KR20080091808A - 열가역적인 수중 유적형 유화액 - Google Patents

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파트리시아 브로벡-쿠엘레쎄
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사노피 파스퇴르
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Abstract

본 발명은 TLR4 작용물질(그의 화학 구조는 당 고리를 포함하지 않는다), 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르인 비이온계 친수성 계면활성제, 비이온계 소수성 계면활성제를 포함하는 열가역적인 수중 유적형(O/W) 유화액 형태의 면역자극 조성물에 관한 것이다.
TLR4 작용물질, 열가역적인 수중 유적형(O/W) 유화액, 면역자극 조성물

Description

열가역적인 수중 유적형 유화액{THERMOREVERSIBLE OIL-IN-WATER EMULSION}
본 발명은 TLA4라 지칭되는 TLR4 작용물질을 포함하는 열가역적인 수중 유적형(O/W) 유화액 형태의 면역자극 조성물에 관한 것이다.
TLR4(톨 유사 수용체 유형 4)는 면역계의 항원 제공 세포에 의해 발현되는 수용체이며; 그람 세균 감염에 대한 초기 방어 기전에 연루된다. 그람 세균의 리포폴리사카라이드(LPS)는 TLR4에 대한 천연 리간드이며; 상기 수용체를 활성화하고, 이는 생물학적 사건들의 캐스케이드, 특히 Nf-카파 B 전사 인자의 활성화, 및 염증 전 사이토킨의 생산을 촉발한다. LPS의 가수분해로부터 발생하는 모노포스포릴 지질 A가 또한 TLR4에 대한 리간드이며, 이는 LPS보다 덜 독성이라는 이점이 있다.
WO 2004/060396에는 인지질 항원보강제를 함유하는 O/W 유화액 형태의 제형이 개시되어 있다. 마이크론 이하의 크기를 갖는 상기 유화액은 고압 균질화기(미세유동화기)의 사용에 의해 수득된다. 제조 방법은 오일 방울의 크기를 감소시키기에 충분히 큰 전단력을 획득하기 위해서 높은 기계 에너지를 사용한다. 상기 교시에 따라, 상기 수득된 유화액은 대략 500 ㎚의 크기를 갖는 방울을 함유한다.
상기 특허 출원에 제안된 대체 제형, 및 특히 보다 단순한 방법(특수 전단 기술을 필요로 하지 않음)(저 에너지를 수반하는 동시에 재연이 가능하고, 신뢰성이 있으며 대규모로 사용이 가능하다)을 사용하여 수득할 수 있는 것이 바람직하며; 더욱 또한 상기 항원보강제 제형은 그의 전적으로 안전한 투여에 유해할 수 있는 어떠한 독성 징후도 나타내지 않는 동시에, 항원에 대한 면역 반응을 증가시킴으로써 백신의 유효성을 개선시킬 수 있어야 한다.
이런 취지로, 본 발명의 주제는
i) TLA4라 지칭되는 TLR4 작용물질(그의 화학 구조는 당 고리를 포함하지 않는다),
ii) 스쿠알렌,
iii) 수성 용매,
iv) 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르인 비이온계 친수성 계면활성제,
v) 비이온계 소수성 계면활성제
를 포함하고, 열가역성인 수중 유적형(O/W) 유화액이다.
본 발명에 따른, 상기 유화액에 함유된 TLR4 작용물질은 지질 A 또는 지질 A의 유도체 또는 지질 A의 구조와 흡사한 분자가 아니다.
전형적으로 TLA4는 하기 화학식 I, II, III 또는 IV의 화학적 화합물 또는 화학식 I, II, III 또는 IV 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112008057736505-PCT00001
Figure 112008057736505-PCT00002
Figure 112008057736505-PCT00003
Figure 112008057736505-PCT00004
상기 식에서, 각각의 화학식 I, II, III 또는 IV에 대해서,
R1은 a) C(O);
b) C(O)-(C1-C14 알킬)-C(O)[여기에서 상기 C1-C14 알킬은 하이드록실, C1-C5 알콕시, C1-C5 알킬렌다이옥시, (C1-C5 알킬)아미노 또는 (C1-C5 알킬)아릴로 임의로 치환되고, 이때 상기 (C1-C5 알킬)아릴의 상기 아릴 부분은 C1-C5 알콕시, (C1-C5 알킬)아미노, (C1-C5 알콕시)아미노, (C1-C5 알킬)아미노(C1-C5 알콕시), -O-(C1-C5 알킬)아미노(C1-C5 알콕시), -O-(C1-C5 알킬)아미노-C(O)-(C1-C5 알킬)-C(O)OH, 또는 -O-(C1-C5 알킬)아미노-C(O)-(C1-C5 알킬)-C(O)-(C1-C5)알킬로 임의로 치환된다];
c) 하이드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된, C2-C15 선형 또는 분지된 쇄를 포함하는 알킬; 및
d) -C(O)-(C6-C12 아릴렌)-C(O)-(여기에서 상기 아릴렌은 하이드록실, 할로겐, 나이트로 또는 아미노로 임의로 치환된다)
로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
a 및 b는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
d, d', d", e, e' 및 e"는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
X1, X2, Y1 및 Y2는 존재하지 않음, 산소, NH 및 N(C(O)(C1-C4 알킬)), 및 N(C1-C4 알킬)로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
W1 및 W2는 카보닐, 메틸렌, 설폰 및 설폭사이드로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
R2 및 R5는
a) 옥소, 하이드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된, C2 내지 C20 직쇄 또는 분지 쇄 알킬;
b) 옥소, 하이드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된, C2 내지 C20 직쇄 또는 분지 쇄 알케닐 또는 다이알케닐;
c) 옥소, 하이드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된, C2 내지 C20 직쇄 또는 분지 쇄 알콕시;
d) 알킬 그룹이 옥소, 하이드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된, NH-(C2 내지 C20 직쇄 또는 분지 쇄 알킬); 및
e)
Figure 112008057736505-PCT00005
(상기 식에서,
Z는 O 및 NH로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, M 및 N은 C2-C20 선형 또는 분지된 쇄를 포함하는 알킬, 알케닐, 알콕시, 아실옥시, 알킬아미노 및 아실아미노로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택된다)
로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
R3 및 R6은 옥소 또는 플루오로로 임의로 치환된, C2-C20 직쇄 또는 분지된 쇄 알킬 또는 알케닐로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
R4 및 R7은 C(O)-(C2-C20 직쇄 또는 분지된 쇄 알킬 또는 알케닐), C2-C20 직쇄 또는 분지된 쇄 알킬, C2-C20 직쇄 또는 분지된 쇄 알콕시, 및 C2-C20 직쇄 또는 분지된 쇄 알케닐로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; 이때 상기 알킬, 알케닐 또는 알콕시 그룹은 독립적이고 임의로 하이드록실, 플루오로 또는 C1-C5 알콕시로 치환될 수 있으며;
G1, G2, G3 및 G4는 산소, 메틸렌, 아미노, 티올, -C(O)NH-, -NHC(O)- 및 -N(C(O)(C1-C4 알킬))-로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되거나; 또는
G2R4 또는 G4R7이 함께 수소 원자 또는 하이드록실일 수 있고;
화학식 III의 경우:
a' 및 b'는 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 바람직하게는 2이고;
Z1은 -OP(O)(OH)2, -P(O)(OH)2, -OP(O)(OR8)(OH)(이때 R8은 C1-C4 알킬 쇄이 다), -OS(O)2OH, -S(O)2OH, -CO2H, -OB(OH)2, -OH, -CH3, -NH2 및 -NR9 3(이때 R9는 C1-C4 알킬 쇄이다) 로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
Z2는 -OP(O)(OH)2, -P(O)(OH)2, -OP(O)(OR10)(OH)(이때 R10은 C1-C4 알킬 쇄이다), -OS(O)2OH, -S(O)2OH, -CO2H, -OB(OH)2, -OH, -CH3, -NH2 및 -NR11(이때 R11은 C1-C4 알킬 쇄이다) 로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
화학식 IV의 경우:
R12는 H 또는 C1-C4 알킬 쇄이다.
본 발명에 따른 유화액은 열가역성이며, 이는 상기 유화액이 "상 전이 온도"와 적어도 동등한 온도로 가열될 때 O/W 유화액의 상태에서 W/O 유화액의 상태로 변화됨을 의미한다. 미시적 규모로, 상기 상 전이 온도는 유성 상을 향한 곡률에서부터 수성 상을 향한 곡률까지의 변화를 반영하며, 이러한 전이는 제로 평균 곡률 상의 통과를 반드시 수반한다(이어서 상기 시스템은 라멜라 상 또는 미세유화액과 관련된다).
본 발명에 따른 유화액을 온도 변화 상 전이 공정에 의해 수득할 수 있으며, 상기 공정은 쉽게 조절될 수 있고 큰 생산 부피에 적합할 수 있으므로 산업상 관점에서 매우 유리하다. 상기와 같은 공정은 안전성과 비용 효과를 보장하며, 이들은 모두 약학 산업에 필요하다. 또한, 상기 공정 덕분에, 소적 크기가 작아, 상기 유 화액이 컷오프가 200 ㎚인 멸균 필터에 의해 쉽게 여과될 수 있게 하는 단분산 유화액을 수득할 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 유화액의 오일 소적 집단 부피의 90% 이상이 크기 ≤200 ㎚를 갖는다. 일반적으로 상기 유화액의 오일 소적 집단 부피의 50% 이상이 크기 ≤110 ㎚를 갖는다. 하나의 구체적인 특징에 따라, 상기 오일 소적 집단 부피의 90% 이상이 크기 ≤180 ㎚를 갖고 상기 소적 집단 부피의 50% 이상이 크기 ≤110 ㎚를 갖는다.
일반적으로, 본 발명에 따른 열가역성 유화액은 균질하다. "균질성 유화액"이란 용어는 상기 오일 소적의 크기 분포의 그래프 표현("granulogram")이 단정상인 유화액을 의미하는데 사용된다. 전형적으로, 상기 그래프 표현은 "정규곡선" 유형을 갖는다.
상기 소적의 크기를 다양한 수단에 의해, 특히 레이저 회절 입자 크기 분석기, 예를 들어 LS 범위(특히 LS230)의 벡크만 쿨터(Beckman Coulter) 장치 또는 마스터사이저(Mastersizer) 범위(특히 마스터사이저 2000)의 맬버른(Malvern) 장치를 사용하여 측정할 수 있다. 이들 장치의 측정 원리는 샘플을 레이저 광선으로 비출 때 각도(큰, 중간 및 작은 각 검출기)의 함수로서 상기 입자에 의해 산란된 빛의 강도를 분석하는데 근거한다. 상기 분석을, 사용된 물질의 크기 및 성질에 따라 선택된 수학 모델에 의해 수행한다. 마이크론 이하의 입자 크기를 측정하는 경우에, 유성 상의 굴절률(이 경우에, 스쿠알렌의 경우 1.495) 및 수성 상(예를 들어 물의 경우 1.322이다)의 굴절률을 고려하여 특수 광학 모델(Mie 이론)을 적용할 필 요가 있으며; 또한 매우 미세한 입자에 의해 방출되는 약한 강도를 검출할 수 있어야 하고, 이는 상기 분석을 하기에 의해 최적화할 것을 필요로 한다:
-큰 각 편광된 강도 미분 산란 측정을 위한 추가적인 검출 셀(쿨터로부터의 PIDS 시스템으로, 40 ㎚로부터의 측정을 허용한다),
-맬버른으로부터의, 2 개의 파장, 청색 및 적색 광을 겸비한 검출 시스템.
넓은 각 산란 및 후방 산란 검출기와 관련된, 보다 짧은 파장인 청색 광원은 상기 마이크론 이하 범위의 분석에 대한 수행성능 수준을 보강한다.
사용되는 장치에 따라, 상기 측정치는 상기 장치의 요소 및 사용되는 데이터 처리 소프트웨어에 따라 약간 변할 수 있다.
본 발명에 따른 열가역성 유화액의 상 전이 온도는 각 유화액 특유의 특징이며 그의 성분들의 성질 및 이들의 상대적인 농도에 따라 변한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 유화액의 조성을 상기 상 변이가 45 내지 80 ℃, 바람직하게는 50 내지 65 ℃의 온도에서 발생하도록 선택한다. 이러한 온도 범위는 상기 유화액을 비교적 고온(∼37 ℃)에서 보관하는 경우 상기 유화액의 상태 변화 위험이 없으므로 유리하다. 더욱 또한, 상기 열가역성 유화액을 제조하는 방법에서와 같이, 상기 성분들의 가열은 80 ℃를 초과하지 않으며, 이는 상기 성분 및 특히 TLA4의 구조 및 완전성을 유지하는데 기여한다. 상기 유화액의 상 전이 온도가 높은 경우, 특히 80 ℃보다 높거나 이에 가까운 경우, 상기 유화액의 조성물에 알디톨(대개는 솔비톨, 만니톨, 글리세롤, 자일리톨 또는 에리쓰리톨 중에서 선택된다)을 가함으로써 상기 온도를 낮추는 것이 유리할 수 있다. 상기 알디톨을 0.1 내지 10%(w/w)의 농도 범위, 바람직하게는 1 내지 10%(w/w)의 농도 범위, 및 특히 2 내지 7%(w/w)의 농도 범위로 사용하는 경우, 상기 유화액의 상 전이 온도를 대략 10 ℃까지 감소시킬 수 있다. 상기 유화액의 상 전이 온도를 또한, 단지 물로만 이루어진 수성 상을 완충된 염수 수성 상으로 대체함으로써 감소시킬 수 있다. TRIS 완충액, 포스페이트 완충액, 예를 들어 PBS, Ca2 + 또는 Mg2 +가 없는 둘베코 PBS 완충액 또는 시트레이트 완충액이 통상적으로 사용된다.
화학식 I, II, III 또는 IV의 화학적 화합물을 특히 US 2003/0153532 또는 US 2005/0164988에 개시된 방법에 따른 합성에 의해 수득한다.
특히, 본 발명에 따른 TLA4는 하기 화학식 I의 화학적 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염이다:
화학식 I
Figure 112008057736505-PCT00006
바람직하게는,
R1은 C(O) 또는 C(O)-(CH2)n-C(O)이고, 이때 n은 1, 2, 3 또는 4이며,
a, b, d, d', d", e, e' 및 e"는 독립적으로 1 또는 2이고,
X1, X2, Y1 및 Y2는 NH이고,
W1 및 W2는 C(O)이고,
R2 및 R5는 옥소로 임의로 치환된 C10-C15 직쇄 알킬, NH-(C10-C15 직쇄 알킬), 및
Figure 112008057736505-PCT00007
(이때 M 및 N은 독립적으로 C2 내지 C20 직쇄 알킬 또는 알케닐이다)로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고,
R3 및 R6은 C5-C10 직쇄 알킬이고,
R4 및 R7은 수소, C(O)-(C8-C12 직쇄 알킬) 및 C(O)-(C8-C12 직쇄 알케닐)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고,
G1 및 G3은 산소 또는 -NH(CO)-이고,
G2 및 G4는 산소이다.
