WO2017105103A1 - 스쿠알렌을 포함하는 양친매성 폴리 아미노산 고분자 기반 백신 면역보조제 조성물 - Google Patents

스쿠알렌을 포함하는 양친매성 폴리 아미노산 고분자 기반 백신 면역보조제 조성물 Download PDF

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acid polymer
antigen
amphiphilic
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squalene
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함승주
임종우
김현욱
최지혜
윤다연
김지혜
송대섭
염민주
나운성
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주식회사 휴벳바이오
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    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to an amphipathic poly amino acid polymer, an adjuvant composition comprising an emulsion particle containing the polymer, a vaccine composition comprising an antigen and the polymer emulsion particles, and a method for producing the same.
  • Adjuvant is a material that can be used for the development of a vaccine to increase the antigenicity or to enhance the non-specific immune response to the antigen to be used for treatment and prevention.
  • the adjuvant is used in the manufacture of vaccines because it plays a role in rapidly, powerfully and long-term maintaining the immune response to the antigen when the antigen level is low. Or to control the type, subtype, or the like of an antibody against an antigen.
  • the use of adjuvant can increase the efficacy of the vaccine and can protect against a wide range of viral infections.
  • the development of such adjuvant is accelerating with the development of vaccines, and as the range of immune-related diseases expands, the development as a new adjuvant has been discussed as a very promising field.
  • the surfactants used in the conventional adjuvant had a problem of low biocompatibility and poor stability. Therefore, in order to solve this problem, it is necessary to develop more biocompatible and stable adjuvant.
  • the present invention provides an amphiphilic poly amino acid polymer.
  • the present invention also provides a method for preparing the amphipathic polyamino polymer.
  • the present invention also provides an adjuvant composition
  • an adjuvant composition comprising amphiphilic polymer particles in water-in-oil emulsion containing the above-mentioned squalene and containing the amphiphilic polyamino acid polymer.
  • the present invention also provides a method for preparing an adjuvant composition comprising mixing an aqueous solution comprising the amphiphilic polyamino acid polymer and a solution containing squalene.
  • the invention also relates to antigens; And an amphiphilic polymer particle carrying oil in an oil-in-water emulsion containing the amphiphilic polyamino acid polymer.
  • the present invention also provides a method for preparing a vaccine composition comprising the step of supporting a solution containing an antigen and squalene and an emulsion solution containing the amphipathic polyamino acid polymer.
  • the present invention provides an amphiphilic polyamino polymer represented by the following Chemical Formula 1:
  • R 1 is , , , , , , and Is selected from the group consisting of,
  • R 2 is or Is
  • x, y, z are integers greater than one.
  • amphipathic poly amino acid polymer may include an amphipathic poly amino acid polymer represented by Formula 1a:
  • x, y, and z are integers greater than 1.
  • the present invention also provides a method for preparing an amphipathic polyamino acid polymer comprising reacting a compound of Formula 2 with a compound of Formula 3 to prepare an amphipathic polyamino acid polymer of Formula 1 below:
  • R 1 is , , , , , , and Is selected from the group consisting of,
  • R 2 is or Is
  • x, y, z, p are integers greater than one.
  • x and y of Formula 1 may be included in 1: 0.1 to 1:10, for example 1: 0.5 to 1: 5, 1: 0.5 to 1: 2, preferably 1: 1. .
  • the amphipathy of the amphipathic poly amino acid can be maintained.
  • the amphiphilic poly amino acid polymer is in the form of a micelle in the form of a spherical particle having a hydrophobic core and a hydrophilic shell through amphiphilic properties, or the hollow hydrophilic core is double-circumscribed by a hydrophobic shell and a hydrophilic shell.
  • the hollow hydrophilic core is double-circumscribed by a hydrophobic shell and a hydrophilic shell.
  • the polymerization reaction may proceed at 30 ° C. to 40 ° C. for 48 hours. After the reaction is terminated, the mixed solution may be separated from the polymer through precipitation, sufficiently dialyzed, and lyophilized to obtain an amphiphilic polyamino polymer having a branched structure.
  • the present invention also provides an adjuvant composition
  • an adjuvant composition comprising amphiphilic polymer particles in water-in-oil emulsion containing the above-mentioned squalene and containing the amphiphilic polyamino acid polymer.
  • the amphiphilic polymer particles in the oil-in-water emulsion state may be to support the squalene in the amphipathic poly amino acid polymer.
  • the squalene serves as an adjuvant or an adjuvant (immune enhancer), and is used to amplify the effect of the vaccine.
  • the term "adjuvant” refers to a substance called an adjuvant, an adjuvant or an adjuvant, more specifically, to increase the response to the vaccine to produce a lot of antibodies by the immune system. Means a substance that helps.
  • the squalene is typically extracted from the deep sea shark liver, but may be generated through other routes, but is not limited thereto.
  • the content of squalene supported in the amphipathic poly amino acid polymer is 0.5% (v / v) to 10% (v / v), for example, 1% (v / v) to 8% (v / v), 3% (v / v) to 7% (v / v), 4% (v / v) to 6% (v / v), preferably 5% (v / v).
  • squalene can function as an adjuvant.
  • the molar ratio of the squalene and the amphiphilic poly amino acid polymer may be 1: 0.001 to 1: 0.999, for example 1: 0.001 to 0.5, 1: 0.001 to 1: 0.005.
  • the size of the amphiphilic polymer particles in the oil-in-water emulsion state can be adjusted.
  • Amphiphilic polyamino acid polymer according to the present invention is high in biocompatibility by using an amino acid polymer is suitable for use as an adjuvant.
