌、卵巢癌、膀胱癌、白血病、恶性黑色素瘤等，作为病原体，可举出成人T细胞白血病病毒、肝炎病毒、人后天性免疫缺陷综合症(AIDS)病毒(HIV)、流感病毒、日本脑炎病毒等。
另外，适当变更PIC纳米粒子的材料、构成比率、分子量、平均粒径、其他参数，可控制抗原的放出速度以及放出时间、PIC纳米粒子自身在生物体内的消失速度。这样的PIC纳米粒子以及抗原的制备方法为本技术领域中公知的。例如，通过控制构成PIC纳米粒子的疏水化聚酸性氨基酸以及碱性多肽的分子量或聚合度，导入疏水基团的种类以及疏水基团的导入率，结合或组合抗原的方式，结合或组合的浓度以及部位以及PIC纳米粒子的平均粒径、粒度分布、形状等，可制备缓释性的免疫疗法制剂。另外，例如，将可被在特定的器官或部位上局部存在的酶分解的键，导入PIC纳米粒子和抗原的键中或者PIC纳米粒子中，可设计成在特定的器官或部位上放出抗原。
本发明所述的免疫疗法制剂可包括，结合或组合了抗原的PIC纳米粒子以及赋形剂或载体，以及根据需要使用的悬浊剂、等渗剂、防腐剂等其他成分。作为赋形剂或载体，只要是向生物体给药后无恶劣影响即可，并无特别限定，例如可举出：水、乙醇或甘油等水性介质，或者脂肪酸、脂肪酸酯等油类非水性介质。另外，本发明所述的免疫疗法制剂的剂形可为任意形式，可根据对象的状态、疾病的种类等条件进行适当选择。例如，可做成溶液剂、悬浊剂、乳化剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂。或者，还可将冷冻干燥的免疫疗法制剂在使用前溶解或悬浊于适当的赋形剂或载体中使用。
另外，在第3实施方式中，本发明提供一种含有混合了抗原和PIC纳米粒子的免疫疗法制剂。在该实施方式中，除了将抗原与PIC纳米粒子结合或组合，替代为混合含有以外，免疫疗法制剂中使用的抗原、PIC纳米粒子和其他的配合成分以及剂型，与上述的包括抗原结合PIC纳米粒子的免疫疗法制剂的情况相同。
本发明所述免疫疗法制剂对于其给药方法、给药路径以及给药次数并无特别限定，可根据剂型、对象的状态、疾病的种类等因素进行适当选择。例如，本发明的免疫疗法制剂可通过注射、输液等进行非口服给药，也可进行口服给药。
如上所述，本发明所述的免疫疗法制剂可以各种疾病的予防和治疗为目的向对象进行给药。因此，在其他实施方式中，本发明还提供PIC纳米粒子作为免疫疗法制剂的使用以及用于免疫疗法制剂的制备的PIC纳米粒子的使用方法。另外，在其他的实施方式中，本发明还提供一种对象的疾病的治疗或予防方法，其特征在于，向对象给予包括结合或组合了抗原的PIC纳米粒子的免疫疗法制剂。
另外，在第4实施方式中，本发明提供一种上述PIC以及PIC纳米粒子的制备方法。
本发明所述PIC以及PIC纳米粒子的制备方法包括：水溶性的疏水化聚酸性氨基酸的制备步骤，以及将这些疏水化聚酸性氨基酸水溶液与碱性多肽水溶液的混合步骤。疏水化聚酸性氨基酸的制备可使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(WSC)、1-环己基-3-[2-(4-甲基吗啉基)乙基]碳二亚胺-p-甲苯磺酸盐等脱水缩合剂，将聚酸性氨基酸的羧基与芳香族氨基酸酯的氨基形成酰胺键，疏水性氨基酸相对于聚酸性氨基酸的导入率可通过适当改变脱水缩合剂的浓度、芳香族氨基酸酯的浓度、反应时间等的反应条件而进行调节。
以下以实施例对本发明进一步进行详细具体地说明，但本发明并不受这些实施例的限定。另外，在实施例中，聚(γ-谷氨酸)简称为γ-PGA、聚(ε-赖氨酸)简称为为ε-PL。
实施例
制备例1
疏水化聚氨基酸的制备
