KR20160132109A - 돌연변이 스태필로코쿠스 항원 - Google Patents

돌연변이 스태필로코쿠스 항원 Download PDF

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KR20160132109A
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루이기 피아스치
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

인간 IgG의 Fcγ 부분에 대한 감소된 친화성을 갖는 돌연변이 SpA가 제공된다. EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, Hla 및 상기 돌연변이 SpA를 이용한 면역화는 S. 아우레우스 감염의 신장 농양 모델에서 현저한 결과를 제공한다.

Description

돌연변이 스태필로코쿠스 항원{MUTANT STAPHYLOCOCCAL ANTIGENS}
본 출원은 유럽 특허 출원 14161861.1호(2014년 3월 26일 출원) 및 14192913.3호(2014년 11월 12일 출원)의 이익을 주장하며, 이러한 둘 모두의 출원의 완전한 내용은 모든 목적상 참조로서 본원에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 S. 아우레우스(S. aureus)에 의한 감염에 대한 면역화에 관한 것이다.
배경 기술
스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)는 그람 양성 구상 박테리아이다. 매년 미국의 사망률은 HIV/AIDS를 포함하는 임의의 다른 감염성 질병의 사망률을 초과하며, S. 아우레우스는 혈류, 하기도, 피부 및 연조직 감염의 주요 원인이다. 이는 또한 전세계에서 뼈 감염의 주요 원인이며, 이들 감염은 고통스럽고, 쇠약화시키며, 치료하기에 어렵다.
S. 아우레우스의 치료는 S. 아우레우스의 많은 균주에 의한 항생제 내성의 발생으로 인해 점점 더 난제가 되고 있다. 메티실린-내성 S. 아우레우스(MRSA)가 모든 지역 및 병원 감염의 절반 초과에서 발견되고 있다. 최근 수년간 마지막 수단의 항생제인 반코마이신에 대해서도 내성인 MRSA 균주의 출현이 관찰되었고, 이는 본질적으로 치료 불가능하다.
현재 공인된 백신이 존재하지 않는다. 박테리아 타입 5 및 8로부터의 표면 다당류의 혼합물을 기초로 한 백신인 StaphVAX™은 III 상 임상 시험에서 위약 그룹과 비교하는 경우 감염을 감소시키는데 실패하였다. 유사하게, IsdB 항원[2]을 기초로 한 V710 백산[1]이 수술후 S. 아우레우스 감염의 비율을 감소시키는데 실패하였다[3].
항생제 내성의 문제 및 S. 아우레우스 감염이 이의 잘 발달된 면역 회피 능력으로 인해 추후 감염으로부터 면역을 제공하지 않는다는 사실로 인해 백신이 특히 시급히 필요하다. S. 아우레우스의 면역 회피 특성은 차례로 효과적인 백신의 개발을 더욱 어렵게 만든다. 면역 회피의 메커니즘은 아직 완전히 이해되어 있지 않으나, 이는 적어도 부분적으로 면역글로불린(Ig)의 Fc에 결합하고, VH3-타입 B 세포 수용체의 Fab 부분에 결합하는 S. 아우레우스 표면 분자인 스태필로코쿠스 단백질 A(SpA)로 인한 것이다. SpA와 B 세포 수용체의 상호작용은 B 세포 집단의 클론 확장 및 이후의 세포 사멸을 초래하여, 적응 면역 반응의 차단을 발생시킨다. Ig Fc로의 SpA 결합은 다형핵 백혈구에 의한 스태필로코쿠스의 옵소닌식작용 청소를 방해한다.
면역글로불린에 대한 감소된 친화성을 갖는 SpA의 돌연변이 형태가 발생되었다. WO2011/005341호에는 5개의 Ig-결합 도메인 각각에서 점 돌연변이를 갖는 SpA가 기재되어 있으며, 이는 IgG에 결합하는 단백질의 능력을 감소시킨다.
참고문헌 4에는 "Combo-1" 및 "Combo-2"로 언급되는 2개의 바람직한 면역원 조합물을 포함하는 개선된 S. 아우레우스 백신을 제공하는 다양한 접근법이 개시되어 있다. "Combo-1"은 5개의 항원 EsxA, EsxB, 돌연변이 Hla, FhuD2, 및 Sta011을 포함한 반면, "Combo-2"는 돌연변이 Hla 대신 IsdA의 단편을 이용하였다. 이들 조합물 둘 모두는 알루미늄 하이드록시드 애쥬번트와 함께 시험되었고, 이들은 완충액 단독 또는 IsdB 항원과 비교하는 경우 마우스 감염 모델에서 중간 생존 시간을 증가시켰다. "Combo-1"은 또한 알루미늄 하이드록시드 애쥬번트 및 TLR7 효능제와 함께 시험되었고, TLR7 효능제의 첨가는 반응을 개선시켰다[5].
"Combo-1" 및 "Combo-2"를 이용한 긍정적인 결과에도 불구하고, S. 아우레우스에 대해 면역화시키기 위한 추가의 개선된 조성물이 필요하다.
발명의 개시
스태필로코쿠스 아우레우스의 세포벽 고정 표면 단백질인 단백질 A(SpA)(SEQ ID NO:43)는 선천 및 적응 면역 반응으로부터의 박테리아 회피를 제공한다. 단백질 A는 면역글로불린의 Fc 부분에서 면역글로불린에 결합하고, B 세포 수용체의 VH3 도메인과 상호작용하여 B 세포 증식 및 아폽토시스를 부적절하게 자극하고, 폰 빌레브란트 인자 A1 도메인에 결합하여 세포내 응고를 활성화시키고, 또한 TNF 수용체-1에 결합하여 스태필로코쿠스 뉴모니아의 발병기전에 기여한다. 단백질 A가 면역글로불린을 포획하고, 독성 특성을 나타낸다는 사실로 인해, 이러한 표면 분자가 인간에서 백신으로서 기능할 수 있다는 가능성이 엄밀히 추구되어 오지 않았다. 본원에서, 본 발명자는 단백질 A 변이체가 면역글로불린에 더 이상 결합할 수 없고, 이에 의해 이들의 독소발생 잠재성이 제거되고, 즉, 비-독소발생성이 되고, 스태필로코쿠스 질병에 대해 보호하는 체액성 면역 반응을 자극하는 것을 입증한다.
따라서, 본 발명은 하기 기재되는 바와 같은 돌연변이 SpA 항원을 제공한다. 상기 돌연변이는 바람직하게는 변형되지 않은 SpA에 비해 인간 IgG의 Fcγ 부분에 대한 감소된 친화성을 갖는다. 돌연변이는 또한 VH3-함유 인간 B 세포 수용체의 Fab 부분에 대해 변형되지 않은 SpA에 비해 감소된 친화성을 가질 수 있다.
본 발명자는 인간 IgG의 Fcγ 부분 및 VH3-함유 B 세포 수용체의 Fab 부분에 대한 친화성을 감소시키도록 변형된 돌연변이 스태필로코쿠스 단백질 A(SpA)를 첨가함으로써 공지된 "Combo-1" 백신이 개선될 수 있음을 발견하였다. 이러한 여분의 항원은 조합물의 보호 효능을 증가시키고, 신장 농양 모델에서 현저한 결과를 제공한다. 참고문헌 4에서 시험된 항원 조합물 어느 것도 SpA 항원을 포함하지 않았다.
따라서, 본 발명은 EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, 및 Hla 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 추가로 제공하며, 상기 조성물은 돌연변이 SpA 항원을 추가로 포함하고, 돌연변이는 인간 IgG의 Fcγ 부분 및 VH3-함유 인간 B 세포 수용체의 Fab 부분에 대해 변형되지 않은 SpA에 비해 감소된 친화성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 (i) EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, 및 Hla 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항원; 및 (ii) 인간 IgG의 Fcγ 부분 및 VH3-함유 인간 B 세포 수용체의 Fab 부분에 대해 변형되지 않은 SpA에 비해 감소된 친화성을 갖는 돌연변이 SpA 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 따라서, EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, 및 Hla 중 1개, 2개, 3개, 4개 또는 바람직하게는 5개 모두가 돌연변이 SpA와 조합하여 이용될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
편의를 위해, 본 명세서, 실시예 및 청구항에서 이용되는 특정 용어 및 구의 의미가 제공된다.
S. 아우레우스 항원
본 발명은 특히 돌연변이 SpA 항원에 관한 것이다. 야생형 SpA(스태필로코쿠스 단백질 A)는 폐 감염, 패혈증, 및 농양 발생에 대한 중요한 독성 인자이고, 대부분의 임상 S. 아우레우스 분리물에 의해 발현되는 세포벽-고정 표면 단백질이다. 야생형 SpA는 인간 IgG의 Fc 부분, VH3-함유 B 세포 수용체, A1 도메인에서의 폰 빌레브란트 인자, 및 TNF-α 수용체 1에 결합한다. SpA와 B 세포 수용체의 상호작용은 적응 및 선천 면역 반응에 대한 효과와 함께 B 세포 집단의 클론 확장 및 이후의 세포 사멸을 발생시키는 반면, IgG의 Fcγ로의 이의 결합은 다형핵 백혈구에 의한 스태필로코쿠스의 옵소닌식작용 청소를 방해한다. 성숙 SpA의 N-말단 부분은 4개 또는 5개의 56-61-잔기 Ig-결합 도메인으로 구성되고, 이는 짧은 링커에 의해 연결된 3중 헬리칼 다발로 폴딩되며, 이는 E, D, A, B, 및 C 순서로 명명된다[6]. 이들 도메인은 아미노산 수준에서 ~80% 동일성을 나타내고, 56 내지 61개의 잔기 길이이며, 일렬 반복으로 구성된다[7]. C-말단 영역은 고도로 반복적이나 가변적인 옥타펩티드인 "Xr", 및 SpA의 세포벽 고정 구조와 접한 도메인인 "Xc"로 구성된다.
NCTC 8325 균주에서, spa는 SAOUHSC_00069이며, 아미노산 서열 SEQ ID NO:43(GI:88193885)을 갖는다. 뉴먼(Newman) 균주에서, 이는 nwmn_0055(GI:151220267)이다. 본 발명과 함께 사용되는 SpA 항원은 SEQ ID NO:43을 인지하는 항체를 유도(예를 들어, 인간에게 투여되는 경우)할 수 있고/있거나, 이는 (a) SEQ ID NO:43과 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 이상(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 이상)인 SEQ ID NO:43의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이들 SpA 항원은 SEQ ID NO:43의 변이체를 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:43으로부터의 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편은 SEQ ID NO:43의 적어도 하나의 에피토프를 유지하면서 SEQ ID NO:43의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상) 및/또는 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상)이 결여되어 있다. SEQ ID NO:43의 최종 35개의 C-말단 아미노산이 유용하게 생략될 수 있다. SEQ ID NO:43의 처음 36개의 N-말단 아미노산이 유용하게 생략될 수 있다. 참고문헌 8은 개별적 IgG-결합 도메인이 단독으로 또는 조합하여 유용한 면역원일 수 있음을 암시한다.
SEQ ID NO:43의 유용한 단편은 아미노산 37 내지 325이다. 이러한 단편은 5개 모두의 SpA Ig-결합 도메인(순서 E, D, A, B, C로 N-말단으로부터 C-말단으로 자연적으로 배열됨)을 함유하며, SpA의 대부분의 노출된 도메인을 포함한다. 이는 또한 인간 단백질과의 항원의 유사성을 감소시킨다. 다른 유용한 단편은 spa가 B 세포 초항원으로 기능하는 경우에 발생할 수 있는 과도한 B 세포 확창 및 이후의 아폽토시스를 방지하기 위해 자연 A, B, C, D 및/또는 E 도메인 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 생략할 수 있다. 참고문헌 18에 보고된 바와 같이, 다른 유용한 단편은 자연 A, B, C, D 및/또는 E 도메인 중 1개, 2개, 3개 또는 4개만 포함할 수 있고, 예를 들어, B 내지 E가 아닌 SpA(A) 도메인만 포함할 수 있거나, A, B, C 또는 E가 아닌 SpA(D) 도메인만 포함할 수 있거나, 기타 등등일 수 있다. 따라서, 본 발명에서 유용한 spa 항원은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 IgG-결합 도메인을 포함할 수 있으나, 이상적으로는 4개 이하를 갖는다.
따라서, SpA의 또 다른 유용한 단편은 SEQ ID NO:50의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 위치 60 및 61의 아미노산 더블렛(doublet)은 Gln-Gln이 아니다. 상기 더블렛은 하기 기재되는 바와 같이, 예를 들어, Lys-Arg로 돌연변이될 수 있다. 따라서, 상기 단편은 SEQ ID NO:51 또는 52를 포함하거나, 이로 구성될 수 있다.
항원이 단지 하나의 유형의 spa 도메인(예를 들어, 단지 Spa(A), SpA(D) 또는 Spa(E) 도메인)을 포함하는 경우, 이는 단일 폴리펩티드 사슬 내에 이러한 도메인의 하나 초과의 카피, 예를 들어, 다수의 SpA(E) 도메인을 포함할 수 있다. 이는 또한 하나의 유형의 SpA 도메인 및 또 다른 단백질 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항원은 단지 하나의 유형의 SpA 도메인, 예를 들어, SpA(E) 도메인, 및 또 다른 단백질 항원, 예를 들어, EsxA; EsxB; FhuD2; Sta011; 및 Hla를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
본 발명의 SpA 항원은 이들이 인간 IgG의 Fcγ 부분에 대한 감소된 친화성을 갖도록 SEQ ID NO:43에 비해 돌연변이된다. 예를 들어, SEQ ID NO:43의 잔기 60-61에서의 QQ 디펩티드는 면역글로불린에 대한 친화성을 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있다. QQ 디펩티드에 대한 유용한 디펩티드 치환은 하기에 논의되며, 바람직한 치환은 KR 디펩티드이다. 따라서, 유용한 SpA 항원은 SEQ ID NO:49를 포함할 수 있으며, 여기서 11개의 XX 디펩티드 중 하나 이상(바람직하게는 모두)은 SEQ ID NO:43 내의 상응하는 디펩티드와 상이하다. 예를 들어, SpA 항원은 SEQ ID NO:46을 포함할 수 있고, SEQ ID NO:46의 바람직한 예는 SEQ ID NO:47이다. N-말단 메티오닌을 갖도록 발현되는 경우, SEQ ID NO:47을 포함하는 SpA 항원은 SEQ ID NO:48로 구성될 수 있다.
본 발명과 함께 사용되는 SpA 항원은 이들이 인간 IgG의 Fcγ 부분 및 VH3-함유 인간 B 세포 수용체의 Fab 부분에 대해 감소된 친화성을 갖도록 SEQ ID NO:43과 관련하여 추가로 돌연변이될 수 있다. 이는, 예를 들어, 참고문헌 9의 지침에 따라 달성되고 평가될 수 있다. 따라서, 야생형 SpA 내 적어도 하나의 Gln-Gln 디펩티드가 돌연변이(예를 들어, Lys-Lys로의 돌연변이; 다른 가능한 돌연변이는 Arg-Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Ala-Ala, Ser-Ser, Ser-Thr, Thr-Thr 등을 포함함)될 수 있고/있거나, 야생형 SpA 내 적어도 하나의 Asp-Asp 디펩티드가 돌연변이(예를 들어, Ala-Ala로의 돌연변이; 다른 가능한 돌연변이는 Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg, Arg-Lys, His-His, Val-Val 등을 포함함)될 수 있다. 이들 돌연변이에 대한 표적 서열은 하기에서 밑줄로 표시되고, 여기서 대시(dash)는 5개의 Ig-결합 도메인을 구분한다:
Figure pct00001
항원 내의 개별적 도메인은 SEQ ID NO:43에 비해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 아미노산에서 돌연변이될 수 있다(예를 들어, Gln-Gln 및 Asp-Asp 서열에 관하여는 상기를 참조하나, 또한 도메인 D의 잔기 3 및/또는 24, 도메인 A의 잔기 46 및/또는 53 등에서의 돌연변이를 개시하는 참고문헌 22를 참조한다). 상기 돌연변이는 상기 기재된 바와 같이 SEQ ID NO:43을 인지하는 항체를 유도하는 항원의 능력을 제거하지 않아야 하나, IgG 및/또는 다른 인간 단백질(예를 들어, 인간 혈액 단백질)에 결합하는 항원의 능력은 제거할 것이다. 특히, 돌연변이 SpA 항원은 SEQ ID NO:43의 위치 43, 44, 70, 71, 104, 105, 131, 132, 162, 163, 190, 191, 220, 221, 247, 248, 278, 279, 305 및/또는 306에서 적어도 1개, 더욱 특히 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 더욱 더 특히 20개의 아미노산에서 돌연변이된 SEQ ID NO:43을 포함하거나 이로 구성되는 서열의 돌연변이 SpA 항원이다. 이들 위치에 대한 유용한 치환은 상기 언급되어 있다.