TLA4는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 면역자극 활성을 발휘한다. 상기 시험관 내 면역자극 활성을 특히 하기에 의해 평가한다:
1) 인간 전혈 세포에 의한 TNFα의 생산의 증가를 측정함으로써, 또는
2) TNFα 프로모터의 조절 하에서 알칼리성 포스파타제 유전자에 의해 형질감염된 THP-1 주에 의한 알칼리성 포스파타제의 생산의 증가를 측정함으로써, 또는
3) 쥐 비장세포에 의한 사이토킨, 예를 들어 IL-10 및 인터페론 γ의 생산의 증가를 측정함으로써, 또는
4) 쥐 대식세포 주 RAW264에 의한 TNFα의 생산의 증가를 측정함으로써, 또는
5) U373 인간 성상세포종에 의한 IL-6의 생산의 증가를 측정함으로써, 또는
6) 유식 세포측정에 의한, CD25, CD80/CD83과 같은 활성화 마커의 발현을 근거로 한, 인간 단핵구로부터 유래된 수지상 세포의 활성화/성숙의 증가를 측정함으로써.
상기 모든 측정 분석들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며 특히 US 2003/0153532의 실시예 7 또는 문헌[Biological Chemistry, (2001), vol 276/3, page 1873-1880]에 개시되어 있다.
생체 내 면역자극 활성은 체액 반응 및/또는 특정한 세포 반응의 증가에 의해 반영된다. 상기 체액 반응을 평가하기 위해서, 항원에 특이적인 항체의 생산을 측정한다. 예로서, 상기 반응을 평가하기 위해 US 2003/0153532의 실시예 8에 개시된 분석을 참고로 할 수 있다. TLA4-관련된 항원의 주입에 이어서 관찰된 특이 항체(전체 면역글로불린 또는 특이적인 아이소타입의 형태 내에 있음)의 생산이 동일한 양의 항원 단독 투여에 이어서 관찰된 경우보다 더 클 때, TLA4를 생체 내 면역자극 활성을 발휘하는 것으로 간주한다. 상기 TLA4의 면역자극 활성을 또한, 예를 들어 세포독성 T 림프구(CTL)의 활성 또는 림프증식을 측정함으로써, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 특이적인 세포 반응 측정 분석을 사용하여 평가할 수 있다.
바람직하게는, TLA4를 ER803022, ER803058, ER803732, ER803789, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804764, ER111232, ER112022, ER112048, ER112065, ER112066, ER113651, ER118989, ER119327 및 ER119328이란 이 름 하에 US 2003/0153532에 동정되고 개시된 화학적 화합물들로 이루어진 그룹 중에서 선택한다.
상기 화합물들은 화학 구조가 여러 비대칭 탄소를 포함하는 경우 부분입체이성체의 형태 또는 라세미 형태(부분입체이성체들의 혼합물)로 존재할 수 있다. 예를 들어, 4 개의 비대칭 탄소를 갖는 ER804057 및 ER804053은 라세미 형태인 ER112066의 부분입체이성체이다. ER804057은 (R,R,R,R)-유형 이성체 형태인 반면, ER804053은 (R,S,S,R)-유형 형태이다. 유사하게, (R,R,R,R)-유형 이성체 형태인 ER804058, 및 (R,S,S,R)-유형 이성체 형태인 ER804059는 라세미 형태인 ER113651의 부분입체이성체이다. (R,R,R,R)-유형 이성체 형태인 ER803022, (R,S,S,R) 형태인 ER803732, 및 (R,R,S,R) 형태인 ER803789는 또한 하나 및 동일한 화학 분자의 부분입체이성체이다. R,R,R,R-유형 형태를 갖는 부분입체이성체(다른 형태보다 일반적으로 더 활성이다)를 사용하는 것이 바람직하다. 이들 중에서 ER804057이 특히 바람직하다. 상기는 도데칸산 (1R,6R,22R,27R)-1,27-다이헵틸-9,19-다이하이드록시-9,19-다이옥시도-14-옥소-6,22-비스[(1,3-다이옥소테트라데실)아미노]-4,8,10,18,20,24-헥사옥사-13,15-다이아자-9,19-다이포스파헵타코산-1,27-다이일 에스터이며; 유리산 또는 염의 형태이다. 상기 유리산 형태의 분자량은 1579이며, 상기 이나트륨 염의 경우는 1624이다. 상기 이나트륨 염의 실험식은 C83H158N4Na2O19P2이다.
구조의 관점에서, 본 발명의 주제에 따른 TLR4 작용물질은 양친매성 분자이 다. 양친매성 분자는 친수성과 소수성 모두의 양상을 가지며 시간에 따라 침전되는 경향이 있다. 상기는 종종 유기 또는 수성 용매에 불완전하게 용해되며 종종 불안정한 용액 또는 재현이 어려운 용액의 원인이 된다. 이들 분자의 제형을 개선시킬 필요가 있다. 본 발명에 개시된 유화액은 시간에 따라 안정한 유화액을 제공함으로써 상기 필요성을 만족시킨다. +4 ℃에서 6 개월간 보관되는 본 발명에 따른 유화액은 상기 유화액이 처음에 갖는 특성을 보존한다, 즉 상기 오일 소적의 크기 분포가 실질적으로 변하지 않으며; 본 발명의 유백색, 유체 및 균질한 태양이 보존되고; 명백히, 상기 TLA4의 구조 완전성이 실시예 II에 나타낸 바와 같이 손상되지 않는다. 심지어 본 발명에 따른 유화액을 오일 소적 크기 분포에 관하여 관찰되는 어떠한 현저한 변화도 없이 -2 ℃의 온도에서 48 시간 이상 보관할 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 유화액은 몇몇 TLR4 작용물질의 발열원 능력을 감소시킨다.
TLA4의 양 대 상기 유화액의 친수성 및 소수성 계면활성제의 전체 량의 비는 대개 0.01 x 10-2 내지 5 x 10-2, 바람직하게는 0.1 x 10-2 내지 2 x 10-2이다. 상기 비의 범위에서, TLA4의 양은 계면활성제의 유화 능력에 대해 어떠한 영향도 미치지 않을 정도로 충분히 작지만, 시험관 내 및/또는 생체 내에서 면역자극 활성을 발휘하기에는 충분한 양으로 존재한다.
본 발명에 따른 친수성 게면활성제는 HLB(친수성/친지성 균형) ≥10을 가지며 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(PAE) 화학 그룹(또한 폴리옥시에틸렌화된 지방 알 콜 에테르라 칭함)에 속한다. 상기 비이온계 계면활성제를 지방 알콜과 에틸렌 옥사이드간의 화학적 축합에 의해 수득한다. 상기는 R-(O-CH2-CH2)n-OH(여기에서 라디칼 R은 대개 포화 또는 불포화 알킬 잔기를 나타내며 n은 에틸렌 옥사이드 단위의 수를 나타낸다) 유형의 화학식을 갖는다. 본 발명의 주제에 따라, R은 탄소수 1 내지 50, 바람직하게는 4 내지 20, 특히 바람직하게는 10 내지 20을 함유한다. n은 ≥2, 일반적으로는 4 내지 50이다. 본 발명에 따른 유화액은 대개 단일 친수성 PAE를 포함한다. 여러 PAE들의 혼합물도 또한, 전체 HLB가 ≥10인 한 적합하다.
본 발명의 주제에 적합한 폴리옥시에틸렌화된 지방 알콜 에테르는 주변 온도에서 액체 또는 고체의 형태로 존재할 수 있다. 상기 고체 화합물들 중에서, 수성 상에 직접 용해되거나 또는 상당한 가열을 요하지 않는 것들이 바람직하다.
에틸렌 옥사이드 단위의 수가 충분한 한에 있어서, 라우릴 알콜, 미리스틸 알콜, 세틸 알콜, 올레일 알콜 및/또는 스테아릴 알콜의 폴리옥시에틸렌화된 에테르가 본 발명의 주제에 특히 적합하다. 상기는 특히 상표명 브리즈(Brij)®, 유멀진(Eumulgin)® 또는 시뮬졸(Simulsol)®로 공지된 제품의 범위에서 발견될 수 있다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 유화액은 비이온계 친수성 계면활성제로서 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르(세테아레트-12)(유멀진® B1이라는 이름으로 판매됨), 폴리옥시에틸렌 (20) 세토스테아릴 에테르(세테아레트-20)(유멀진® B2), 폴리옥시에틸렌 (21) 스테아릴 에테르(스테아레트-21)(유멀진® S21), 폴리옥시에틸렌 (20) 세틸 에테르(세테트-20)(시뮬졸® 58 또는 브리즈® 58), 폴리옥시에틸렌 (10) 세틸 에테르(세테트-10)(브리즈® 56), 폴리옥시에틸렌 (10) 스테아릴 에테르(스테아레트-10)(브리즈® 76), 폴리옥시에틸렌 (20) 스테아릴 에테르(스테아레트-20)(브리즈®78), 폴리옥시에틸렌 (10) 올레일 에테르(올레트-10)(브리즈® 96 또는 브리즈® 97) 및 폴리옥시에틸렌 (20) 올레일 에테르(올레트-20)(브리즈® 98 또는 브리즈® 99)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르를 함유한다. 각각의 화학식 명칭 옆에 나타낸 숫자는 화학식 중의 에틸렌 옥사이드 단위의 수에 해당한다.
반합성 기원으로 인해 특히 적합하고 바람직한 화합물은 유멀진TM B1(세테아레트-12)(Cognis 사에 의해 제공됨)이다.
본 발명에 따른 유화액은 또한 비이온계 소수성 계면활성제를 함유하며, 그의 HLB는 ≤6이다. 상기 유화액은 대개 단일의 비이온계 소수성 계면활성제를 포함한다. 여러 비이온계 소수성 계면활성제들의 혼합물이 또한, 상기 전체 HLB가 ≤6인 한 적합하다. 전형적으로, 상기는 소수성 솔비탄 에스터 또는 소수성 만나이드 에스터를 포함한다. 솔비탄 에스터는 대개 지방산과 솔비톨, 솔비톨 일무수물 또는 솔비톨 이무수물간의 에스터화 반응에 의해 수득된다. 만나이드 에스터는 통상적으로 지방산과 만니톨 일수화물 또는 이수화물간의 에스터화 반응에 의해 수득된다. 바람직하게는, 상기는 만나이드 모노올리에이트(Sigma 또는 Seppic 사에 의해 몬타나이드(Montanide) 80TM이라는 이름으로 판매됨) 또는 솔비탄 모노올리에이트(스판(Span)® 80, 데하이뮬스(Dehymuls) SMOTM(Cognis) 또는 몬탄(Montane) 80TM(Seppic)이라는 이름으로 판매됨)를 포함한다.
유화액의 제조를 위해 종래 기술에 제안된 모든 계면활성제들 중에서 상기 특정한 계면활성제를 선택한 덕분에, 본 발명에 이르러 항원보강제 O/W 유화액이 실행하기 용이한 상 전이 방법을 사용하여 매우 유리하게 제조될 수 있음을 발견하였다.
친수성 및 소수성 계면활성제 각각의 농도를 상기 혼합물의 HLB(HLBm)가 8.5 내지 10, 보다 특히는 8.6 내지 9.6이도록 선택할 때, 상기 유화액은 일반적으로 균질하고 종종 상기 오일 소적의 집단 부피의 90% 이상이 크기 ≤0.2 ㎛를 갖는다. 상기 유화액은 더욱이, 특히 안정하다. 스쿠알렌 유화액 중의 친수성 및 소수성 계면활성제의 양을 바람직하게는 상기 HLBm이 8.5 내지 10, 보다 특히 8.6 내지 9.6이 되도록 조절한다. 상기 유화액의 조성물 중의 친수성 및 소수성 계면활성제 각각의 농도를 측정하기 위해서, 하기 식을 사용한다:
HLBm = HLBe x M + HLBpae x (1-M)
상기에서,
HLBm은 혼합물의 HLB에 상응하며, 바람직하게는 8.5 내지 10, 보다 특히 8.6 내지 9.6이고,
HLBe는 소수성 게면활성제의 HLB에 상응하고,
M은 소수성 계면활성제와 PAE로 구성된 혼합물 중의 소수성 계면활성제의 중량 퍼센트에 상응하고,
HLBpae는 PAE의 HLB에 상응한다.
유화액의 유성 상을 나타내는 스쿠알렌은 실험식 C30H50를 가지며 6 개의 이중 결합을 포함한다. 상기 오일은 대사가능하며 주사 가능한 약품에 사용하기에 필수적인 품질을 갖는다. 상기는 상어 간(동물성)으로부터 나오지만 또한 올리브 오일(식물성)로부터 추출될 수도 있다. 양호한 결과는 특히 플루카(Fluka) 사에서 제공하는 스쿠알렌(동물성)을 사용하여 획득되었다. 일반적으로, 스쿠알렌의 양은 상기 유화액의 전체 중량의 5 내지 45%를 차지한다.
본 발명에 따른 유화액 중의 스쿠알렌의 양 대 계면활성제의 전체 량의 질량 비는 대개 2.0 내지 4.0, 바람직하게는 2.5 내지 3.5이다.
특히 바람직한 본 발명에 따른 유화액의 조성물은 하기를 포함한다:
-스쿠알렌,
-수성 용매로서 포스페이트 완충액 또는 시트레이트 완충액,
-TLR4 작용물질로서 화합물 ER 804057,
-친수성 계면활성제로서 세테아레트-12(유멀진® B1),
-소수성 계면활성제로서 솔비탄 모노올리에이트.
스쿠알렌의 양은 상기 유화액의 전체 중량의 5 내지 45%를 차지한다. 화합물 ER804057의 양은 대개 상기 두 계면활성제의 중량의 0.05 내지 2%를 차지한다. 바람직하게는 세테아레트-12 및 솔비탄 모노올리에이트의 양은 상기 두 계면활성제의 혼합물의 HLB가 8.5 내지 10, 보다 특히 8.6 내지 9.6이도록 하는 양이다. 스쿠알렌의 양 대 세테아레트-12 및 솔비탄 모노올리에이트의 전체 량의 비는 2.0 내지 4.0, 바람직하게는 2.5 내지 3.5이다. 더욱 또한, 상기 조성물은 만니톨을 함유할 수 있으며, 그의 양은 대개 상기 유화액의 전체 중량의 0.1 내지 10%를 차지한다.
본 발명에 따른 유화액의 수성 상은 또한 하나 이상의 저온보호제를 함유하는 동결건조 기질을 함유할 수 있다. 상기 저온보호제는 대개 당, 예를 들어 슈크로스, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨 또는 솔비톨, 또는 당 유도체, 예를 들어 알킬폴리글리코사이드, 예를 들어 나트륨 데실-D-갈락토사이드 유로네이트 또는 도데실 β-말토사이드 중에서 선택된다. 혼합물로서 슈크로스, 만니톨 및 도데실 β-말토사이드를 함유하는 동결건조 기질이 통상적으로 사용된다. 이어서 본 발명에 따른 유화액을 동결건조시키고 동결건조물의 형태로 보존할 수 있다. 그러나, 상기는 그의 모든 특성들을 보존하며, 따라서 일단 수성 상에 용해되면, 다시 동결건조 이전에 존재했던 것과 유사한 오일 소적 크기 분포를 갖는 유백색의 안정한 유동성 열가역성 O/W 유화액으로 된다.