  • amphiphilic polymer particles in the oil-in-water emulsion state may have an average particle diameter of 10 nm to 1 ⁇ m, for example, 100 nm to 500 nm, 200 nm to 400 nm.
  • composition of the present invention uses an amphiphilic polyamino acid polymer in place of the surfactant used in the conventional adjuvant composition, by using the amphiphilic polyamino acid polymer more biocompatible, and an adjuvant composition having a high antibody titer Can be provided.
  • amphipathic polyamino acid polymer the amphiphilic polymer particles in an oil-in-water emulsion state, and the immunoadjuvant may be applied or mutatis mutandis as described above.
  • the present invention also provides a method for preparing an adjuvant composition comprising mixing the aqueous solution containing the amphiphilic polyamino acid polymer and the solution containing squalene to prepare amphiphilic polymer particles in an oil-in-water emulsion state.
  • amphipathic polyamino acid polymer the amphiphilic polymer particles in an oil-in-water emulsion state, an adjuvant and squalene may be applied or mutatis mutandis as described above.
  • the invention also relates to antigens; And an amphiphilic polymer particle carrying oil in an oil-in-water emulsion containing the amphiphilic polyamino acid polymer.
  • the antigen may be, but is not limited to, an influenza virus antigen or a swine pandemic diarrheal virus antigen.
  • the viral antigen is not particularly limited as long as the squalene is administered as an adjuvant with the vaccine, as long as it is a viral antigen that can exhibit the effect of immunopotentiation.
  • the vaccine composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not significantly irritate an organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered component.
  • the pharmaceutically acceptable carrier in the present invention may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, If desired, other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added to formulate them in the form of injectables suitable for infusion into tissues or organs.
  • It may also be formulated as an isotonic sterile solution, or as a dry preparation (particularly a lyophilized preparation), which may optionally be an injectable solution with the addition of sterile water or physiological saline.
  • a target organ specific antibody or other ligand may be used in combination with the carrier to specifically act on the target organ.
  • composition of the present invention may further include a filler, an excipient, a disintegrant, a binder and a lubricant.
  • the compositions of the present invention may also be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the term "administration" refers to introducing a composition of the present invention to a patient in any suitable manner, wherein the route of administration of the composition of the present invention is via oral or parenteral various routes as long as the target tissue can be reached. May be administered. Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, nasal administration, pulmonary administration, rectal administration, but is not limited thereto.
  • an effective amount means the amount necessary to delay or entirely stop the onset or progression of the particular disease to be treated.
  • the composition may be administered in a pharmaceutically effective amount. It will be apparent to those skilled in the art that a suitable total daily dose may be determined by the practitioner within the correct medical judgment.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved and whether other agents are used in some cases, the age, weight, general state of health, sex of the patient. And various factors and similar factors well known in the medicinal art, including diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or concurrent with the specific composition.
  • the present invention also provides a method of preparing a vaccine composition comprising the step of mixing a solution comprising an antigen and an emulsion solution comprising an amphiphilic polyamino acid polymer carrying a squalene.
  • the vaccine composition may be prepared by mixing a solution containing an antigen and the emulsion solution in a volume ratio of 1: 0.2 to 1: 5, for example, 1: 1.
  • the adjuvant composition of the present invention can provide a vaccine adjuvant composition having a more biocompatible and high antibody titer by using an amphiphilic poly amino acid polymer.
  • Figure 1 shows the synthesis process of amphiphilic poly amino acid polymer (PLL-b-Phe).
  • Figure 2 shows a TEM observation picture of the oil-in-water emulsion.
  • Figure 3 shows a schematic representation of an oil-in-water emulsion.
  • FIG. 4 is a schematic view showing a method for preparing an oil-in-water emulsion.
  • Figure 5 shows the results confirmed by the NMR analysis of the polymerization result of polylysine (PLL).
  • Figure 6 shows the results confirmed by the NMR analysis of the polymerization of the amphiphilic poly amino acid polymer (PLL-b-Phe).
  • Figure 7 illustrates the polymerization process of the amphiphilic poly amino acid polymer (PLL-b-Phe).
  • Figure 8 shows the results of confirming the size change of the emulsion according to the amount of squalene (1% / 200 ⁇ l) supported on the amphiphilic poly amino acid polymer (PLL-b-Phe) through the DLS method.
  • Figure 9 shows the results of the size change of the emulsion according to the amount of squalene (5% / 1ml) supported on the amphiphilic poly amino acid polymer (PLL-b-Phe) through the DLS method.
  • Figure 10 shows the results of confirming the change in the size of the emulsion according to the amount of squalene (10% / 2ml) supported on the amphiphilic poly amino acid polymer (PLL-b-Phe) through the DLS method.
  • FIG. 11 shows five conditions (i) PBS (non-vac), ii) Influenza Immune Vaccine Antigen (Ag-only), and iii) Influenza. Combination of immune vaccine antigens with commercially available research adjuvant addavax (iv), iv) Combination of influenza immune vaccine antigens with PLL-b-Phe (Amino-Sq), v) Influenza immune vaccine antigens and laboratory-produced addavax HI titer values measured through combination (T80-Sq)).
  • Figure 13 is the result of confirming the IgG of the blood serum collected in the mouse model by ELISA for measuring the immune activity of the vaccine composition of the present invention.
  • Figure 14 is the result of confirming the IgG1 of serum collected in the mouse model by ELISA for measuring the immune activity of the vaccine composition of the present invention.
  • Figure 15 shows the results confirmed by ELISA IgG2a of the blood serum collected in the mouse model for the immunological activity of the vaccine composition of the present invention.
  • Figure 16 is the result of confirming the infection inhibition ability of the vaccine composition according to the invention by inoculating the mouse model with influenza virus (H1N1) by measuring the weight of the mouse model.