将607mg微生物(Bacillus subtilis)来源的γ-PGA(明治制果(株)，分子量3.8×105，pKa＝2.3)均一地溶解在100ml的50mM碳酸氢钠水溶液中。向该溶液中添加225～901mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(WSC)、1080mg的L-苯基丙氨酸乙酯(PheE)，在冰冷却下反应1小时，然后在室温下反应24小时。反应后，将生成的溶液用透析膜(分子量分级50000)在水中进行3天透析，然后进行冷冻干燥。再将获得的冷冻干燥物添加入100ml乙醇中，搅拌过夜。将生成的溶液进行离心分离(1500×g，20分钟)，减压干燥沉淀物，得到疏水化γ-PGA。PheE向γ-PGA中的导入量通过改变WSC浓度的方式进行调节。这样制备的疏水化γ-PGA的PheE导入率通过1H-NMR进行了测定，结果，PheE导入率分别为16％、28％、36％以及49％(以下分别简称为γ-PGA-PheE-16、-28、-36以及-49)。
制备例2
聚离子复合物(PIC)纳米粒子的制备
将上述这样制备的各种疏水化γ-PGA(γ-PGA-PheE-16、-28以及-49)或未修饰γ-PGA(明治制果(株)，分子量3.8×105，pKa＝2.3)和微生物(Streptomyces albulus 346)来源的ε-PL(chisso(チツソ)(株)、分子量4.7×103)，分别以各最终浓度10mg/ml以及0～5mg/ml溶解于25℃的PBS(pH 7.4)中，再将它们等量混合。通过动态光散射法(机器名，ZetasizerNano ZS，Malvern公司)测定刚混合后的平均粒径以及粒度分布，与此同时用扫描电子显微镜观察了粒子的状态。其结果在表1以及图1中示出。
【表1】
aγ-PGA以及γ-PGA-PheE溶解在PBS中(10mg/mL)，将该溶液添加到等量的ε-PL溶液中。
b未测定。
如表1以及图1所示，刚混合后形成了纳米粒子。可认为随着ε-PL浓度升高，生成的粒子粒径有增大的倾向，通过与ε-PL浓度进行组合，疏水化聚氨基酸的疏水性基团的导入率变化也影响粒径的大小。即，显示了通过改变疏水化聚酸性氨基酸中的疏水性基团的导入率以及疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽的混合比率，可控制本发明的PIC纳米粒子的粒径。
实施例1
PIC纳米粒子的稳定性
随后，测定了上述这样形成的PIC纳米粒子的稳定性。将以各种比例导入了疏水基团的γ-PGA-PheE-16、-28或-49(10mg/mL)以及ε-PL(2mg/mL)分别溶解在1ml的PBS(pH7.4)中，等量混合后，在4℃下静置，用动态光散射法(机器名，Zatasizer Nano ZS，Malvern公司)测定了经时变化的平均粒径。其结果在图2中示出。
如图2所示，在疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽以一定的比例混合的情况下，当使用γ-PGA-PheE-16时，观察到1天后粒子的崩解以及凝集，通过动态光散射法未观察到单分散的峰。另一方面，当使用γ-PGA-PheE-28时，虽然由于粒子的膨润而观察到粒径的增加，但制备后3天中维持了单分散。另外，当使用γ-PGF-PheE-49时显示了较高的稳定性，制备后3天中未观察到大的粒径变化。这种高稳定性是起因于粒子内部的PheE基团导致的疏水性区域的形成。
实施例2
抗原-结合PIC纳米粒子的免疫诱导效果
抗原-结合PIC纳米粒子的制备
制备γ-PGA-PheE-36 10mg/ml、ε-PL 4mg/ml以及卵白蛋白(OVA)2mg/ml的PBS溶液。首先，将各250μl的ε-PL和OVA溶液进行等量混合，制作ε-PL+OVA混合溶液(ε-PL 2mg/ml+OVA 1mg/ml in PBS，500μl)。向该溶液中加入500μl的γ-PGA-PheE-36溶液进行混合，制备了OVA-结合PIC纳米粒子(OVA-PIC NP)。OVA-PIC NP的粒径为213nm。
PIC纳米粒子的免疫诱导效果