또한, 자연 N-말단은 제거될 수 있고, SEQ ID NO:4의 처음 36개의 아미노산은 유용하게 생략될 수 있다. 유사하게, 자연 C-말단은 제거될 수 있고, 제5 Ig-결합 도메인의 다운스트림 서열(즉, SEQ ID NO:43에서 Lys-327의 다운스트림)은 유용하게 생략될 수 있다. 따라서, 유용한 SpA 항원은 SEQ ID NO:44를 포함한다:
Figure pct00002
여기서, 10개의 밑줄로 표시된 XX 디펩티드는 SEQ ID NO:43 내의 상응하는 디펩티드와 상이하다. 따라서, SEQ ID NO:43 내의 이들 위치에서의 QQ는 SEQ ID NO:44에서 QQ가 아닐 것이며, 이상적으로는 글루타민 잔기를 포함하지 않고, 예를 들어, 이는 KK이다. 유사하게, SEQ ID NO:43 내의 이들 위치에서의 DD는 SEQ ID NO:44에서 DD가 아닐 것이며, 이상적으로는 아스파테이트 잔기를 포함하지 않고, 예를 들어, 이는 AA이다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 SpA의 바람직한 형태는 따라서 SEQ ID NO:45를 포함한다.
SEQ ID NO:44 내의 XX 디펩티드에서의 치환에 더하여, 아미노산 서열을 5개 이하의 단일 아미노산 변화를 갖도록 변형시키는 것이 가능하나, 단, 변형된 서열은 SEQ ID NO:44로 구성된 폴리펩티드에 여전히 결합하는 항체를 유도할 수 있어야 한다. 따라서, SEQ ID NO:45는 SEQ ID NO:44 내의 XX 디펩티드 외부의 위치에서 1개, 2개 또는 3개의 치환에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:44의 잔기 60-61에서의 QQ 디펩티드는 면역글로불린에 대한 친화성을 추가로 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있다. QQ 디펩티드에 대한 유용한 디펩티드 치환은 상기 논의되어 있으며, 바람직한 치환은 KR 디펩티드이다. 따라서, 유용한 SpA 항원은 SEQ ID NO:49를 포함할 수 있으며, 여기서 11개의 XX 디펩티드 중 하나 이상(바람직하게는 모두)은 SEQ ID NO:43 내의 상응하는 디펩티드와 상이하다. 예를 들어, SpA 항원은 SEQ ID NO:46을 포함할 수 있고, SEQ ID NO:46의 바람직한 예는 SEQ ID NO:47이다. N-말단 메티오닌을 갖도록 발현되는 경우, SEQ ID NO:47을 포함하는 SpA 항원은 SEQ ID NO:48로 구성될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, SpA의 유용한 단편은 자연 A, B, C, D 및/또는 E 도메인 중 1개, 2개, 3개 또는 4개만 포함할 수 있고, 예를 들어, D, A B 또는 C가 아닌 SpA(E) 도메인만 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 유용한 SpA 항원은 상기 기재된 바와 같이 단지 돌연변이된 SpA(E) 도메인, 즉, SEQ ID NO:54의 위치 60 및 61에서 적어도 1개의 아미노산에서 돌연변이된 SEQ ID NO:54를 포함하거나 이로 구성되는 아미노산 서열, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47 또는 SEQ ID NO:49의 아미노산 1 내지 67, 또는 SEQ ID NO:48의 아미노산 1 내지 68을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 항원은 SEQ ID NO.50, SEQ ID NO.51, SEQ ID NO.52 또는 SEQ ID NO.53을 포함할 수 있다. 상기 항원은 바람직하게는 SpA로부터의 다른 서열을 포함하지 않을 것이다. 이는 SpA(E) 도메인의 하나 초과의 카피를 포함할 수 있고/있거나, 본원에 기재된 바와 같은 또 다른 단백질 항원, 예를 들어, EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, 또는 Hla 항원을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항원 조합은 EsxA; EsxB; FhuD2; Sta011; 및 Hla의 항원 중 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 모두를 이용한다. 이들 5개의 항원은 당 분야에 이미 공지되어 있으며(예를 들어, 참고문헌 4-14 참조), 추가 세부사항이 하기에 제공된다. 특히 유용한 조성물은 이들 항원의 5개 모두(바람직하게는 Hla는 비독성(즉, 무독화) 돌연변이 형태임)를 포함한다.
NCTC 8325 균주 내의 'EsxA' 항원은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1(GI:88194063)을 갖는다. 본 발명과 함께 사용되는 EsxA 항원은 SEQ ID NO:1을 인지하는 항체를 유도(예를 들어, 인간에게 투여되는 경우)할 수 있고/있거나, 이는 (a) SEQ ID NO:1과 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 이상(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 이상)인 SEQ ID NO:1의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이들 EsxA 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1의 변이체를 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:1로부터의 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편은 SEQ ID NO:1의 적어도 하나의 에피토프를 유지하면서 SEQ ID NO:1의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상) 및/또는 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상)이 결여되어 있다.
NCTC 8325 균주 내의 'EsxB' 항원은 아미노산 서열 SEQ ID NO:2(GI:88194070)를 갖는다. 본 발명과 함께 사용되는 EsxB는 SEQ ID NO:2를 인지하는 항체를 유도(예를 들어, 인간에게 투여되는 경우)할 수 있고/있거나, 이는 (a) SEQ ID NO:2와 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 이상(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 이상)인 SEQ ID NO:2의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이들 EsxB 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 변이체를 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:2로부터의 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편은 SEQ ID NO:2의 적어도 하나의 에피토프를 유지하면서 SEQ ID NO:2의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상) 및/또는 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상)이 결여되어 있다. 유용한 EsxB 항원은 SEQ ID NO:2의 내부 시스테인 잔기가 결여되어 있고, 예를 들어, 이는 SEQ ID NO:35를 포함하며, 여기서 위치 30의 잔기 X는 부재하거나, 자유 티올기가 없는(환원 조건하에서) 아미노산 잔기이고, 예를 들어, 시스테인을 제외한 임의의 자연 아미노산이다.
'FhuD2' 항원은 '페리크롬-결합 단백질'로 부연 설명되며, 참고문헌[15]에서 또한 연구되었다. 이는 또한 'Sta006'으로 공지되어 왔다(예를 들어, 참고문헌 4-14 내). NCTC 8325 균주에서, FhuD2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:3(GI:88196199)을 갖는다. 본 발명과 함께 사용되는 FhuD2는 SEQ ID NO:3을 인지하는 항체를 유도(예를 들어, 인간에게 투여되는 경우)할 수 있고/있거나, 이는 (a) SEQ ID NO:3와 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 이상(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 이상)인 SEQ ID NO:3의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이들 FhuD2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3의 변이체를 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:3로부터의 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편은 SEQ ID NO:3의 적어도 하나의 에피토프를 유지하면서 SEQ ID NO:3의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상) 및/또는 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상)이 결여되어 있다. SEQ ID NO:3의 처음 17개의 N-말단 아미노산이 유용하게 생략될 수 있다(SEQ ID NO:6을 생성시킴). FhuD2의 돌연변이 형태는 참고문헌 16에 보고되어 있다. 유용한 FhuD2 항원은 SEQ ID NO:3의 시스테인 잔기가 결여되어 있으며, 예를 들어, 이는 SEQ ID NO:34를 포함하고, 자유 티올기를 갖는(환원 조건하에서) 임의의 아미노산 잔기를 포함하지 않고, 예를 들어, 이는 시스테인을 함유하지 않는다. FhuD2 항원은, 예를 들어, 아실화된 N-말단 시스테인으로 지질화될 수 있다. 한 유용한 FhuD2 서열은 SEQ ID NO:7이고, 이는 N-말단에 Met-Ala-Ser- 서열을 가지며; SEQ ID NO:37이 또 다른 상기 서열이나, 이는 SEQ ID NO:7에 존재하는 시스테인이 결여되어 있다.
'Sta011' 항원은 NCTC 8325 균주에서 아미노산 서열 SEQ ID NO:4(GI:88193872)를 갖는다. 본 발명과 함께 사용되는 Sta011 항원은 SEQ ID NO:4를 인지하는 항체를 유도(예를 들어, 인간에게 투여되는 경우)할 수 있고/있거나, 이는 (a) SEQ ID NO:4와 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 이상(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 이상)인 SEQ ID NO:4의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이들 Sta011 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4의 변이체를 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:4로부터의 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편은 SEQ ID NO:4의 적어도 하나의 에피토프를 유지하면서 SEQ ID NO:4의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상) 및/또는 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상)이 결여되어 있다. SEQ ID NO:4의 처음 23개의 N-말단 아미노산이 유용하게 생략될 수 있다(SEQ ID NO:33을 생성시킴). 유용한 Sta011 항원은 SEQ ID NO:4의 시스테인 잔기가 결여되어 있으며, 예를 들어, 이는 SEQ ID NO:36을 포함하고, 자유 티올기를 갖는(환원 조건하에서) 임의의 아미노산 잔기를 포함하지 않고, 예를 들어, 이는 시스테인을 함유하지 않는다. Sta011 항원은, 예를 들어, 아실화된 N-말단 시스테인으로 지질화될 수 있다. 한 유용한 Sta011 서열은 SEQ ID NO:8이고, 이는 N-말단 메티오닌을 가지며; SEQ ID NO:39는 또 다른 이러한 서열이나, 이는 SEQ ID NO:8에 존재하는 시스테인이 결여되어 있다. Sta011 항원으로서 또는 Sta011 항원을 제조하기 위해 이용될 수 있는 SEQ ID NO:4의 변이체 형태는 다양한 Ile/Val/Leu 치환을 갖는 SEQ ID NO:9, 10 및 11을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다(이들 서열의 Cys 비함유 변이체가 또한 본 발명과 함께 이용될 수 있다). Sta011은 단량체 또는 올리고머화를 선호하는 Ca++ 이온을 갖는 올리고머로 존재할 수 있다. 본 발명은 Sta011의 단량체 및/또는 올리고머를 이용할 수 있다.
'Hla' 항원은 '알파 독소' 또는 단순히 '용혈소'로도 공지된 '알파-용혈소 전구체'이다. NCTC 8325 균주에서, Hla는 아미노산 서열 SEQ ID NO:5(GI:88194865)를 갖는다. Hla는 포어-형성 및 용혈 활성을 갖는 S. 아우레우스의 대부분의 균주에 의해 생성되는 중요한 독력 결정인자이다. 항-Hla 항체는 동물 모델에서 독소의 유해한 효과를 중화시킬 수 있고, Hla는 폐렴에 대해 보호하는데 특히 유용하다.
유용한 Hla 항원은 SEQ ID NO:5을 인지하는 항체를 유도(예를 들어, 인간에게 투여되는 경우)할 수 있고/있거나, 이는 (a) SEQ ID NO:5와 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상)을 갖고/갖거나; (b) 'n'이 7 이상(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 이상)인 SEQ ID NO:5의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이들 Hla 항원은 SEQ ID NO:5의 변이체를 포함한다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:5로부터의 에피토프를 포함한다. 다른 바람직한 단편은 SEQ ID NO:5의 적어도 하나의 에피토프를 유지하면서 SEQ ID NO:5의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상) 및/또는 N-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상)이 결여되어 있다. SEQ ID NO:5의 처음 26개의 N-말단 아미노산은 유용하게 생략될 수 있다(예를 들어, SEQ ID NO:12를 생성시킴). C-말단에서의 트렁케이션은 또한, 예를 들어, 50개의 아미노산(SEQ ID NO:5의 잔기 27-76)만 남기도록 이용될 수 있다[17].
특히, Hla 항원은 무독화된 Hla 항원, 즉, Hla의 돌연변이 형태이고, 여기서 Hla의 자연 독성은 제거되었다. Hla의 독성은 화학적 비활성화(예를 들어, 포름알데하이드, 글루타르알데하이드 또는 다른 가교 시약을 이용함)에 의해 회피될 수 있다. 그러나, 대신, 면역원성은 유지하면서 독성 활성은 제거하는 Hla의 돌연변이 형태를 이용하는 것이 바람직하다. 더욱 특히, 무독화된 Hla 항원은 Hla의 돌연변이 형태이며, 여기서 Hla의 면역원성은 유지되면서 Hla의 독성은 제거되었다. 상기 무독화된 돌연변이는 당 분야에 이미 공지되어 있다. 바람직한 Hla 항원은 성숙 항원의 잔기 35인 SEQ ID NO:5의 잔기 61(즉, 처음 26개의 N-말단 아미노산 생략 후 = SEQ ID NO:12의 잔기 35)에서 돌연변이를 갖는 돌연변이 S. 아우레우스 용혈소이다. 따라서, 잔기 61은 히스티딘이 아닐 수 있고, 대신, 예를 들어, Ile, Val 또는 바람직하게는 Leu일 수 있다. 이러한 위치에서의 His-Arg 돌연변이가 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:13은 Hla의 성숙 H35L 돌연변이 형태의 서열(즉, H35L 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO:12)이며, 유용한 무독화된 Hla 항원은 SEQ ID NO:13을 포함하거나 이로 구성되는 서열의 무독화된 Hla 항원이다. 또 다른 유용한 돌연변이는 긴 루프를 짧은 서열로 대체하며, 예를 들어, SEQ ID NO:15(H35L 돌연변이를 또한 포함함) 및 SEQ ID NO:16(H35L 돌연변이를 포함하지 않음)에서와 같이 SEQ ID NO:5의 잔기 136-174의 39mer를 테트라머, 예를 들어, PSGS(SEQ ID NO:14)로 대체한다. 또 다른 유용한 돌연변이는 잔기 Y101을, 예를 들어, 류신으로 대체한다(SEQ ID NO:17). 또 다른 유용한 돌연변이는 잔기 D152를, 예를 들어, 류신으로 대체한다(SEQ ID NO:18). 또 다른 유용한 돌연변이는 잔기 H35 및 Y101을, 예를 들어, 류신으로 대체한다(SEQ ID NO:19). 또 다른 유용한 돌연변이는 잔기 H35 및 D152를, 예를 들어, 류신으로 대체한다(SEQ ID NO:20).
추가의 유용한 Hla 항원은 참고문헌 18 및 19에 개시되어 있다.
SEQ ID NO:21, 22 및 23은 SEQ ID NO:5의 3개의 유용한 단편(각각 'Hla27 -76', 'Hla27-89' 및 'Hla27 -79')이다. SEQ ID NO:24, 25 및 26은 SEQ ID NO:13으로부터의 상응하는 단편이다.
하나의 유용한 Hla 서열은 SEQ ID NO:27이다. 이는 N-말단 Met, 이후 발현 벡터로부터의 Ala-Ser 디펩티드, 이후 H35L 돌연변이를 포함하는 SEQ ID NO:13(NCTC8325 균주로부터의 SEQ ID NO:13)을 갖는다.
조성물이 EsxA 및 EsxB 항원 둘 모두를 포함하는 경우, 이들은 단일 폴리펩티드(즉, EsxA 및 EsxB 둘 모두를 포함하거나 이들로 구성되는 융합 폴리펩티드)로 제공될 수 있다. 따라서, 단일 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 둘 모두를 인지하는 항체를 유도(예를 들어, 인간에게 투여하는 경우)할 수 있다. 단일 폴리펩티드는 (i) EsxA에 대해 상기 정의된 바와 같이 SEQ ID NO:1과 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상)을 갖고/갖거나 SEQ ID NO:1의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드 서열; 및 (ii) EsxB에 대해 상기 정의된 바와 같이 SEQ ID NO:2와 50% 이상의 동일성(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상)을 갖고/갖거나 SEQ ID NO:2의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 제2 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 제1 및 제2 폴리펩티드 서열은 N-말단에서 C-말단으로 어느 한 순서로 존재할 수 있다. SEQ ID NO:28('EsxAB') 및 29('EsxBA')는 둘 모두 헥사펩티드 링커 ASGGGS(SEQ ID NO:30)를 갖는 상기 폴리펩티드의 예이다. 또 다른 'EsxAB' 하이브리드는 SEQ ID NO:31을 포함하며, 여기에 N-말단 메티오닌이 제공될 수 있다(예를 들어, SEQ ID NO:32). 유용한 EsxAB의 변이체는 EsxB의 내부 시스테인 잔기가 결여되어 있고, 예를 들어, 이는 SEQ ID NO:40을 포함하며, 여기서 위치 132의 잔기 X는 부재하거나, 자유 티올기가 없는(환원 조건하에서) 아미노산 잔기이고, 예를 들어, 시스테인을 제외한 임의의 자연 아미노산이다. 따라서, 본 발명과 함께 사용하기에 바람직한 EsxAB 항원은 아미노산 서열 SEQ ID NO:38을 갖는다.
따라서, 유용한 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NO:31과 80% 이상의 동일성(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상)을 갖고/갖거나; (b) SEQ ID NO:31의 아미노산 1-96으로부터의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편 및 SEQ ID NO:31의 아미노산 103-205로부터의 적어도 'n'개의 연속 아미노산의 단편(여기서, 'n'은 7 이상(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 이상)임) 둘 모두를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 이들 폴리펩티드(예를 들어, SEQ ID NO:32)는 SEQ ID NO:1을 포함하는 야생형 스태필로코쿠스 단백질 및 SEQ ID NO:2를 포함하는 야생형 스태필로코쿠스 단백질 둘 모두를 인지하는 항체를 유도(예를 들어, 인간에게 투여되는 경우)할 수 있다. 따라서, 면역 반응은 항원 EsxA 및 EsxB 둘 모두를 인지할 것이다. (b)의 바람직한 단편은 SEQ ID NO:1로부터의 에피토프 및 SEQ ID NO:2로부터의 에피토프를 제공한다.
