CN108368260B - 含有角鲨烯的基于两亲性聚氨基酸聚合物的疫苗佐剂组合物 - Google Patents

含有角鲨烯的基于两亲性聚氨基酸聚合物的疫苗佐剂组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种佐剂组合物及其制备方法，所述组合物包括含有两亲性聚氨基酸聚合物的水包油乳剂型的两亲性聚合物颗粒。本发明的佐剂组合物使用两亲性聚氨基酸聚合物，所以它能够提供更具生物相容性且具有高抗体滴度的疫苗佐剂组合物。

Description

含有角鲨烯的基于两亲性聚氨基酸聚合物的疫苗佐剂组合物
技术领域
本发明涉及两亲性聚氨基酸聚合物、包括含有该聚合物的乳剂颗粒的免疫佐剂组合物、包括抗原和所述聚合物乳剂颗粒的疫苗组合物及它们的制备方法。
背景技术
佐剂可用于通过增加其抗原性用于疫苗开发，或通过增加其对抗原的非特异性免疫应答用于疾病的治疗和预防。由于免疫佐剂可以在抗原量较小时快速且强烈地维持对抗原的免疫应答长的时间，所以它们用于疫苗生产。另外，通过使用特异性免疫佐剂或改变抗原的量，可以控制免疫应答、抗原特异性抗体或其亚型的类型等。通过使用免疫佐剂，可以增加疫苗的功效并且可以实现针对各种病毒感染的保护。随着疫苗的发展，这种免疫佐剂的开发正在加速，并且随着免疫相关疾病范围的扩大，新免疫佐剂的开发被认为是有前景的。
然而，现有免疫佐剂中使用的表面活性剂具有诸如生物相容性相对较低和稳定性差的问题。因此，为了解决这些问题，需要开发更具生物相容性和稳定性的免疫佐剂。
发明内容
技术问题
因此，鉴于上述问题而提出了本发明，并且本发明的一个目的是提供具有生物相容性并表现出高抗体滴度的免疫佐剂组合物和疫苗组合物，以及其制备方法。
技术方案
根据本发明的一个方面，上述和其它目的可以通过提供两亲性聚氨基酸聚合物来实现。
根据本发明的另一方面，提供了一种制备所述两亲性聚氨基酸聚合物的方法。
根据本发明的又一方面，提供了一种免疫佐剂组合物，其包括含有两亲性聚氨基酸聚合物的水包油乳剂状态的携带角鲨烯的两亲性聚合物颗粒。
根据本发明的又一方面，提供了一种制备免疫佐剂组合物的方法，所述方法包括将包括两亲性聚氨基酸聚合物的水溶液与包括角鲨烯的溶液混合的步骤。
根据本发明的又一方面，提供了包括抗原和含有两亲性聚氨基酸聚合物的水包油乳剂状态的携带角鲨烯的两亲性聚合物颗粒的疫苗组合物。
根据本发明的又一个方面，提供了制备疫苗组合物的方法，所述方法包括将包括抗原的溶液与包括携带角鲨烯的两亲性聚氨基酸聚合物的乳剂溶液混合的步骤。
在下文中，将具体描述本发明的配置。
本发明提供了下面式1表示的两亲性聚氨基酸聚合物：
[式1]
Figure GDA0001697822950000021
其中R1选自下组中的一种：
Figure GDA0001697822950000031
Figure GDA0001697822950000032
R2是
Figure GDA0001697822950000033
和
x、y和z是大于1的整数。
在一个实施方案中，所述两亲性聚氨基酸聚合物可以包括一种两亲性聚氨基酸聚合物，其中R1是
Figure GDA0001697822950000034
且R2是
Figure GDA0001697822950000035
此外，本发明提供了一种制备两亲性聚氨基酸聚合物的方法，该方法包括将下面式2表示的化合物与下面式3表示的化合物混合以制备下面的式1表示的两亲性聚氨基酸聚合物的步骤：
[式1]
Figure GDA0001697822950000041
[式2]
Figure GDA0001697822950000042
[式3]
Figure GDA0001697822950000051
其中，在式1至3中，R1是选自下组中的一种：
Figure GDA0001697822950000052
Figure GDA0001697822950000053
R2是