  • Figure 17 shows the results of measuring the antibody titer of the virus by extracting the lungs of the mouse model on the 5th and 7th day of influenza virus infection.
  • Figure 18 is a result of confirming the IgG of the blood serum collected in the guinea pig model for measuring the immune activity of the vaccine composition according to the present invention by ELISA.
  • the degree of polymerization (n) of Lys) was determined to prepare a mass so that the molar ratio of polyamines (-NH 2 ) of polylysine (Poly-Lys) to phenylalanine-NCA (Phe-NCA) was 1: 0.9 to 0.1.
  • the prepared samples were dissolved in 25 mL of DMF (dimethylformamide) to prepare a mixed solution, and then polymerized at 35 ° C. for 48 hours. After the reaction was completed, the polymer was separated using ethyl ether as a precipitation method, and the dialysis was carried out to remove excess solvent and samples, followed by freeze-drying to remove Poly-Lys and Phe-.
  • An amphiphilic polyamino polymer (PLL-b-Phe) in which NCA was polymerized into a branched form was obtained.
  • the synthesis process of PLL-b-Phe is shown in FIG. 1.
  • the vaccine composition was prepared by mixing 25 ⁇ l of the oil-in-water emulsion prepared in 2) and 25 ⁇ l of the PBS solution containing the influenza virus antigen such that the HA titer value was about 128.
  • the amount of amphiphilic polyamino acid polymer (PLL-b-Phe) was fixed and the amount of squalene was adjusted to measure the size distribution of amphiphilic polymer particles in the oil-in-water emulsion. 2)
  • the squalene was supported in the polymer using the emulsion production method of Example 1.
  • the change in particle size according to the amount of squalene was confirmed through DLS (dynamic light scattering) method. The results are shown in FIGS. 8 to 10 and Table 1 below.
  • mice were injected at 2 week intervals for intramuscular injection, and 4 weeks after the first inoculation, erythrocyte aggregation inhibition experiments were performed to confirm antibody titers.
  • Antibody titer of mice was measured by HI (Hemaglutination Inhibition) test method. 5 conditions: (i) PBS (non-vac in FIG. 11), ii) influenza immune vaccine antigen (Ag-only in FIG. 11), iii) influenza immune vaccine antigen and a combination of commercially available research adjuvant Addavax (FIG. 11) Addavax), iv) combination of influenza immune vaccine antigen and PLL-b-Phe (Amino-Sq in FIG.
  • the antibody titer was 1.5 times higher than the combination of the influenza vaccine vaccine and addavax when the antibody titer was determined by the HI titer mean value. It was confirmed to have a potency.
  • the emulsion containing the amphiphilic polyamino acid polymer (PLL-b-Phe) carrying the squalene prepared in 2) of Example 1 was confirmed particle stability by measuring the particle size according to the storage temperature using a DLS device.
  • the particles were stored at 4 ° C. in cold storage and at room temperature (RT, 25 ° C.) to confirm particle stability according to storage period.
  • mice were injected two times at two week intervals for intramuscular injection, and two weeks after the last inoculation, blood was collected and immunoassay assays were performed by ELISA to confirm antigen-specific antibody-based immune responses. Proceeded. Measurement of immune activity of the mice was diluted 1:50 of the collected serum and the amount of IgG and its isotypes (IgG1, IgG2a) were confirmed by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), respectively.
  • mice After intravenous injection of mice at 2 weeks intervals, the mice were challenged with 30 ml of influenza virus (H1N1) at a dose of 20 * LD 50 to the nasal cavity to confirm the ability to suppress infection of the vaccine according to the present invention. 16 is shown. Infection inhibition test was confirmed by measuring the weight of the animal for 11 days after the virus infection. At this time, 6 conditions (i) non-treated group (NC of Figure 16), ii) PBS-treated group (PBS of Figure 16: challenge inoculation after administration of 50 ⁇ l PBS in Figure 16, targeting 10 mice per condition), iii) Influenza Immune Vaccine Antigen (Ag of FIG.
  • mice were removed on the 5th and 7th day of infection, and the titer of the virus was measured by measuring the titer value of the virus. At this time, three mice were identified for each condition, and the results are shown in FIG. 17.

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Abstract

본 발명은 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 함유하는 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자를 포함하는 면역보조제 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 면역보조제 조성물은 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 이용함으로써 더욱 생체 적합하고, 높은 항체 역가를 갖는 백신 면역보조제 조성물을 제공할 수 있다.

Description

스쿠알렌을 포함하는 양친매성 폴리 아미노산 고분자 기반 백신 면역보조제 조성물
본 발명은 양친매성 폴리 아미노산 고분자, 상기 고분자를 함유하는 에멀젼 입자를 포함하는 면역보조제 조성물, 항원과 상기 고분자 에멀젼 입자를 포함하는 백신 조성물 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.
면역보조제(adjuvant)란 항원성을 높여 백신의 개발에 이용되거나 항원에 대한 비특이적 면역반응을 증강시켜 치료 및 예방 등에 이용될 수 있는 소재이다. 면역보조제는 항원량이 적을 때 항원에 대한 면역반응을 신속하고 강력하게, 그리고 장기간 유지시켜 주는 역할을 하기 때문에 백신을 제조할 때 사용되며, 특별한 면역보조제를 사용하거나 항원의 양을 다르게 하여 면역반응을 조절하거나 항원에 대한 항체의 종류, 아형 등을 조절할 수 있게 한다. 면역보조제의 사용은 백신의 효능을 증대시킬 수 있고, 광범위한 바이러스 감염병으로부터 보호할 수 있다. 이러한 면역보조제 개발은 백신 개발과 함께 가속화되고 있으며, 면역관련 질환에 대한 범위가 넓어지면서 새로운 면역보강제로서의 개발이 매우 유망한 분야로 거론되고 있다.