随后，对这样制备的OVA结合PIC纳米粒子(OVA-PIC NP)的免疫诱导效果进行了评价。将仅PBS、仅溶解于PBS的OVA(0.5mg/ml)、仅添加了OVA(0.5mg/ml)的弗氏完全佐剂(CFA)或仅OVA-PIC NP(OVA：0.5mg/ml，γ-PGA-PheE-36：5mg/ml，ε-PL：1mg/ml)，在6周的C57BL/6小鼠的皮下以1周的间隔进行了2次免疫(各0.2mL接种)。从最终免疫开始1周后，从小鼠中取出脾脏。对于脾细胞中OVA特异性的CD8+T细胞(细胞性免疫)的存在，使用H-2kb/SIINFEKL(OVA257-264肽)-Pro5 MHC Pentamer(Prolmmune公司)以及FITC标记抗-CD8+抗体进行染色，并通过流式细胞仪进行了分析。其结果在图3中示出。
如图3所示，在仅PBS、仅OVA以及OVA+CFA免疫的动物组中几乎未观察到细胞性免疫的诱导，于此相对，在OVA-PIC NP免疫的动物组中确认了非常高的免疫诱导效果。
根据以上的结果可知，由于OVA-PIC NP在生物体内显示了很高的稳定性，向抗原递呈细胞高效地传输抗原，因而显示了优良的免疫诱导效果。
实施例3
另外，在实施例2中，替代γ-PGA-PheE-36使用了新制备的γ-PGA-PheE-40，替代弗氏完全佐剂(CFA)使用了氢氧化铝(Alum)，除此之外依照实施例2的方法，评价了OVA-PIC NP的免疫诱导效果。其结果在图4中示出。
如图4所示，在仅PBS、仅OVA以及OVA+Alum免疫的动物组中，几乎未观察到细胞性免疫的诱导，与此相对，在OVA-PIC NP免疫的动物组中确认了非常高的免疫诱导效果。
从这些实施例2以及实施例3的结果可知，由于OVA-PIC NP在生物体内显示了很高的稳定性，向抗原递呈细胞高效地传输了抗原，因而显示了超过现有佐剂的优良的细胞性免疫诱导效果。
实施例4
随后，将实施例2中从小鼠脾脏取出的脾细胞用细胞伤害性T细胞表位肽(10μg/ml)进行刺激，根据ELISPOT法测定了占全部CD8+T细胞的干扰素(IFN)-γ以及肿瘤坏死因子(TNF)-α的产生细胞数。其结果在图5A-D中示出。
如图5A-D所示，在仅PBS、仅OVA以及OVA+Alum免疫的动物组中几乎观察不到产生IFN-γ以及TNF-α的细胞，与此相对，在OVA-PIC NP免疫的动物组中观察到高比例的细胞因子产生细胞(各图右上部的数值表示占全部CD8+T细胞的细胞因子产生细胞的比例)。
从该结果可知，根据本发明的PIC NP，实施例3所示的抗原特异性CD8+T细胞实际上被活化，其显示了超过现有佐剂的优良的细胞性免疫活化效果。
实施例5
抗原-结合PIC纳米粒子的制备
制备了γ-PGA-PheE-40 10mg/ml、ε-PL或精蛋白4mg/ml以及卵白蛋白(OVA)2mg/ml的PBS溶液。将各250μl的ε-PL或精蛋白溶液和OVA溶液进行等量混合，制作ε-PL或精蛋白+OVA混合溶液(ε-PL或精蛋白2mg/ml+OVA 2mg/ml in PBS，500μl)。向这些溶液中加入500μl的γ-PGA-PheE-40PBS溶液进行混合，制备了OVA-结合PIC纳米粒子(OVA-PIC NP)。OVA-PIC NPε-PL以及OVA-PIC NP精蛋白的粒径分别为220以及187nm。另外，稀释溶液的调整用PBS进行。
PIC纳米粒子的免疫诱导效果
随后，对这样制备的OVA结合PIC纳米粒子(OVA-PIC NP)的细胞性免疫诱导效果进行了评价。将仅PBS 100μl，或OVA-PIC NP(OVA：0.5mg/ml，γ-PGA-PheE-40：5mg/ml，ε-PL或精蛋：1mg/ml)200μl，或OVA-PIC NP(OVA：0.1mg/ml，γ-PGA-PheE-40：1mg/ml，ε-PL或精蛋白：0.2mg/ml)100μl，在6周的C57BL/6小鼠的皮下以1周的间隔进行2次免疫。最终免疫1周后从小鼠中取出脾脏，对于脾细胞中的OVA特异性的CD8+T细胞(细胞性免疫)的存在，使用H-2kb/SIINFEKL(OVA 257-264肽)-Pro5 MHC Pentamer(Prolmmune公司)以及FITC标记抗-CD8+T抗体进行染色，并通过流式细胞仪进行分析。其结果在图6中示出。
如图6所示，在仅PBS免疫的动物组中，几乎观察不到细胞性免疫的诱导，与此相对，在使用精蛋白制备的OVA-PIC NP免疫的动物组中，确认了超过用ε-PL制备的OVA-PIC NP免疫的动物组的非常高的细胞性免疫诱导效果。