Figure GDA0001697822950000054
和
x、y、z和p是大于1的整数。
在本发明中，可以以1：0.1至1：10的比率包括式1中的x和y，例如1：0.5至1：5或1：0.5至1：2，优选1：1。当式2表示的化合物与式3表示的化合物的摩尔比调节在这些范围内时，可以保持所述两亲性聚氨基酸的两亲性。
在一个实施方案中，所述两亲性聚氨基酸聚合物可以以特征为由疏水性核与亲水性壳组成的球形颗粒形式的胶束形式存在，或以由中空亲水性核与疏水性和亲水型壳组成的聚合物囊泡形式存在，所述疏水性和亲水型壳由于其两亲特性而双重封闭所述中空亲水性核。
根据本发明的一个实施方案，将式2表示的化合物和式3表示的化合物溶解在有机溶剂中，使得式1中x与y之比为1：0.1至1：10，随后在30℃至40℃下进行聚合24小时至60小时，例如48小时。通过沉淀法从所得混合物中分离聚合物，随后充分透析，然后冻干。结果，可以获得具有支化结构的两亲性聚氨基酸聚合物。
本发明还提供了一种免疫佐剂组合物，其包括含有两亲性聚氨基酸聚合物的水包油乳剂状态的携带角鲨烯的两亲性聚合物颗粒。
关于免疫佐剂组合物，可以应用所有上述含量的两亲性聚氨基酸聚合物。
在本发明中，水包油乳剂状态的两亲性聚合物颗粒可以是携带角鲨烯的两亲性聚氨基酸聚合物。这里，角鲨烯作为佐剂或免疫佐剂发挥作用，用于增强疫苗的效果。
在本发明中，术语“免疫佐剂”是指称为免疫佐剂或佐剂的物质。更特别地，免疫佐剂是指通过增加对疫苗的应答帮助通过免疫系统产生大量抗体的物质。角鲨烯通常从深海鲨鱼的肝脏中提取，但可以通过其它各种途径生产，没有特别的限制。
在一个实施方案中，所述两亲性聚氨基酸聚合物中携带的角鲨烯的含量可以是0.5％(v/v)至10％(v/v)，例如1％(v/v)至8％(v/v)，3％(v/v)至7％(v/v)或4％(v/v)至6％(v/v)，优选5％(v/v)。当角鲨烯的含量调节在这些范围内时，角鲨烯可以作为免疫佐剂发挥作用。
在一个实施方案中，角鲨烯与两亲性聚氨基酸聚合物的摩尔比可以为1：0.001至1：0.999，例如1：0.001-0.5或1：0.001至1：0.005。
当将角鲨烯与两亲性聚氨基酸聚合物的摩尔比调节到这些范围内时，可以控制水包油乳剂状态下的两亲性聚合物颗粒的尺寸。
根据本发明的两亲性聚氨基酸聚合物由于氨基酸聚合物的应用而具有高的生物相容性，因此适合用作免疫佐剂。
另外，处于水包油乳剂状态的两亲性聚合物颗粒可以具有10nm至1μm的平均直径，例如100nm至500nm或200nm至400nm。
由于本发明的免疫佐剂组合物包括两亲性聚氨基酸聚合物而不是常规免疫佐剂组合物中使用的表面活性剂，所以其更具生物相容性并具有高抗体滴度。
关于该方法，所有上述含量都可以应用于两亲性聚氨基酸聚合物、水包油乳剂状态的两亲性聚合物颗粒和免疫佐剂。
本发明还提供制备免疫佐剂组合物的方法，所述方法包括将包含两亲性聚氨基酸聚合物的水溶液与包含角鲨烯的溶液混合以制备水包油乳剂状态的两亲性聚合物颗粒的步骤。
关于该方法，所有上述含量都可以应用于两亲性聚氨基酸聚合物、水包油乳剂状态的两性聚合物颗粒、免疫佐剂和角鲨烯。
本发明还提供了一种疫苗组合物，其包括抗原和含有两亲性聚氨基酸聚合物的水包油乳剂状态的携带角鲨烯的两亲性聚合物颗粒。
在一个实施方案中，所述抗原可以是流感病毒抗原或猪流行性腹泻病毒抗原，但是本发明不限于此。作为免疫佐剂的角鲨烯与疫苗一起给药时，病毒抗原不受特别限制，只要它们表现出免疫增强作用即可。
本发明的疫苗组合物可以包括药学上可接受的载体。在本发明中，“药学上可接受的载体”是指不显著刺激生物体且不干扰所给药成分的生物活性和性能的载体或稀释剂。在本发明中，药学上可接受的载体可以是盐水、灭菌水、林格溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇或其一种或多种的混合物，并且可以根据需要，通过添加通常的添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，配制成适于注射到组织和器官中的注射剂的形式。另外，可以配制成能够通过加入等渗无菌溶液或根据需要加入无菌水或生理盐水将疫苗组合物制备成注射液的干制剂(特别是冻干制剂)。另外，载体可以与特异性作用于靶器官或其它配体的靶器官特异性抗体结合。