그러나 종래의 면역보조제에서 사용되어온 계면활성제는 생체적합성이 다소 낮고 안정성이 떨어지는 문제점이 있었다. 따라서, 이러한 문제를 해결하기 위해서는 더욱 생체적합하고 안정적인 면역보조제의 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 생체적합하고 높은 항체역가를 나타내는 면역보조제 조성물, 백신 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 스쿠알렌을 담지하고, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 함유하는 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자를 포함하는 면역보조제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 포함하는 수용액과 스쿠알렌을 포함하는 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 면역보조제 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 항원; 및 스쿠알렌을 담지하고, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 함유하는 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 항원을 포함하는 용액과 스쿠알렌을 담지하고, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 포함하는 에멀젼 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2016014714-appb-I000001
상기 화학식 1에서,
R1은
Figure PCTKR2016014714-appb-I000002
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000003
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000004
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000005
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000006
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000007
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000008
및
Figure PCTKR2016014714-appb-I000009
로 이루어진 군에서 선택된 하나이고,
R2는
Figure PCTKR2016014714-appb-I000010
또는
Figure PCTKR2016014714-appb-I000011
이며,
x, y, z는 1보다 큰 정수이다.
한 구체예에서, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자는 하기 화학식 1a로 표현되는 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 포함할 수 있다:
[화학식 1a]
Figure PCTKR2016014714-appb-I000012
상기 화학식 1a에서 x, y, z는 1보다 큰 정수이다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1의 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 제조하는 단계를 포함하는 양친매성 폴리 아미노산 고분자의 제조방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2016014714-appb-I000013
[화학식 2]
Figure PCTKR2016014714-appb-I000014
[화학식 3]
Figure PCTKR2016014714-appb-I000015
상기 화학식 1 내지 3에서,
R1은
Figure PCTKR2016014714-appb-I000016
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000017
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000018
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000019
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000020
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000021
,
Figure PCTKR2016014714-appb-I000022
및
Figure PCTKR2016014714-appb-I000023
로 이루어진 군에서 선택된 하나이고,
R2는
Figure PCTKR2016014714-appb-I000024
또는
Figure PCTKR2016014714-appb-I000025
이며,
x, y, z, p는 1보다 큰 정수이다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 x와 y는 1:0.1 내지 1:10, 예를 들어 1:0.5 내지 1:5, 1:0.5 내지 1:2, 바람직하게는 1:1로 포함될 수 있다. 상기 범위로 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물의 몰량비를 조정함으로써, 상기 양친매성 폴리 아미노산의 양친매성이 유지될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자는 양친매성 특성을 통해 소수성 코어와 친수성 쉘을 갖는 구형 입자 형태의 마이셀(micelle) 형태이거나, 속이 비어있는 친수성 코어를 소수성 쉘과 친수성 쉘이 이중으로 둘러싸고 있는 폴리머좀(polymersome) 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 1에서의 x와 y를 1:0.1 내지 1:10이 되도록 상기 화학식 2의 화합물 및 화학식 3의 화합물을 유기용매에 녹인 후 24시간 내지 60시간, 예컨대 48시간 동안 30℃ 내지 40℃에서 중합 반응을 진행할 수 있다. 반응이 종결된 혼합 용액은 침전법을 통해 고분자를 분리해내고, 충분히 투석한 후 동결건조하여 가지형 구조(branched structure)의 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 수득할 수 있다.
본 발명은 또한, 스쿠알렌을 담지하고, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 함유하는 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자를 포함하는 면역보조제 조성물을 제공한다.
상기 면역보조제 조성물에 있어서, 위에서 기술한 양친매성 폴리 아미노산 고분자의 모든 내용을 그대로 적용 또는 준용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자는 양친매성 폴리 아미노산 고분자 내에 스쿠알렌을 담지하는 것일 수 있다. 상기 스쿠알렌(squalene)은 항원보강제 또는 면역보조제(면역증강제)의 역할을 하며, 백신의 효과를 증폭시키기 위해 사용된다.
본 발명에 있어서, 용어 "면역보조제(adjuvant)"는 면역증강제, 항원보강제 또는 아쥬번트(adjuvant)로 불리는 물질을 의미하며, 보다 구체적으로 백신에 대한 반응을 높여 면역 시스템에 의해 항체가 많이 생성될 수 있도록 도와주는 물질을 의미한다. 상기 스쿠알렌은 통상적으로 심해 상어 간으로부터 추출되는 것이나, 그 외에 여러 경로를 통해 생성된 것일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
한 구체예에서, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자 내에 담지된 스쿠알렌의 함량은 0.5%(v/v) 내지 10%(v/v), 예를 들어, 1%(v/v) 내지 8%(v/v), 3%(v/v) 내지 7%(v/v), 4%(v/v) 내지 6%(v/v), 바람직하게는 5%(v/v)일 수 있다. 상기 범위로 스쿠알렌의 함량을 조정함으로써, 스쿠알렌이 면역보조제로서의 기능을 수행할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 스쿠알렌과 양친매성 폴리 아미노산 고분자의 몰량비는 1:0.001 내지 1:0.999, 예를 들어 1:0.001 내지 0.5, 1:0.001 내지 1:0.005일 수 있다.
상기 범위로 양친매성 폴리 아미노산 고분자와 스쿠알렌의 몰량비를 조정함으로써, 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자의 크기를 조절할 수 있다.
본 발명에 따른 양친매성 폴리 아미노산 고분자는 아미노산 고분자를 이용함으로써 생체적합성이 높아 면역보조제로 사용하기에 적합하다.