본 발명에 따른 유화액은 또한 항원에 대한 면역 반응의 항원보강제의 역할을 한다. 본 발명의 목적을 위해서, "항원"이란 용어는 살아있는 것인지, 감독된 것인지 또는 죽은 완전한 미생물인지, 미생물의 추출물인지 또는 서브유닛 형태인지에 관계없이, 백신에 사용될 수 있는 임의의 항원을 의미하는데 사용된다. 상기가 서브유닛 형태인 경우, 상기 항원의 성질은 거의 중요하지 않으며; 상기는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 폴리사카라이드, 당지질, 리포펩타이드 또는 핵산일 수 있다. 본 발명의 주제에 적합한 항원들 중에는 클로스트리듐 테타니 , 클로스트리듐 디프테리아에, 보르데텔라 페르투시스 , 하에모필루스 인플루엔자에 유형 b, 스 트렙토코커스 뉴모니아에 , 네이세리아 메닌지티디스 , 시겔라 스페시즈 , 살모넬라 타이피, 스타필로코커스 아우레우스 또는 스타필로코커스 에피더미디스 , 마이코박테리움 튜베르큘로시스 , 클라미디아 트라코마티스 또는 스트렙토코커스 스페시즈로부터 기원하는 세균 항원, A, B 또는 C형 간염 바이러스, 독감 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 광견병 바이러스, 폴리오바이러스, HIV 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황색열 바이러스, 거대세포바이러스 또는 헤르페스 바이러스로부터 기원하는 바이러스 항원, 특히 플라스모디움 스 페시즈로부터 기원하는 기생충 항원 또는 종양 항원을 들 수 있다. 이들 항원을 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 유전자 재조합 방법 또는 추출 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 본 발명에 따른 유화액은 특이 항체의 생산을 증가시킴으로써 체액 면역성에 대해 및/또는 특히 T 림프구 증식, 특이 세포용해 반응(CTL 반 응)의 발생 및/또는 활성화된 림프구에 의해 생산된 사이토킨, 케모킨 및 성장 인자의 생산을 촉진시킴으로써 특이 세포 면역성에 대해 작용한다.
이러한 이유로, 본 발명의 주제는 또한 백신 조성물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 유화액의 용도이다. 수득된 백신 조성물은, 예를 들어 상기 조성물이 체액 유형 및/또는 세포 유형이든지 간에 보다 큰 특이적인 면역 반응을 유도하거나, 또는 보다 적은 양의 항원이 동일한 강도 및 필적할만한 지속 기간의 면역 반응을 획득하기 위해 필요하기 때문에, 보다 더 면역원성인 것으로 입증된다. 본 발명에 따른 유화액으로부터 수득한 백신 조성물을 백신에 통상적으로 사용되거나 권장되는 임의의 경로, 즉 비 경구, 피 내, 피하, 근육 내 또는 점막에 의해 투여할 수 있으며, 다양한 형태, 특히 액체 또는 동결건조된 형태일 수 있다. 상기를 주사기에 의해 또는 근육 내, 피하 또는 피 내 주입용의 무바늘 주입기에 의해 또는 코 스프레이에 의해 투여할 수 있다.
상기 백신 조성물은 일반적으로는 본 발명에 따른 유화액과 항원과의 혼합물의 형태이다. 상기는 또한 일시 제형의 형태로 존재할 수도 있다. 이 경우에, 상기 항원 및 유화액을 상기 백신 조성물의 투여 직전 또는 투여 시에 접촉시킨다. 예를 들어, 상기 항원을 동결건조시키고 투여 직전에 상기 유화액에 용해시키거나, 또는 역으로, 상기 유화액이 동결 건조된 형태로 존재하고 이를 항원 용액으로 용해시킬 수 있다. 상기 백신 조성물은 또한 상기 항원과 유화액의 혼합을 원하지 않을 때 특수 주입 장치, 예를 들어 "우회" 주사기 중에 있을 수도 있다.
상기 백신 조성물이 항원 용액에 의한 본 발명에 따른 유화액의 희석에 의해 수득된 혼합물의 형태일 때, 상기는 대개 스쿠알렌의 양이 일반적으로 상기 조성물의 전체 중량의 0.5 내지 5 중량%를 차지하는 O/W 유화액의 형태이다. 상기는 또한 상기 백신 조성물 중의 스쿠알렌의 양이 5%(w/w)에 도달하거나 이를 초과할 때 열가역성 O/W 유화액의 형태로 존재할 수 있다. 상기 백신 조성물이 열가역성 O/W 유화액인 경우, 상기는 특히 상기 오일 소적의 집단 부피의 90% 이상이 ≤0.2 ㎛의 크기를 갖는 형태로 존재할 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 유화액은 미세유동화에 의해 수득된 종래 기술의 O/W 유화액(그의 조성물은 스쿠알렌, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올리에이트(트윈® 80) 및 솔비탄 트라이올리에이트(스판® 85)를 함유한다)(종래 기술의 O/W 유화액) 보다 중화 항체를 유도하는 능력이 더 크다.
중화 항체는 감염성 미생물과 관련되거나 이로부터 유도된 항원으로 면역된 개인 또는 상기 미생물과 접촉한 개인에 의해 생산되고 상기 미생물에 의해 상기 세포의 감염이 방지되는, 상기 미생물에 대한 작용성 항체이다. 상기는 세포 내 미생물, 특히 바이러스 및 단세포 기생충, 특히 플라스모디움 스페시즈에 의해 유발된 감염의 예방 또는 치료에 매우 중요한 역할을 한다. 플라스모디움 팔시파룸의 "스포로조이트" 형으로부터 기원하는 항원(예를 들어 상기 스포로조이트의 주요 표면 단백질(서컴스포로조이트 단백질), LSA3, 또는 Pfs 16 항원), 및 플라스모디움 팔시파룸의 "메로조이트" 형으로부터 기원하는 항원(예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, EBA-175, Rhop-1, Rhop-2, Rhop-3, RAP-1, RAP-2, RAP-3, Pf155/RESA 또는 AMA-1 항원)은 중화 항체를 유도한다. 플라스모디움 팔시파룸 스포로조이트 또는 메로조이트로부터 유래하는 하나 이상의 항원을 함유하는 백신 조성물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 유화액의 용도는 상기 중화 면역 반응을 증폭시키는데 지시된다. 본 발명에 따른 유화액을 특히 백신 항원으로서 플라스모디움 팔시파룸 LSA3 단백질을 포함하는 백신 조성물의 제조에 사용할 수 있다. 상기 단백질을 암호화하는 유전자는 가드너 등(Gardner et al.)(Science(1998), 282, 1126-1132)에 의해 동정되었으며 이는 팔라스모디움 팔시파룸(균주 3D7)의 염색체 2 상에 있다. 상기 유전자의 완전한 서열은 12240 염기쌍 길이이며 1558 아미노산 단백질을 암호화한다. 상기 뉴클레오타이드 및 단백질 서열은 EMBL 데이터뱅크에 수탁 번호 AE001424 및 유니프롯 번호 096275-PLAF7으로 개시되어 있다. 개시된 바와 같은 전체 단백질, 또는 상기 단백질의 단편, 예를 들어 WO 02/38176에 개시된 것들을 백신 항원으로 사용할 수 있다. 상기 전체 단백질(플라스모디움 팔시파룸의 균주들간에 존재하는 변이를 고려하여 하나 이상의 점 돌연변이를 함유할 수 있다) 또는 상기 단백질의 단편(그의 아미노산 서열은 유니프롯 096275-PLAF7에 개시된 전체 서열에 대해 80% 이상의 일치율을 갖는다)을 통상적으로 사용한다. 몇몇 항바이러스 백신의 유효성을 몇몇 경우, 상기 백신이 유도하는 중화 항체의 역가를 근거로 평가한다. 이는 독감 백신의 경우이며, 그의 유효성은 헤마글루틴화-억제(HAI) 항체의 역가와 관련된다.
본 발명에 따른 유화액을 사용하여 독감 바이러스와 관련된 인간 또는 동물(조류, 말)의 감염성 질병의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물을 제조한다. 상 기 독감 백신의 성질에 따라, 상기 백신 조성물은 다양한 형태로 존재할 수 있다:
-상기 독감 백신이 하나 이상의 불활성화된 전체 또는 "분열" 바이러스 균주를 함유하거나, 또는 하나 이상의 바이러스 균주로부터 정제된 헤마글루티닌을 함유하는 서브유닛 백신의 형태 또는 비로솜(베르나 백신)의 형태인 경우, 상기 백신 조성물은 대개 혼합물, O/W 유화액, 또는 열가역성 O/W 유화액의 형태이다.
-상기 독감 백신이 하나 이상의 생 감독된 바이러스 균주를 함유하는 경우, 상기 백신 조성물은 바람직하게는 상기 생 바이러스가 상기 유화액과 직접 접촉하지 않도록 우회 주사기 유형의 장치 중에 있다. 본 발명에 따른 바이러스 현탁액 및 유화액은 상기 주사기의 2 개의 다른 구획 안에 있다.
상기 독감 백신을 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법에 따라 알 또는 세포 중에서 배양한 독감 바이러스로부터 제조하며, 상기는 모두 필수 성분으로서 하나 이상의 바이러스 균주의 헤마글루티닌을 포함한다.
따라서 본 발명의 주제는 또한 백신 항원으로서 하나 이상의 독감 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 백신 조성물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 유화액의 용도이다. 상기 백신 조성물을 사용하여 하기를 면역화할 수 있다:
1) 독감 바이러스에 대하여 혈청반응음성인 개인 집단: 이들은 상기 독감 바이러스 또는 그의 면역원 성분과 접촉한 적이 없거나 또는 감작되지 않은 개인, 또는 유행병의 원인인 새로운 독감 바이러스 균주와 접촉한 적이 없는 개인이다;
2) 상기 독감 바이러스에 대하여 혈청양성인 개인 집단: 이들은 이미 상기 독감 바이러스 또는 그의 면역원 성분과 접촉하였거나 감작된 개인이다;
3) 세포 및/또는 체액 면역성의 손상을 통상적으로 나타내는, 특히 상기 독감 바이러스에 관하여 관찰된 노인 집단.
본 발명에 따른 유화액을 또한 헤르페스 바이러스(HSV1, HSV2, 거대세포바이러스(CMV))에 의해 유발된 감염성 질병의 치료 또는 예방용 백신 조성물의 제조에 사용한다. 바이러스 외막 항원이 상기 백신 조성물에 일반적으로 사용된다. CMV 감염에서, 상기 바이러스 외막 단백질, 주로 당단백질 B(gB) 및 당단백질 H(gH)에 대한 항체로, 상기 바이러스 감염을 중화하는 항체는 보호 면역성의 발생에 매우 중요한 역할을 한다. CMV 외막 단백질을 함유하는 백신 조성물의 제조에서 본 발명에 따른 유화액의 사용은 중화 항체의 생산을 증가시키는 효과를 갖는다.
따라서 본 발명의 주제는 백신 항원으로서 CMV 외막 항원을 포함하는 백신 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 유화액의 용도이다. 전형적으로는, 상기 항원은 gB 당단백질 및/또는 gH 당단백질이다. 상기는 또한 하나 이상의 중화 에피토프를 포함하는, gB 및/또는 gH로부터 유도된 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
CMV의 UL 55 유전자에 의해 암호화된, 고유 형태(gp130)의 gB는 AD169 균주 또는 타운(Towne) 균주의 관련 여부에 따라 906 또는 907 아미노산의 당단백질이다. 이들 두 균주의 단백질 서열은 US 2002/0102562(도 2)에 개시되어 있다. gB의 고유 형태는 아르기닌 460과 세린 461 잔기 사이에 단백질내 분해적 절단 부위를 함유하는 세포 외 도메인, 막통과 도메인 및 세포 내 도메인이 이어지는 신호 서열을 함유한다. 중화 항체를 유도하는 여러 항원 도메인들이 개시되었다. 이는 특히 gp130의 아미노산 잔기 461과 680 사이에 위치한 도메인을 포함하며, 상기 도메인은 2 개의 불연속도메인, 즉 461과 619 잔기 사이의 도메인, 및 620과 680 잔기 사이의 도메인으로 분류된다(US 5,547,834). 상기는 또한 아미노산 잔기 552와 635 사이에 위치한 AD-1 도메인, 또는 아미노산 잔기 50과 77 사이에 위치한 AD-2 도메인을 포함한다(General Virology(1999), 80, 2183-2191; Virology(2005), 79, 4066-4079의 저널 참조). 결과적으로, 아미노산 서열 중에 상기 언급한 도메인들 중 하나와 상동성인 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본 발명의 주제에 적합하다. 전형적으로, 상기 폴리펩타이드는 그의 아미노산 서열 중에 gp130의 잔기 461과 680 사이에 위치한 것과 상동성인 서열, 또는 보다 구체적으로 잔기 552와 635 사이에 위치한 것과 상동성인 서열을 포함한다. "상동 서열"이란 용어는 상기 타운 또는 AD 169 균주(US 2002/0102562에 개시됨)의 gp130 상에 위치한 고려 중인 항원 도메인의 아미노산 서열과 80% 이상의 일치율을 갖는 임의의 아미노산 서열을 의미하는데 사용된다. 전형적으로 서열 상동성은 90% 이상의 일치율에 근거하며, 훨씬 더 특히 서열 상동성은 100%의 서열 일치율에 근거한다.
본 발명의 주제에 적합한 gB-유도된 펩타이드 또는 폴리펩타이드 중에서, 특히 US 5,547,834에 개시된 바와 같은 gp55를 들 수 있다. 상기는 단백질 내 분해적 절단 부위에서의 gB의 절단으로부터 유도되며; 그의 아미노산 서열은 세린 잔기 461과 C-말단 단부 사이에 있는 것에 상응한다. gp55의 말단 불활성화된 형태, 예를 들어 막통과 서열의 전부 또는 일부 및 세포 내 C-말단 도메인의 전부 또는 일부가 고갈된 gp55(예를 들어 잔기 461과 646 사이의 gp130의 아미노산 서열과 상동 성인 서열을 갖는 펩타이드) 또는 세포 내 C-말단 도메인의 전부 또는 일부가 고갈된 gp55(예를 들어 잔기 461과 680 사이의 gp130의 아미노산 서열과 상동성인 서열을 갖는 펩타이드)(US 5,547,834에 개시됨)를 또한 사용할 수 있다. 또한 후자가 무능하도록 단백질 내 분해적 절단 부위에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 gB의 변이된 형태를 사용하는 것도 또한 가능하다. 상기 돌연변이(들)는 gp130 서열의 잔기 457과 460 사이에 위치하고, 보다 특히 아르기닌 460 및/또는 리신 459 및/또는 아르기닌 457에 위치한다. 본 발명의 주제에 특히 적합한 CMV 외막 항원은 C-말단 도메인의 전부 또는 일부가 고갈되고/되거나 막통과 서열의 전부 또는 일부가 고갈되고 상기 절단 부위가 무능한 gB의 말단 불활성화된 형태이다. 특히 바람직한 gB의 말단 불활성화된 형태는 gBdTM이라 명명되는, US 6,100,064에 개시된 것에 상응하며; 상기는 상기 세포 외 도메인이 세포질 도메인에 직접 연결되도록 상기 절단 부위에 3 개의 돌연변이 및 아미노산 잔기 발린 677과 아르기닌 752 사이의 막통과 부위에 결실을 갖는다.