优选地，本发明的组合物可以进一步包含填料、赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂等。此外，本发明的组合物可以使用本领域已知的方法配制，以在对哺乳动物给药后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。
在本发明中，术语“给药”是指通过任何适当的方法将本发明的组合物给予患者。本发明的组合物可以通过各种途径给药，例如口服或胃肠外给药，只要它可以到达目标组织即可。本发明的组合物可以通过腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内或直肠给药，但本发明不限于此。
在说明书中，术语“有效量”是指延迟或完全停止待治疗的特定疾病的发作或进展所需的量。在本发明中，所述组合物可以以药学有效量给药。对于本领域技术人员来说显而易见的是，合适的总日剂量可以由在合理的医学判断范围内的从业者来确定。
为了本发明的目的，对于特定患者的治疗有效量优选取决于各种因素，包括要实现的应答的类型和程度、包括或不包括其它制剂的特定组合物、年龄、体重、身体状况、性别和患者的饮食、给药时间、给药途径和组合物的分泌速率、治疗持续时间、与特定组合物一起使用或共同使用的药物，以及医学领域中众所周知的类似因素。
本发明还提供了制备疫苗组合物的方法，所述方法包括将包括抗原的溶液与包括携带角鲨烯的两亲性聚氨基酸聚合物的乳剂溶液混合的步骤。
所述疫苗组合物可以通过将包括抗原的溶液与所述乳剂溶液以1：0.2至1：5的体积比，例如1：1的体积比混合来制备。
有益效果
如上所述，本发明的免疫佐剂组合物使用两亲性聚氨基酸聚合物制备，由此提供更具生物相容性且具有高抗体滴度的疫苗免疫佐剂组合物。
附图说明
图1说明了两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)的合成过程。
图2说明了水包油乳剂的TEM图像。
图3说明了水包油乳剂的示意图。
图4是说明了水包油乳剂的制备方法的示意图。
图5说明了通过NMR分析确认聚赖氨酸(PLL)的聚合结果的结果。
图6说明了通过NMR分析确认两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)的聚合结果的结果。
图7是说明两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)的聚合过程的示意图。
图8说明了通过DLS方法研究的乳剂尺寸变化的结果，其取决于两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)-携带的角鲨烯(1％/200μl)的量。
图9说明了通过DLS方法研究的乳剂尺寸变化的结果，其取决于两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)-携带的角鲨烯(5％/1ml)的量。
图10说明了通过DLS方法研究的乳剂尺寸变化的结果，其取决于两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)-携带的角鲨烯(10％/2ml)的量。
图11说明了通过小鼠红细胞聚集抑制实验测量的HI滴度值，该实验是在以下五种条件下进行以测量本发明的疫苗组合物的抗体滴度：i)PBS(non-vac)，ii)流感疫苗抗原(仅Ag)，iii)流感疫苗抗原与市售研究用免疫佐剂(AddaVax)的组合，iv)流感疫苗抗原与PLL-b-Phe(Amino-Sq)的组合，和v)流感疫苗抗原与实验室中生产的addavax(T80-Sq)的组合。