또한, 상기 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자는 평균 입경이 10 nm 내지 1 ㎛, 예를 들어 100 nm 내지 500 nm, 200 nm 내지 400 nm일 수 있다.
본 발명의 조성물은 종래의 면역보조제 조성물에서 사용되었던 계면활성제를 대체하여 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 사용하는 것으로, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 사용함으로써 더욱 생체적합하고, 높은 항체 역가를 갖는 면역보조제 조성물을 제공할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 양친매성 폴리 아미노산 고분자, 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자 및 면역보조제는 위에서 기술한 모든 내용을 그대로 적용 또는 준용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 포함하는 수용액과 스쿠알렌을 포함하는 용액을 혼합하여 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자를 제조하는 단계를 포함하는 면역보조제 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법에 있어서, 양친매성 폴리 아미노산 고분자, 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자, 면역보조제 및 스쿠알렌은 위에서 기술한 모든 내용을 그대로 적용 또는 준용할 수 있다.
본 발명은 또한, 항원; 및 스쿠알렌을 담지하고, 상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 함유하는 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 항원은 인플루엔자 바이러스 항원 또는 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 바이러스 항원은 면역보조제로서 스쿠알렌이 백신과 함께 투여되는 경우, 면역증강의 효과를 나타낼 수 있는 바이러스 항원이라면 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다. 또한, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
또한 바람직하게 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.
본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 항원을 포함하는 용액과 스쿠알렌을 담지하는 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 포함하는 에멀젼 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 백신 조성물은 항원을 포함하는 용액과 상기 에멀젼 용액을 1:0.2 내지 1:5, 예를 들어 1:1의 부피비로 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 면역보조제 조성물은 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 이용함으로써 더욱 생체 적합하고, 높은 항체 역가를 갖는 백신 면역보조제 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe)의 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 수중유 에멀젼의 TEM 관찰 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 수중유 에멀젼을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 4는 수중유 에멀젼의 제조방법을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 5는 폴리 리신(PLL)의 중합 결과를 NMR 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe)의 중합 결과를 NMR 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe)의 중합 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 8은 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe)에 담지하는 스쿠알렌의 양(1%/200㎕)에 따른 에멀젼의 크기 변화를 DLS 법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe)에 담지하는 스쿠알렌의 양(5%/1ml)에 따른 에멀젼의 크기 변화를 DLS 법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe)에 담지하는 스쿠알렌의 양(10%/2ml)에 따른 에멀젼의 크기 변화를 DLS 법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 백신 조성물의 항체 역가를 측정하기 위해 마우스의 적혈구 응집 억제 실험을 5가지 조건(i)PBS(non-vac), ii)인플루엔자 면역 백신 항원(Ag-only), iii)인플루엔자 면역 백신 항원과 시판되고 있는 연구용 면역보조제 addavax의 조합(Addavax), iv)인플루엔자 면역 백신 항원과 PLL-b-Phe의 조합(Amino-Sq), v)인플루엔자 면역 백신 항원과 실험실에서 제조한 addavax의 조합(T80-Sq))을 통해 측정한 HI titer 값을 나타낸 것이다.
도 12는 수중유형 에멀젼 상태의 양친매성 아미노산 고분자 입자의 보관 온도 및 보관 기간에 따른 입자 안정성을 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명의 백신 조성물의 면역 활성 측정을 위해 마우스 모델에서 채혈한 혈청의 IgG를 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 백신 조성물의 면역 활성 측정을 위해 마우스 모델에서 채혈한 혈청의 IgG1를 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 15는 본 발명의 백신 조성물의 면역 활성 측정을 위해 마우스 모델에서 채혈한 혈청의 IgG2a를 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 16은 마우스 모델에 인플루엔자 바이러스(H1N1)를 공격접종하여 본 발명에 따른 백신 조성물의 감염억제능력을 마우스 모델의 몸무게를 측정하여 확인한 결과이다.
도 17은 인플루엔자 바이러스 감염 5일차 및 7일차에 마우스 모델의 폐를 적출하여 바이러스의 항체 역가를 측정한 결과이다.
도 18은 본 발명에 따른 백신 조성물의 면역 활성 측정을 위해 기니피그 모델에서 채혈한 혈청의 IgG를 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
이하, 본 출원을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 출원을 예시하는 것일 뿐 본 출원의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 스쿠알렌을 담지하는 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b- Phe )를 포함하는 에멀젼의 제조
1) 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b- Phe ) 합성
양이온성 폴리 아미노산 고분자인 폴리리신(Poly-Lys)과 소수성 아미노산의 무수물인 페닐알라닌-NCA(Phe-NCA)의 가지형 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe) 중합을 위해 폴리리신(Poly-Lys)의 중합도(n)를 구하여 폴리리신(Poly-Lys)의 아민기(-NH2)와 페닐알라닌-NCA(Phe-NCA)의 몰량비가 1:0.9 내지 0.1이 되도록 질량을 준비하였다. 준비된 시료들을 25 mL의 DMF(dimethylformamide)에 녹여 혼합 용액을 제조한 후 48시간 동안 35℃에서 중합반응을 진행하였다. 반응이 종결된 혼합 용액을 침전법으로 에틸 에테르(ethyl ether)를 이용하여 고분자를 분리해내고, 충분히 투석(dialysis)하여 여분의 용매와 시료들을 제거한 후, 동결건조를 통해 Poly-Lys과 Phe-NCA가 가지형으로 중합된 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe)를 수득하였다. PLL-b-Phe의 합성 과정을 도 1에 나타내었다.