상기 gB 단백질 또는 상기로부터 유도된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 유전자 재조합 방법에 의해 수득하고 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법에 따라 정제한다. 참고로 인용된 US 6,100,064 및 US 2002/0102562에 개시된 방법을 특히 사용할 수 있다. 이들의 면역원성을 증가시키기 위해서, 이들을 부차적으로 담체 단백질에 접합하거나 또는 다른 단백질, 특히 B형 간염 표면 항원(HbS)과 같은 입자 형성 단백질에 융합시킬 수 있다. 상기 gB 단백질 또는 이로부터 유도된 펩타이드를 또한 재조합 바이러스, 특히 재조합 아데노바이러스 또는 재조합 폭스 바이러스에 의해 발현시킬 수 있다. gB 또는 유도된 펩타이드를 발현하는 상기 재조합 벡터를 제조하기 위해서, 특히 US 6,162,620, US 5,866,383, US 5,552,143, US 6,183,750, US 5,338,683 또는 WO 9215672 또는 WO 9639491에 개시된 방법들을 사용한다. gB를 또한 세포 배양액 상에서의 연속적인 계대배양에 의해 감독시킨 CMV의 균주, 특히 이미 백신용으로 시험된 타운 균주에 의해 제공할 수 있다.
상기 gH 단백질은 CMV의 UL75 유전자에 의해 암호화된다. 상기는 상기 균주가 타운 균주인지 AD169 균주인지에 따라 742 또는 743 아미노산의 당단백질이다. 상기 서열들은 US 5,474,914(도 1) 및 US 6,610,295(도 5(a))에 개시되어 있다. 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 gH의 단백질 서열은 신호 펩타이드에 이어서 단백질 내 분해적 절단 부위를 갖지 않는 세포 외 도메인, 막통과 도메인 및 C-말단 세포질 도메인을 함유한다. 상기 중화 에피토프는 세포 외 도메인 중에, 주로 상기 도메인의 N-말단 부분에, 보다 구체적으로 음성 gH의 단백질 서열의 아미노산 잔기 15와 142 사이에, 훨씬 더 구체적으로 아미노산 잔기 33과 142 사이에 있다. 상기 AD 169 균주의 주요 중화 에피토프가 동정되었으며 이는 gH 서열의 33과 43 번 잔기 사이에 있고 LDPHAFHLLL 서열을 갖는다(Urban M et al.: J. Virol(1992, vol 66/3, p1303-1311)). 결과적으로, 아미노산 서열 중에 서열 LDPHAFHLLL과 상동성인 서열 또는 gH의 단백질 서열의 잔기 15와 142 사이 또는 잔기 33과 142 사이에 있는 서열과 상동성인 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 본 발명의 주제에 적합하다. "상동 서열"이란 용어는 AD 169 균주의 gH의 단백질 서열의 잔기 15와 142 사이 또는 잔기 33과 142 사이에 있는 아미노산 서열과, 또는 서열 LDPHAFHLLL 과 80% 이상의 일치율을 갖는 아미노산 서열을 의미하는데 사용된다. 보다 특히, 상기 서열 상동성은 90% 이상의 일치율에 근거하며, 훨씬 더 특히 서열 상동성은 100%의 서열 일치율에 근거한다.
본 발명의 주제에 적합한 gH-유도된 펩타이드 또는 폴리펩타이드로서, 막통과 부위의 전부 또는 일부 및/또는 세포질 부위의 전부 또는 일부가 고갈된 gH를 들 수 있다. 전형적으로 상기는 5 개 이상, 바람직하게는 10 개 이상, 훨씬 더 바람직하게는 20 내지 34 개의 상기 아미노산 서열의 C-말단 잔기가 고갈된 gH 단백질에 상응한다.
상기 gH 단백질 또는 상기로부터 유도된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 유전자 재조합 방법에 의해 수득하고 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법, 특히 US 5,474,914 또는 US 5,314,800(참고로 인용된다)에 개시된 방법에 따라 정제한다. 이들의 면역원성을 증가시키기 위해서, 이들을 부차적으로 담체 단백질에 접합시킬 수 있다. 이들을 또한 문헌[J. Virol, 1992, vol 66/3, p1303-1311]에 개시된 바와 같이 융합 단백질의 형태로 제조할 수 있다. 상기 gH 단백질 및 이로부터 유도된 펩타이드를 또한 재조합 바이러스, 특히 재조합 아데노바이러스 또는 재조합 폭스바이러스에 의해 발현시킬 수 있다. 이들 gH 또는 유도된 형태를 발현하는 재조합 벡터를 제조하기 위해서, 특히 US 6,162,620, US 5,866,383, US 5,552,143, 또는 WO 9639491에 개시된 방법들을 사용한다. 상기 gH 단백질을 또한 세포 배양액 상에서의 연속적인 계대배양에 의해 감독시킨 CMV의 균주, 특히 이미 백신용으로 시험된 타운 균주에 의해 제공할 수 있다.
또한 백신 항원으로서 상기 gB 당단백질 또는 gH 당단백질(또는 상기 당단백질들의 말단 불활성화된 형태) 간의 융합으로부터 생성되는 단백질 및 HSV1 또는 HSV2(또는 그의 말단 불활성화된 형태)의 막 단백질을 사용할 수 있다. 예로서, EP 0759995에 개시된 융합 단백질, 특히 상기 CMV gB 당단백질의 일부와 상기 HSV gD 당단백질의 일부 사이의 융합으로부터 생성되는 gB 685* 및 gB 685**를 언급할 수 있다.
상기 CMV 항원의 성질에 따라, 백신 조성물은 하기의 다양한 형태로 존재할 수 있다:
-항원이 단백질 또는 펩타이드인 경우, 상기 백신 조성물은 혼합물, O/W 유화액 또는 열가역성 O/W 유화액의 형태일 수 있다. 상기는 또한 투여 직전에 제조되는 즉석 제제의 형태로 존재할 수 있다. 상기 백신 조성물은 또한 상기 유화액으로부터 상기 항원을 물리적으로 분리시키는 장치, 예를 들어 "우회" 주사기의 내부에 존재할 수 있다.
-상기 CMV 항원이 gB, gH 또는 gB 또는 gH로부터 유도된 펩타이드를 발현하는 재조합 바이러스의 형태로 존재하거나 또는 CMV의 감독된 균주의 형태로 존재하는 경우, 본 발명에 따른 유화액 및 항원은 대개 상기 백신 조성물 중에서 직접 접촉하지 않는다. 상기 항원 및 유화액은 이들을 물리적으로 분리시키는 장치, 예를 들어 "우회" 주사기의 내부에 존재할 수 있으나, 이들을 투여와 동시에 동일한 부위에 투여한다.
본 발명에 따른 유화액은 또한 특정 CD4+ T 세포 반응을, MHC II 등급 배경 하에서 제공된 항원에 반응하여 Th1 사이토킨(IL2, IFN-γ 등)의 생산을 촉진하고/하거나 Th2 사이토킨(IL4, IL5, IL10 등)의 생산을 감소시킴으로써 Th1 프로파일을 향해 배향시킨다. 이러한 효과를 생체 내 면역화에 사용된 것과 관련된 항원으로 시험관 내에서 재자극 후 생산된 IFN-γ 및 IL5의 양을 측정하고 상기 IFN-γ/IL5 비를 측정함으로써 평가한다. 상기 비가 높을수록, 상기 CD4+ 반응이 Th1 유형을 향하는 경향이 커진다. 상기 CD4+ T 세포 반응 프로파일을 또한 본 발명에 따른 백신 조성물로 마우스의 면역화 후에 획득한 특이적인 Ig2as/특이적인 IgG1s의 역가 사이의 비를 측정함으로써 간접적으로 평가할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 유화액을 사용하여 면역 결핍 또는 면역계의 손상을 보이는 몇몇 개인 집단에서 관찰되는 CD4+ T 세포 반응의 불균형을 보정할 수 있다. 이들은 특히 세포 내 미생물로부터 기원하는 항원, 특히 독감 항원에 의한 시험관 내 자극에 이은 IFN-γ 및/또는 IL2의 생산 결핍을 보이는 노인이다(Ouyang et al., Mechanisms of ageing and development, 2000, vol. 121, 131-137).
따라서 본 발명의 주제는 CD4+ T 세포 반응에 불균형을 보이는 개인 집단에 사용하기 위한 백신 조성물을 제조하기 위한, 본 발명에 따른 유화액의 용도이다.
본 발명의 주제는 또한 온도를 증가시킴으로써 W/O 역 유화액을 수득하는 단계 및 온도를 감소시킴으로써 상기 W/O 역 유화액을 O/W 유화액으로 전환시키는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 O/W 유화액의 제조 방법이다. 상기 전환은 상기 수득된 W/O 유화액을 상기 유화액의 상 전이 온도 아래의 온도로 낮출 때 발생한 다.
상기 방법의 하나의 실시태양에 따라, 상기 W/O 유화액을, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 및 TLR4 작용물질을 포함하는 수성 상을 스쿠알렌 및 비이온계 소수성 계면활성제를 포함하는 유성 상과 혼합하여 O/W 유화액을 수득하는 첫 번째 단계, 및 상기 O/W 유화액을 적어도 상기 유화액의 상 전이 온도인 온도로 가열하는 두 번째 단계를 수행함으로써 수득한다.
상기 수성 용액(대개는 완충된 용액), TLR4 작용물질(상기가 유성 상 중에 존재하지 않는 경우) 및 비이온계 친수성 계면활성제를 포함하는 수성 상을 스쿠알렌 및 비이온계 소수성 계면활성제를 포함하는 유성 상에 혼입하거나, 또는 이와 역으로 수행한다, 즉 상기 유성 상을 상기 수성 상에 혼입한다. 상기 혼입을 기계적 교반과 함께 수행한다. 눈금조정되지 않은, 불안정한 조 O/W 유화액이 수득된다(예비유화액). 상기 예비유화액을 상 전이가 획득될 때까지, 즉 W/O 유화액이 수득될 때까지 기계적으로 교반하면서 가열한다. 상기 상 전이 또는 변이에 이어서 전도변화가 있을 수 있다. 한 가지 유형의 유화액에서 또 다른 것으로의 통과를 반영하는 곡률 변화가 발생하는 온도가 상 전이 온도이다. 실제로, 상기 온도는 매우 특정한 온도 값이기보다는 온도 범위이다; 사실상, 상기 온도는 1도 또는 2도까지 변하여, 전체 유화액이 상 전이 현상을 겪을 수 있는 것으로 간주할 수 있다. 상기 유화액이 W/O 유화액의 형태인 경우, 전도도의 갑작스러운 강하가 관찰된다. 가열을 중단하고 상기 혼합물을 냉각시킨다. 냉각은 수동적으로, 단순히 상기 온도가 자발적으로 주변 온도로 돌아가게 함으로써, 또는 보다 능동적으로, 예를 들어 상기 유화액을 빙욕에 담금으로써 수행할 수 있다. 온도가 감소하는 동안, W/O 유화액은 다시 상 전이 온도에서 역전되어 다시 O/W 유화액을 제공할 것이다. 상기 유화액을 백신 항원을 포함하는 용액으로 희석을 기다리는 동안 그 대로 보관할 수 있다. 상기는 열가역성이며, 이는 상기가 다시 적어도 상 전이 온도와 같은 온도로 가는 경우, 다시 W/O 유화액으로 될 것임을 의미한다. 상기 상 전이 온도는 대개 45 내지 80 ℃, 전형적으로는 50 내지 65 ℃이다. 상기 유화액의 성분, 특히 TLR4 작용물질에는 따라서 상기 성분들의 화학적 분해 또는 상기 수성 상의 증발을 방지하는 보통의 가열이 가해진다.
또 다른 실시태양에 따라서, 상기 W/O 유화액을, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 및 TLR4 작용물질을 포함하는 수성 상 및 스쿠알렌 및 비이온계 소수성 계면활성제를 포함하는 유성 상을 적어도 상기 유화액의 상 전이 온도와 같은 온도에서 별도로 가열하고, 이어서 상기 수성 상과 유성 상을 적어도 상기 상 전이 온도와 같은 온도에서 상기 혼합물의 온도를 유지시키는 동시에 혼합하여 수득한다.
이 경우에, 상기 수성 및 유성 상을, 이들을 혼합하여 W/O 역 유화액을 제공하기 전에, 상기 상 전이 온도보다 약간 높은 온도로 별도로 가열하며, 상기 유화액을 후속적으로 마이크론 이하의 O/W 유화액이 수득될 때까지 냉각할 것이다. 상기 공정을 배치 제조를 위해 별도의 용기에서 수행할 수 있다.
또한 온-라인 제조 방법을 사용할 수도 있다. 상기 방법은 고온 조건 하에서 상기 별도로 제조된 두 수성 및 유성 상을 써모스탯이 있는 정적 혼합기를 통해 혼합한 다음, 상기 정적 혼합기의 유출구에 연결된 냉각된 열 교환기를 통해 온-라인 냉각시키고 이어서 적합한 용기(플라스크 또는 반응기)에서 본 발명에 따른 유화액을 최종적으로 회수하는 것이다. 교차된 블레이드가 도입되는 튜브의 축에 대해 기울어지는 상기 블레이드로 구성된 일련의 혼합 요소들로 이루어진 정적 혼합기가 성공적으로 사용되었다. 상기 혼합에 필요한 에너지는 상기 유체를 운반하는 펌프에 의해 제공되며 상기 혼합을 이동하는 부분 없이, 상기 혼합물의 구성성분의 연속적인 분리, 치환 및 조합에 의해 상기 혼합 요소를 통해 수행한다.
상기 온-라인 제조 방법을 하기의 방식으로 수행한다, 즉 수성 상 및 유성 상을 상기와 같이 2 개의 플라스크 또는 반응기에서 별도로 제조한다. 상기 두 상을 상기 상 전이 온도보다 약간 높은 온도로 교반하면서 가열한다. 이어서 상기 두 상을 2 개의 펌프에 의해 써모스탯이 있는 정적 혼합기에 도입시키며, 상기 두 펌프의 유속을 본 발명에 따른 유화액의 조성물을 수득하기 위해 조절한다. W/O 역 유화액을 상기 정적 혼합기를 통한 상기 두 상의 통과 중에 수득한다. 상기 역 유화액을 후속적으로 상기 정적 혼합기의 유출구에 연결된 냉각된 열 교환기를 통한 온-라인 통과에 의해 냉각시킨다. 이어서 상기 W/O 유화액을 상기 냉각된 열 교환기를 통해 역전시켜 O/W 유화액을 생성시키고, 이를 플라스크 또는 반응기에서 수거할 것이며, 상기의 특징은 배치 방법을 사용하여 수득한 유화액의 특징과 동일하다.
바로 위에서 개시한 방법의 실시태양에 대한 대안이 존재한다, 즉 상기 TLR4 작용물질의 양상은 친수성보다는 보다 소수성이며, 상기를 수성 상에 도입하기보다 는 유성 상에 도입시킨다. 상기 TLR4 작용물질을 또한 상기 유성 상과 수성 상의 혼합을 수행한 후에 또는 상기 유화액을 이미 가열했고 상기가 W/O 유화액 형태로 존재하는 경우에 도입시킬 수 있다. 상기 수성 상은 또한 알디톨을 함유할 수 있다. 최종적으로, 본 발명에 따른 유화액의 제조 방법은 다수의 연속적인 열전환 주기를 포함할 수 있다.
본 발명의 주제는 또한 하나 이상의 백신 항원을 TLR4 작용물질(그의 화학 구조는 당 고리를 포함하지 않는다)을 함유하는 O/W 유화액과 혼합하는 백신 조성물의 제조 방법이며, 상기 TLR4 작용물질을 함유하는 O/W 유화액을, 유화액을 온도의 증가에 의해 W/O 역 유화액의 형태로 수득하는 단계 및 상기 W/O 유화액을 온도 감소에 의해 O/W 유화액으로 전환시키는 단계를 포함하는 상 전이 방법에 따라 제조했음을 특징으로 한다.