根据以上的结果可知，不仅ε-PL，而且用精蛋白制备的OVA-PIC NP在生物体内也显示了很高的稳定性，向抗原递呈细胞高效地传输了抗原，显示了优良的细胞性免疫诱导效果。
实施例6
随后，将实施例5中从小鼠脾脏取出的脾细胞用细胞伤害性T细胞表位肽(10μg/ml)进行刺激，通过ELISPOT法测定了占全部细胞的干扰素(IFN)-γ以及肿瘤坏死因子(TNF)-α的产生细胞数。其结果在图7A-E中示出。
如图7A-E所示，在仅以PBS免疫的动物组中几乎观察不到产生IFN-γ以及TNF-α的细胞，与此相对，在用精蛋白制备的OVA-PIC NP免疫的动物组中，观察到超过用ε-PL制备的OVA-PIC NP免疫的动物组的非常高的细胞性免疫活化效果(各图右上部的数值表示占全部CD8+T细胞的细胞因子产生细胞的比例)。
从该结果可知，不仅ε-PL，而且用精蛋白制备的本发明的PIC NP也可将抗原特异性的CD8+T细胞实际上活化，显示了超出现有佐剂的优良的细胞性免疫活化效果。
实施例7
另外，从实施例5的小鼠中取出血清，通过ELISA法测定了产生的OVA特异性的免疫球蛋白IgG的抗体效价。其结果在图8中示出。
如图8所示，在仅以PBS免疫的动物组中只观察到低抗原特异性的抗体效价，但在以用ε-PL或精蛋白制备的本发明的PIC NP免疫的动物组中，观察到很高的OVA特异性的IgG抗体效价。
从该结果可知，在以本发明的PIC NP免疫的动物中以高抗体效价生成了抗原特异性的抗体，不仅显示了细胞性免疫，还显示了诱导体液免疫的效果。
实施例8
对流感抗原的体液免疫以及细胞性免疫的诱导性
将有精卵(受精卵)在孵卵机内，38～39℃下进行保温约11天，确认胚的发生后，在卵壳上开注射针通过大小的孔，从该处向浆尿液中直接注入为疫苗制造株的流感病毒(A/广岛株(H3N2)，A/所罗门群岛株(H1N1)以及B/马来西亚株)，将该孔封上，再度放回孵卵机中，在32～36℃下，进行了3天保温。然后，将病毒接种卵在冰箱放置过夜，切取卵壳，无菌地采取浆尿液。将采取液中的血液等混入物除去后，通过用区带离心机的蔗糖密度梯度离心法，浓缩精制病毒粒子。将该流感病毒浮游液进行醚处理，然后添加福尔马林。
在生物学的制剂基准(日本厚生劳动省)的流感HA疫苗中记载的效价试验法中，依照一元放射免疫扩散试验法，测定了以上这样制备的3株流感HA抗原量，将其作为流感HA抗原液。
制备的3株流感HA抗原的HA抗原含量，A/广岛株为502.4μg/ml，A/所罗门群岛株为1262.5μg/ml，B/马来西亚株为611.0μg/ml。
对小鼠的免疫方法
将4周(BALB/c，雌)分为以下的6组(一组4只)，各组中以下述成分单独或混合地对每只小鼠以100μl进行皮下免疫。
第一组：PBS给药组
第二组：HA抗原单独免疫组(各株0.3μg/小鼠)
第三组：HA抗原(各株0.3μg/小鼠)+Imject Alum(100μg/小鼠，PIERCE公司)免疫组
第四组：HA抗原(各株0.3μg/小鼠)+γ-PGA NP(100μg/小鼠)免疫组
第五组：HA抗原(各株0.3μg/小鼠)+PIC NP(100μg/小鼠)免疫组
第六组：HA抗原(各株0.3μg/小鼠)+弗氏佐剂(GERBU公司，50μl/小鼠)免疫组
另外，对于弗氏佐剂而言，初次免疫时使用完全佐剂，第二次免疫时使用不完全佐剂。
免疫以1周间隔进行2次，第二次免疫一周后采取血液，对血中的IgG以及HI抗体效价进行了评价。A/广岛株，A/所罗门群岛株，B/马来西亚株的结果在各图9至11中示出。
如图9至11所示，与卵白蛋白(OVA)作为抗原使用的前述实验结果相同，对于全部的不同病毒株的HA抗原，观察到PIC NP具有与Alum同等以上的佐剂活性。
从该结果可知，在本发明的以PIC NP免疫的动物中，生成了高抗体效价的抗原特异性的抗体，具有对流感抗原的体液免疫诱导活性。