2) 수중유 에멀젼(Oil in water emulsion)의 제조
1)에서 수득한 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe) 40 mg을 증류수(DW) 20 mL에 녹여 수용액을 제조하였다. 이 수용액을 초음파 처리(sonication process)하여 800 rpm에서 교반하였다. 이렇게 교반이 진행되는 혼합 용액에 소량의 THF(tetrahydrofuran)에 용해된 스쿠알렌 혼합 용액을 한번에 첨가하였다. 스쿠알렌을 첨가한 혼합 용액은 30분 동안 초음파 처리하고 5시간 이상 300 rpm 내지 400 rpm 으로 교반시켜 THF 용매를 제거한 후 스쿠알렌을 담지한 수중유 상태의 PLL-b-Phe 에멀젼을 제조하였다. 제조된 에멀젼을 TEM 현미경으로 관찰한 사진을 도 2에 나타내었고, 수중유 상태의 에멀젼 및 에멀젼의 제조방법을 도 3 및 도 4에 도식화하였다.
3) 백신 조성물의 제조
2)에서 제조한 수중유 상태의 에멀젼 25㎕과 HA titer 값이 약 128이 되도록 인플루엔자 바이러스 항원을 포함한 PBS 용액 25㎕을 혼합하여 부피비가 약 1:1이 되도록 백신 조성물을 제조하였다.
[ 실험예 1] NMR 분석
양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe)의 중합 결과를 핵자기공명(Nuclear Magnetic Resonance; NMR) 분석을 통해 확인하여 도 5 및 6에 나타내었고, 도 7을 통해 PLL-b-Phe의 중합 과정을 도식화하였다. 먼저, H-Lys(Z)-OH를 트리포스젠(Triphosgene)과 반응시켜 Lys(z)-NCA 리신 무수물을 합성하였으며 NMR 분석을 통해 NCA와 Cbz의 피크를 확인하여 적절히 합성된 것을 확인하였다. 합성된 Lys(z)-NCA 리신 무수물은 헥실아민(Hexylamine)을 이용해 중합하여 양이온성 폴리 아미노산 고분자(PLL(z), Poly-l-lysine(z))를 합성하였고, 이는 NMR 데이터에서 NCA 피크가 사라진 것을 통해 중합의 성공을 확인하였다. 이후 HBr/acetic acid 용액을 이용하여 아민기를 보호하고 있는 Cbz 보호그룹을 탈보호 그룹화하고, NMR 분석 데이터에서 Cbz 피크가 약해지고 사라진 것을 통해 양이온성 아미노산 고분자인 폴리 리신(Poly-l-lysine)의 합성을 확인하였다. 또한, 소수성 아미노산 무수물(Phe-NCA)을 폴리 리신과 반응시켜 폴리 리신에 페닐알라닌 무수물이 가지형으로 중합되도록 하였다. 이의 결과로 NMR 분석 데이터에서 NCA 피크가 사라지고 페닐알라닌의 벤젠고리 피크가 생긴 것을 통해 중합되었음을 확인하였다.
[ 실험예 2] DLS 법에 의한 수중유형 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자의 크기 분포도 측정
양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe)의 양은 고정하고, 스쿠알렌의 양을 조절하여 수중유형 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자 크기 분포도를 측정하였다. 실시예 1의 2) 에멀젼 제조방법을 이용하여 스쿠알렌을 고분자 내에 담지하였다. 스쿠알렌의 양에 따른 입자 크기의 변화를 DLS(dynamic light scattering) 법을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 8 내지 도 10 및 하기 표 1에 나타내었다.
D.W(mL) PLL-b-Phe(mg) Squalene RPM Size(nm, AVG) STDEV
① 20 60 1% / 200 ㎕ 900 221.03 1.87
② 20 60 5% / 1 mL 900 255.11 4.25
③ 20 60 10% / 2 mL 900 354.47 11.77
도 8 내지 도 10 및 상기 표 1을 통해, 스쿠알렌의 함량이 증가할수록 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자의 크기는 점점 증가하는 것을 확인하였다. 또한, DLS 분석을 통해 입자들이 고르게 단순분산(monodisperse)되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 3] 항체역가 측정
근육 주사 접종 대상으로 하여 마우스를 2주 간격으로 주사 접종을 실시하였고, 첫 접종 4주 후에 적혈구 응집 억제 실험을 진행하여 항체 역가를 확인하였다. 마우스의 항체역가 측정은 HI(Hemaglutination Inhibition) 테스트 법으로 측정하였다. 5가지 조건(i)PBS(도 11의 non-vac), ii)인플루엔자 면역 백신 항원(도 11의 Ag-only), iii)인플루엔자 면역 백신 항원과 시판되고 있는 연구용 면역보조제 Addavax의 조합(도 11의 Addavax), iv)인플루엔자 면역 백신 항원과 PLL-b-Phe의 조합(도 11의 Amino-Sq), v)인플루엔자 면역 백신 항원과 실험실에서 제조한 Addavax의 조합(도 11의 T80-Sq))으로 실험을 진행하였다. 각 조건 당 5마리의 마우스를 대상으로 실험하였고, 면역 백신 항원은 CA04(H1N1) 바이러스를 사용하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 보는 바와 같이, 항체 역가를 HI titer 평균값으로 확인하였을 때 인플루엔자 면역 백신 항원과 PLL-b-Phe의 조합의 결과가 인플루엔자 면역 백신 항원과 addavax의 조합의 결과에 비해 1.5배 정도 더 높은 항체 역가를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 4] 입자 안정성 확인
상기 실시예 1의 2)에서 제조한 스쿠알렌을 담지하는 양친매성 폴리 아미노산 고분자(PLL-b-Phe)를 포함하는 에멀젼은 DLS 기기를 이용해 보관 온도에 따른 입자 크기를 측정하여 입자 안정성을 확인하였다. 입자는 4℃에서 냉장 보관과 상온(room temperature; RT, 25℃)에서 상온 보관하여 보관 기간에 따른 입자 안정성을 확인하였다.