간단한 실시태양은 백신 항원의 수용액을 바로 앞에서 개시한 실시태양들 중 하나에 따라 수득한 열가역성 O/W 유화액에 혼합시키는 것이다. 상기 수득된 백신 조성물은 O/W 유화액의 형태 또는 스쿠알렌의 양이 상기 백신 조성물의 전체 중량의 5% 이상을 차지할 때 열가역성 O/W 유화액의 형태이다. 한편으로, 상기 항원을 유화액의 제조 전에 수성 상 또는 유성 상과 혼합할 수 있다. 이러한 방식으로 상기 과정을 수행하는 것은 물론 상기 항원이 상기 열전환 방법에 적합한 항원임을 의미한다. 상기 항원 용액은 또한 무기 염 및 하나 이상의 완충액, 및 또한 백신에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 화합물, 예를 들어 안정제, 보존제 또는 임의로 또한 다른 항원보강제를 함유할 수 있다. 지시를 목적으로, 상기 수용액 중의 항원 농도는 일반적으로 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖이다.
본 발명에 따른 방법은 또한 동결건조 단계를 포함할 수 있다. 농축된 액체 유화액을 먼저 바로 개시한 바와 같이 제조하지만, 바람직하게는 수성 용액으로서 완충된 용액보다는 물을 선택한다. 상기 유화액을 후속적으로 알디톨, 당 및 알킬폴리글리코사이드를 포함하는 동결건조 기질로 희석한다. 통상적으로 사용되는 동결건조 기질은 만니톨, 슈크로스 및 도데실 말토사이드를 포함한다. 이어서 희석된 유화액을 샘플들(예를 들어 0.5 ㎖)로 분할하고 동결건조 주기를 가하며, 상기 주기를 하기의 방식으로 수행할 수 있다:
- 샘플들을 +4 ℃에서 부하한다,
- -45 ℃의 고정 온도에서 대략 2 시간 동안 동결시킨다,
- 0 ℃의 고정 온도에서 14 내지 19 시간 동안 1 차 건조시킨다,
- +25 ℃의 고정 온도에서 3 시간 30 분 동안 2 차 건조시킨다.
상기 수득된 동결건조물을 일반적으로는 하나 이상의 백신 항원과 혼합하기 전에 +4 ℃ 범위의 온도에서 보존한다. 따라서 본 발명에 따른 백신 조성물을, 상기 동결건조된 유화액을 항원 수용액으로 용해시킴으로써 제조할 수 있으며, 이어서 상기를 그대로(즉 액체 상태로) 또는 동결건조물의 형태로(상기 항원의 성질이 이를 허용하는 경우) 보존하기 위해서 추가의 동결건조 주기를 가할 수 있다. 한편으로, 상기 농축된 유화액을 백신 항원과 알디톨, 당 및 알킬폴리글리코사이드를 모두 포함하는 수성 용액으로 직접 희석하고, 후속적으로 상기 수득된 조성물을 동결건조시킬 수 있다. 상기와 같은 상기 과정의 수행 방식은 물론 상기 항원이 동 결건조 방법에 적합함을 암시한다.
하기의 실시예들은 본 발명의 다양한 실시태양들을 비 제한적인 방식으로 예시한다.
실시예 I: 스쿠알렌 32.4%(w/w)를 함유하는 농축된 열가역성 O/W 유화액의 제조
포스페이트 완충액 중의 만니톨 18%(w/w)의 용액을 40 ℃에서 기계적으로 교반하면서 제조하였다. 유멀진TM B1 0.093 g을 상기 용액 0.454 g에 가하고, 이를 40 ℃에서 5 분간 기계적으로 교반하면서 균질화하였다.
50 mM 트리스 완충액 중의 화학적 화합물 ER804057 1000 ㎍/㎖을 함유하는 모 현탁액을 제조하였다. ER804057의 모 현탁액 390 ㎕를 B1TM/만니톨 혼합물에 가하였다.
또 다른 용기에서, 데하이뮬스TM SMO 0.073 g을 스쿠알렌 0.484 g과 혼합하고 상기 혼합물을 30 ℃에서 5 분간 기계적 교반에 의해 균질화하였다.
ER804057을 함유하는 수성 상의 내용물을 후속적으로, 대략 30 ℃에서 교반하면서 상기 데하이뮬스TM SMO/스쿠알렌 혼합물을 함유하는 유성 상에 혼입하였다.
상기 수득된 조 유화액을 상기 온도가 60 ℃에 도달할 때까지 기계적으로 교반하면서 가열하였다. 상기 온도는 상기 조성물의 상 전이 온도에 상응한다. 이때 상기 유화액은 역 유화액(W/O 유화액)의 형태이다. 가열을 후속적으로 중단하 였지만, 교반은 상기 온도가 실험실의 주변 온도(∼20 ℃)에 도달할 때까지 유지시켰다. 상기 유화액은 O/W 유화액의 형태로 복귀한다.
따라서 균질한 열가역성 O/W 유화액을 수득하였으며, 여기에서 상기 오일 소적의 집단 부피의 90% 초과가 크기 ≤200 ㎚를 가지며 상기 조성물의 중량은 하기와 같다:
스쿠알렌 32.4%
세테아레트-12(유멀진 B1) 6.2%
솔비탄 모노올리에이트(데하이뮬스 SMO) 4.9%
만니톨 5.5%
ER804057 0.026%
따라서 상기 항원보강제 유화액 중의 스쿠알렌의 양은 상기 유화액의 전체 중량의 32.4%를 차지한다.
또 다른 변형에서, 포스페이트 완충제 50.5 g, 만니톨 6 g, 유멀진TM B1 6.18 g 및 ER804057 0.026 g을 함유하는 혼합물을 비이커에서 제조하였다. 상기 혼합물을 대략 40 ℃에서 계속 교반하였다. 상기 오일 상을 또 다른 용기에서 스쿠알렌 32.5 g은 데하이뮬스 SMO 4.8 g과, 상기 데하이뮬스 SMO가 완전히 용해될 때까지 기계적으로 교반하면서 혼합하여 제조하였다. 상기 균질한 상이 수득되었으면, 상기 수성 상을 유성 상에 혼입하고 온도 증가 단계에 이어서 온도 감소 단계를 상기와 같이 수행하였다. 균질한 열가역성 O/W 유화액이 수득되었으며, 여기 에서 상기 오일 소적의 집단 부피의 90% 초과가 크기 ≤200 ㎚를 가지며 상기 조성물의 중량은 하기와 같다:
스쿠알렌 32.5%
세테아레트-12(유멀진 B1) 6.2%
솔비탄 모노올리에이트(데하이뮬스 SMO) 4.8%
만니톨 6%
ER804057 0.026%
PBS 50.5%.
상기 방법의 또 다른 변형에서, 시트르산 모노하이드레이트 0.83 mM을 시트르산 나트륨 9.14 mM과 혼합하여 제조한 시트레이트 완충액(pH 6.04)을 상기 PBS 완충액 대신에 사용하였다.
상기 농축된 스쿠알렌 유화액을 "모" 유화액으로서 사용하였으며, 이로부터 포스페이트 완충액, 트리스 완충액 또는 시트레이트 완충액의 희석에 의해 묽은 열가역성 O/W 유화액이 유도되었으며, 이어서 이를 여과에 의해 멸균시켰다(실시예 II 참조). 상기 묽은 O/W 유화액을 후속적으로 하나 이상의 백신 항원(실시예 III, IV 및 V 참조)과 혼합한다.
실시예 II : 스쿠알렌 5%(w/w)를 함유하는 묽은 열가역성 O/W 유화액의 안정성에 대한 연구
실시예 1의 농축된 유화액을 스쿠알렌의 양이 상기 유화액의 전체 중량의 5%를 차지하는 묽은 유화액을 수득하기 위해서 9.6 mM 포스페이트 완충액(pH = 7.4) 으로 희석하였다. 5%의 PIT-ER804057이라 칭하는 묽은 유화액의 조성은 하기와 같았다:
스쿠알렌: 50 ㎎/㎖
세테아레트-12(유멀진 B1): 9.5 ㎎/㎖
솔비탄 모노올리에이트(데하이뮬스 SMO): 7.4 ㎎/㎖
만니톨: 9 ㎎/㎖
ER804057: 40 ㎍/㎖
상기 열가역성 유화액의 안정성을, 상기 유화액 중의 ER804057 함량 및 상기 유화액의 크기 분포를 입증함으로써 +4 ℃의 온도에서 6 개월 동안 보관한 후에 평가하였다. ER804057을 분석하기 위해서, 상기 유화액으로부터 ER804057의 선택적인 추출을 수행한 다음, 다이오드 배열 검출기(UV 검출)에 커플링된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 분석을 수행하였다. 상기 입증된 유화액의 ER804057 함량은 ER804057 5 내지 25 ㎍/㎖을 함유하는 표준 범위를 사용하여 측정되었다. 추출 수율을 상기 변화에 대해 보상하기 위해서 내부 표준(그의 화학식은 ER804057의 경우와 매우 유사하다)의 일정한 양을 분석할 각 샘플(상기 표준 범위의 샘플 포함)에 도입시켰다. 상기 내부 표준은 ER803022라 칭하는 화학 분자이다.
상기 표준 범위를, 동일한 조성을 갖고 하기를 제외하고 5% 유화액(실시예 II 비교)으로 PIT-ER804057과 동일한 방식으로 제조한 열가역성 유화액으로부터 제조하였다: 상기 유화액은 ER804057(5% 유화액 PIT)을 함유하지 않았으며, 여기에 메탄올 부피당 클로로폼 2 부피를 함유하는 혼합물(혼합물 CM 2:1) 0.1 ㎎/㎖의 ER804057의 모액으로부터 취한 다양한 양의 ER804057, 및 혼합물 CM 2:1 0.1 ㎎/㎖의 내부 표준의 모액으로부터 취한 고정된 양의 내부 표준(10 ㎍)(주사 가능한 제제를 위해 수중에서 적합하게 희석되었다)을 가하였다.
분석할 5%의 PIT-ER804057 샘플을, 5%의 유화액 PIT-ER804057의 분액을 취하여 제조하였으며, 여기에 내부 표준 10 ㎍을 가하고 이를 주사 가능한 제제를 위해 수중에서 희석하였다.
표준 범위의 샘플 또는 5%의 PIT-ER804057의 샘플로부터의 ER804057의 추출을 하기의 방식으로 수행하였다: 상기 샘플을 CM 2:1로 용해시켰다. 상기 수득된 2-상 시스템은 ER804057을 우세하게 함유하는 클로로폼 상 및 상기 유화액의 다른 화합물을 함유하는 수성 상으로 구성된다. 상기 클로로폼 상을 회수하고 이를 질소 스트림 하에 고온 조건 하에서 증발시켰다. 상기 수득된 건조 추출물을 용해시키고 다시 CM 2:1 혼합물에 용해시켰다. 상기 혼합물을 CM 2:1 혼합물에 미리 평형화시킨 음이온 교환 카트리지 상에 부하하였다. 상기는 ER804057 및 내부 표준(음으로 하전됨)을 선택적으로 유지시키는 반면, 상기 유화액의 다른 성분들(하전되지 않음)은 제거되었다. ER804057 및 내부 표준을 1M NaCl의 부피당 2 부피의 클로로폼 및 3 부피의 메탄올을 함유하는 혼합물에 의해 용출시켰다. 상기 용출물을 후속적으로 질소 스트림 하에 고온 조건 하에서 건조시켰다. 최종적으로, 최종 추출을, 잔류 염을 제거하고 클로로폼 상(이는 최종적으로 질소 스트림 하에 고온 조건 하에서 증발되었다) 중의 내부 표준 및 ER804057을 회수하기 위해서 물 및 CM 2:1을 사용하여 수행하였다. 각 샘플로부터 유래된 건조 추출물을 HPLC에 의해 분 석하기 전에 -20 ℃에서 보존하였다.
각 샘플의 건조 추출물을 50 ㎕의 CM 4:1로 용해시키고, 이어서 메탄올 중에서 1/2로, 이어서 주사 가능한 제제를 위해서 30% 아세토나이트릴-물의 혼합물 중에서 1/10으로 희석하였다. 상기 희석액 20 ㎕를 80%의 상 A(H3PO4 2%를 함유하는 주사가능한 제제/에탄올에 대한 50/50 물) 및 20%의 상 B(H3PO4 2%를 함유하는 에탄올)로 이루어진 이동 상으로 예비 평형화시킨 워터스(Waters) XTerraTM RP8 컬럼을 포함하는 액체 크로마토그래피 장치(Merck Hitachi HPLC, Lachrom series 7000)에 주입하였다. ER804057 및 내부 표준을 H3PO4 2%를 함유하는 에탄올의 구배를 사용하여 용출시켰다. 상기 HPLC의 유출구에서, 상기 용출물은 상기 다이오드 배열 검출기에 도달하였으며 분자들이 215 ㎚의 파장에서 검출되었다. 수득된 크로마토그램 상에서, 2 개의 피크(분석물 및 표준)의 표면적을 적분하고 보정하였다. 상기 샘플의 제조와 관련된 변화를 보정하기 위해서, ER804057(정량화된 분자) 및 ER803022(내부 표준) 쌍에 해당하는 피크의 표면적의 비와, ER804057 및 ER803022(내부 표준)에 해당하는 농도의 비 간의 표준 곡선을 작성하였다. 일단 상기 곡선이 작성되었으면, 5%의 유화액 PIT-ER804057 중에 존재하는 ER804057의 양을, ER804057/내부 표준 피크의 표면적의 비를 측정하고 표준 곡선과 비교함으로써 측정하였다.
+4 ℃에서 1 개월 +4 ℃에서 3 개월 +4 ℃에서 6 개월
ER 804057 (이론 농도 40 ㎍/㎖) 38 ㎍/㎖ 37 ㎍/㎖ 42 ㎍/㎖
상기 표에서 언급된 결과는 ER804057이 그의 구조 완전성을 보존하며 5%의 PIT-ER804057 유화액 중의 그의 농도가 상기 유화액을 +4 ℃에서 6 개월간 보존한 후에 실질적으로 변하지 않음을 보인다.
크기 분포 분석을, 상기 유화액을 마스터사이저(Mastersizer) 2000으로 1/100으로 희석한 후에 하기 매개변수들을 사용하여 수행하였다: IR 입자 = 1.495; IR 매질 = 1.332; 흡수 값 = 0; 하부 모호성 한계 = 4%; 상부 모호성 한계 = 7%; "일반적인 목적"의 분석 모델. 각각의 크기 분포 분석을 위해서, 하기의 매개변수들을 평가하였다: d10, d50 및 d90(이들은 각각 오일 소적의 집단 부피의 각각 10%, 50% 및 90%가 발견된 평균 입자 직경의 값을 나타낸다).
T = 0 T = 3 개월 T = 6 개월
d10 71　nm 70　nm 70　nm
d50 103　nm 100　nm 101　nm
d90 155　nm 152　nm 153　nm
상기 결과는 상기 유화액의 크기 분포가 6 개월 이상의 기간에 걸쳐 +4 ℃에서 안정함을 보인다.