图12说明了用于确定颗粒稳定性的一组结果，这些结果取决于水包油乳剂状态下两亲性氨基酸聚合物颗粒的储存温度和时间。
图13说明了从各小鼠模型采集的血清的IgG的ELISA结果，以测量本发明的疫苗组合物的免疫活性。
图14说明了从各小鼠模型采集的血清的IgG1的ELISA结果，以测量本发明的疫苗组合物的免疫活性。
图15说明了从各小鼠模型采集的血清的IgG2a的ELISA结果，以测量本发明的疫苗组合物的免疫活性。
图16说明了用流感病毒(H1N1)挑战接种(challenge-inoculated)的小鼠模型的体重测量结果，用于评价根据本发明的疫苗组合物的感染抑制能力。
图17说明了在流感病毒感染第5日和第7日的各小鼠模型的肺收集的病毒的抗体滴度测量结果。
图18说明了从各豚鼠模型采集的血清的IgG的ELISA结果，以测量根据本发明的疫苗组合物的免疫活性。
具体实施方式
在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本申请。这些实施例仅用于说明的目的，不应解释为限制本申请的范围和精神。
[实施例1]包括携带角鲨烯的两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)的乳剂的制备
1)两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)的合成
为了使作为无水疏水性氨基酸的苯丙氨酸-NCA(Phe-NCA)与作为阳离子聚氨基酸聚合物的聚赖氨酸(Poly-Lys)的支化的两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)聚合，建立Poly-Lys的聚合度(n)，并测定其质量，使得Poly-Lys的胺基(-NH2)与苯丙氨酸-NCA(Phe-NCA)的摩尔比变为1：0.9至0.1。将样品溶解在25mL二甲基甲酰胺(DMF)中以制备溶液混合物，随后在35℃进行聚合48小时。使用乙醚通过沉淀法从反应终止的溶液混合物中分离聚合物，并充分透析以从中除去过量溶剂和样品，然后冻干。结果，获得两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)，其中Poly-Lys和Phe-NCA以支化的形式聚合。PLL-b-Phe的合成过程如图1所示。
2)水包油乳剂的制备
将40mg在步骤1)中获得的两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)溶解于20mL蒸馏水(DW)中，由此制备水溶液。将制备的水溶液超声处理，并以800rpm搅拌。将其中角鲨烯溶解在少量四氢呋喃(THF)中的角鲨烯溶液混合物分批加入所述水溶液中，同时搅拌所述水溶液。将含有角鲨烯的溶液混合物超声处理30分钟，并以300rpm至400rpm搅拌5小时或以上以从中除去THF溶剂。随后，制备其中携带角鲨烯的水包油状态的PLL-b-Phe乳剂。图2说明了用TEM显微镜观察的所制备的乳剂的照片。图3和4说明了水包油状态的乳剂和制备乳剂的方法的示意图。
3)疫苗组合物的制备
将25μl步骤2)中制备的水包油状态的乳剂与25μl包含流感病毒抗原的PBS溶液以约1：1的体积比混合，使得HA滴度变为约128，从而制备疫苗组合物。
[实验实施例1]NMR分析