본 발명은 EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, 및 Hla(바람직하게는, 비독성 돌연변이 Hla) 중 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 모두를 이용한다. 상기 언급된 바와 같이, 특히 유용한 조성물은 이들 항원 5개 모두를 포함하나, 일부 구체에에서, 본 발명은 이들 5개의 항원 중 1개, 2개, 3개 또는 4개, 즉, EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 중 1개, 2개, 3개 또는 4개만 포함하고, Hla는 조성물에 부재한다.
바람직한 조성물은 (i) EsxA 항원 및 EsxB 항원 둘 모두를 포함하는, 예를 들어, SEQ ID NO:31을 포함하는 단일 폴리펩티드; (ii) 예를 들어, SEQ ID NO:6을 포함하는 FhuD2 항원; (iii) 예를 들어, SEQ ID NO:33을 포함하는 Sta011 항원; 및 (iv) 예를 들어, SEQ ID NO:13을 포함하는 Hla의 H35L 돌연변이 형태 4개 모두를 포함한다.
SEQ ID NO:31, 6, 33 및 13은 조합물에서 유용한 아미노산 서열이나, 본 발명은 이들 정확한 서열로 제한되지는 않는다. 따라서, 이들 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 모두는 5개의 단일 아미노산 변화(즉, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 단일 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입)까지 독립적으로 변형될 수 있으나, 단, 변형된 서열은 변형되지 않은 서열로 구성된 폴리펩티드에 여전히 결합하는 항체를 유도할 수 있어야 한다.
또 다른 유용한 조성물은 (i) 아미노산 서열 SEQ ID NO:32를 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 아미노산 서열 SEQ ID NO:7을 갖는 제2 폴리펩티드; (iii) 아미노산 서열 SEQ ID NO:8을 갖는 제3 폴리펩티드; 및 (iv) 아미노산 서열 SEQ ID NO:27을 갖는 제4 폴리펩티드 4개 모두를 포함한다.
SEQ ID NO:32, 7, 8 및 27은 조합물에서 유용한 아미노산 서열이나, 본 발명은 이들 정확한 서열로 제한되지는 않는다. 따라서, 이들 4개의 서열 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 모두는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 단일 아미노산 변화(즉, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 단일 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입)까지 독립적으로 변형될 수 있으나, 단, 변형된 서열은 변형되지 않은 서열로 구성된 폴리펩티드에 여전히 결합하는 항체를 유도할 수 있어야 한다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 따라서 1개의 단일 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입까지 독립적으로 변형된 SEQ ID NO:32, 7, 8 및 27 중 1개, 2개, 3개 또는 4개 모두를 갖는 이들 4개의 특정된 폴리펩티드를 포함한다.
예를 들어, 야생형 FhuD2, Sta011 및 EsxAB 폴리펩티드 서열(예를 들어, SEQ ID NO:6, 31 및 33) 각각은 폴리펩티드간 이황화 다리를 발생시켜 동종이합체 및 이종이합체 둘 모두를 형성할 수 있는 단일 시스테인 잔기를 포함한다. 이러한 상호 연결된 폴리펩티드는 바람직하지 않으며, 따라서 Sta006, Sta011 및 EsxB 서열은 이들의 자연 시스테인 잔기를 제거하도록 변형될 수 있어, 이들은 자유 티올기를 함유하지 않는다(환원 조건하). 야생형 시스테인은 결실될 수 있거나, 다양한 아미노산으로 치환될 수 있다.
따라서, FhuD2 항원은 SEQ ID NO:34를 포함할 수 있고; Sta011 항원은 SEQ ID NO:36을 포함할 수 있고; EsxB 항원은 SEQ ID NO:35(예를 들어, SEQ ID NO:40을 포함하는 EsxAB 하이브리드로서)를 포함할 수 있다. 상기 서열의 예는 SEQ ID NO:37, 39, 및 38을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 서열은 해당 야생형 서열에 대한 대체물로서 단독으로 또는 조합하여 이용될 수 있다. 따라서, 특히 유용한 조성물은 (i) 아미노산 서열 SEQ ID NO:38을 갖는 제1 폴리펩티드; (ii) 아미노산 서열 SEQ ID NO:37을 갖는 제2 폴리펩티드; (iii) 아미노산 서열 SEQ ID NO:39를 갖는 제3 폴리펩티드; 및 (iv) 아미노산 서열 SEQ ID NO:27을 갖는 제4 폴리펩티드 4개 모두를 포함한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 조성물은 (i) EsxA 항원 및 EsxB 항원 둘 모두를 포함하는, 예를 들어, SEQ ID NO:31을 포함하는 단일 폴리펩티드; (ii) 예를 들어, SEQ ID NO:6을 포함하는 FhuD2 항원; (iii) 예를 들어, SEQ ID NO:33을 포함하는 Sta011 항원; (iv) 예를 들어, SEQ ID NO:13을 포함하는 Hla의 H35L 돌연변이 형태; 및 (v) 예를 들어, SEQ ID NO:45 또는 47을 포함하는 돌연변이 SpA, 또는 이의 단일 도메인을 포함하는 항원, 예를 들어, SEQ ID NO:50, 51, 52 또는 53의 5개 모두를 포함한다. 그러므로, 특히 본 발명에 따른 조성물은 하기를 포함한다:
(i) 특히 SEQ ID NO:31을 포함하거나 이로 구성되는 서열의 EsxA 항원 및 EsxB 항원 둘 모두를 포함하는 단일 폴리펩티드;
(ii) 특히 SEQ ID NO:6을 포함하거나 이로 구성되는 서열의 FhuD2 항원;
(iii) 특히 SEQ ID NO:33을 포함하거나 이로 구성되는 서열의 Sta011 항원;
(iv) 특히 SEQ ID NO:13을 포함하거나 이로 구성되는 서열의 Hla의 H35L 돌연변이 형태; 및
(v) 특히 SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, 또는 SEQ ID NO:52를 포함하거나 이들로 구성되는 서열의 돌연변이 SpA 항원.
본 발명에 따른 또 다른 바람직한 조성물은 하기를 포함한다:
(i) SEQ ID NO:32를 포함하거나 이로 구성되고, 더욱 특히 SEQ ID NO:32로 구성되는 서열의 제1 폴리펩티드;
(ii) SEQ ID NO:7를 포함하거나 이로 구성되고, 더욱 특히 SEQ ID NO:7로 구성되는 서열의 제2 폴리펩티드;
(iii) SEQ ID NO:8을 포함하거나 이로 구성되고, 더욱 특히 SEQ ID NO:8로 구성되는 서열의 제3 폴리펩티드;
(iv) SEQ ID NO:27을 포함하거나 이로 구성되고, 더욱 특히 SEQ ID NO:27로 구성되는 서열의 제4 폴리펩티드; 및
(v) SEQ ID NO:52를 포함하거나 이로 구성되고, 더욱 특히 3개 이하의 아미노산 치환에 의해 변형된 SEQ ID NO:45(예를 들어, SEQ ID NO:47을 포함하거나, SEQ ID NO:48로 구성됨)를 포함하거나 이로 구성되는 서열의 제5 폴리펩티드.
본 발명에 따른 또 다른 바람직한 조성물은 하기를 포함한다:
(i) SEQ ID NO:38을 포함하거나 이로 구성되고, 더욱 특히 SEQ ID NO:38로 구성되는 서열의 제1 폴리펩티드;
(ii) SEQ ID NO:37을 포함하거나 이로 구성되고, 더욱 특히 SEQ ID NO:37로 구성되는 서열의 제2 폴리펩티드;
(iii) SEQ ID NO:39를 포함하거나 이로 구성되고, 더욱 특히 SEQ ID NO:39로 구성되는 서열의 제3 폴리펩티드;
(iv) SEQ ID NO:27을 포함하거나 이로 구성되고, 더욱 특히 SEQ ID NO:27로 구성되는 서열의 제4 폴리펩티드; 및
(v) SEQ ID NO:52, 더욱 특히 3개 이하의 아미노산 치환에 의해 변형된 SEQ ID NO:45(예를 들어, SEQ ID NO:47을 포함하거나, SEQ ID NO:48로 구성됨)를 포함하거나 이들로 구성되는 서열의 제5 폴리펩티드.
상기 설명된 바와 같은 이들 조합의 단백질 (i) 내지 (v)는 독립적으로 5개 이하의 단일 아미노 변화에 의해 변형될 수 있으나, 단, 변형된 서열은 변형되지 않은 서열로 구성된 폴리펩티드에 여전히 결합하는 항체를 유도할 수 있어야 한다. 일부 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 추가의 폴리펩티드를 포함할 수 있고; 다른 구체예에서, 조성물 내의 폴리펩티드만 이들 5개의 특정된 폴리펩티드이고, 이들 폴리펩티드는 심지어 조성물 내의 유일한 면역원성 성분일 수 있다.
하나 초과의 폴리펩티드가 존재하는 경우, 이들은 실질적으로 동등한 질량으로 제공될 수 있고, 즉, 이들 각각의 질량은 모든 폴리펩티드의 평균 질량의 ±5% 내이다. 따라서, 5개의 폴리펩티드가 제공되는 경우, 이들은 a:b:c:d:e의 질량비로 제공될 수 있고, 여기서 a-e 각각은 0.95 내지 1.05이다.
EsxA, EsxB, Hla, FhuD2, Sta011, 및 SpA은 제외하고, 다른 S. 아우레우스 항원이 존재하며, 조성물은 하나 이상의 추가의 S. 아우레우스 항원을 임의로 포함할 수 있다. 예를 들어, 당류 및 폴리펩티드 항원 둘 모두가 S. 아우레우스에 대해 공지되어 있다. 따라서, 조성물은 S. 아우레우스 당류 항원을 포함할 수 있고, 예를 들어, 공지된 당류 항원은 폴리-N-아세틸글루코사민(PNAG)인 S. 아우레우스의 엑소폴리사카라이드, 및, 예를 들어, 타입 5, 타입 8 또는 타입 336으로부터 유래될 수 있는 S. 아우레우스의 캡슐 당류를 포함한다. 조성물은 또한 ClfA 항원, IsdA 항원, IsdB 항원, IsdC 항원, 및/또는 IsdH 항원(각각은 참고문헌 5의 15-17 페이지에 정의된 바와 같음)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 상기 정의된 바와 같은 S. 아우레우스 항원, 및 또한 다양한 유기체로부터의 항원(예를 들어, 바이러스 또는 또 다른 박테리아로부터의 항원)을 포함한다.
면역원성 조성물 및 약제
본 발명에 따른 면역원성 조성물은 백신으로서 유용할 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 예방적(즉, 감염을 예방함) 또는 치료적(즉, 감염을 치료함) 백신일 수 있으나, 통상적으로는 예방적 백신일 것이다.
따라서, 조성물은 약학적으로 허용될 수 있다. 이들은 보통 항원에 더한 성분을 포함할 것이며, 예를 들어, 이들은 통상적으로 하나 이상의 약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함한다. 상기 성분의 충분한 논의가 참고문헌 121에서 이용 가능하다.
조성물은 일반적으로 수성 형태로 포유동물에 투여될 것이다. 그러나, 투여 전, 조성물은 비-수성 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 백신은 수성 형태로 제조되나, 이후 충전되고 분배되고, 수성 형태로 또한 투여되며, 다른 백신은 제조 동안 동결건조되고, 사용시에 수성 형태로 재구성된다. 따라서, 조성물은 건조된 제형, 예를 들어, 동결건조된 제형일 수 있다. 참고문헌 10에는 S. 아우레우스 면역원성 조성물과 함께 동결건조의 이용이 개시되어 있다.
조성물은 보존제, 예를 들어, 티오머살 또는 2-페녹시에탄올을 포함할 수 있다. 그러나, 백신이 수은 물질을 실질적으로 함유하지 않는(즉, 5㎍/ml 미만), 예를 들어, 티오머살을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 수은을 함유하지 않는 백신이 더욱 바람직하다. 보존제를 함유하지 않는 백신이 특히 바람직하다.
열 안정성을 개선시키기 위해, 조성물은 온도 보호제(하기 참조)를 포함할 수 있다.
긴장성을 조절하기 위해, 생리학적 염, 예를 들어, 소듐 염을 포함시키는 것이 바람직하다. 1 내지 20 mg/ml, 예를 들어, 약 10±2mg/ml NaCl로 제공될 수 있는 소듐 클로라이드(NaCl)가 바람직하다. 제공될 수 있는 다른 염은 포타슘 클로라이드, 포타슘 디하이드로겐 포스페이트, 디소듐 포스페이트 데하이드레이트, 마그네슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드 등을 포함한다.
조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg의 오스몰랄농도를 가질 것이며, 더욱 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위 내에 해당될 것이다.
조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 통상적인 완충제는 포스페이트 완충제; Tris 완충제; 보레이트 완충제; 숙시네이트 완충제; 히스티딘 완충제(특히, 알루미늄 하이드록시드 애쥬번트를 가짐); 또는 시트레이트 완충제를 포함한다. 완충제는 통상적으로 5-20mM 범위 내에 포함될 것이다.
조성물은 금속 이온 킬레이터, 특히 2가 금속 이온 킬레이터, 예를 들어, EDTA를 포함할 수 있다. 참고문헌 10에는 EDTA의 포함이 본원에 개시된 조성물의 안정성을 개선시킬 수 있음이 개시되어 있다. 면역원성 조성물 내의 EDTA의 최종 농도는 약 1-50 mM, 약 1-10 mM 또는 약 1-5 mM, 바람직하게는 약 2.5 mM일 수 있다.
조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 더욱 통상적으로 6.0 내지 8.0, 예를 들어, 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다.
조성물은 바람직하게는 멸균 조성물이다. 조성물은 바람직하게는, 예를 들어, 용량 당 <1 EU(내독소 단위, 표준 척도), 바람직하게는 용량 당 <0.1 EU를 함유하는 비-발열성 조성물이다. 조성물은 바람직하게는 글루텐-비함유 조성물이다.
조성물은 단일 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있거나, 다중 면역화를 위한 물질(즉, '다중용량' 키트)을 포함할 수 있다. 보존제의 포함은 다중용량 배열에서 바람직하다. 다중용량 조성물에서 보존제를 포함하는 것에 대한 대안(또는 보존제 포함에 더하여)으로서, 조성물은 물질의 제거를 위한 무균 어댑터를 갖는 용기에 함유될 수 있다.
S. 아우레우스 감염은 신체의 다양한 영역에 영향을 미칠 수 있으므로, 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사가능물질로 제조될 수 있다. 주사 전 액체 비히클 내 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다(예를 들어, 동결건조된 조성물 또는 분무-동결 건조된 조성물). 조성물은, 예를 들어, 연고, 크림 또는 분말로서 국소 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 정제 또는 캡슐, 스프레이, 또는 시럽(임의로 착향됨)으로서 경구 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 미세 분말 또는 스프레이를 이용하는 흡입기로서 폐 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 좌약 또는 페서리로 제조될 수 있다. 조성물은 코, 귀 또는 안구 투여를 위해, 예를 들어, 점적약제로 제조될 수 있다. 조성물은 조합된 조성물이 환자로의 투여 직전에 재구성되도록 설계된 키트 형태로 존재할 수 있다. 상기 키트는 액체 형태의 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 동결건조된 항원을 포함할 수 있다.
조성물이 사용 전에 즉석으로 제조되고(예를 들어, 성분이 동결건조된 형태로 제공되는 경우), 키트로 제공되는 경우, 키트는 2개의 바이알을 포함할 수 있거나, 이는 하나의 충전 준비된 주사기 및 하나의 바이알을 포함할 수 있고, 주사기의 내용물은 주사 전 바이알의 내용물을 재활성화시키기 위해 이용된다.
인간 백신은 통상적으로 약 0.5ml의 투여량 부피로 투여되나, 절반 부피(즉, 약 0.25ml)가 또한, 예를 들어, 아동에 대해 유용할 수 있다.
본 발명에 따라 투여되는 면역원성 조성물은 또한 하나 이상의 면역조절성 작용제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 면역조절성 작용제 중 하나 이상은 하나 이상의 애쥬번트(하기 참조)를 포함한다.
조성물은 세포 매개 면역 반응 뿐만 아니라 체액성 면역 반응 둘 모두를 유도할 수 있다. 이러한 면역 반응은 바람직하게는 장기 작용(예를 들어, 중화) 항체 및 S. 아우레우스에 대한 노출시 신속히 반응할 수 있는 세포 매개 면역을 유도할 것이다.