실시예 III : 본 발명에 따른 O/W 유화액으로부터 제조된, 거대세포바이러스 감염에 대한 백신 조성물
백신 항원으로서 CMV의 gB 당단백질로부터 유도된 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물을 제조하였다. 상기 재조합 단백질은 pPRgB27clv4(변형된 gB 유전자를 함유한다)로 지칭되는 플라스미드로 형질감염된 재조합 CHO 주에 의해 생산되었다. 상기 CHO 주에 의한 상기 재조합 단백질의 생산을 촉진하기 위해서, 상기 gB 유전자(그의 서열은 US 5,834,307에 개시됨)를, 사전에 발린 677 내지 아르기닌 752의 아미노산 서열에 상응하는 gB 단백질의 막통과 영역을 암호화하는 유전자의 부분을 결실시키고 절단 부위에서 3 개의 점 돌연변이를 도입시킴으로써 변형시켰다. gBdTM이라 지칭되는, CHO 주에 의해 생산된 단백질은 상기 절단 부위 및 막통과 영역이 고갈된 말단 불활성화된 gB 단백질에 상응한다.
플라스미드 pPRgB27clv4의 제작 및 재조합 CHO 주에 의한 말단 불활성화된 gB 단백질(gBdTM)의 생산은 US 6,100,064에 개시되어 있다. 상기 배양 배지 중에 생산된 gBdTM 단백질을 후속적으로 문헌[Rasmussen L et al. J. Virol. 1985 55:274-280]에 개시된 단클론 항체 15D8을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 상기 정제된 단백질을 포스페이트 완충액 중에 gBdTM 0.975 ㎎/㎖을 함유하는 모액의 형태로 보관하였다.
다양한 조성의 O/W 유화액 또는 수산화 알루미늄의 현탁액으로 제형화된 gBdTM의 면역자극 조성물을 제조하였다.
조성물 1 번은 50 ㎕의 시트레이트 완충액(pH 6) 중의 gBdTM 2 ㎍을 함유하였다(그룹 gB).
조성물 2 번은 50 ㎕의 시트레이트 완충액(pH 6) 중의 gBdTM 2 ㎍, 스쿠알렌 1.075 ㎎, 솔비탄 트라이올리에이트(몬탄TM VG 85) 0.133 ㎎ 및 트윈TM 80 0.125 ㎎을 함유하였다(그룹 gB+O/W 유화액). 상기 조성물은 gB의 용액을 미세유동화에 의해 수득한 종래 기술의 O/W 유화액과 부피 대 부피로 혼합하여 수득하였다.
조성물 3 번은 50 ㎕의 포스페이트 완충액 중의 gBdTM 2 ㎍ 및 수산화 알루 미늄 60 ㎍을 함유하였다(그룹 gB+AL).
조성물 4 번은 50 ㎕의 PBS 완충액(pH 7.4) 중의 gB 2 ㎍, 스쿠알렌 1.25 ㎎, 데하이뮬스TM SMO 0.187 ㎎, 유멀진TM B1 0.237 ㎎ 및 만니톨 0.225 ㎎을 함유하였다. 상기 조성물은 gB의 용액을, 5%의 스쿠알렌을 함유하는 열가역성 O/W 유화액과 부피 대 부피로 혼합하여 수득하였다(그룹 gB+PIT). 상기 조성물의 제조에 사용된 열가역성 O/W 유화액은 32.5%의 스쿠알렌(w/w)을 함유하는 농축된 열가역성 O/W 유화액(수성 상이 어떠한 ER804057을 함유하지 않았다는 사실을 제외하고, 실시예 1에 개시된 바와 동일한 방법을 사용하여 제조하였다)의 희석에 의해 수득하였다.
조성물 5 번은 50 ㎕의 시트레이트 완충액(pH 6) 중의 gBdTM 2 ㎍ 및 ER804057 1 ㎍을 함유하였다(그룹 gB+ER804057).
조성물 6 번은 50 ㎕의 시트레이트 완충액(pH 6) 중의 gBdTM 2 ㎍, 스쿠알렌 1.25 ㎎, 몬탄TM VG 85 0.145 ㎎, 트윈TM 80 0.147 ㎎ 및 ER804057 1 ㎍을 함유하였다(그룹 gB+O/W 유화액+ER804057). 상기 조성물은 gB의 용액을, ER804057을 첨가한, 미세유동화에 의해 수득한 종래 기술의 O/W 유화액과 부피 대 부피로 혼합하여 수득하였다.
조성물 7 번은 50 ㎕의 포스페이트 완충액 중의 gBdTM 2 ㎍, ER804057 1 ㎍ 및 수산화 알루미늄 60 ㎍을 함유하였다(그룹 gB+Al+ER804057).
조성물 8 번은 50 ㎕의 PBS 완충액(pH 7.4) 중의 gB 2 ㎍, 스쿠알렌 1.25 ㎎, 데하이뮬스TM SMO 0.189 ㎎, 유멀진TM B1 0.240 ㎎, 만니톨 0.211 ㎎ 및 ER804057 1 ㎍을 함유하였다. 상기 조성물은 gB의 용액을, 실시예 1의 모액을 희석하여 수득한, 스쿠알렌 5%의 열가역성 O/W 유화액 PIT-ER804057과 부피 대 부피로 혼합하여 수득하였다(그룹 gB+PIT+ER804057).
8주된 암컷 이종교배된 OF1 마우스 8 그룹을 D0 및 D21일에 상기 나타낸 조성물로 피하 면역시켰다(각 그룹의 마우스에게 같은 조성물을 2 회 주입하였다).
D20 및 D34일에 안와후 공동으로부터 혈액 샘플을 취하고 이를 사용하여 gBdTM-특이적 IgG1 및 IgG2a 항체 농도를 측정하였다. 상기 분석을 ELISA에 의해, 다이넥스(Dynex) 96-웰 미세플레이트의 웰을 +4 ℃에서 밤새 0.05M 카보네이트 완충액(pH 9.6) 중의 gBdTM 100 ng(100 ㎕)으로 코팅하여 수행하였다.
중화 항체를 측정하기 위해서 문헌[Gonczol E. et al., J. Virological Methods, 14:37-41(1986)]에 개시된 프로토콜을 사용하였다.
10% 송아지 태아 혈청을 함유하는 MEM 배지에서 배양한 MRC5 세포를 미세중화 분석을 위해 28 내지 38 계대배양으로 사용하였다. 대략 2 x 106 PFU/㎖의 역가를 갖는, 정제되고 MRC5 세포 상에서 번식시킨 타운 CMV 균주(Wistar Institute, Philadelphia, US)를 감염 균주로 사용하였다. 마우스(Virion Ltd Institute, Switzerland로부터)의 혈청으로부터 수득한 보체의 공급원을 또한 사용하였다. 1:128의 역가를 갖는 인간 혈청의 혼합물을 양성 대조군으로 사용하였으며, 이를 각 미세중화 분석에 포함시킨다.
시험할 혈청을 56 ℃에서 30 분간 가열하여 불활성화시켰다. 배양 배지(MEM + 10% 송아지 태아 혈청) 105 ㎕를 편평 바닥 96-웰 배양 플레이트(1/8 희석)에서 각 불활성화된 혈청 15 ㎕ 분액에 가하였다. 이어서 일련의 2 배 희석물을 제조하였다. 대조용 혈청을 동일한 방식으로 시험하였다. 3000 PFU를 함유하는 바이러스 현탁액 60 ㎕ 및 마우스 보체 5 ㎕를 각 웰에 가하였다. 37 ℃에서 CO2 하에 1 시간 동안 배양 후에, 배양 배지 150 ㎕ 부피 중의 3-4 x 104 MRC5 세포를 각 웰에 가하였다. 미세배양물을 4일간 배양하였다. 상기 바이러스의 세포변성 활성은 어떠한 혈청도 함유하지 않은 웰에서 100%이었다. 한편으로, 상기 바이러스의 세포변성억제가 중화 혈청을 함유하는 웰에서 관찰되었다. 혈청의 중화 항체 역가는 상기 바이러스의 세포변성을 90% 초과하여 억제하는 그의 희석물의 역에 상응한다.
각 마우스 그룹에 대해 획득된 결과들을 하기 표에 제공한다:
마우스의 그룹 IgG1 at D20 IgG2a at D20 IgG1 at D34 IgG2a at D34 D34에서 IgG1/IgG2a 비
그룹 gB 2.47* 2.09 3.80 2.94 137
그룹 gB+O/W 유화액 4.06 2.98 5.49 4.18 143
그룹 gB+AL 3.06 1.85 4.90 3.33 357
그룹 gB+PIT 4.61 3.91 5.61 4.85 14
그룹 gB+ER804057 3.09 3.12 4.43 4.16 6
그룹 gB+PIT+ER804057 4.78 4.58 5.83 5.74 3
*: 혈청 희석물의 평균 역가(log10로 나타냄)
상기 결과는 마우스의 "gB+PIT+ER804057" 그룹에서 획득한 특이적인 IgG1 및 IgG2a 역가가 마우스의 "gB+AL" 또는 "gB+O/W 유화액" 그룹에서 획득한 것보다 현저하게 더 높기 때문에 PIT-ER804057 유화액이 다른 항원보강제들보다 더 큰 면억자극 능력을 가짐을 보인다. 본 발명에 따른 유화액의 면역자극 능력은 단지 상기 열가역성 유화액(PIT 유화액) 또는 TLA4 작용물질에 기인하는 것이 아니라, 상기 두 생성물의 조합에 기인한다. 상기 "gB+PIT" 및 "gB+ER804057" 그룹에서 관찰된 특이적인 IgG1 및 IgG2a 역가는 실제로 상기 "gB+PIT+ER804057" 그룹에서 관찰된 것보다 현저하게 더 낮다.
중화 항체 생산에 대한 요약표
마우스의 그룹 평균 중화 항체 역가
그룹 gB 16**
그룹 gB+O/W 유화액 32
그룹 gB+AL 32
그룹 gB+PIT 48
그룹 gB+ER804057 16
그룹 gB+O/W 유화액 H/E+ER804057 32
그룹 gB+AL+ER804057 32
그룹 gB+PIT+ER804057 128
**상기 바이러스의 세포변성 효과를 90% 초과하여 억제하는 혈청 희석물의 평균의 역
상기 결과는 CMV 외막 항원과, 본 발명에 개시한 바와 같은 TLR4 작용물질을 함유하는 열가역성 O/W 유화액과의 혼합으로부터 생성된 면역자극 조성물이 마우스에서 최고의 중화 항체 역가를 유도하는 것임을 보인다. 상기 PIT-ER804057 유화액은 시험된 다른 항원보강제 조성물보다 중화 항체 생산을 자극하는 능력이 더 크다. 상기 PIT-ER804057 유화액은 지금까지 출현한 CMV 단백질에 대한 표준 항원보강제인 것으로 간주되는 상기 MF59 유화액과 동일한 성분을 함유하는 종래 기술의 스쿠알렌 기재 O/W 유화액보다 더 유효한 것으로 밝혀졌다(중화 항체 생산을 자극하는 능력에 대하여). 또한 종래기술의 O/W 유화액에의 TLR4 작용물질의 첨가는 상기 유화액의 유효성을 증가시키지 않는 반면(중화 항체 역가가 동일한 것으로 남아있다), 열가역성 유화액(PIT)의 유효성은, 상기가 TLR4 작용물질을 함유하는 경우, 증가함(중화 항체 역가가 증가한다)은 물론이다.
실시예 IV : 본 발명에 따른 O/W 유화액으로부터 제조한 독감에 대한 백신 조성물
면역자극 조성물을 다양한 조성의 O/W 유화액 또는 수산화 알루미늄의 현탁액과 제형화된, 2004 캠페인의 3 백신 균주(A/New Caledonia(H1N1) 균주, A/Wyoming(H3N2), 및 B/Jiangus 균주)를 포함하는 항-독감 백신 조성물로부터 제조하였다.
조성물 1 번은 30 ㎕의 PBS 완충액 중의 각 바이러스 균주의 헤마글루티닌(HA) 0.3 ㎍을 함유하였다(0.3 ㎍ HA 그룹).
조성물 2 번은 30 ㎕의 PBS 중의 각 바이러스 균주의 헤마글루티닌(HA) 6.3 ㎍을 함유하였다(6.3 ㎍ HA 그룹).
조성물 3 번은 30 ㎕의 PBS 완충액 중의 각 바이러스 균주의 헤마글루티닌(HA) 0.3 ㎍, 스쿠알렌 0.65 ㎎, 솔비탄 트라이올리에이트(스판TM 85) 0.075 ㎎ 및 트윈TM 80 0.075 ㎎을 함유하였다(0.3 ㎍ HA+O/W 유화액 그룹). 상기 조성물은 항-독감 백신 조성물을 미세유동화에 의해 수득한 종래 기술의 O/W 유화액과 혼합하여 수득하였다.
조성물 4 번은 30 ㎕의 PBS 완충액(pH 7.4) 중의 각 바이러스 균주의 헤마글루티닌(HA) 0.3 ㎍, 스쿠알렌 0.75 ㎎, 데하이뮬스TM SMO 0.11 ㎎, 유멀진TM B1 0.143 ㎎ 및 만니톨 0.138 ㎎ 및 ER804057 0.6 ㎍을 함유하였다(0.3 ㎍ HA+PIT+ER804057 그룹). 상기 조성물은 항-독감 백신 조성물을 실시예 1에 개시된 바와 같은, PBS 완충액에 미리 희석시킨 열가역성 유화액과 혼합하여 수득하였다.
8 마리의 8 주된 암컷 BALB/c 마우스 8 개 그룹을 D0일에 30 ㎕ 용량의 상기 나타낸 면역자극 조성물들 중 하나를 피내 (귀의 안쪽 면)로 투여하여 면역시켰다.
혈액 샘플을 D21일에 상기 안와후 공동으로부터 취하여 상기 면역된 마우스의 각 그룹에서 획득한 각 바이러스 균주에 특이적인 중화 항체(헤마글루틴화-억제(HAI) 항체)의 역가를 측정하였다. 상기 분석의 원리는, 적혈구를 교착시키지만 독감 바이러스의 HA에 특이적인 중화 항체를 함유하는 혈청은 상기 바이러스의 "헤마글루틴화" 활성을 억제하는 상기 바이러스의 능력에 근거한다. 먼저, 상기 혈청 중에 함유된 비특이적 억제제를, 후자를 시그마 사에 의해 제공된 RDE 효소(수용체 파괴 효소)로 처리하고 이어서 이를 닭 적혈구 10% 용액과 접촉시켜 제거하였다. 비특이적 억제제가 없고 1/10으로 희석된 혈청에 상응하는 상등액을 수득하였다. 포스페이트 완충액 중의 상등액의 일련의 2 배 희석물을 연속적으로 제조하고 이어서 각 희석물 50 ㎕를 V-바닥 미세플레이트의 웰에 침착시켰다. 4 헤마글루틴화 단위(4HAU)로 적정한 등명화된 요낭 유체로부터 기원한 바이러스 현탁액 50 ㎕를 각 웰에 가하였다. 상기 플레이트를 실험실 온도에서 1 시간 동안 배양한 후에 상기 각 웰에 닭 또는 칠면조 적혈구 용액 50 ㎕를 가하였다. 상기 플레이트를 +4 ℃에서 1 시간 동안 정치시킨 후에 분석을 판독하였다. 헤마글루틴화 억제의 존재는 상기 미세웰 바닥의 붉은 반점의 존재에 의해 반영되는 반면, 헤마글루틴화의 존재는 상기 미세웰 중의 핑크색을 띤 무리의 존재에 의해 반영되었다. 상기 HAI 항체 역가는 상기 미세웰에서 헤마글루틴화가 관찰되지 않은 최종 희석의 역으로 나타낸다.