通过NMR分析研究了所述两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)的聚合结果。结果示于图5和6。图7说明了PLL-b-Phe的聚合过程的示意图。首先，使H-Lys(Z)-OH与三光气反应以合成Lys(z)-NCA赖氨酸酐。通过NMR分析观察合成的Lys(z)-NCA赖氨酸酐的NCA和Cbz峰，以确认它是否合适地合成。使用己胺聚合合成的Lys(z)-NCA赖氨酸酐以合成阳离子聚氨基酸聚合物(PLL(z)，聚-l-赖氨酸(z))。通过NMR数据中NCA峰的消失确定了PLL(z)的成功聚合。随后，使用HBr/乙酸溶液对保护胺基团的Cbz保护基团进行去保护，并在NMR分析数据中通过Cbz峰的弱化和消失确认了作为阳离子氨基酸聚合物的聚赖氨酸(聚-l-赖氨酸)的合成。另外，将疏水性氨基酸酐(Phe-NCA)与聚赖氨酸反应，使得苯丙氨酸酐以支化形状聚合到聚赖氨酸上。结果，通过NMR分析数据确定完成聚合，其中NCA峰消失并产生苯丙氨酸的苯环峰。
[实验例2]通过DLS法测量水包油型乳剂状态下的两亲性聚合物颗粒的粒度分布
固定两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)的量并调节角鲨烯的量以测量水包油型乳剂状态下所述两亲聚合物颗粒的粒度分布。使用实施例1的步骤2)的乳剂制备方法，在聚合物中携带角鲨烯。使用动态光散射(DLS)方法研究了取决于角鲨烯的量的粒度变化。结果示于图8至10和下面表1中。
【表1】
Figure GDA0001697822950000111
如图8至10或表1所示，确定了随着角鲨烯含量的增加，水包油乳剂状态的两亲聚合物颗粒的尺寸逐渐增大。另外，通过DLS分析确定颗粒均匀地单分散。
[实验例3]抗体滴度的测量
以2周的间隔肌内接种小鼠，并在第一次接种后4周，进行红细胞凝集抑制实验以研究抗体滴度。使用血凝抑制(HI)测试方法测量抗体滴度。实验在五种条件下进行：(i)PBS(图11的non-vac)，ii)流感疫苗抗原(图11的仅Ag)，iii)流感疫苗抗原与市售研究用免疫佐剂AddaVax(图11的AddaVax)的组合，iv)流感疫苗抗原与PLL-b-Phe(图11的Amino-Sq)的组合，和v)流感疫苗抗原与实验室中生产的addavax(图11的T80-Sq)的组合。在每种条件下，将五只小鼠用作受试者，并将CA04(H1N1)病毒用作免疫疫苗抗原。结果示于图11。
如图11所示，确定了当抗体滴度确定为平均HI滴度值时，流感疫苗抗原和PLL-b-Phe的组合的抗体滴度比流感疫苗抗原与addavax的组合的抗体滴度高1.5倍。
[实验实施例4]颗粒稳定性的确定
借助于DLS仪器测量实施例1的步骤2)中制备的包括其中携带角鲨烯的两亲性聚氨基酸聚合物(PLL-b-Phe)的乳剂的储存温度依赖性的粒度，以研究颗粒的稳定性。为了研究颗粒的储存期依赖性的稳定性，将所述颗粒在4℃冰箱中和室温(RT，25℃)下储存。
如图12所示，确定了即使延长储存时间也保持初始粒度。从该结果可以确定，即使长时间储存，本发明的两亲性氨基酸聚合物颗粒也均匀地分散。
[实验实施例5]病毒感染模型中的免疫活性的测量
1)流感病毒(H1N1)感染的小鼠模型中的免疫活性的测量
以2周的间隔肌内接种小鼠两次。最后一次接种后两周，收集血液样品并使用ELISA进行免疫活性测量实验以研究基于抗原特异性抗体的免疫应答(体液免疫)。为了测量小鼠的免疫活性，将每个收集的血清样品以1：50稀释，并使用酶联免疫吸附测定(ELISA)研究其中的IgG及其同种型(IgG1，IgG2a)的量。结果示于图13至15。实验在六种条件下进行：(i)未处理组(N.C.：给予PBS 50μl)，ii)流感疫苗抗原(Ag：给予抗原(灭活的免疫抗原，抗原滴度：32)25μl+PBS 25μl)，iii)流感疫苗抗原和市售免疫佐剂，Alum(ThermoFisherScientific,ImjectTM，US)的组合(Ag/Alum：给予抗原(灭活的免疫抗原，抗原滴度：32)25μl+Alum25μl)，iv)流感疫苗抗原和市售免疫佐剂，AddaVax(InvivoGen，US)的组合(Ag/AddaVax：给予抗原(灭活的免疫抗原，抗原滴度：32)25μl+AddaVax 25μl)，v)流感疫苗抗原和携带角鲨烯(0％)的PLL-b-Phe的组合(Ag/CASq(0％)：给予抗原(灭活的免疫抗原，抗原滴度：32)25μl+CASq(0％)25μl)，和vi)流感疫苗抗原和携带角鲨烯(5％)的PLL-b-Phe的组合(Ag/CASq(5％)：给予抗原(灭活的免疫抗原，抗原滴度：32)25μl+CASq(5％)25μl)。