백신으로서 사용되는 면역원성 조성물은 면역학적 유효량의 항원(들), 뿐만 아니라 필요에 따라 임의의 다른 성분을 포함한다. '면역학적 유효량'은 단일 용량으로 또는 일련의 일부로서 개체로의 상기량의 투여가 치료 또는 예방에 효과적인 것을 의미한다. 상기량은 치료되는 개체의 건강 및 신체 상태, 연령, 치료되는 개체의 분류학적 그룹(예를 들어, 비-인간 영장류, 영장류 등), 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 요망되는 보호의 정도, 백신의 제형, 의학적 상황의 치료 의사의 평가, 및 다른 관련 요인에 따라 다양하다. 상기량이 일상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 광범위한 범위 내에 해당할 것이 예상된다. 하나 초과의 항원이 조성물에 포함되는 경우, 2개의 항원은 서로 동일한 용량 또는 상이한 용량으로 제공될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 조성물은 온도 보호제를 포함할 수 있고, 이러한 성분은 애쥬번트화된 조성물(특히, 무기물 애쥬번트, 예를 들어, 알루미늄 염을 함유하는 애쥬번트화된 조성물)에서 특히 유용할 수 있다. 참고문헌 20에 기재된 바와 같이, 액체 온도 보호제는 이의 빙점을 낮추기 위해, 예를 들어, 0℃ 미만으로 빙점을 감소시키기 위해 수성 백신 조성물에 첨가될 수 있다. 따라서, 조성물은 열 파괴를 억제하기 위해 0℃ 아래, 그러나 이의 빙점 이상으로 저장될 수 있다. 온도 보호제는 또한 동결 및 해동 후에 응집 또는 침강에 대해 무기물 염 애쥬번트를 보호하면서 조성물의 동결을 가능케 하고, 또한 상승된 온도, 예를 들어, 40℃ 이상에서 조성물을 보호할 수 있다. 시작 수성 백신 및 액체 온도 보호제는 액체 온도 보호제가 최종 혼합물의 1-80 부피%를 형성하도록 혼합될 수 있다. 적합한 온도 보호제는 인간 투여에 대해 안전해야 하고, 물에서 용이하게 혼화/가용성이어야 하고, 조성물 내의 다른 성분(예를 들어, 항원 및 애쥬번트)을 손상시키지 않아야 한다. 예로는 글리세린, 프로필렌 글리콜, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 적합한 PEG는 200-20,000 Da 범위의 평균 분자량을 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 300 Da의 평균 분자량을 가질 수 있다('PEG-300').
치료 방법, 및 면역원성 조성물의 투여
본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 S. 아우레우스 감염의 예방 및/또는 치료에서 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 면역학적 유효량의 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 S. 아우레우스 감염의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 S. 아우레우스 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공한다. 이로운 구체예는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 포유동물에서 S. 아우레우스 감염을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에서의 (i) EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, 및 Hla 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항원; 및 (ii) 인간 IgG의 Fcγ 부분 및 VH3-함유 인간 B 세포 수용체의 Fab 부분에 대해 변형되지 않은 SpA에 비해 감소된 친화성을 갖는 돌연변이 SpA 항원의 용도를 제공한다. 이로운 구체예는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 S. 아우레우스 감염을 예방하거나 치료하기 위해 포유동물을 면역화시키는데서 사용하기 위한 (i) EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, 및 Hla 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항원; 및 (ii) 인간 IgG의 Fcγ 부분 및 VH3-함유 인간 B 세포 수용체의 Fab 부분에 대해 변형되지 않은 SpA에 비해 감소된 친화성을 갖는 돌연변이 SpA 항원을 제공한다. 이로운 구체예는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 치료적 유효량의 항원을 포유동물에 투여함으로써 S. 아우레우스 감염을 예방하거나 치료하기 위해 포유동물을 면역화시키는 방법에서 사용하기 위한 (i) EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, 및 Hla 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항원; 및 (ii) 인간 IgG의 Fcγ 부분 및 VH3-함유 인간 B 세포 수용체의 Fab 부분에 대해 변형되지 않은 SpA에 비해 감소된 친화성을 갖는 돌연변이 SpA 항원을 제공한다. 이로운 구체예는 상기 정의된 바와 같다.
상기 기재된 바와 같이, EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011, 및 Hla 중 1개, 2개, 3개, 4개 또는 바람직하게는 5개 모두가 돌연변이 SpA와 조합하여 이용될 수 있다. 이러한 방식에서, 본 발명의 방법, 용도, 조성물 및 항원 조합물은 S. 아우레우스 감염을 예방하거나 치료하는데 효과적인 면역 반응을 유도한다. 면역 반응은 항체 및/또는 세포-매개 면역을 포함할 수 있다. 이들 용도 및 방법에 의해 포유동물에서 면역 반응을 발생시킴으로써, 포유동물은 병원내 감염을 포함하는 S. 아우레우스 감염에 대해 보호될 수 있다. 더욱 특히, 포유동물은 피부 감염, 폐렴, 수막염, 골수염, 심장내막염, 독성 쇼크 증후군, 및/또는 패혈증에 대해 보호될 수 있다. 본 발명은 또한 포유동물의 뼈 및 관절의 S. 아우레우스 감염에 대해 보호(및 이에 따라 골수염, 패혈성 관절염, 및 인공 관절 감염을 포함하나 이에 제한되지는 않는 장애를 예방)하기에 유용하다. 많은 경우에, 이들 장애는 S. 아우레우스 균막의 형성과 관련될 수 있다.
S. 아우레우스는 다양한 포유동물(소, 개, 말, 및 돼지를 포함함)을 감염시키나, 본 발명과 함께 사용하기 위한 바람직한 포유동물은 인간이다. 인간은 아동(예를 들어, 유아 또는 영아), 청소년, 또는 성인일 수 있다. 일부 구체예에서, 인간은 인공 뼈 또는 관절을 가질 수 있거나, 상기 인공삽입물(예를 들어, 수술전 정형외과 수술 환자)의 의도된 수용자일 수 있다. 아동에 대해 의도된 백신은 또한, 예를 들어, 안전성, 투여량, 면역원성 등을 평가하기 위해 성인에게 투여될 수 있다. 그러나, 백신은 이들 그룹에 대해 단독으로 적합하지 않으며, 인간 집단에서 더욱 일반적으로 이용될 수 있다.
치료적 처리의 효능을 확인하는 한 방법은 본 발명에 따른 조성물 또는 항원의 투여 후 S. 아우레우스 감염을 모니터링하는 것을 포함한다. 예방적 처리의 효능을 확인하는 한 방법은 조성물의 투여 후 투여된 조성물 내의 항원에 대해 전신적(예를 들어, IgG1 및 IgG2a 생성 수준의 모니터링) 및/또는 점막적(예를 들어, IgA 생성 수준의 모니터링)으로 면역 반응을 모니터링하는 것을 포함한다. 조성물의 면역원성을 평가하는 또 다른 방법은 면역블롯 및/또는 마이크로어레이에 의해 환자 혈청 또는 점막 분비물을 스크리닝하기 위해 항원을 재조합적으로 발현시키는 것이다. 단백질과 환자 샘플 사이의 양성 반응은 환자가 당해 단백질에 대한 면역 반응을 마운팅하였다는 것을 나타낸다.
백신 조성물의 효능은 또한 S. 아우레우스 감염 동물 모델, 예를 들어, 기니아 피그 또는 마우스를 백신 조성물로 공격함으로써 생체내에서 결정될 수 있다. S. 아우레우스 감염 질병의 연구를 위해 3개의 일반적으로 유용한 동물 모델, 즉, (i) 뮤린 농양 모델[21], (ii) 뮤린 치사 감염 모델[21], 및 (iii) 뮤린 폐렴 모델[22]이 존재한다. 농양 모델은 정맥내 공격 후 마우스 신장에서 농양을 관찰한다. 치사 감염 모델은 정맥내 또는 복막내 경로에 의한 S. 아우레우스의 일반적-치사 용량에 의해 감염된 후 생존하는 마우스의 수를 관찰한다. 폐렴 모델도 또한 생존률을 관찰하나, 비내 감염을 이용한다. 균막-매개 이식 감염, 피부 및 연조직 감염(SSTI), 및 패혈증과 관련하여 둘 모두의 S. 아우레우스 질병을 연구하기 위한 추가의 유용한 모델은 참고문헌[23]에 개시되어 있다. 유용한 백신은 이들 모델 중 하나 이상에서 효과적일 수 있다. 예를 들어, 일부 임상 상황에 대해, 조혈 확산을 방지하거나 옵소닌화를 촉진할 필요 없이 폐렴에 대해 보호하는 것이 요망될 수 있고; 다른 상황에서 주요 요망사항은 조혈 확산 또는 패혈증을 방지하는 것일 수 있다. 다양한 항원, 및 다양한 항원 조합물이 효과적인 백신의 다양한 양태에 기여할 수 있다.
조성물은 일반적으로 환자에게 직접 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 주사(예를 들어, 피하, 복막내, 정맥내, 근내, 또는 조직의 간질 공간), 또는 점막 투여, 예를 들어, 직장, 경구(예를 들어, 정제, 스프레이), 질, 국소, 경피 또는 피부통과, 비내, 안구, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 달성될 수 있다. 근내 주사가 본 발명에 따른 조성물을 투여하기 위한 가장 통상적인 경로이다.
본 발명은 전신 및/또는 점막 면역을 유도하고, 바람직하게는 향상된 전신 및/또는 점막 면역을 유도하기 위해 이용될 수 있다. 바람직하게는, 향상된 전신 및/또는 점막 면역은 향상된 TH1 및/또는 TH2 면역 반응에서 반영된다. 바람직하게는, 향상된 면역 반응은 IgG1 및/또는 IgG2a 및/또는 IgA의 생성에서의 증가를 포함한다.
투여는 단일 용량 스케줄 또는 다수 용량 스케줄에 의해 이루어질 수 있다. 다수 용량은 일차 면역화 스케줄 및/또는 부스터 면역화 스케줄에서 이용될 수 있다. 다수 용량 스케줄에서, 다양한 용량은 동일하거나 상이한 경로, 예를 들어, 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 제공될 수 있다. 다수 용량은 통상적으로 적어도 1주일 간격(예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등)으로 투여될 것이다.
면역원성 조성물은 다른 백신과 실질적으로 동시(예를 들어, 동일한 의학적 상담 또는 건강관리 전문가 또는 예방접종 센터 방문 동안)에 환자에게 투여될 수 있다.
면역원성 조성물은 항생제와 함께 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 이들은 항생제와 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 유사하게, 이들은 항생제 요법을 받는 대상체에 투여될 수 있다. 유사하게, 이들은 본원에 논의된 조성물 및 항생제 둘 모두의 투여를 수반하는 공동-요법의 일부로서 투여될 수 있다. 항생제는 S. 아우레우스 박테리아, 예를 들어, 베타-락탐에 대해 효과적일 것이다.
균주 및 변종
항원은 현존하는 명명법(예를 들어, "EsxA") 및 GI 번호로서 제공되고 또한 서열 목록에 제공되는 예시적 서열을 참조로 하여 상기 논의되어 있다. 본 발명은 이들 정확한 서열로 한정되지는 않는다. MRSA 균주 N315 및 Mu50[24], MW2, N315, COL, MRSA252, MSSA476, RF122, USA300(매우 독성), JH1, JH9, NCTC 8325, 및 뉴먼(Newman)의 균주를 포함하는 S. 아우레우스의 여러 균주의 유전체 서열이 이용 가능하다. 이들(또는 다른) 추가의 유전체 서열 중 임의의 유전체 서열에서 본원에 언급된 임의의 특정 서열의 동족체를 확인하기 위해 표준 검색 및 정렬 기술이 이용될 수 있다. 또한, 다른 균주로부터의 상동성 서열의 증폭을 위한 프라이머를 설계하기 위해 본원에 개시된 특정 서열이 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 S. 아우레우스의 임의의 균주로부터의 상기 변이체 및 동족체, 뿐만 아니라 비-자연 변이체를 포함한다. 일반적으로, 특정 SEQ ID NO의 적합한 변이체는 이의 대립유전자 변이체, 이의 다형 형태, 이의 동족체, 이의 오쏠로그, 이의 파랄로그, 이의 돌연변이 등을 포함한다.
따라서, 예를 들어, 본 발명과 함께 사용되는 폴리펩티드는 본원의 SEQ ID NO에 비해 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 등)의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존성 치환(즉, 하나의 아미노산의 관련된 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산에 의한 치환)을 포함할 수 있다. 유전적으로 인코딩된 아미노산은 일반적으로 (1) 산성, 즉, 아스파테이트, 글루타메이트; (2) 염기성, 즉, 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성, 즉, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 하전되지 않은 극성, 즉, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신의 4개의 패밀리로 나뉘어진다. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 종종 방향족 아미노산으로 함께 분류된다. 일반적으로, 이들 패밀리 내의 단일 아미노산의 치환은 생물학적 활성에 대한 주요 효과를 갖지 않는다. 폴리펩티드는 또한 SEQ ID NO 서열에 비해 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 등)의 단일 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 SEQ ID NO 서열에 비해 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 등)의 삽입(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 각각)을 포함할 수 있다.
유사하게, 본 발명과 함께 사용되는 폴리펩티드는 (a) 서열 목록에 개시된 서열과 동일(즉, 100% 동일)하거나; (b) 서열 목록에 개시된 서열(이상적으로는, 상기 서열의 전체 길이에 걸쳐)과 서열 동일성(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상)을 공유하거나; (c) (a) 또는 (b)의 서열에 비해 떨어진 위치에 존재하거나 연속적일 수 있는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개(또는 그 초과)의 단일 아미노산 변경(결실, 삽입, 치환)을 갖거나; (d) N-말단으로부터 C-말단으로 x 아미노산의 윈도우를 각각 이동시키는(p 아미노산까지 연장된 정렬에 대해, 여기서 p> x인 경우, 상기 윈도우에 대해 p-x+l임) 쌍을 이룬 정렬 알고리즘을 이용하여 서열 목록으로부터의 특정 서열과 정렬되는 경우, 적어도 x·y(여기서, x는 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200으로부터 선택되고; y는 0.50, 0.60, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99로부터 선택되고; x·y가 정수가 아닌 경우, 이는 가장 가까운 정수로 반올림됨)의 동일한 정렬된 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 쌍을 이룬 정렬 알고리즘은 디폴트 파라미터(예를 들어, EBLOSUM62 스코어링 매트릭스를 이용하여 갭 오픈 페널티 = 10.0, 및 갭 신장 페널티 = 0.5를 가짐)를 이용하는 니들먼-분쉬 전체 정렬 알고리즘[25]이다. 이러한 알고리즘은 EMBOSS 패키지의 니들 툴[26]에서 편리하게 수행된다.
하이브리드 폴리펩티드가 이용되는 경우, 하이브리드 내의 개별적 항원(즉, 개별적 -X- 모이어티)은 하나 이상의 균주로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, n=2인 경우, X2는 X1과 동일한 균주 또는 상이한 균주로부터 유래될 수 있다. n=3인 경우, 균주는 (i) X1=X2=X3 (ii) X1=X2≠X3 (iii) X1≠X2=X3 (iv) X1≠X2≠X3 또는 (v) X1=X3≠X2 등일 수 있다.
그룹 (c) 내에서, 결실 또는 치환은 N-말단 및/또는 C-말단에 존재할 수 있거나, 2개의 말단 사이에 존재할 수 있다. 따라서, 트렁케이션이 결실의 한 예이다. 트렁케이션은 N-말단 및/또는 C-말단에서 40개 이하(또는 그 초과)의 아미노산의 결실을 수반할 수 있다. N-말단 트렁케이션은, 예를 들어, 이종성 숙주에서의 재조합 발현을 촉진하기 위해 선도 펩티드를 제거할 수 있다. C-말단 트렁케이션은, 예를 들어, 이종성 숙주에서의 재조합 발현을 촉진하기 위해 고정 서열을 제거할 수 있다.
일반적으로, 항원이 서열 목록으로부터의 완전한 S. 아우레우스 서열과 동일하지 않은 서열(예를 들어, 서열이 이에 대해 <100% 서열 동일성을 갖는 서열 목록을 포함하거나, 서열이 이의 단편을 포함하는 경우)을 포함하는 경우, 각각의 개별적 예에서 항원이 각각의 완전한 S. 아우레우스 서열을 인지하는 항체를 유도할 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명과 함께 사용되는 폴리펩티드
본 발명과 함께 사용되는 폴리펩티드는 다양한 형태(예를 들어, 자연, 융합체, 당화, 비-당화, 지질화, 비-지질화, 인산화, 비-인산화, 미리스토일화, 비-미리스토일화, 단량체, 다합체 등)를 취할 수 있다.
본 발명과 함께 사용되는 폴리펩티드는 다양한 수단(예를 들어, 재조합 발현, 세포 배양물로부터의 정제, 화학적 합성 등)에 의해 제조될 수 있다. 재조합적으로 발현된 단백질이 특히 하이브리드 폴리펩티드에 대해 바람직하다.
본 발명과 함께 사용되는 폴리펩티드는 바람직하게는 정제되거나 실질적으로 정제된 형태, 즉, 다른 폴리펩티드를 실질적으로 비함유(예를 들어, 자연 발생 폴리펩티드를 비함유)하고, 특히 다른 스태필로코쿠스 또는 숙주 세포 폴리펩티드를 실질적으로 비함유하는 형태로 제공되며, 이는 일반적으로 적어도 약 50% 순도(중량 기준), 보통 적어도 약 90% 순도이고, 즉, 조성물의 약 50% 미만, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만(예를 들어, 5%)가 다른 발현된 폴리펩티드로 구성된다. 따라서, 조성물 내의 항원은 분자가 발현되는 전체 유기체로부터 분리된다.