획득된 결과를 하기 표에 제공한다:
마우스의 그룹 A /뉴 칼레도니아에 대한 HAI (H1N1) A/와이오밍에 대한 HAI (H3N2) B/지앙수에 대한 HAI
0.3 ㎍ HA 26*** 174 8
6.3 ㎍ HA 247 907 73
0.3㎍ HA+O/W 유화액 135 987 57
0.3㎍ HA+PIT+ER804057 290 1522 98
***: 각 마우스 그룹의 8 개 혈청상에서 획득한 HAI 역가의 평균
상기 결과는 독감 백신을 TLR4 작용물질을 함유하는 열가역성 O/W 유화액과 혼합하여 수득한 백신 조성물이 다른 백신 조성물에 비해, 시험된 백신 균주와 무관하게 상기 마우스에서 최고의 중화 항체 역가를 유도하는 것임을 보인다. 상기 PIT-ER804057 유화액은 종래 기술의 O/W 유화액(그의 조성은 MF59와 유사하다)보다 심지어 약간 더 유효한 것으로 밝혀졌다(중화 항체 생산을 자극하는 능력에 관하여). 상기 유화액의 이점은 또한 상기 항원의 양을, PIT-ER804057 유화액과 혼합된 0.3 ㎍ 용량의 헤마글루티닌에 의해 획득된 결과가 20 배 더 높은 용량의 헤마글루티닌에 의해 획득된 결과보다 양호하므로, 크게 줄일 수 있다는 점에 있다.
또 다른 분석에서, 시간에 따른 헤마글루티닌-억제 항체 역가의 진전은 상기 2004 캠페인으로부터의 동일한 백신으로부터 제조된 다양한 면역자극 조성물로 면역된 마우스 그룹에서 이어졌다.
조성물 1 번은 30 ㎕의 PBS 완충액 중의 각 바이러스 균주의 헤마글루티닌(HA) 0.3 ㎍을 함유하였다(0.3 ㎍ HA 그룹).
조성물 2 번은 30 ㎕의 PBS 완충액 중의 각 바이러스 균주의 헤마글루티닌(HA) 6.3 ㎍을 함유하였다(6.3 ㎍ HA 그룹).
조성물 3 번은 30 ㎕의 수성 완충액 중의 각 바이러스 균주의 헤마글루티닌(HA) 0.3 ㎍ 및 ER804057 0.6 ㎍을 함유하였다(0.3 ㎍ HA+ER804057 그룹).
조성물 4 번은 30 ㎕의 PBS 완충액(pH 7.4) 중의 각 바이러스 균주의 헤마글루티닌(HA) 0.3 ㎍, 스쿠알렌 0.30 ㎎, 데하이뮬스TM SMO 0.044 ㎎, 유멀진TM B1 0.057 ㎎ 및 만니톨 0.055 ㎎을 함유하였다(0.3 ㎍ HA+PIT 1% 그룹).
조성물 5 번은 30 ㎕의 PBS 완충액(pH 7.4) 중의 각 바이러스 균주의 헤마글루티닌(HA) 0.3 ㎍, 스쿠알렌 0.30 ㎎, 데하이뮬스TM SMO 0.044 ㎎, 유멀진TM B1 0.057 ㎎ 및 만니톨 0.055 ㎎ 및 ER804057 0.6 ㎍을 함유하였다(0.3 ㎍ HA+PIT 1%+ER804057 그룹).
8 마리의 8 주된 암컷 BALB/c 마우스 8 개 그룹을 D0일에 30 ㎕ 용량의 상기 나타낸 면역자극 조성물들 중 하나를 피내 (귀의 안쪽 면)로 투여하여 면역시켰다.
혈액 샘플을 D23, D51 및 D29일에 상기 안와후 공동으로부터 취하고 이를 사용하여 상기 면역된 마우스의 각 그룹에서 획득한 H1N1 균주에 특이적인 중화 항체(헤마글루틴화-억제(HAI) 항체)의 역가를 측정하였다. 획득된 결과를 하기 표에 제공한다.
마우스의 그룹 D23 D51 D79
0.3　㎍ HA 그룹 35*** 53 80
6.3　㎍ HA 그룹 235 243 279
0.3　㎍ HA+ER804057 그룹 65 211 243
0.3　㎍ HA+PIT 1% 그룹 226 557 735
0.3　㎍ HA+PIT 1%+ER804057 그룹 226 970 844
***: 각 마우스 그룹의 5 개 혈청 상에서 획득한 HAI 역가의 평균
독감 바이러스 헤마글루틴화-억제 항체(보호 항체)를 생산하는 능력에 대한 상기 PIT-ER804057 유화액의 유효성은 상기 유화액과 TLR4 작용물질의 복합 작용의 결과이며; 상기 PIT 유화액 단독 또는 ER804057 단독은 덜 효과적이다.
실시예 V: 독감 바이러스에 대해 이미 감작된 어린 또는 늙은 마우스 집단에서 시 험된 본 발명에 따른 유화액으로부터 제조된, 상기 독감에 대한 백신 조성물
본 발명 유화액의 유효성을 상기 독감 바이러스에 이미 감작된 개인(상기 개인은 이미 상기 독감 바이러스와 접촉하였거나 또는 이미 독감 백신을 접종하였으므로)에게 투여되는 상기 독감에 대한 백신의 경우에서 시험하였다.
상기 유형의 평가를 수행하기 위해서, 3 가 백신에 의해 근육 내로(IM) 미리면역시킨 마우스를 상기 독감에 대해 경험이 없지않은 동물 모델로서 문헌[Potter et al. Vaccine, 2003, 21:940-945]에 따라 사용할 수 있다.
상기 A/뉴칼레도니아/20/99(H1N1), A/뉴욕/55/04(H3N2) 및 B/말레이시아/2506/04 균주 각각의 HA 1.5 ㎍을 함유하는 3 가 백신의 용량을 8 내지 10 주된 10 마리의 C57B1/6 마우스 5 개 그룹에 IM 주입에 의해 제공하였다.
D28일에, PBS 완충액을 주사한 하나의 그룹(PBS 그룹)을 제외하고, 모든 다른 마우스 그룹에게 1 차 면역화에 사용된 것과 상이한 3 가 백신(A/뉴칼레도니아/20/99(H1N1), A/웰링톤/01/04(H3N2) 및 B/지앙수/10/03)을 함유하는 다양한 백신 조성물을 30 ㎕의 부피로 피 내 제공하였다.
하나의 그룹에게는 PBS 완충액 중의 상기 각 균주의 HA 0.3 ㎍을 함유하는 조성물을 제공하였다(0.3 ㎍ HA 그룹).
또 다른 그룹에게는 PBS 완충액 중의 상기 각 균주의 HA 6.3 ㎍을 함유하는 조성물을 제공하였다(6.3 ㎍ HA 그룹).
또 다른 그룹에게는 PBS 완충액 중의 스쿠알렌 0.3 ㎎, 데하이뮬스TM SMO 0.044 ㎎, 유멀진TM B1 0.057 ㎎ 및 만니톨 0.055 ㎎을 함유하는 스쿠알렌 1%의 O/W 유화액 중의 PBS 완충액 중의 상기 각 균주의 HA 0.3 ㎍을 함유하는 조성물을 제공하였다. 1%의 스쿠알렌을 함유하는 상기 조성물은 상기 독감 백신을, 수성 상이 어떠한 ER804057도 함유하지 않는다는 점을 제외하고, 실시예 1에 개시된 바와 동일한 방법에 따라 제조한 농축된 열가역성 모액을 희석하여 수득한 O/W 유화액과 혼합하여 제조하였다(0.3 ㎍ HA + PIT 1% 그룹).
마지막으로, 최종 그룹에게는 PBS 완충액 중의 스쿠알렌 0.3 ㎎, 데하이뮬스TM SMO 0.44 ㎎, 유멀진TM B1 0.057 ㎎ 및 만니톨 0.055 ㎎ 및 ER804057 0.6 ㎍을 함유하는 스쿠알렌 1%의 O/W 유화액 중의 PBS 완충액 중의 상기 각 균주의 HA 0.3 ㎍을 함유하는 조성물을 제공하였다. 1%의 스쿠알렌 및 0.6 ㎍의 ER804057을 함유하는 상기 조성물은 상기 독감 백신을, 실시예 1에 개시된 바와 동일한 방법에 따라 제조한 농축된 열가역성 모액을 희석하여 수득한 O/W 유화액과 혼합하여 제조하였다(0.3 ㎍ HA + PIT 1%/ER 804057 그룹).
D50일에, 상기 마우스를 혈액 샘플의 수거 및 비장 샘플의 채취를 위해 안락사에 의해 죽였다.
A/뉴칼레도니아/20/99(H1N1), A/웰링톤/01/04(H3N2) 및 B/지앙수/10/03 균주에 대한 HAI의 분석을 각 혈액 샘플 상에서 수행하였다. 획득된 결과를 하기 표에 제공한다.
마우스의 그룹 A/뉴칼레도니아 (H1N1)에 대한 HAI A/웰링톤 (H3N2)에 대한 HAI B/지앙수에 대한 HIA
PBS 그룹 52* 48 13
0.3　㎍ HA 그룹 95 226 57
6.3　㎍ HA 그룹 190 640 226
0.3　㎍ HA +PIT 1% 그룹 431 640 290
0.3　㎍ HA+PIT 1%/ER804057 그룹 698 2348 640
* 각 마우스 그룹으로부터의 10 개 혈청 상에서 획득한 HAI 역가의 평균 값을 나타낸다.
상기 결과는 저 용량의 스쿠알렌(1%) 및 TLR4 작용물질을 함유하는 "HA + PIT 1%/ER804057" 백신(0.6 ㎍의 ER804057을 함유한다)으로 면역시킨 마우스 그룹의 평균 HAI 역가가 동등한 HA(0.3 ㎍ HA 그룹) 또는 20 배 이상의 HA(6.3 ㎍ HA 그룹)의 용량에서 항원보강되지 않은 독감 백신으로 상기 마우스를 면역시킨 후 획득한 역가보다 현저하게 더 높음을 보인다. 상기 결과는 상기 PIT 1%/ER 804057 유화액이 심지어 상기 독감 바이러스에 이미 감작된 집단 내에서조차 유리함을 보이는데, 그 이유는 각 균주의 독감 항원의 양을 20의 인자까지 감소시킬 수 있는 동시에 상기 3 개의 바이러스 균주에 대해 보다 높은 보호 항체 역가를 수득할 수 있기 때문이다.
상기 특이적인 세포 면역 반응을 특이적인 자극 후 비장세포에 의해 생산된 IL5 및 인터페론-γ를 분석하기 위해서 ELISPOT 기법 및 CBA(세포측정 비드 배열) 기법을 사용하여 각각의 비장 샘플 상에서 분석하였다.
상기 ELISPOT 기법에 대해서, 배양 배지(RPMI 1640, 10%의 송아지 태아 혈청, 2 mM 글루타민, 50 mM β-머캅토에탄올) 200 ㎕ 중의 2 x 105 비장세포를 래트 항-마우스 IFNγ 항체(Pharmingen ref: 551216) 또는 래트 항-마우스 IL5 항 체(Pharmingen ref: 554393)로 미리 감작시킨 나이트로셀룰로스 미세플레이트의 웰에 침작시켰다. 상기 비장 세포를 37 ℃에서 밤새 쥐 IL-2(Bohringer)(10 U/㎖) 및 1 ㎍/㎖ 농도의 다양한 독감 항원의 존재 하에 배양하였다. CD8+ 세포 반응의 분석을 위해서, H-2kd 배경 하에서 인식된 독감 NP 펩타이드(TYQRTRALV)를 사용하였다. 상기 CD4+ 세포 반응의 분석을 위해서, A/뉴칼레도니아/20/99(H1N1), A/웰링톤/01/04(H3N2) 및 B/지앙수/10/03 균주를 함유하는 3 가의 불활성화된 분할 백신에 의해 독감 항원을 제공한다. 이어서 상기 미세플레이트를 세척하고 IFNγ 또는 IL5를 분비한 비장세포를 비오틴화된 래트 항-마우스 IFNγ 항체(Pharmingen ref: 554410) 또는 비오틴화된 래트 항-마우스 IL5 항체(Pharmingen ref: 554393)에 의해서 및 퍼옥시다제-접합된 스트렙트아비딘(Southern Biotechnology-ref 7100-05)에 의해 검출하였다. 3-아미노-9-에틸카바졸을 사용하여 드러낸 후에, IFNγ 또는 IL5를 분비하는 비장세포에 해당하는 반점들을 자동 ELISPOT 판독기에 의해 카운트하였다. 결과를 IFNγ 또는 IL5/106 비장세포를 분비하는 세포의 수로서 나타내었다. 양의 검출 한계는 106 비장세포에 의한 20 반점이다.
CBA 기법에 관하여, 배양 배지(RPMI 1640, 10%의 송아지 태아 혈청, 2 mM 글루타민, 50 mM β-머캅토에탄올) 200 ㎕ 중의 4 x 105 비장세포를 배양 미세플레이트의 웰에 침착시켰다. 상기 비장세포를, 사이토킨(대조용 배지)의 비 특이적인 생산을 평가하기 위해서 자극제의 부재 하에서 또는 3 가 백신(1 ㎍/㎖)의 존재 하에서 37 ℃에서 5일간 배양하였다. 이어서 상기 배양 상등액의 IFNγ 함량 또는 IL5 함량을 마우스 Th1/Th2 CBA 키트(Becton Dickinson-ref: 551287)를 사용하여 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 양의 검출 한계는 IFNγ의 경우 2.5 pg/㎖이고 IL5의 경우 5 pg/㎖이었다. 각각의 비장 샘플에 대해서 IFNγ 또는 IL5의 구체적인 농도를 상기 결과로부터 비특이적으로 생성된 IFNγ 또는 IL5의 양을 감하여 계산하였다.
세포 반응 분석의 결과를 하기 표에 제공한다:
마우스의 그룹 IFNγ를 분비하는 비장세포의 수 IL5를 분비하는 비장세포의 수 배양 상등액 중의 IFNγ의 양 배양 상등액 중의 IL5의 양 IFNγ/IL5 비
PBS 19* 23* 148** 355** 2.1***
0.3　㎍ HA 17 66 295 400 1.3
6.3　㎍ HA 30 13 780 523
0.3　㎍ HA+PIT 1% 31 74 691 1301 0.6
0.3　㎍ HA+PIT 1%/ER 804057 66 22 1499 640 4.1
*는 상기 3 가 백신으로 자극 후 106 비장세포당 IL5 또는 IFNγ를 분비하는 비장세포의 수의 평균값을 나타낸다. 상기 평균값은 10 개의 비장세포/마우스 그룹 상에서 획득한 ELISPOT 결과를 근거로 계산한다. **는 상기 CBA 기법을 사용하여 10 개의 비장세포/마우스 그룹 상에서 획득한 ELISPOT 결과를 근거로 계산한 IL5 또는 IFNγ의 평균 량(pg/㎖)을 나타낸다. ***비는 각 그룹에서 IFNγ/IL5 비의 산술 평균을 나타낸다. 상기 IFNγ/IL5 비를 비장세포 배양 후 CBA 방법에 따라 획득한 IFNγ 및 IL5의 특정 농도 값을 근거로 각 샘플에 대해 측정하였으며, 이어서 10 개 비의 산술 평균을 각 마우스 그룹에 대해 계산하였다.