这里，抗原和免疫佐剂以1：1的比例混合以制备疫苗制剂。对于每种条件，将三只小鼠进行实验，并使用CA04(流感病毒H1N1)病毒作为免疫疫苗抗原。结果示于图13至15。
如图13至15所示，确定的是，作为间接研究在吸光度(450nm)下的IgG量所进行的ELISA实验的结果，通过吸光度强度的差异，CASq(5％)显示了比AddaVax和Alum更高的IgG量。另外，从与Th1免疫应答相关的IgG2a和与Th2免疫应答相关的IgG1的结果确定了CASq(5％)显示出显著更高的水平。
2)流感病毒(H1N1)感染的小鼠模型中的感染抑制的测量
以2周的间隔对小鼠进行肌内接种，然后以30ml的剂量以20*LD50的含量对流感病毒(H1N1)进行鼻内挑战接种，以研究根据本发明的疫苗的感染抑制能力。结果示于图16。为了研究感染抑制能力，在病毒感染后测量动物的体重11天。这里，对于以下6种条件中的每一个，使用10只小鼠：(i)未处理组(图16的N.C.)，ii)PBS-处理组(图16的PBS：给予PBS 50μl之后挑战接种)，iii)流感疫苗抗原(图16的Ag：给予抗原(灭活的免疫抗原，抗原滴度：32)25μl+PBS25μl后挑战接种)，iv)流感疫苗抗原和市售免疫佐剂，Alum(ThermoFisherScientific,ImjectTM，US)的组合(图16的Ag/Alum：给予抗原(灭活的免疫抗原，抗原滴度：32)25μl+Alum 25μl之后挑战接种，v)流感疫苗抗原和市售免疫佐剂AddaVax(InvivoGen,US)的组合(图1的Ag/AddaVax：给予抗原(灭活的免疫抗原，抗原滴度：32)25μl+AddaVax 25μl之后挑战接种，和vi)流感疫苗抗原和携带角鲨烯(5％)的PLL-b-Phe的组合(图16的Ag/CASq(5％)：给予抗原(灭活的免疫抗原，抗原滴度：32)25μl+CASq(5％)25μl之后挑战接种。这里，抗原和免疫佐剂以1：1的比例混合以制备疫苗制剂。
另外，在感染的第5天和第7天，收集小鼠的肺以测量留在肺中的病毒的滴度。这里，针对每个条件研究了三只小鼠。结果示于图17。
如图17所示，确定了其中使用本发明的免疫佐剂的实验组(Ag/CASq(5％))的重量变化最接近未处理对照组，实验组(Ag/CASq(5％))与市售免疫佐剂相比表现出优异的免疫抑制能力。另外，从感染第5天和第7天研究的病毒滴度结果确定，使用本发明的免疫佐剂显示出最低的病毒滴度。
3)猪流行性腹泻(PED)病毒感染的豚鼠模型中的免疫活性的测量
以2周的间隔肌内接种豚鼠三次。在第二次和第三次接种后两周，从豚鼠采集血液样品。收集的血液样品使用ELISA进行免疫活性测量实验以研究基于抗原特异性抗体的免疫应答(体液免疫)。为了测量豚鼠的免疫活性，将收集的血清以1：50稀释，并使用酶联免疫吸附测定(ELISA)研究IgG的量。实验在以下五种条件下进行：(i)未处理组(图18的N.C.：给予PBS 50μl)，ii)PED免疫疫苗抗原(图18的仅Ag：给予抗原25μl+PBS 25μl)，iii)PEDK(用于肌肉接种的PED病毒免疫抗原)和市售免疫佐剂，AddaVax(InvivoGen，US)的组合(图18的Ag/AddaVax：给予抗原25μl+AddaVax 25μl)，iv)PEDK(用于肌肉接种的PED病毒免疫抗原)和市售免疫佐剂，IMS1313(SEPPIC，法国)的组合(图18的Ag/IMS1313：给予抗原25μl+IMS1313 25μl)，和v)PEDK(用于肌肉接种的PED病毒免疫抗原)和携带角鲨烯(5％)的PLL-b-Phe的组合(图18的Ag/CASq(5％)：给予抗原25μl+CASq(5％)25μl)。这里，抗原和免疫佐剂以1：1的比例混合以制备疫苗制剂。对于每种条件，使用两只小鼠作为受试者。结果示于图18。