용어 "폴리펩티드"는 임의의 길이의 아미노산 중합체를 나타낸다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이는 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들어, 표지화 성분을 이용한 컨쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비자연 아미노산 등을 포함함), 뿐만 아니라 당 분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 포함된다. 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 회합된 사슬로 발생할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 발현은 스태필로코쿠스에서 발생할 수 있으나, 본 발명은 보통 발현(재조합 발현)을 위해 이종성 숙주를 이용할 것이다. 이종성 숙주는 원핵생물(예를 들어, 박테리아) 또는 진핵생물일 수 있다. 이는 E. 콜리일 수 있으나, 다른 적합한 숙주는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 나이세리아 락타미카(Neisseria lactamica), 나이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 미코박테리아(Mycobacteria)(예를 들어, M. 튜베르쿨로시스(M.tuberculosis)), 효모 등을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 야생형 S. 아우레우스 유전자에 비해, 인코딩된 아미노산에 영향을 미치지 않고 상기 숙주에서의 발현 효율을 최적화시키기 위해 코돈을 변경시키는 것이 도움이 된다.
애쥬번트
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따라 사용되는 면역원성 조성물은 하나 이상의 애쥬번트를 포함할 수 있다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 애쥬번트는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
A. 무기물 함유 조성물
본 발명에서 애쥬번트로서 사용하기에 적합한 무기물 함유 조성물은 무기물 염, 예를 들어, 알루미늄 염 및 칼슘 염(또는 이들의 혼합물)을 포함한다. 칼슘 염은 칼슘 포스페이트(예를 들어, 참고문헌 27에 개시된 "CAP" 입자)를 포함한다. 알루미늄 염은 하이드록시드 및 포스페이트 등을 포함하며, 이러한 염은 임의의 적합한 형태(예를 들어, 젤, 결정체, 무정형 등)를 취한다. 이들 염으로의 흡착이 바람직하다(예를 들어, 모든 항원이 흡착될 수 있다). 무기물 함유 조성물은 또한 금속 염의 입자로 제형화될 수 있다[28].
알루미늄 하이드록시드 및 알루미늄 포스페이트로 공지된 애쥬번트가 이용될 수 있다. 이들 명칭은 관습적인 것이나, 단지 편의를 위해 사용되며, 어느 것도 제공되는 실제 화학적 화합물의 정확한 설명이 아니다(예를 들어, 참고문헌 29의 챕터 9 참조). 본 발명은 애쥬번트로서 일반적으로 사용되는 "하이드록시드" 또는 "포스페이트" 애쥬번트 중 어느 하나를 이용할 수 있다. "알루미늄 하이드록시드"로 공지된 애쥬번트는 통상적으로 보통 적어도 부분적으로 결정체인 알루미늄 옥시하이드록시드 염이다. "알루미늄 포스페이트"로 공지된 애쥬번트는 통상적으로 적은 양의 설페이트를 또한 종종 함유하는 알루미늄 하이드록시포스페이트(즉, 알루미늄 하이드록시포스페이트 설페이트)이다. 이들은 침전에 의해 획득될 수 있고, 침전 동안의 반응 조건 및 농도가 염 내의 하이드록실에 대한 포스페이트의 치환 정도에 영향을 미친다.
섬유상 형태(예를 들어, 투과 전자 현미경에서 관찰됨)가 알루미늄 하이드록시드 애쥬번트에 대해 통상적이다. 알루미늄 하이드록시드 애쥬번트의 pI는 통상적으로 약 11이고, 즉, 상기 애쥬번트 자체는 생리학적 pH에서 양성 표면 전하를 갖는다. pH 7.4에서 Al+++ 1 mg 당 1.8-2.6 mg 단백질의 흡착 능력이 알루미늄 하이드록시드 애쥬번트에 대해 보고된 적이 있다.
알루미늄 포스페이트 애쥬번트는 일반적으로 0.3 내지 1.2, 바람직하게는 0.8 내지 1.2, 더욱 바람직하게는 0.95±0.1의 PO4/Al 몰비를 갖는다. 알루미늄 포스페이트, 특히 하이드록시포스페이트 염은 일반적으로 무정형일 것이다. 통상적인 애쥬번트는 0.6mg Al3 +/ml로 포함되는 0.84 내지 0.92의 PO4/Al 몰비를 갖는 무정형 알루미늄 하이드록시포스페이트이다. 알루미늄 포스페이트는 일반적으로 미립자(예를 들어, 투과 전자 현미경에서 관찰되는 바와 같이 판형 유사 형태)일 것이다. 입자의 통상적인 직경은 임의의 항원 흡착 후 0.5-20μm 범위(예를 들어, 약 5-10μm) 내이다. pH 7.4에서 Al+++ 1 mg 당 0.7-1.5 mg 단백질의 흡착 능력이 알루미늄 포스페이트 애쥬번트에 대해 보고된 적이 있다.
알루미늄 포스페이트의 영전하점(PZC)은 하이드록실에 대한 포스페이트의 치환 정도와 역으로 관련되며, 이러한 치환 정도는 침전에 의해 염을 제조하기 위해 이용되는 반응물의 반응 조건 및 농도에 따라 다양할 수 있다. PZC는 또한 용액 내의 자유 포스페이트 이온의 농도를 변화(더 많은 포스페이트 = 더욱 산성의 PZC)시키거나, 완충제, 예를 들어, 히스티딘 완충제를 첨가(PZC를 더욱 염기성을 만듬)함으로써 변경된다. 본 발명에 따라 사용되는 알루미늄 포스페이트는 일반적으로 4.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 5.0 내지 6.5, 예를 들어, 약 5.7의 PZC를 가질 것이다.
본 발명의 조성물을 제조하기 위해 사용되는 알루미늄 염의 현탁액은 완충제(예를 들어, 포스페이트 또는 히스티딘 또는 트리스 완충제)를 함유할 수 있으나, 이는 항상 필요한 것은 아니다. 현탁액은 바람직하게는 멸균되고, 발열원을 비함유한다. 현탁액은, 예를 들어, 1.0 내지 20 mM, 바람직하게는 5 내지 15 mM, 더욱 바람직하게는 약 10 mM의 농도로 제공되는 자유 수성 포스페이트 이온을 포함할 수 있다. 현탁액은 또한 소듐 클로라이드를 포함할 수 있다.
본 발명은 알루미늄 하이드록시드 및 알루미늄 포스페이트 둘 모두의 혼합물을 이용할 수 있다. 이러한 경우, 예를 들어, 적어도 2:1, 예를 들어, ≥5:1, ≥6:1, ≥7:1, ≥8:1, ≥9:1 등의 중량비와 같이 하이드록시드보다 많은 알루미늄 포스페이트가 존재할 수 있다.
환자로의 투여를 위한 조성물 내의 Al+++의 농도는 바람직하게는 10mg/ml 미만, 예를 들어, ≤5 mg/ml, ≤4 mg/ml, ≤3 mg/ml, ≤2 mg/ml, ≤1 mg/ml 등이다. 바람직한 범위는 0.3 내지 1mg/ml이다. 최대 0.85mg/용량이 바람직하다.
B. 수중유 에멀젼
본 발명에서 애쥬번트로 사용하기에 적합한 수중유 에멀젼 조성물은 수중 스쿠알렌 에멀젼, 예를 들어, MF59(참고문헌 29의 챕터 10 참조; 또한 참고문헌 30 참조) 및 AS03[31]을 포함한다.
다양한 수중유 에멀젼 애쥬번트가 공지되어 있고, 이들은 통상적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하고, 오일(들) 및 계면활성제(들)은 생물분해성(대사가능성) 및 생체적합성이다. 에멀젼은 서브마이크론 오일 비말을 포함할 것이며, 220nm 미만의 직경을 갖는 비말을 갖는 에멀젼이 바람직한데, 이는 이들이 필터 멸균에 적용될 수 있기 때문이다.
에멀젼은 하나 이상의 오일을 포함한다. 적합한 오일(들)은, 예를 들어, 동물(예를 들어, 어류) 또는 식물 공급원의 오일(들)을 포함한다. 오일은 이상적으로는 생물분해성(대사가능성) 및 생체적합성이다. 식물성 오일에 대한 공급원은 견과, 종자 및 곡물을 포함한다. 가장 흔히 이용 가능한 낙화생유, 대두유, 코코넛유, 및 올리브유가 견과 오일의 예시이다. 예를 들어, 호호바 콩으로부터 획득된 호호바 오일이 이용될 수 있다. 종자 오일은 잇꽃유, 면실유, 해바라기씨유, 참기름 등을 포함한다. 곡물 그룹에서, 옥수수유가 가장 용이하게 이용 가능하나, 다른 곡류 곡물, 예를 들어, 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프(teff), 트리티케일(triticale) 등의 오일이 또한 이용될 수 있다. 종자 오일에서 자연 발생하지 않는 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 6-10 탄소 지방산 에스테르가 견과 및 종자 오일로부터 시작하는 적절한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수 있다. 포유동물 밀크로부터의 지방 및 오일은 대사 가능하므로, 이용될 수 있다. 분리, 정제, 사포닌화, 및 동물 공급원으로부터 순수한 오일을 획득하기 위해 필요한 다른 수단에 대한 절차는 당 분야에 널리 공지되어 있다.
대부분의 어류는 용이하게 회수될 수 있는 대사 가능한 오일을 함유한다. 예를 들어, 대구 간유, 상어 간유, 및 고래 오일, 예를 들어, 경뇌가 본원에서 이용될 수 있는 여러 어류 오일의 예시이다. 다수의 분지된 사슬의 오일이 5-탄소 이소프렌 단위에서 생화학적으로 합성되며, 일반적으로 테르페노이드로 언급된다. 바람직한 에멀젼은 분지된 불포화 테르페노이드인 상어 간유 스쿠알렌을 포함한다. 스쿠알렌의 포화 유사체인 스쿠알란이 또한 이용될 수 있다. 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함하는 어류 오일은 상업적 공급원으로부터 용이하게 이용 가능하거나, 당 분야에 공지된 방법에 의해 획득될 수 있다.
다른 유용한 오일은 토코페롤, 특히 스쿠알렌과 조합된 토코페롤이다. 에멀젼의 오일상이 토코페롤을 포함하는 경우, α, β, γ, δ, ε 또는 ξ 토코페롤 중 임의의 토코페롤이 이용될 수 있으나, α 토코페롤이 바람직하다. D-α-토코페롤 및 DL-α-토코페롤 둘 모두가 이용될 수 있다. 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이다. 스쿠알렌 및 토코페롤(예를 들어, DL-α-토코페롤)을 포함하는 오일 조합물이 이용될 수 있다.
에멀젼 내의 오일은 오일의 조합물, 예를 들어, 스쿠알렌 및 적어도 하나의 다른 오일의 조합물을 포함할 수 있다.
에멀젼의 수성 성분은 순수한 물(예를 들어, w.f.i.)일 수 있거나, 추가 성분, 예를 들어, 용질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 완충제를 형성시키기 위한 염, 예를 들어, 시트레이트 또는 포스페이트 염, 예를 들어, 소듐 염을 포함할 수 있다. 통상적인 완충제는 포스페이트 완충제; 트리스 완충제; 보레이트 완충제; 숙시네이트 완충제; 히스티딘 완충제; 또는 시트레이트 완충제를 포함한다. 완충된 수성상이 바람직하며, 완충제는 통상적으로 5-20mM 범위 내로 포함될 것이다.
오일 및 양이온성 지질에 더하여, 에멀젼은 비-이온성 계면활성제 및/또는 쯔비터이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(보통 Tweens로 언급됨), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; DOWFAX™ 상표명으로 시판되는 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO), 및/또는 부틸렌 옥사이드(BO)의 공중합체, 예를 들어, 선형 EO/PO 블록 공중합체; 반복 에톡시(옥시-1,2-에탄디일)기의 수가 다양할 수 있는 옥톡시놀, 특히 관심있는 옥톡시놀-9(Triton X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올); (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올(IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예를 들어, 포스파티딜콜린(레시틴); 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르(Brij 계면활성제로 공지됨), 예를 들어, 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르; 및 소르비탄 에스테르(보통 Spans로 공지됨), 예를 들어, 소르비탄 트리올레에이트(Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 에멀젼에 포함시키기 위한 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 80(Tween 80; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트), Span 85(소르비탄 트리올레에이트), 레시틴 및 Triton X-100이다.
계면활성제의 혼합물, 예를 들어, Tween 80/Span 85 혼합물, 또는 Tween 80/Triton-X100 혼합물이 이용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(Tween 80) 및 옥톡시놀, 예를 들어, t-옥틸페녹시-폴리에톡시에탄올(Triton X-100)의 조합물이 또한 적합하다. 또 다른 유용한 조합물은 라우레쓰 9 + 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다. 유용한 혼합물은 10-20의 범위 내의 HLB 값을 갖는 계면활성제(예를 들어, 15.0의 HLB를 갖는 폴리소르베이트 80) 및 1-10의 범위 내의 HLB 값을 갖는 계면활성제(예를 들어, 1.8의 HLB를 갖는 소르비탄 트리올레에이트)를 포함할 수 있다.
최종 에멀젼 내의 오일의 바람직한 양(부피%)은 2-20%, 예를 들어, 5-15%, 6-14%, 7-13%, 8-12%이다. 약 4-6% 또는 약 9-11%의 스쿠알렌 함량이 특히 유용하다.
최종 에멀젼 내의 계면활성제의 바람직한 양(중량%)은 0.001% 내지 8%이다. 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예를 들어, 폴리소르베이트 80) 0.2 내지 4%, 특히 0.4-0.6%, 0.45-0.55%, 약 0.5% 또는 1.5-2%, 1.8-2.2%, 1.9-2.1%, 약 2%, 또는 0.85-0.95%, 또는 약 1%; 소르비탄 에스테르(예를들어, 소르비탄 트리올레에이트) 0.02 내지 2%, 특히 약 0.5% 또는 약 1%; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예를 들어, Triton X-100) 0.001 내지 0.1%, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르(예를 들어, 라우레쓰 9) 0.1 내지 8%, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%.
오일 및 계면활성제의 절대량, 및 이들의 비는 에멀젼을 여전히 형성하는 광범위한 범위 내에서 다양할 수 있다. 당업자는 요망되는 에멀젼을 획득하기 위해 성분의 상대 비율을 용이하게 변화시킬 수 있으나, 오일 및 계면활성제에 대해 4:1 내지 5:1의 중량비가 통상적이다(과량의 오일).
특히, 큰 동물에서 에멀젼의 면역자극성 활성을 보장하기 위한 중요한 파라미터는 오일 비말 크기(직경)이다. 가장 효과적인 에멀젼은 서브마이크론 범위 내의 비말 크기를 갖는다. 적합하게는, 비말 크기는 50-750nm 범위 내일 것이다. 가장 유용하게는, 평균 비말 크기는 250nm 미만, 예를 들어, 200nm 미만, 150nm 미만이다. 평균 비말 크기는 유용하게는 80-180nm의 범위 내이다. 이상적으로, 에멀젼의 오일 비말의 적어도 80%(수 기준), 바람직하게는 적어도 90%는 250 nm 미만의 직경이다. 이러한 비말 크기는 미세유동화와 같은 기술에 의해 편리하게 달성될 수 있다. 에멀젼 내의 평균 비말 크기, 및 크기 분포를 결정하기 위한 장치는 상업적으로 이용 가능하다. 이들은 통상적으로 동적 광 산란 및/또는 단일-입자 광학 감지의 기술을 이용하며, 예로는 Particle Sizing Systems(Santa Barbara, USA)로부터 이용 가능한 Accusizer™ 및 Nicomp™ 시리즈 기계, 또는 Malvern Instruments(UK)로부터의 Zetasizer™ 기계, 또는 Horiba(Kyoto, Japan)로부터의 Particle Size Distribution Analyzer 기계가 있다.
이상적으로, 비말 크기의 분포(수 기준)는 단지 하나의 최고치를 가지며, 즉, 2개의 최고치를 갖는 것이 아니라 평균 주위에 분포된 비말의 단일 집단(모드)이 존재한다. 바람직한 에멀젼은 <0.4, 예를 들어, 0.3, 0.2, 또는 그 미만의 다분산성을 갖는다.
본 발명에서 유용한 특정한 수중유 에멀젼 애쥬번트는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
● 스쿠알렌, Tween 80, 및 Span 85의 서브마이크론 에멀젼. 부피를 기준으로 한 에멀젼의 조성은 약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% Span 85일 수 있다. 중량 표현으로, 이들 비는 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% Span 85가 된다. 이러한 애쥬번트는 참고문헌 35의 챕터 10 및 참고문헌 36의 챕터 12에 더욱 상세히 기재된 바와 같이 'MF59'[32-34]로 공지되어 있다. MF59 에멀젼은 유리하게는 시트레이트 이온, 예를 들어, 10mM 소듐 시트레이트 완충제를 포함한다.
● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 에멀젼. 상기 에멀젼은 포스페이트 완충 염수를 포함할 수 있다. 이들 에멀젼은 부피를 기준으로 2 내지 10%의 스쿠알렌, 2 내지 10%의 토코페롤 및 0.3 내지 3%의 폴리소르베이트 80을 가질 수 있으며, 스쿠알렌:토코페롤의 중량비는 바람직하게는 <1(예를 들어, 0.90)인데, 이러한 중량비가 더욱 안정한 에멀젼을 제공할 수 있기 때문이다. 스쿠알렌 및 폴리소르베이트 80은 약 5:2의 부피비 또는 약 11:5의 중량비로 제공될 수 있다. 따라서, 3개의 성분(스쿠알렌, 토코페롤, 폴리소르베이트 80)은 1068:1186:485 또는 약 55:61:25의 중량비로 제공될 수 있다. 하나의 상기 에멀젼('AS03')은 PBS에 Tween 80을 용해시켜 2% 용액을 생성시킨 후, 90ml의 상기 용액과 (5g의 DL α 토코페롤 및 5ml의 스쿠알렌)의 혼합물을 혼합시킨 후, 혼합물을 미세유동화시킴으로써 제조될 수 있다. 생성된 에멀젼은, 예를 들어, 100 내지 250nm, 바람직하게는 약 180nm의 평균 직경을 갖는 서브마이크론의 오일 비말을 가질 수 있다. 상기 에멀젼은 또한 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3d MPL)를 포함할 수 있다. 이러한 유형의 또 다른 유용한 에멀젼은, 예를 들어, 상기 논의된 비로 인간 용량 당 0.5-10 mg의 스쿠알렌, 0.5-11 mg의 토코페롤, 및 0.1-4 mg의 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다[37].
● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 Triton 세제(예를 들어, Triton X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 에멀젼은 포스페이트 완충제를 함유할 수 있다.
● 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 80), Triton 세제(예를 들어, Triton X-100) 및 토코페롤(예를 들어, α-토코페롤 숙시네이트)을 포함하는 에멀젼. 상기 에멀젼은 약 75:11:10의 질량비의 상기 3개의 성분(예를 들어, 750μg/ml의 폴리소르베이트 80, 110μg/ml의 Triton X-100 및 100μg/ml의 α-토코페롤 숙시네이트)을 포함할 수 있고, 이들 농도는 항원으로부터의 이들 성분의 임의의 기여를 포함해야 한다. 상기 에멀젼은 또한 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 상기 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 상기 수성상은 포스페이트 완충제를 함유할 수 있다.
● 스쿠알란, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401("Pluronic™ L121")의 에멀젼. 상기 에멀젼은 포스페이트 완충 염수, pH 7.4에서 제형화될 수 있다. 이러한 에멀젼은 뮤라밀 디펩티드에 대한 유용한 전달 비히클이며, "SAF-1" 애쥬번트에서 트레오닐 MDP와 함께 사용되어 왔다[38](0.05-1%의 Thr-MDP, 5% 스쿠알란, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 이는 또한 "AF" 애쥬번트에서와 같이 Thr-MDP 없이 이용될 수 잇다[39](5% 스쿠알란, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 미세유동화가 바람직하다.
● 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리옥시에틸렌(12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르, 예를 들어, 소르비탄 모노올레에이트 또는 'Span 80')를 포함하는 에멀젼. 상기 에멀젼은 바람직하게는 열가역적이고/이거나, 200 nm 미만의 크기를 갖는 적어도 90%의 오일 비말(부피 기준)을 갖는다[40]. 상기 에멀젼은 또한 알디톨; 동결방지제(예를 들어, 당, 예를 들어, 도데실말토시드 및/또는 수크로스); 및/또는 알킬폴리글리코시드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 에멀젼은 TLR4 효능제를 포함할 수 있다[41]. 상기 에멀젼은 동결건조될 수 있다.
● 스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀젼[42]. 애쥬번트화된 백신 내 이들 성분의 최종 농도(중량)는 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머 105(pluronic 폴리올) 및 2% Abil-Care 85(Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드)이다.
● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질, 및 0.05-5%의 비이온성 계면활성제를 갖는 에멀젼. 참고문헌 43에 기재된 바와 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카디오리핀이다. 서브마이크론 비말 크기가 유리하다.
● 대사 가능하지 않은 오일(예를 들어, 경량 무기물 오일) 및 적어도 하나의 계면활성제(예를 들어, 레시틴, Tween 80 또는 Span 80)의 서브마이크론 수중유 에멀젼. 첨가제, 예를 들어, QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성 컨쥬게이트(예를 들어, 글루쿠론산의 카르복실기를 통한 데스아실사포닌으로의 지방족 아민의 첨가에 의해 생성된 참고문헌 44에 기재된 GPI-0100), 디메티이디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스 (2-하이드록시에틸)프로판디아민이 포함될 수 있다.
● 사포닌(예를 들어, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)이 헬리칼 마이셀로 회합된 에멀젼[45].
● 무기물 오일, 비-이온성 친지질성 에톡실화 지방 알콜, 및 비이온성 친수성 계면활성제(예를 들어, 에톡실화 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체)를 포함하는 에멀젼[46].
● 무기물 오일, 비-이온성 친수성 에톡실화 지방 알콜, 및 비이온성 친지질성 계면활성제(예를 들어, 에톡실화 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체)를 포함하는 에멀젼[46].
일부 구체예에서, 에멀젼은 전달시에 즉석으로 항원(들)과 혼합될 수 있고, 따라서 애쥬번트 및 항원(들)은 사용시에 최종 제형에 대해 준비된 패키징되거나 분산된 백신으로 단독으로 유지될 수 있다. 다른 구체예에서, 에멀젼은 제조 동안 항원과 혼합되고, 따라서 조성물은 액체 애쥬번트화 형태로 패키징된다. 항원은 일반적으로 수성 형태로 존재할 것이며, 백신은 최종적으로 2개의 액체를 혼합함으로써 제조된다. 혼합을 위한 2개의 액체의 부피비는 다양할 수 있으나(예를 들어, 5:1 내지 1:5), 일반적으로 약 1:1이다. 성분의 농도가 특정 에멀젼의 상기 설명에 제공되는 경우, 이들 농도는 통상적으로 희석되지 않은 조성물에 대한 것으로, 항원 용액과의 혼합 후의 농도는 따라서 감소할 것이다.
C. 사포닌 제형 [참고문헌 29의 챕터 22]
사포닌 제형은 또한 본 발명에서 애쥬번트로 이용될 수 있다. 사포닌은 광범위한 식물 종의 나무껍질, 잎, 줄기, 뿌리 및 심지어 꽃에서 발견되는 스테롤 글리코시드 및 트리테르페노이드 글리코시드의 이종성 그룹이다. 퀼라이아 사포나리아 몰리나(Quillaia saponaria Molina) 나무의 나무껍질로부터의 사포닌이 애쥬번트로서 널리 연구되어 왔다. 사포닌은 또한 스밀락스 오르나타(Smilax ornata)(사르사프릴라(sarsaprilla)), 집소필라 파니쿨라타(Gypsophilla paniculata)(브리지스 베일(brides veil)), 및 사포나리아 오피시아날리스(Saponaria officianalis)(소프 루트(soap root))로부터 상업적으로 획득될 수 있다. 사포닌 애쥬번트 제형은 정제된 제형, 예를 들어, QS21, 뿐만 아니라 지질 제형, 예를 들어, ISCOM을 포함한다. QS21은 Stimulon™으로 시판된다.
사포닌 조성물은 HPLC 및 RP-HPLC를 이용하여 정제되어 왔다. QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B 및 QH-C를 포함하는 상기 기술을 이용한 특정한 정제된 분획이 확인되었다. 바람직하게는, 사포닌은 QS21이다. QS21의 생성 방법은 참고문헌 47에 개시되어 있다. 사포닌 제형은 또한 스테롤, 예를 들어, 콜레스테롤을 포함할 수 있다[48].
ISCOM으로 언급되는 입자(참고문헌 29의 챕터 23)를 형성시키기 위해 사포닌 및 콜레스테롤의 조합물이 이용될 수 있다. ISCOM은 통상적으로 인지질, 예를 들어, 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린을 포함한다. ISCOM에서 임의의 공지된 사포닌이 이용될 수 있다. 바람직하게는, ISCOM은 QuilA, QHA 및 QHC 중 하나 이상을 포함한다. ISCOM은 참고문헌 48-50에 추가로 기재되어 있다. 임의로, ISCOM은 추가 세제가 결여되어 있을 수 있다[51].
사포닌 기반 애쥬번트의 개발의 개관은 참고문헌 52 및 53에서 발견될 수 있다.
D. 박테리아 또는 미생물 유도체
본 발명에서 사용하기에 적합한 애쥬번트는 박테리아 또는 미생물 유도체, 예를 들어, 장내세균 지질다당류(LPS)의 비독성 유도체, 지질 A 유도체, 면역자극성 올리고뉴클레오티드 및 ADP-리보실화 독소 및 이의 무독화 유도체를 포함한다.
LPS의 비독성 유도체는 모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 3-O-데아실화 MPL(3dMPL)을 포함한다. 3dMPL은 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화 사슬의 혼합물이다. 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 "소립자" 형태가 참고문헌 54에 개시되어 있다. 3dMPL의 상기 "소립자"는 0.22μm 막을 통해 멸균 여과되기에 충분히 작다[54]. 다른 비독성 LPS 유도체는 모노포스포릴 지질 A 모방체, 예를 들어, 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트 유도체, 예를 들어, RC-529를 포함한다(하기 참조).
지질 A 유도체는 에스케리키아 콜리로부터의 지질 A의 유도체, 예를 들어, OM-174를 포함한다. OM-174는, 예를 들어, 참고문헌 55 및 56에 기재되어 있다.
본 발명에서 애쥬번트로서 사용하기에 적합한 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 CpG 모티프를 함유하는 뉴클레오티드 서열(포스페이트 결합에 의해 구아노신에 연결된 메틸화되지 않은 시토신을 함유하는 디뉴클레오티드 서열)을 포함한다. 팔린드롬 또는 폴리(dG) 서열을 함유하는 이중 가닥 RNA 및 올리고뉴클레오티드가 또한 면역자극성인 것으로 밝혀졌다.
CpG는 뉴클레오티드 변형/유사체, 예를 들어, 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있으며, 이는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 참고문헌 57, 58 및 59에는 가능한 유사 치환, 예를 들어, 2'-데옥시-7-데아자구아노신에 의한 구아노신의 대체가 개시되어 있다. CpG 올리고뉴클레오티드의 애쥬번트 효과는 참고문헌 60-65에 추가로 논의되어 있다.
모티프 GTCGTT 또는 TTCGTT와 같은 CpG 서열은 TLR9에 특이적일 수 있다[66]. CpG-A ODN과 같은 CpG 서열은 Th1 면역 반응을 유도하는데 특이적일 수 있거나, CpG-B ODN과 같은 CpG 서열은 B 세포 반응을 유도하는데 더욱 특이적일 수 있다. CpG-A 및 CpG-B ODN은 참고문헌 67-69에 논의되어 있다. 바람직하게는, CpG는 CpG-A ODN이다.
바람직하게는, CpG 올리고뉴클레오티드는 5' 말단이 수용체 인지를 위해 접근 가능하도록 작제된다. 임의로, 2개의 CpG 올리고뉴클레오티드 서열이 이들의 3' 말단에 부착되어 "이뮤노머(immunomer)"를 형성할 수 있다. 예를 들어, 참고문헌 66 및 70-72를 참조한다.
유용한 CpG 애쥬번트는 ProMune™(Coley Pharmaceutical Group, Inc.)으로도 공지된 CpG7909이다. 또 다른 것은 CpG1826이다. CpG 서열을 이용하는 것에 대한 대안으로서 또는 이에 더하여, TpG 서열이 이용될 수 있으며[73], 이들 올리고뉴클레오티드는 메틸화되지 않은 CpG 모티프가 없을 수 있다. 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 피리미딘이 풍부하게 존재할 수 있다. 예를 들어, 이는 하나 초과의 연속 티미딘 뉴클레오티드(예를 들어, 참고문헌 73에 개시된 바와 같은 TTTT)를 포함할 수 있고/있거나, 이는 >25% 티미딘(예를 들어, >35%, >40%, >50%, >60%, >80% 등)을 갖는 뉴클레오티드 조성물을 가질 수 있다. 예를 들어, 이는 하나 초과의 연속 시토신 뉴클레오티드(예를 들어, 참고문헌 73에 개시된 바와 같은 CCCC)를 포함할 수 있고/있거나, 이는 >25% 시토신(예를 들어, >35%, >40%, >50%, >60%, >80% 등)을 갖는 뉴클레오티드 조성물을 가질 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 메틸화되지 않은 CpG 모티프가 없을 수 있다. 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 적어도 20개의 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 이들은 100개보다 적은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
면역자극성 올리고뉴클레오티드를 기초로 한 특히 유용한 애쥬번트는 IC-31™으로 공지되어 있다[74]. 따라서, 본 발명과 함께 사용되는 애쥬번트는 (i) 적어도 하나(바람직하게는 다수)의 CpI 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 15-40개의 뉴클레오티드)(즉, 디뉴클레오티드를 형성하기 위해 이노신에 연결된 시토신), 및 (ii) 적어도 하나(바람직하게는 다수)의 Lys-Arg-Lys 트리펩티드 서열(들)을 포함하는 다가양이온 중합체, 예를 들어, 올리고펩티드(예를 들어, 5-20개의 아미노산)의 혼합물을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 26-mer 서열 5'-(IC)13-3'(SEQ ID NO:41)을 포함하는 데옥시뉴클레오티드일 수 있다. 다가양이온 중합체는 11-mer 아미노산 서열 KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO:42)를 포함하는 펩티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 및 중합체는, 예를 들어, 참고문헌 75 및 76에 개시된 바와 같이 복합체를 형성할 수 있다.
박테리아 ADP-리보실화 독소 및 이의 무독화 유도체가 본 발명에서 애쥬번트로 이용될 수 있다. 바람직하게는, 단백질은 E.콜리(E.콜리 열 불안정 장독소 "LT"), 콜레라("CT"), 또는 백일해("PT")로부터 유래된다. 점막 애쥬번트로서의 무독화된 ADP-리보실화 독소의 사용이 참고문헌 77에 기재되어 있고, 비경구 애쥬번트로서의 사용이 참고문헌 78에 기재되어 있다. 독소 또는 톡소이드는 바람직하게는 A 및 B 서브유닛 둘 모두를 포함하는 홀로톡신(holotoxin)의 형태로 존재한다. 바람직하게는, A 서브유닛은 무독화 돌연변이를 함유하고, 바람직하게는, B 서브유닛은 돌연변이되지 않는다. 바람직하게는, 애쥬번트는 무독화된 LT 돌연변이, 예를 들어, LT-K63, LT-R72, 및 LT-G192이다. 애쥬번트로서의 ADP-리보실화 독소 및 이의 무독화 유도체, 특히 LT-K63 및 LT-R72의 이용이 참고문헌 79-86에서 발견될 수 있다. 유용한 CT 돌연변이는 CT-E29H이다[87]. 아미노산 치환에 대한 숫자상의 언급은 바람직하게는 전체내용이 참조로서 본원에 특별히 포함되는 참고문헌 88에 기재된 ADP-리보실화 독소의 A 및 B 서브유닛의 정렬을 기초로 한다.
E. TLR 효능제
조성물은 TLR 효능제, 즉, Toll-유사 수용체를 효능화시킬 수 있는 화합물을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, TLR 효능제는 인간 TLR의 효능제이다. TLR 효능제는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 또는 TLR11 중 임의의 것을 활성화시킬 수 있고; 바람직하게는 이는 인간 TLR4 또는 인간 TLR7을 활성화시킬 수 있다.
임의의 특정 Toll-유사 수용체에 대한 화합물의 효능제 활성은 표준 검정에 의해 결정될 수 있다. Imgenex 및 Invivogen과 같은 회사는 인간 TLR 유전자 및 NFκB로 안정적으로 공동 트랜스펙션된 세포주와 TLR 활성화 경로를 측정하기에 적합한 리포터 유전자를 공급한다. 이들은 민감한 넓은 작업 범위 역학에 대해 설계되며, 고-처리량 스크리닝에 이용될 수 있다. 1개 또는 2개의 특정 TLR의 항시적 발현이 상기 세포주에서 통상적이다. 또한, 참고문헌 89를 참조한다. 많은 TLR 효능제가 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 참고문헌 90에는 TLR2 효능제인 특정 리포펩티드 분자가 기재되어 있고, 참고문헌 91 내지 94 각각에는 TLR7의 소분자 효능제의 부류가 기재되어 있고, 참고문헌 95 및 96에는 질병의 치료를 위한 TLR7 및 TLR8 효능제가 기재되어 있다.
본 발명과 함께 사용되는 TLR 효능제는 이상적으로는 적어도 하나의 흡착 모이어티를 포함한다. TLR 효능제 내의 상기 모이어티의 포함은 이들을 불용성 알루미늄 염에 흡착시키고(예를 들어, 리간드 교환 또는 임의의 다른 적합한 메카니즘에 의함), 이들의 면역학적 거동을 개선시키는 것을 가능케 한다[97]. 인-함유 흡착 모이어티가 특히 유용하고, 이에 흡착 모이어티는 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포나이트, 포스피나이트 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, TLR 효능제는 적어도 하나의 포스포네이트기를 포함한다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 조성물은 포스포네이트기를 포함하는 TLR 효능제(더욱 바람직하게는, TLR7 효능제)를 포함한다. 이러한 포스포네이트기는 불용성 알루미늄 염으로의 효능제의 흡착을 가능케 할 수 있다[97].