상기 결과는 PIT 1%/ER804057 유화액이 CD4+ 세포 반응을 독감 백신에 의한 상기 세포의 특이적인 재자극에 이은 IFNγ의 생산을 향해 강력하게 배향시킴을 보인다. 가장 현저한 Th1 반응(최고 IFNγ/IL5 비)이 상기 유화액을 제공받은 마우스 그룹에서 관찰되었다. 상기 Th1 반응은 실제로 20 배 더 큰 용량을 함유하는 독감 백신을 제공받은 마우스 그룹(6.3 ㎍ 그룹)에서 관찰된 경우보다 더 강하다. 따라서 상기 유화액을 특히 노인에서 독감 백신화에 이어 불량한 Th1 반응을 갖는 개인 집단에 권장한다.
동일한 실험 프로토콜을 17-개월된 수컷 C57B16 마우스를 사용하여 재연하고 이어서 A/웰링톤(H3N2)에 대한 HAI의 역가를 측정하였다. 획득된 결과를 하기 표에 나타낸다:
마우스의 그룹 A/웰링톤 (H3N2)에 대한 HAI
6.3　㎍ 그룹 104*
0.3　㎍ HA+PIT 1% 그룹 247
0.3　㎍ HA+PIT 1%/ER804057 그룹 476
*는 각 마우스 그룹으로부터의 10 개 혈청 상에서 획득한 HAI 역가의 평균값을 나타낸다.
상기 결과는 저 용량의 스쿠알렌(1%) 및 TLR4 작용물질(ER804057 0.6 ㎍)을 함유하는 O/W 유화액 중의 독감 백신을 상기 독감 바이러스에 이미 감작된 노인 집단을 백신화하기 위해 혼합함으로써 수득한 백신 조성물의 이점을 보이는데, 그 이유는 각 균주의 독감 항원의 양을 20의 인자까지 줄일 수 있는 동시에 3 개의 바이러스 균주에 대해 보다 높은 보호 항체 역가를 가질 수 있기 때문이다.

Claims (38)

  1. i) TLA4라 지칭되는 TLR4 작용물질로서, 그의 화학 구조는 당 고리를 포함하지 않으며,
    ii) 스쿠알렌,
    iii) 수성 용매,
    iv) 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르인 비이온계 친수성 계면활성제,
    v) 비이온계 소수성 계면활성제
    를 포함하고, 열가역성인 수중 유적형(O/W) 유화액.
  2. 제 1 항에 있어서,
    TLA4가 하기 화학식 I, II, III 또는 IV의 화학적 화합물 또는 화학식 I, II, III 또는 IV 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염인 유화액:
    화학식 I
    Figure 112008057736505-PCT00008
    화학식 II
    Figure 112008057736505-PCT00009
    화학식 III
    Figure 112008057736505-PCT00010
    화학식 IV
    Figure 112008057736505-PCT00011
    상기 식들에서, 각각의 화학식 I, II, III 또는 IV에 대해서,
    R1은 a) C(O);
    b) C(O)-(C1-C14 알킬)-C(O)[여기에서 상기 C1-C14 알킬은 하이드록실, C1-C5 알콕시, C1-C5 알킬렌다이옥시, (C1-C5 알킬)아미노 또는 (C1-C5 알킬)아릴로 임의로 치환되고, 이때 상기 (C1-C5 알킬)아릴의 상기 아릴 부분은 C1-C5 알콕시, (C1-C5 알킬)아미노, (C1-C5 알콕시)아미노, (C1-C5 알킬)아미노(C1-C5 알콕시), -O-(C1-C5 알킬)아미노(C1-C5 알콕시), -O-(C1-C5 알킬)아미노-C(O)-(C1-C5 알킬)-C(O)OH, 또는 -O-(C1-C5 알킬)아미노-C(O)-(C1-C5 알킬)-C(O)-(C1-C5)알킬로 임의로 치환된다];
    c) 하이드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된, C2-C15 선형 또는 분지된 쇄를 포함하는 알킬; 및
    d) -C(O)-(C6-C12 아릴렌)-C(O)-(여기에서 상기 아릴렌은 하이드록실, 할로겐, 나이트로 또는 아미노로 임의로 치환된다)
    로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    a 및 b는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
    d, d', d", e, e' 및 e"는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이고;
    X1, X2, Y1 및 Y2는 존재하지 않음, 산소, NH 및 N(C(O)(C1-C4 알킬)), 및 N(C1-C4 알킬)로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
    W1 및 W2는 카보닐, 메틸렌, 설폰 및 설폭사이드로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
    R2 및 R5는
    a) 옥소, 하이드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된, C2 내지 C20 직쇄 또는 분지 쇄 알킬;
    b) 옥소, 하이드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된, C2 내지 C20 직쇄 또는 분지 쇄 알케닐 또는 다이알케닐;
    c) 옥소, 하이드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된, C2 내지 C20 직쇄 또는 분지 쇄 알콕시;
    d) 알킬 그룹이 옥소, 하이드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된, NH-(C2 내지 C20 직쇄 또는 분지 쇄 알킬); 및
    e)
    Figure 112008057736505-PCT00012
    (상기 식에서,
    Z는 O 및 NH로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, M 및 N은 C2-C20 선형 또는 분지된 쇄를 포함하는 알킬, 알케닐, 알콕시, 아실옥시, 알킬아미노 및 아실아미노로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택된다)
    로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
    R3 및 R6은 옥소 또는 플루오로로 임의로 치환된, C2-C20 직쇄 또는 분지된 쇄 알킬 또는 알케닐로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고;
    R4 및 R7은 C(O)-(C2-C20 직쇄 또는 분지된 쇄 알킬 또는 알케닐), C2-C20 직쇄 또는 분지된 쇄 알킬, C2-C20 직쇄 또는 분지된 쇄 알콕시, 및 C2-C20 직쇄 또는 분지된 쇄 알케닐로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; 이때 상기 알킬, 알케닐 또는 알콕시 그룹은 독립적이고 임의로 하이드록실, 플루오로 또는 C1-C5 알콕시로 치환될 수 있으며;
    G1, G2, G3 및 G4는 산소, 메틸렌, 아미노, 티올, -C(O)NH-, -NHC(O)- 및 -N(C(O)(C1-C4 알킬))-로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되거나; 또는
    G2R4 또는 G4R7이 함께 수소 원자 또는 하이드록실일 수 있고;
    화학식 III의 경우:
    a' 및 b'는 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 바람직하게는 2이고;
    Z1은 -OP(O)(OH)2, -P(O)(OH)2, -OP(O)(OR8)(OH)(이때 R8은 C1-C4 알킬 쇄이다), -OS(O)2OH, -S(O)2OH, -CO2H, -OB(OH)2, -OH, -CH3, -NH2 및 -NR9 3(이때 R9는 C1-C4 알킬 쇄이다) 로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    Z2는 -OP(O)(OH)2, -P(O)(OH)2, -OP(O)(OR10)(OH)(이때 R10은 C1-C4 알킬 쇄이다), -OS(O)2OH, -S(O)2OH, -CO2H, -OB(OH)2, -OH, -CH3, -NH2 및 -NR11(이때 R11은 C1-C4 알킬 쇄이다) 로 이루어진 그룹 중에서 선택되고;
    화학식 IV의 경우:
    R12는 H 또는 C1-C4 알킬 쇄이다.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 오일 소적의 집단 부피의 90% 이상이 크기 ≤200 ㎚를 갖는 유화액.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 오일 소적의 집단 부피의 50% 이상이 크기 ≤110 ㎚를 갖는 유화액.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 상 전이가 45 내지 80 ℃, 바람직하게는 50 내지 65 ℃의 온도에서 발생하는 유화액.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 알디톨을 또한 포함하는 유화액.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 알디톨이 솔비톨, 만니톨, 글리세롤, 자일리톨 또는 에리쓰리톨인 유화액.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수성 상이 완충된 염수 용액인 유화액.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TLR4 작용물질이 하기 화학식 I의 화학적 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염인 유화액:
    화학식 I
    Figure 112008057736505-PCT00013
  10. 제 9 항에 있어서,
    R1이 C(O) 또는 C(O)-(CH2)n-C(O)이고, 이때 n은 1, 2, 3 또는 4이며,
    a, b, d, d', d", e, e' 및 e"가 독립적으로 1 또는 2이고,
    X1, X2, Y1 및 Y2가 NH이고,
    W1 및 W2가 C(O)이고,
    R2 및 R5가 옥소로 임의로 치환된 C10-C15 직쇄 알킬, NH-(C10-C15 직쇄 알킬), 및
    Figure 112008057736505-PCT00014
    (이때 M 및 N은 독립적으로 C2 내지 C20 직쇄 알킬 또는 알케닐이다)로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고,
    R3 및 R6이 C5-C10 직쇄 알킬이고,
    R4 및 R7이 수소, C(O)-(C8-C12 직쇄 알킬) 및 C(O)-(C8-C12 직쇄 알케닐)로 이루어진 그룹 중에서 선택되고,
    G1 및 G3이 산소 또는 -NH(CO)-이고,
    G2 및 G4가 산소인
    유화액.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 화학적 화합물이 ER803022, ER803058, ER803732, ER803789, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804764, ER111232, ER112022, ER112048, ER112065, ER112066, ER113651, ER118989, ER119327 및 ER119328로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 유화액.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TLR4 작용물질의 양 대 비이온계 친수성 및 소수성 계면활성제의 전체 량의 비가 0.01 x 10-2 내지 5 x 10-2, 바람직하게는 0.05 x 10-2 내지 2 x 10-2(중량/중량)인 유화액.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르가 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르(세테아레트-12), 폴리옥시에틸렌 (20) 세토스테아릴 에테르(세테아레트-20), 폴리옥시에틸렌 (21) 스테아릴 에테르(스테아레트-21), 폴리옥시에틸렌 (20) 세틸 에테르(세테트-20), 폴리옥시에틸렌 (10) 세틸 에테르(세테트-10), 폴리옥시에틸렌 (10) 스테아릴 에테르(스테아레트-10), 폴리옥시에틸렌 (20) 스테아릴 에테르(스테아레트-20), 폴리옥시에틸렌 (10) 올레일 에테르(올레트-10) 및 폴리옥시에틸렌 (20) 올레일 에테르(올레트-20)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 유화액.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소수성 계면활성제가 솔비탄 에스터 또는 만나이드 에스터인 유화액.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 소수성 계면활성제가 만나이드 모노올리에이트인 유화액.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 소수성 계면활성제가 솔비탄 모노올리에이트인 유화액.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친수성 및 소수성 계면활성제의 양이, 상기 계면활성제의 전체 HLB가 8.5 내지 10이 되도록 하는 양인 유화액.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스쿠알렌의 양이 상기 유화액의 전체 중량의 5 내지 45%를 차지하는 유화액.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스쿠알렌의 양 대 계면활성제의 양의 비가 2.0 내지 4.0, 바람직하게는 2.5 내지 3.5인 유화액.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TLR4 작용물질이 화학적 화합물 ER804057이고, 상기 비이온계 친수성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르(세테아레트-12)이고, 상기 비이온계 소수성 계면활성제가 솔비탄 모노올리에이트이고, 상기 수성 용매가 포스페이트 완충액 또는 시트레이트 완충액인 유화액.
  21. 제 20 항에 있어서,
    a. 상기 스쿠알렌의 양이 상기 유화액의 전체 중량의 5 내지 45%(중량/중량)를 차지하고,
    b. 상기 스쿠알렌의 양 대 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르(세테아레트-12) 및 솔비탄 모노올리에이트의 전체 량의 비가 2.0 내지 4.0이고,
    c. 상기 세테아레트-12 및 솔비탄 모노올리에이트의 양이, HLB가 8.5 내지 10이 되도록 하는 양이고,
    d. 상기 ER 804057의 양 대 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르(세테아레트-12) 및 솔비탄 모노올리에이트의 전체 량의 비가 0.01 x 10-2 내지 2 x 10-2인
    유화액.
  22. 제 21 항에 있어서,
    만니톨을 또한 포함하고, 그의 양이 상기 유화액의 전체 중량의 0.1 내지 10%를 차지하는 유화액.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동결건조 기질을 또한 포함하는 유화액.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 동결건조 기질이 슈크로스, 만니톨 및 도데실 말토사이드의 수용액인 유화액.
  25. 백신 조성물을 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 유화액의 용도.
  26. 백신 항원으로서, 하나 이상의 독감 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 백신 조성물을 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 유화액의 용도.
  27. 백신 항원으로서, 거대세포바이러스(CMV) 외막 항원을 포함하는 백신 조성물을 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 유화액의 용도.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 CMV 외막 항원이 하나 이상의 중화 에피토프를 포함하는 CMV의 gB 단백질 또는 그의 유도체인 용도.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 CMV 외막 항원이, 막통과 도메인이 결실되고 절단 부위가 무능한 gB 단백질인 용도.
  30. 온도를 증가시킴으로써 W/O 역 유화액을 수득하는 단계 및 온도를 감소시킴으로써 상기 W/O 역 유화액을 O/W 유화액으로 전환시키는 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 O/W 유화액의 제조 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 W/O 유화액을, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 및 TLR4 작용물질을 포함하는 수성 상을 스쿠알렌 및 비이온계 소수성 계면활성제를 포함하는 유성 상과 혼합하여 O/W 유화액을 수득하는 첫 번째 단계, 및 상기 O/W 유화액을 적어도 상기 유화액의 상 전이 온도인 온도로 가열하는 두 번째 단계를 수행함으로써 수득하는 방법.
  32. 제 30 항에 있어서,
    상기 W/O 유화액을, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 및 TLR4 작용물질을 포함하는 수성 상, 및 스쿠알렌 및 비이온계 소수성 계면활성제를 포함하는 유성 상을 적어도 상기 유화액의 상 전이 온도인 온도로 별도로 가열하고, 이어서 상기 수성 상과 유성 상을 적어도 상기 상 전이 온도인 온도에서 상기 혼합물의 온 도를 유지시키는 동시에 혼합함으로써 수득하는 방법.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서,
    상기 TLR4 작용물질이 수성 상 중에 있는 대신에 유성 상 중에 있는 방법.
  34. 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수성 상이 알디톨을 또한 포함하는 방법.
  35. 제 31 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 상 전이 온도가 45 내지 80 ℃, 바람직하게는 50 내지 65 ℃인 방법.
  36. 하나 이상의 백신 항원을 TLR4 작용물질(그의 화학 구조는 당 고리를 포함하지 않는다)을 함유하는 O/W 유화액과 혼합하는 백신 조성물의 제조 방법으로서, 상기 TLR4 작용물질을 함유하는 O/W 유화액을, 유화액을 온도의 증가에 의해 W/O 역 유화액의 형태로 수득하는 단계 및 상기 W/O 유화액을 온도 감소에 의해 O/W 유화액으로 전환시키는 단계를 포함하는 상 전이 방법에 따라 제조함을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    상기 O/W 유화액이
    a) 제 2 항에서 정의한 바와 같은 TLR4 작용물질,
    b) 스쿠알렌,
    c) 수성 용매,
    d) 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르인 비이온계 친수성 계면활성제, 및
    e) 비이온계 소수성 계면활성제
    를 포함하는 방법.
  38. 제 30 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
    동결건조 단계를 또한 포함하는 방법.
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