도 12에서 보는 것과 같이, 보관 기간이 길어짐에도 입자는 초반의 입자 크기를 유지하는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 본 발명에 따른 양친매성 아미노산 고분자 입자를 장기간 보관하여도 균일하게 잘 분산되어 있는 것을 알 수 있었다.
[ 실험예 5] 바이러스 감염 모델에서의 면역 활성 측정
1) 인플루엔자 바이러스( H1N1 ) 감염 마우스 모델에서의 면역 활성 측정
근육 주사 접종 대상으로 하여 마우스를 2주 간격으로 2번 주사 접종을 실시하였고, 마지막 접종 2주 후에 채혈하여 항원특이적 항체기반 면역반응(humoral immunity)을 확인하기 위해 ELISA를 통해 면역 활성 측정 실험을 진행하였다. 마우스의 면역 활성 측정은 채혈한 혈청을 1:50으로 희석하여 IgG와 그 isotype(IgG1, IgG2a)의 양을 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 를 통해 확인하여 각각 도 13 내지 도 15에 나타내었다. 6가지 조건(i)무처리군(N.C.: PBS 50㎕ 투여), ii)인플루엔자 면역 백신 항원(Ag: 항원(불활성화 면역항원, 항원 역가 32) 25㎕+PBS 25㎕ 투여), iii)인플루엔자 면역 백신 항원과 시판되고 있는 면역보조제 Alum(ThermoFisher Scientific, ImjectTM, 미국)의 조합(Ag/Alum: 항원(불활성화 면역항원, 항원 역가 32) 25㎕+Alum 25㎕ 투여), iv)인플루엔자 면역 백신 항원과 시판되고 있는 면역보조제 Addavax(InvivoGen, 미국)의 조합(Ag/Addavax: 항원(불활성화 면역항원, 항원 역가 32) 25㎕+Addavax 25㎕ 투여), v)인플루엔자 면역 백신 항원과 스쿠알렌(0%) 담지한 PLL-b-Phe의 조합(Ag/CASq(0%): 항원(불활성화 면역항원, 항원 역가 32) 25㎕+CASq(0%) 25㎕ 투여), vi)인플루엔자 면역 백신 항원과 스쿠알렌(5%)을 담지한 PLL-b-Phe의 조합(Ag/CASq(5%): 항원(불활성화 면역항원, 항원 역가 32) 25㎕+CASq(5%) 25㎕ 투여)으로 실험을 진행하였으며, 항원과 면역보조제는 1:1의 비율로 백신제제를 제조하여 실험을 수행하였다. 이때, 각 조건 당 3마리의 마우스를 대상으로 실험하였고, 면역 백신 항원은 CA04(인플루엔자 바이러스 H1N1) 바이러스를 사용하였다. 그 결과를 도 13 내지 도 15에 나타내었다.
도 13 내지 도 15를 통해 볼 수 있듯이, ELISA 실험을 진행하여 흡광도(450nm)에서 IgG의 양을 간접적으로 확인한 결과, 흡광도의 세기 차이를 보아 CASq(5%) 가 Addavax, Alum에 비해 더 많은 양의 IgG를 발현시켰음을 확인할 수 있었다. 또한, Th1 면역 반응과 관련된 IgG2a, Th2 면역반응과 관련된 IgG1의 결과에서도 CASq(5%)가 유의한 수준임을 확인하였다.
2) 인플루엔자 바이러스( H1N1 ) 감염 마우스 모델에서의 감염 억제능력 측정
근육 주사 접종 대상으로 하여 마우스를 2주 간격으로 주사 접종을 실시한 후 인플루엔자 바이러스(H1N1)를 20*LD50 함량으로 30㎖씩 비강에 공격접종하여 본 발명에 따른 백신의 감염억제능력을 확인하여 도 16에 나타내었다. 감염억제능력 확인 실험은 바이러스 감염 후 11일동안 동물의 몸무게를 측정하여 확인하였다. 이때, 각 조건 당 10마리의 마우스를 대상으로 6가지 조건(i)무처리군(도 16의 N.C.), ii)PBS 처리군(도 16의 PBS: PBS 50㎕ 투여 후 공격접종), iii) 인플루엔자 면역 백신 항원(도 16의 Ag: 항원(불활성화 면역항원, 항원 역가 32) 25㎕+PBS 25㎕ 투여 후 공격접종), iv)인플루엔자 면역 백신 항원과 시판되고 있는 면역보조제 Alum ThermoFisher Scientific, ImjectTM, 미국)의 조합(도 16의 Ag/Alum: 항원(불활성화 면역항원, 항원 역가 32) 25㎕+Alum 25㎕ 투여 후 공격접종), v)인플루엔자 면역 백신 항원과 시판되고 있는 면역보조제 Addavax(InvivoGen, 미국)의 조합(도 16의 Ag/Addavax: 항원(불활성화 면역항원, 항원 역가 32) 25㎕+Addavax 25㎕ 투여 후 공격접종), vi)인플루엔자 면역 백신 항원과 스쿠알렌(5%)을 담지한 PLL-b-Phe의 조합(도 16의 Ag/CASq(5%): 항원(불활성화 면역항원, 항원 역가 32) 25㎕+CASq(5%) 25㎕ 투여 후 공격접종))으로 실험을 진행하였으며, 항원과 면역보조제는 1:1의 비율로 백신제제를 제조하여 실험을 수행하였다.