另外，将第二次免疫一周后从小鼠采取的脾细胞，以5×105细胞/100μl/孔的密度在孔中播种，使用ELISpotPLUS for Mouse Interferon-γ试剂盒(MABTECH公司)，将PBS、流感HA抗原(A/HI、A/SI、B/MA的3株混合物)、卵白蛋白(OVA，Sigma公司，A2512-250MG，GradeIV)以30ng/ml的浓度进行添加，依照试剂盒的说明书进行约38小时培养后，测定了脾脏细胞的IFN-γ产生细胞数(各个体的各刺激抗原以3孔的平均值进行评价)。其结果在图12中示出。
如图12所示，γ-PGA NP显示不能诱导高细胞性免疫。另一方面，PIC NP显示了具有与弗氏佐剂同等以上的细胞性免疫的活化效果。
从这些结果可知，本发明的PIC NP对流感HA抗原也显示了高免疫诱导效果以及活化效果，显示了本发明的聚离子复合物以及聚离子复合物纳米粒子作为载体或免疫疗法制剂非常有用。
产业上的可利用性
本发明的聚离子复合物以及聚离子复合物纳米粒子具有提高对各种抗原的生物体的细胞性免疫以及体液免疫的两方面的效果，可作为免疫佐剂而用于医疗领域乃至医药领域中。

Claims (7)

1.一种免疫疗法制剂，其包括结合或组合和/或混合了抗原的聚离子复合物PIC，
所述聚离子复合物以20：1～1：20的重量比包含疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽，
所述疏水化聚酸性氨基酸包含通式（I）所表示的结构单元A和通式（II）所表示的结构单元B，
通式（I）
通式（II）
式中，R1为非取代型或取代型的苯基或吲哚基；
R2为直链型或支链型的碳数1～5的烷基、烯基或炔基；l=1或2；m+n=40～40000，
结构单元A和结构单元B的摩尔比m：n为10：90～90：10，
所述聚离子复合物具有粒子形状，并且其平均粒径为0.01μm～1μm。
2.根据权利要求1所述的免疫疗法制剂，
所述制剂可惹起体液免疫以及细胞性免疫。
3.根据权利要求1或2所述的免疫疗法制剂，
所述抗原为卵白蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的免疫疗法制剂，
所述抗原为流感·血球凝集素。
5.一种免疫疗法制剂的制备方法，其特征在于，
将抗原与聚离子复合物结合或组合和/或混合，
所述聚离子复合物以20：1～1：20的重量比包含疏水化聚酸性氨基酸和碱性多肽，
所述疏水化聚酸性氨基酸包含通式（I）所表示的结构单元A和通式（II）所表示的结构单元B，
通式（I）
通式（II）
式中，R1为非取代型或取代型的苯基或吲哚基；
R2为直链型或支链型的碳数1～5的烷基、烯基或炔基；l=1或2；m+n=40～40000，
结构单元A和结构单元B的摩尔比m：n为10：90～90：10。
6.根据权利要求5所述的免疫疗法制剂的制备方法，
所述抗原为卵白蛋白。
7.根据权利要求5所述的免疫疗法制剂的制备方法，
所述抗原为流感·血球凝集素。
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"Protein direct delivery to dendritic cells using nanoparticles based on amphiphilic poly(amino acid) derivatives";Akagi,Takami et al;《BIOMATERIALS》;20070831;第28卷(第23期);第3428页第2.1节，第3430页3.1节，图1 *
Akagi,Takami et al."Protein direct delivery to dendritic cells using nanoparticles based on amphiphilic poly(amino acid) derivatives".《BIOMATERIALS》.2007,第28卷(第23期),第3428页第2.1节，第3430页3.1节，图1.
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