본 발명에서 유용한 TLR 효능제는 단일 흡착 모이어티를 포함할 수 있거나, 하나 초과, 예를 들어, 2 내지 15개의 흡착 모이어티를 포함할 수 있다. 통상적으로, 화합물은 1, 2 또는 3개의 흡착 모이어티를 포함할 것이다.
유용한 인-함유 TLR 효능제는 하기 화학식 (A1)에 의해 표현될 수 있다:
Figure pct00003
상기 식에서,
RX 및 RY는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되고;
X는 공유 결합, O 및 NH로부터 선택되고;
Y는 공유 결합, O, C(O), S 및 NH로부터 선택되고;
L은 링커, 예를 들어, 할로, OH, C1-C4알킬, -OP(O)(OH)2 및 P(O)(OH)2로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 치환기로 각각 임의로 치환되는 C1-C6알킬렌, C1-C6알케닐렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, C1-C6알킬렌옥시 및 -((CH2)pO)q(CH2)p-로부터 선택된 링커이고;
각각의 p는 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 독립적으로 선택되고;
q는 1, 2, 3 및 4로부터 선택되고;
n은 1, 2 및 3으로부터 선택되고;
A는 TLR 효능제 모이어티이다.
한 구체예에서, 화학식 (A1)에 따른 TLR 효능제는 다음과 같다: RX 및 RY는 H이고; X는 O이고; L은 1 내지 2개의 할로겐 원자로 각각 임의로 치환되는 C1-C6 알킬렌 및 -((CH2)pO)q(CH2)p-로부터 선택되고; p는 1, 2 및 3으로부터 선택되고; q는 1 및 2로부터 선택되고; n은 1이다. 따라서, 이들 구체예에서, 흡착 모이어티는 포스페이트기를 포함한다.
화학식 (A1)의 다른 유용한 TLR 효능제는 참고문헌 98의 6-13페이지에 개시되어 있다.
조성물은 이미다조퀴놀론 화합물, 예를 들어, 이미퀴모드(Imiquimod)("R-837")[99,100], 레시퀴모드(Resiquimod)("R-848")[101], 및 이들의 유사체; 및 이들의 염(예를 들어, 하이드로클로라이드 염)을 포함할 수 있다. 면역자극성 이미다조퀴놀린에 대한 추가의 세부사항은 참고문헌 102 내지 106에서 발견될 수 있다.
조성물은 TLR4 효능제, 가장 바람직하게는 인간 TLR4의 효능제를 포함할 수 있다. TLR4는 통상적인 수지상 세포 및 대식세포를 포함하는 선천 면역계의 세포에 의해 발현된다[107]. TLR4를 통한 촉발은 MyD88- 및 TRIF-의존성 경로 둘 모두를 이용하여 NF-κB 및 IRF3/7 활성화를 각각 초래하는 신호전달 캐스케이드를 유도한다. TLR4 활성화는 통상적으로 강한 IL-12p70 생성을 유도하고, Th1-타입 세포성 및 체액성 면역 반응을 크게 향상시킨다.
다양한 유용한 TLR4 효능제가 당 분야에 공지되어 있고, 이 중 많은 것이 내독소 또는 지질다당류(LPS)의 유사체이다. 예를 들어, TLR4 효능제는 3d-MPL(즉, GSK의 'AS04' 애쥬번트에 제공되는 3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A, 참고문헌 108 내지 111의 추가 세부사항을 가짐); 글루코피라노실 지질 A(GLA)[112] 또는 이의 암모늄 염; 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트, 예를 들어, RC-529 또는 CRX-524[113-115]; E5564[116,117]; 또는 참고문헌 118에서 정의된 바와 같은 화학식 I, II 또는 III의 화합물, 또는 이들의 염, 예를 들어, 화합물 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', 'ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 803022', 'ER 804764' 또는 'ER 804057'(E6020으로도 공지됨)일 수 있다.
본 발명은 인간 TLR7 효능제, 예를 들어, 하기 화학식 (K)의 화합물을 이용하는 경우에 특히 유용하다. 이들 효능제는 참고문헌 119에 상세히 논의되어 있다:
Figure pct00004
상기 식에서,
R1은 H, C1-C6알킬, -C(R5)2OH, -L1R5, -L1R6, -L2R5, -L2R6, -OL2R5, 또는 -OL2R6이고;
L1은 -C(O)- 또는 -O-이고;
L2는 C1-C6알킬렌, C2-C6알케닐렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌 또는 -((CR4R4)pO)q(CH2)p-이고, 여기서 L2의 C1-C6알킬렌 및 C2-C6알케닐렌은 1 내지 4개의 플루오로기로 임의로 치환되고;
각각의 L3는 C1-C6알킬렌 및 -((CR4R4)pO)q(CH2)p-로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 L3의 C1-C6알킬렌은 1 내지 4개의 플루오로기로 임의로 치환되고;
L4는 아릴렌 또는 헤테로아릴렌이고;
R2는 H 또는 C1-C6알킬이고;
R3는 C1-C4알킬, -L3R5, -L1R5, -L3R7, -L3L4L3R7, -L3L4R5, -L3L4L3R5, -OL3R5, -OL3R7, -OL3L4R7, -OL3L4L3R7, -OR8, -OL3L4R5, -OL3L4L3R5 및 -C(R5)2OH로부터 선택되고;
각각의 R4는 H 및 플루오로부터 독립적으로 선택되고;
R5는 -P(O)(OR9)2이고,
R6는 -CF2P(O)(OR9)2 또는 -C(O)OR10이고;
R7은 -CF2P(O)(OR9)2 또는 -C(O)OR10이고;
R8은 H 또는 C1-C4알킬이고;
각각의 R9은 H 및 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택되고;
R10은 H 또는 C1-C4알킬이고;
각각의 p는 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 독립적으로 선택되고;
q는 1, 2, 3 또는 4이다.
화학식 (K)의 화합물은 바람직하게는 하기 화학식 (K')의 화합물이다:
Figure pct00005
상기 식에서,
P1은 H, COOH로 임의로 치환되는 C1-C6알킬 및 -Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)로부터 선택되고;
P2는 H, C1-C6알킬, C1-C6알콕시 및 -Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)로부터 선택되고;
단, P1 및 P2 중 적어도 하나는 -Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)이고;
RB는 H 및 C1-C6알킬로부터 선택되고;
RX 및 RY는 H 및 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택되고;
X는 공유 결합, O 및 NH로부터 선택되고;
Y는 공유 결합, O, C(O), S 및 NH로부터 선택되고;
L은 할로, OH, C1-C4알킬, -OP(O)(OH)2 및 -P(O)(OH)2로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 치환기로 각각 임의로 치환되는 공유 결합 C1-C6알킬렌, C1-C6알케닐렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, C1-C6알킬렌옥시 및 -((CH2)pO)q(CH2)p-로부터 선택되고;
각각의 p는 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 독립적으로 선택되고;
q는 1, 2, 3 및 4로부터 선택된다.
화학식 (K')의 일부 구체예에서, P1은 COOH로 임의로 치환되는 C1-C6알킬 및 -Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)로부터 선택되고; P2는 C1-C6알콕시 및 -Y-L-X-P(O)(ORX)(ORY)로부터 선택되고; RB는 C1-C6알킬이고; X는 공유 결합이고; L은 할로, OH, C1-C4알킬, -OP(O)(OH)2 및 -P(O)(OH)2로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 치환기로 각각 임의로 치환되는 C1-C6알킬렌 및 -((CH2)pO)q(CH2)p-로부터 선택되고; 각각의 p는 1, 2 및 3으로부터 독립적으로 선택되고; q는 1 및 2로부터 선택된다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 화학식 (K)의 바람직한 화합물은 3-(5-아미노-2-(2-메틸-4-(2-(2-(2-포스포노에톡시) 에톡시)에톡시)펜에틸)벤조[f][1,7] 나프티리딘-8-일)프로판산, 또는 화합물 'K1'이다:
Figure pct00006
이러한 화합물은 자유 염기로서 또는 약학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 아르기닌 염의 형태로 사용될 수 있다[120].
F. 미세입자
미세입자가 또한 본 발명에서 애쥬번트로 이용될 수 있다. 음성으로 하전된 표면(예를 들어, SDS를 이용함) 또는 양성으로 하전된 표면(예를 들어, 양이온성 세제, 예를 들어, CTAB를 이용함)을 갖도록 임의로 처리된, 생물분해성이고 비독성인 물질(예를 들어, 폴리(α-하이드록시산), 폴리하이드록시부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리카프로락톤 등)과 폴리(락티드-코-글리콜리드)로부터 형성된 미세입자(즉, ~100nm 내지 ~150μm 직경, 더욱 바람직하게는 ~200nm 내지 ~30μm 직경, 가장 바람직하게는 ~500nm 내지 ~10μm 직경의 입자)가 바람직하다.
애쥬번트 조합물
상기 나열된 개별적 애쥬번트가 또한 조합물 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 알루미늄 하이드록시드 및 알루미늄 포스페이트 애쥬번트의 조합물이 이용될 수 있다. 유사하게, 알루미늄 포스페이트 및 3dMPL의 조합물이 이용될 수 있다.
특히 바람직한 애쥬번트 조합물은 참고문헌 5 및 97에 개시된 바와 같은 불용성 금속 염(예를 들어, 알루미늄 염, 예를 들어, 알루미늄 하이드록시드) 및 TLR 효능제(예를 들어, 인간 TLR7 효능제, 예를 들어, 상기에서 확인된 화합물 'K1')이다. 그러므로, 특히, 상기 애쥬번트는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된다:
- 알루미늄 염, 특히 알루미늄 하이드록시드 및 알루미늄 포스페이트;
- 인간 TLR 효능제, 특히 TLR7 효능제; 및
- 이들의 혼합물.
TLR 효능제는 바람직하게는 금속 염에 흡착되고, S. 아우레우스 항원(들)이 또한 금속 염에 흡착될 수 있다.
금속 염에 흡착된 본 발명의 TLR 효능제를 포함하는 조성물은 또한 완충제(예를 들어, 포스페이트 또는 히스티딘 또는 트리스 완충제)를 포함할 수 있다. 그러나, 상기 조성물이 포스페이트 완충제를 포함하는 경우, 완충제 내의 포스페이트 이온의 농도는 50mM 미만, 예를 들어, <40mM, <30mM, <20mM, <10mM, 또는 <5mM, 또는 1-15mM이어야 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 1-50mM, 5-25mM, 또는 약 10mM의 히스티딘 완충제가 바람직하다.
조성물은 알루미늄 옥시하이드록시드 및 알루미늄 하이드록시포스페이트 둘 모두의 혼합물을 포함할 수 있고, TLR 효능제는 이들 염 중 하나 또는 둘 모두에 흡착될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 최대 0.85mg/용량의 Al+++이 바람직하다. TLR 효능제의 포함은 알루미늄 염의 애쥬번트 효과를 개선시킬 수 있으므로, 본 발명은 유리하게는 용량 당 적은 양의 Al+++를 가능케 하고, 따라서 조성물은 단위 용량 당 10 내지 250μg의 Al+++을 유용하게 포함할 수 있다. 현재의 소아 백신은 통상적으로 적어도 300μg의 Al+++을 포함한다. 농도 표현으로, 조성물은 10 내지 500μg/ml, 예를 들어, 10-300μg/ml, 10-200μg/ml, 또는 10-100μg/ml의 Al+++ 농도를 가질 수 있다.
일반적으로, 조성물이 TLR 효능제 및 알루미늄 염 둘 모두를 포함하는 경우, 효능제 대 Al+++의 중량비는 5:1 미만, 예를 들어, 4:1 미만, 3:1 미만, 2:1 미만, 또는 1:1 미만일 것이다. 따라서, 예를 들어, 0.5mg/ml의 Al+++ 농도를 이용하여, TLR 효능제의 최대 농도는 1.5mg/ml일 것이다. 그러나, 더 높거나 더 낮은 수준이 이용될 수 있다.
조성물이 TLR 효능제 및 불용성 금속 염을 포함하는 경우, 조성물 내의 효능제의 적어도 50%(질량 기준), 예를 들어, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥85%, ≥90%, ≥92%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 심지어 100%가 금속 염에 흡착되는 것이 바람직하다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 면역원성 조성물을 이용한다:
■ 알루미늄 하이드록시드 애쥬번트;
■ 화학식 (K), 예를 들어, 화합물 K1의 TLR7 효능제;
■ SEQ ID NO:6, 또는 5개 이하의 단일 아미노산 변화까지 SEQ ID NO:6과 상이하나, 단, 변형된 서열이 SEQ ID NO:6으로 구성된 폴리펩티드에 결합하는 항체를 유도할 수 있어야 하는 변형된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드;
■ SEQ ID NO:13, 또는 5개 이하의 단일 아미노산 변화까지 SEQ ID NO:13과 상이하나, 단, 변형된 서열이 SEQ ID NO:13으로 구성된 폴리펩티드에 결합하는 항체를 유도할 수 있어야 하는 변형된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드;
■ SEQ ID NO:31, 또는 5개 이하의 단일 아미노산 변화까지 SEQ ID NO:31과 상이하나, 단, 변형된 서열이 SEQ ID NO:31으로 구성된 폴리펩티드에 결합하는 항체를 유도할 수 있어야 하는 변형된 아미노산 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드;
■ SEQ ID NO:33, 또는 5개 이하의 단일 아미노산 변화까지 SEQ ID NO:33과 상이하나, 단, 변형된 서열이 SEQ ID NO:33으로 구성된 폴리펩티드에 결합하는 항체를 유도할 수 있어야 하는 변형된 아미노산 서열을 포함하는 제4 폴리펩티드;
■ SEQ ID NO:45, 또는 5개 이하의 단일 아미노산 변화까지 SEQ ID NO:45와 상이하나, 단, 변형된 서열이 SEQ ID NO:43으로 구성된 폴리펩티드에 결합하는 항체를 유도할 수 있어야 하는 변형된 아미노산 서열을 포함하는 제5 폴리펩티드;
여기서, TLR7 효능제 및/또는 폴리펩티드 중 적어도 하나는 알루미늄 하이드록시드 애쥬번트에 흡착된다.
예를 들어, 본원의 다른 곳에 더욱 상세히 설명된 바와 같이, 제1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:34를 포함할 수 있고; 제2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:13을 포함할 수 있고; 제3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:40을 포함할 수 있고; 제4 폴리펩티드는 SEQ ID NO:36을 포함할 수 있고; 제5 폴리펩티드는 SEQ ID NO:45를 포함할 수 있으며, 이들은 3개 이하의 아미노산 치환에 의해 임의로 변형된다(SEQ ID NO:44에서 X인 위치는 아님). 따라서, 조성물은 SEQ ID NO:37, 27, 38, 39, 및 45를 갖는 5개의 폴리펩티드의 혼합물을 이용할 수 있다(상기 논의된 바와 같이 SEQ ID NO:45가 3개 이하의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있는 경우는 제외함).
화학기
달리 특별히 정의하지 않는 한, 본원에 논의된 화학기는 본 명세서에서 사용되는 경우 하기 의미를 갖는다:
용어 "알킬"은 하기를 포함하는 포화 탄화수소 잔기를 포함한다:
- 10개 이하의 원자(C1-C10), 또는 6개 이하의 원자(C1-C6), 또는 4개 이하의 원자(C1-C4)의 선형 기. 상기 알킬기의 예는 C1 - 메틸, C2 - 에틸, C3 - 프로필 및 C4 - n-부틸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
- 3 내지 10개의 원자(C3-C10), 또는 7개 이하의 원자(C3-C7), 또는 4개 이하의 원자(C3-C4)의 분지된 기. 상기 알킬기의 예는 C3 - 이소-프로필, C4 - 2차-부틸, C4 - 이소-부틸, C4 - 3차-부틸 및 C5 - 네오-펜틸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "알킬렌"은 알킬기로부터 유래된 2가 탄화수소 라디칼을 나타내며, 상기 정의에 따라 해석될 것이다.
용어 "알케닐"은 하기를 포함하는 단일불포화된 탄화수소 잔기를 포함한다:
- 2 내지 6개의 원자(C2-C6)의 선형 기. 상기 알케닐 기의 예는 C2 - 비닐, C3 - 1-프로페닐, C3 - 알킬, C4 - 2-부테닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
- 3 내지 8개의 원자(C3-C8)의 분지된 기. 상기 알케닐기의 예는 C4 - 2-메틸-2-프로페닐 및 C6 - 2,3-디메틸-2-부테닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 알케닐렌은 알케닐기로부터 유래된 2가 탄화수소 라디칼을 나타내며, 상기 정의에 따라 해석될 것이다.