如图18所示，确定的是，与其中使用针对猪流行性腹泻(PED)病毒的疫苗产品中使用的常规免疫佐剂的情况相比，当使用根据本发明的免疫佐剂时，显示出显著的IgG值。从根据本发明的免疫佐剂对PED病毒的免疫活性的结果确定，根据本发明的免疫佐剂是对PED病毒的优异的免疫佐剂。

Claims (12)

1.下面式1表示的两亲性聚氨基酸聚合物：
[式1]
Figure FDA0002476434100000011
其中R1选自下组中的一种：
Figure FDA0002476434100000012
Figure FDA0002476434100000013
Figure FDA0002476434100000021
R2是
Figure FDA0002476434100000022
并且x、y和z是大于1的整数。
2.根据权利要求1所述的两亲性聚氨基酸聚合物，其中R1是
Figure FDA0002476434100000023
且R2是
Figure FDA0002476434100000024
3.一种免疫佐剂组合物，其包含水包油乳剂状态的携带角鲨烯的两亲性聚合物颗粒，所述两亲性聚合物颗粒含有根据权利要求1所述的两亲性聚氨基酸聚合物。
4.根据权利要求3所述的免疫佐剂组合物，其中所述组合物基于含有两亲性聚氨基酸聚合物的水溶液计包含0.5％v/v至10％v/v量的角鲨烯。
5.根据权利要求3所述的免疫佐剂组合物，其中所述角鲨烯与所述两亲性聚氨基酸聚合物的摩尔比为1:0.001至1:0.999。
6.一种疫苗组合物，其包含抗原和水包油乳剂状态的携带角鲨烯的两亲性聚合物颗粒，所述两亲性聚合物颗粒含有根据权利要求1所述的两亲性聚氨基酸聚合物。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述抗原是流感病毒抗原或猪流行性腹泻病毒抗原。
8.一种制备两亲性聚氨基酸聚合物的方法，所述方法包括使下面式2表示的化合物与下面式3表示的化合物反应以制备式1表示的两亲性聚氨基酸聚合物的步骤：
[式1]
Figure FDA0002476434100000031
[式2]
Figure FDA0002476434100000032
[式3]
Figure FDA0002476434100000041
其中，在式1至3中，
R1选自下组中的一种：
Figure FDA0002476434100000042
Figure FDA0002476434100000043
R2是
Figure FDA0002476434100000044
并且
x、y、z和p是大于1的整数。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在式1中，x与y之比为1:0.1至1:10。
10.一种制备免疫佐剂组合物的方法，所述方法包括将包含根据权利要求1所述的两亲性聚氨基酸聚合物的水溶液与包含角鲨烯的溶液混合以制备水包油乳剂状态的两亲性聚合物颗粒的步骤。
11.一种制备疫苗组合物的方法，所述方法包括将包含抗原的溶液与携带角鲨烯的乳剂溶液混合的步骤，所述乳剂溶液包含携带角鲨烯的根据权利要求1所述的两亲性聚氨基酸聚合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，在所述步骤中，将所述包含抗原的溶液和所述乳剂溶液以1:0.2至1:5的体积比混合。
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