또한, 감염 5일차와 7일차에 마우스의 폐를 적출하여 바이러스의 titer값을 측정함으로써 폐에 남아있는 바이러스의 역가를 측정하였다. 이때, 각 조건 당 3마리의 마우스를 대상으로 확인하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에서 보는 것과 같이, 본 발명의 면역보조제를 사용한 실험군(Ag/CASq(5%))에서 동물의 몸무게 변화가 무처리 대조군에 가장 가까운 수준으로, 시판되는 면역보조제를 사용하였을 때보다 뛰어난 감염억제능을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 감염 5일차와 7일차의 바이러스 역가를 확인한 결과, 본 발명의 면역보조제를 사용하였을 때 바이러스 역가가 가장 낮은 것을 알 수 있었다.
3) 돼지 유행성 설사병 바이러스( PED ) 감염 기니피그 모델에서의 면역 활성 측정
근육 주사 접종 대상으로 하여 기니피그를 2주 간격으로 3번 주사 접종을 실시하였고, 2차 및 3차 접종의 각 2주 후에 채혈하여 항원특이적 항체기반 면역반응(humoral immunity)을 확인하기 위해 ELISA를 통한 면역 활성 측정 실험을 진행하였다. 기니피그의 면역 활성 측정은 채혈한 혈청을 1:50으로 희석하여 IgG의 양을 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 확인하였다. 5가지 조건(i)무처리군(도 18의 N.C.: PBS 50㎕ 투여), ii)PED 면역 백신 항원(도 18의 Ag only: 항원 25㎕+PBS 25㎕ 투여), iii)PEDK(근육접종용 PED 바이러스 면역 항원)와 시판되고 있는 면역보조제 Addavax(InvivoGen, 미국)의 조합(도 18의 Ag/Addavax: 항원 25㎕+Addavax 25㎕ 투여), iv)PEDK(근육접종용 PED 바이러스 면역 항원)와 시판되고 있는 면역보조제 IMS1313(seppic사, 프랑스)의 조합(도 18의 Ag/IMS1313: 항원 25㎕+IMS1313 25㎕ 투여), v)PEDK(근육접종용 PED 바이러스 면역 항원)와 스쿠알렌(5%)을 담지한 PLL-b-Phe의 조합(도 18의 Ag/CASq(5%): 항원 25㎕+CASq(5%) 25㎕ 투여)으로 실험을 진행하였으며, 항원과 면역보조제는 1:1의 비율로 백신제제를 제조하여 실험을 수행하였다. 이때, 각 조건 당 2마리의 마우스를 대상으로 실험하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에서 볼 수 있듯이, 기존 돼지 유행성 설사병(PED) 바이러스의 백신 제품에 사용되는 면역보조제를 사용한 경우와 비교하여 본 발명에 따른 면역보조제를 사용한 경우에 현저한 IgG 값을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명에 따른 면역보조제의 PED 바이러스에 대한 면역활성을 통해, PED 바이러스에 대한 면역보조제로서 우수한 효과를 낼 수 있음을 확인하였다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1로 표현되는 양친매성 폴리 아미노산 고분자:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000026
    상기 화학식 1에서,
    R1은
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000027
    ,
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000028
    ,
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000029
    ,
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000030
    ,
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000031
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000032
    ,
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000033
    및
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000034
    로 이루어진 군에서 선택된 하나이고,
    R2는
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000035
    또는
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000036
    이며,
    x, y, z는 1보다 큰 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 양친매성 폴리 아미노산 고분자는 하기 화학식 1a로 표현되는 것인 양친매성 폴리 아미노산 고분자:
    [화학식 1a]
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000037
    상기 화학식 1a에서 x, y, z는 1보다 큰 정수이다.
  3. 스쿠알렌을 담지하고, 제1항의 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 함유하는 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자를 포함하는 면역보조제 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 조성물에서 스쿠알렌은 0.5%(v/v) 내지 10%(v/v)로 포함되는 것인 면역보조제 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 스쿠알렌과 양친매성 폴리 아미노산 고분자의 몰량비는 1:0.001 내지 1:0.999 인 면역보조제 조성물.
  6. 항원; 및 스쿠알렌을 담지하고, 제1항의 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 함유하는 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자를 포함하는 백신 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항원은 인플루엔자 바이러스 항원 또는 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원인 백신 조성물.
  8. 하기 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 반응시켜 화학식 1의 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 제조하는 단계를 포함하는 양친매성 폴리 아미노산 고분자의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000038
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000039
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000040
    상기 화학식 1 내지 3에서,
    R1은
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000041
    ,
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000042
    ,
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000043
    ,
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000044
    ,
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000045
    ,
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000046
    ,
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000047
    및
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000048
    로 이루어진 군에서 선택된 하나이고,
    R2는
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000049
    또는
    Figure PCTKR2016014714-appb-I000050
    이며,
    x, y, z, p는 1보다 큰 정수이다.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 화학식 1의 x, y에 대하여, 상기 x와 y는 1:0.1 내지 1:10의 비율로 포함되는 양친매성 폴리 아미노산 고분자의 제조방법.
  10. 제1항의 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 포함하는 수용액과 스쿠알렌을 포함하는 용액을 혼합하여 수중유 에멀젼 상태의 양친매성 고분자 입자를 제조하는 단계를 포함하는 면역보조제 조성물의 제조방법.
  11. 항원을 포함하는 용액과 스쿠알렌을 담지하는 제1항의 양친매성 폴리 아미노산 고분자를 포함하는 에멀젼 용액을 혼합하는 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 항원을 포함하는 용액과 에멀젼 용액을 혼합하는 단계는 항원을 포함하는 용액과 에멀젼 용액을 1:0.2 내지 1:5의 부피비로 혼합하는 것을 포함하는 백신 조성물의 제조방법.
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