용어 "알콕시"는 하기를 포함하는 O-결합된 탄화수소 잔기를 포함한다:
- 1 내지 6개의 원자(C1-C6), 또는 1 내지 4개의 원자(C1-C4)의 선형 기. 상기 알콕시기의 예는 C1 - 메톡시, C2 - 에톡시, C3 - n-프로폭시 및 C4 - n-부톡시를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
- 3 내지 6개의 원자(C3-C6), 또는 3 내지 4개의 원자(C3-C4)의 분지된 기. 상기 알콕시기의 예는 C3 - 이소-프로폭시, 및 C4 - 2차-부톡시 및 3차-부톡시를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
할로는 Cl, F, Br 및 I로부터 선택된다. 할로는 바람직하게는 F이다.
용어 "아릴"은 6 또는 10개의 탄소 원자를 함유하는 단일하거나 융합된 방향족 고리 시스템을 포함하며, 여기서, 달리 언급되지 않는 한, 아릴의 각각의 존재는 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, OH, 할로, CN, COOR14, CF3 및 NR14R15로부터 독립적으로 선택된 5개 이하의 치환기로 임의로 치환될 수 있으며, 이는 상기 정의된 바와 같다. 통상적으로, 아릴은 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 임의로 치환될 것이다. 임의의 치환기는 상기 언급된 것으로부터 선택된다. 적합한 아릴기의 예는 페닐 및 나프틸(각각 상기 언급된 바와 같이 임의로 치환됨)을 포함한다. 아릴렌은 아릴기로부터 유래된 2가 라디칼을 나타내며, 상기 정의에 따라 해석될 것이다.
용어 "헤테로아릴"은 1 또는 2개의 N 원자 및, 임의로, NR14 원자, 또는 1개의 NR14 원자 및 S 또는 O 원자, 또는 1개의 S 원자, 또는 1개의 O 원자를 함유하는 5, 6, 9 또는 10원의 모노- 또는 바이-사이클릭 방향족 고리를 포함하며, 여기서, 달리 언급되지 않는 한, 상기 헤테로아릴은 (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, OH, 할로, CN, COOR14, CF3 및 NR14R15로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있으며, 이는 하기 정의되는 바와 같다. 적합한 헤테로아릴기의 예는 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다조일, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 테트라졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 퀴놀리닐 및 이소퀴놀리닐(상기 언급된 바와 같이 임의로 치환됨)을 포함한다. 헤테로아릴렌은 헤테로아릴로부터 유래된 2가 라디칼을 나타내며, 상기 정의에 따라 해석될 것이다.
용어 "헤테로사이클릴"은 C-결합되거나 N-결합된 3 내지 10원의 비-방향족, 모노- 또는 바이-사이클릭 고리이며, 상기 헤테로사이클로알킬 고리는 가능한 경우 N, NR14, S(O)q 및 O로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 함유하고; 상기 헤테로사이클로알킬 고리는 가능한 경우 1 또는 2개의 이중 결합을 임의로 함유하고, (C1-C6)알킬, (C1-C6)알콕시, OH, CN, CF3, 할로, COOR14, NR14R15 및 아릴로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 치환기에 의해 탄소 상에서 임의로 치환된다.
상기 정의에서, R14 및 R15는 H 및 (C1-C6)알킬로부터 독립적으로 선택된다.
구조식이, 예를 들어, 화학식 (C)의 경우에서 P3기에 대해서와 같이 특정되지 않거나 "일정치 않은(floating)" 결합에 의해 분자의 코어에 부착된 치환기로 정의되는 경우, 이러한 정의는 고리 상의 원자 중 임의의 원자에 대해 허용 가능한 결합가에 따르면서 일정치 않은 결합이 위치되는 고리 상의 원자 중 임의의 원자에 특정되지 않은 치환기가 부착되는 경우를 포함한다.
토토머 형태(즉, 케토 또는 에놀 형태)로 존재할 수 있는 본 발명의 화합물, 예를 들어, 화학식 (C) 또는 (H)의 화합물의 경우에서, 특정 화합물에 대한 언급은 상기 모든 토토머 형태를 임의로 포함한다.
총론
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 당 분야의 기술 내의 화학, 생화학, 분자생물학, 면역학 및 약리학의 통상적인 방법을 이용할 것이다. 상기 기술은 문헌에 의해 충분히 설명된다. 예를 들어, 참고문헌 121-128 등을 참조한다.
"GI" 넘버링이 상기에서 사용된다. GI 넘버, 또는 "GenInfo 식별자"는 서열이 이의 데이터베이스에 추가되는 경우 NCBI에 의해 처리되는 처리되는 각각의 서열 기록에 대해 연속적으로 할당되는 일련의 숫자이다. GI 넘버는 서열 기록의 등록 번호와 유사성을 갖지 않는다. 서열이 업데이트(예를 들어, 정정을 위하거나, 더 많은 주석 또는 정보를 추가하기 위함)되는 경우, 이는 새로운 GI 번호를 받는다. 따라서, 제공된 GI 번호와 관련된 서열은 변화되지 않는다.
본 발명이 "에피토프"와 관련되는 경우, 이러한 에피토프는 B-세포 에피토프 및/또는 T-세포 에피토프일 수 있다. 상기 에피토프는 경험적으로 확인(예를 들어, PEPSCAN[129,130] 또는 유사한 방법을 이용함)될 수 있거나, 이들은 예측(예를 들어, 제임슨-볼프(Jameson-Wolf) 항원 지수[131], 행렬-기반 접근법[132], MAPITOPE[133], TEPITOPE[134,135], 신경 네트워크[136], OptiMer & EpiMer[137,138], ADEPT[139], Tsites[140], 친수성[141], 항원 지수[142] 또는 참고문헌 143-147에 개시된 방법 등)될 수 있다. 에피토프는 항체 또는 T-세포 수용체의 항원 결합 부위에 의해 인지되고 이에 결합하는 항원의 부분이며, 이들은 또한 "항원 결정인자"로 언급될 수 있다.
항원 "도메인"이 생략되는 경우, 이는 신호 펩티드, 세포질 도메인, 막횡단 도메인, 세포외 도메인 등의 생략을 수반할 수 있다.
용어 "포함하는"은 "포함하는" 뿐만 아니라 "구성되는"을 포함하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 구성될 수 있거나, 예를 들어, X + Y와 같이 추가적인 것을 포함할 수 있다.
숫자값 x와 관련된 용어 "약"은 임의적인 것이며, 예를 들어, x±10%를 의미한다.
2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성 백분율에 대한 언급은 정렬되는 경우 아미노산의 백분율이 2개의 서열 비교에서 동일한 것을 의미한다. 이러한 정렬 및 상동성 퍼센트 또는 서열 동일성은 당 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, 참고문헌 148의 섹션 7.7.18에 기재된 것을 이용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 12의 갭 오픈 페널티 및 2의 갭 신장 페널티, 62의 BLOSUM 매트릭스와 함께 어파인 갭(affine gap) 검색을 이용하는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘은 참고문헌 149에 개시되어 있다. 임의의 특정 서열(예를 들어, 특정 SEQ ID)에 대한 동일성 백분율은 이상적으로는 상기 서열의 전장에 걸쳐 계산된다.
결합 친화성은 표면 플라즈몬 내성, 등온 적정 열량측정법, 경쟁 결합 검정, 열 전환 검정 등을 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 다양한 방법을 이용하여 획득된 절대 도면은 다양할 수 있으나, 하나의 단백질의 또 다른 단백질에 비한 상대 결합 친화성 결정은 이용되는 방법에 좌우되지 않아야 하는 것이 예견된다.
본 발명과 함께 사용되는 인-함유 애쥬번트는 주위 환경의 pH, 예를 들어, 이들이 용해되는 용매의 pH에 따라 다수의 양성자화 및 비양성자화 형태로 존재할 수 있다. 따라서, 특정 형태가 예시될 수 있으나, 이들 예시는 단지 대표적 예시이며, 특정한 양성자화 또는 탈양성자화 형태로 제한되지 않는 것으로 의도된다. 예를 들어, 포스페이트기의 경우에서, 이는 -OP(O)(OH)2로 예시되었으나, 상기 정의는 산성 조건에서 존재할 수 있는 양성자화 형태 [OP(O)(OH2)(OH)]+ 및 -[OP(O)(OH)2]2+ 및 염기성 조건에서 존재할 수 있는 탈양성자화 형태 -[OP(O)(OH)(O)]- 및 [OP(O)(O)2]2-를 포함한다.
화합물은 약학적으로 허용되는 염으로 존재할 수 있다. 따라서, 화합물(예를 들어, 애쥬번트)는 이들의 약학적으로 허용되는 염, 즉, 생리학적 또는 독물학적으로 용인되는 염(이는 적절한 경우 약학적으로 허용되는 염기 부가염 및 약학적으로 허용되는 산 부가염을 포함함)의 형태로 이용될 수 있다.
용어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어, Y를 "실질적으로 함유하지 않는" 조성물은 Y를 완전히 함유하지 않을 수 있다. 필요한 경우, 용어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
본 발명을 수행하기 위한 방식
SpAkR 돌연변이
SpA는 S. 아우레우스에서의 중요한 독성 인자이며, 이는 박테리아의 옵소닌식작용 청소를 방해하고, 적응 면역 반응을 제거함으로써 작용한다. 야생형 서열 SEQ ID NO:43은 상기 제시된 바와 같이 5개의 Ig-결합 도메인(IgBD)을 포함하며, 면역원성을 유지시키면서 Fc/Fab 결합 활성을 폐기하기 위해 이들 도메인 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것이 공지되어 있으며, 예를 들어, Gln-Gln 디펩티드를 Lys-Lys로 대체하고/하거나 Asp-Asp 디펩티드를 Ala-Ala로 대체하는 참고문헌 19를 참조한다.
추가의 Gln-Gln 디펩티드가 Lys-Arg로 돌연변이되는 새로운 돌연변이 SpA가 생성되었다. 생물정보학 분석 및 Ig 결합과 관련된 추가 부위의 예측을 기초로 하여 상기 디펩티드가 확인되었다. 특히, SEQ ID NO:43의 잔기 96 및 97이 Ig 결합과 관련된 것으로 가정되었다. 이러한 부위는 이전 연구에서는 빠졌었는데, 이는 보존된 IgBD 외부에 존재하고, 해명된 구조의 부분이 아니기 때문이다. 새로운 돌연변이는 'SpAkR'로 언급되고, 이는 하기 아미노산 서열을 가지며, 이전의 'SpAkkAA' 돌연변이에 비한 여분의 QQ/KR 치환이 박스로 표시된다:
Figure pct00007
SpAkR 돌연변이는 면역원성을 유지하면서 공지된 돌연변이에 비해 면역글로불린에 대한 감소된 친화성을 갖는 것으로 확인되었다.
CD 및 DSC 분석은 KR 돌연변이의 도입이 SpA의 구조에 크게 영향을 미치지 않은 것을 나타내었다. SpAkkAA 및 SpAKR의 CD 스펙트럼은 동일하였다. DSC 분석으로부터의 Tm1 및 Tm2는 하기와 같았다: Tm1: SpAkkAA 48.9℃; SpAKR 51.1℃. Tm2: SpAkkAA 68.1℃; SpAKR 68.0℃.
인간 IgG, IgA 및 IgM에 대한 야생형 SpA, 및 SpAkkAA 및 SpAkR 돌연변이의 친화성을 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 시험하였다. 단백질을 센서 칩 상에 고정시키고, 인간 IgG, IgA 및 IgM을 분석물로 이용하였다. 둘 모두의 돌연변이는 야생형에 비해 크게 감소된 결합 능력을 나타내었으나, SpAkkAA는 IgG 및 IgM에 대해 잔여 결합을 나타내었고, 임의의 면역글로불린과의 검출 가능한 상호작용이 SpAkR을 이용하여 관찰되지 않았다. IgG 및 IgM에 대한 SpAkkAA의 잔여 결합 활성은 매우 낮았으나(야생형보다 11-12배 낮음), 재현성이 있었고, 농도-의존적이었다.
SpA(WT, SpAkkAA 및 SpAkR)의 존재하에서의 S. 아우레우스 생존을 전체 혈액 생존 검정(WBA)을 통해 평가하였다. 50mg/l 레피루딘 항응고제(10μl/ml 혈액)가 보충된 건강한 공여자로부터의 1ml 전체 혈액을 37℃에서 15분 동안 0.15μM SpA 또는 PBS와 함께 인큐베이션시킨 후, BHI에 희석된 약 2.5 x 105 CFU의 S. 아우레우스 USA300 LAC(OD600, 0.4)를 첨가하였다. 이러한 배양물의 분취액을 BHI-아가 상에 플레이팅하여 투입 CFU를 결정하였다. 진탕(180 RPM)과 함께 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션 후, 호중구를 얼음 상에서 3분 동안 0.5% 사포닌-PBS에서 용해시켰다. 살아 있는 박테리아의 수를 BHI에서의 10배 연속 희석 및 영양 아가 플레이트 상의 플레이팅에 의해 결정하였다. 18시간 동안 37℃에서의 플레이트의 인큐베이션 후에 콜로니를 카운트하였다. 대조군은 PBS와 예비 인큐베이션된 혈액 샘플이었다. 인큐베이션 후 CFU에 비한 투입 CFU를 기초로 하여 상대 생존을 계산하였다. 실험을 삼중으로 수행하였고, 실험 사이에 약간의 변동이 있었다.
WBA에서, 인간 전체 혈액에서의 S. 아우레우스의 상대 생존은 야생형 SpA(p<0.001, 만-휘트니(Mann-Whitney)) 또는 SpAkkAA(p<0.05)보다 SpAKR과 함께 인큐베이션하는 경우에 매우 낮았다. SpAwt와의 인큐베이션은 대조군에 비한 증가된 S. 아우레우스 생존을 발생시킨 반면(p<0.001), SpAkkAA와 함께 인큐베이션된 WBA에서의 생존은 대조군과 동등하였다. SpAkR과의 인큐베이션은 생존을 대조군의 생존의 약 절반까지 감소시켰다.
알루미늄 하이드록시드 애쥬번트와 함께 제형화된 SpAkkAA 또는 SpAkR은 마우스 자신에서 약하게 면역원성인 것으로 밝혀졌으나, 흡착된 TLR7 효능제 'K1'의 포함은 항체 역가를 유의하게 증가시켰다. SpA 면역화와 관련된 작용의 메커니즘은 주로 항체에 의해 유도되는 것으로 보이므로, 이는 중요한 개선이다.
S. 아우레우스 백신
SpAkR, SpAkkAA, SpAkR E 도메인 단독 및 HlaH35L에 융합된 SpAkR E 도메인을 2mg/ml(전체 염)의 알루미늄 하이드록시드(Al-H)로 애쥬번트화된 신장 농양 모델에서 시험하였다. 항원은 근내 주사를 위해 100μL 용량 중 10μg으로 각각 제공되었다.
4주령 또는 5주령의 마우스(CD1)를 14일 간격의 프라임-부스터 주사에 의해 근내 면역화(IM)시켰다. 대조군 마우스에 동등량의 애쥬번트 단독을 투여하였다. 혈청을 예방접종 전 및 예방접종 후 둘 모두에 마우스로부터 수거하여 조합 백신 내의 각각의 단백질 성분에 대한 혈청 항체 역가를 기록하였다. 이들 역가를 미세구에 컨쥬게이션된 재조합 백신 항원을 이용한 Luminex 기술에 의해 측정하였다.
신장 농양 모델: 면역화된 동물을 치사량에 가까운 용량의 S. 아우레우스 뉴먼 균주(~ 2-6 x107 CFU)의 정맥내 주사에 의해 24일에 공격하였다. 28일에, 마우스를 안락사시키고, 신장을 분리시키고, 2 mL의 PBS 중에서 균질화시키고, 콜로니 형성 단위(CFU)의 결정을 위해 이중으로 아가 배지 상에 플레이팅하였다.
log10 CFU/ml의 동등한 감소(약 1 log 감소)가 애쥬번트 단독에 비해 SpAKR, SpAkkAA, SpAkR E 도메인 단독 및 HlaH35L에 융합된 SpAkR E 도메인을 이용한 예방접종에 대해 획득되었다.
조합 S. 아우레우스 백신
5가 및 6가 백신을 제조하였다. 5가 백신은 SEQ ID NO:7, 8, 27 및 32(FhuD2, Sta011, Hla-H35L, 및 EsxAB)로 구성된 항원을 포함하였고, 6가 백신은 또한 SpAkR 돌연변이를 포함하였다. 백신을 (i) 알루미늄 하이드록시드, Al-H; (ii) Al-H + 흡착된 TLR7 효능제 K1; 또는 (iii) 수중유 에멀젼 MF59로 애쥬번트화시켰다. Al-H를 2mg/ml(전체 염)로 사용하였고, K1은 용량 당 50μg으로 제공되었고, MF59는 1:1의 부피비로 항원과 혼합되었다. 항원은 근내 주사를 위해 각각 100μL 용량 중 10μg으로 제공되었다.
4주령 또는 5주령의 마우스(CD1)를 14일 간격의 프라임-부스터 주사에 의해 면역화시켰다. 대조군 마우스에 동등량의 애쥬번트 단독을 투여하였다. 혈청을 예방접종 전 및 예방접종 후 둘 모두에 마우스로부터 수거하여 조합 백신 내의 각각의 단백질 성분에 대한 혈청 항체 역가를 기록하였다. 이들 역가를 미세구에 컨쥬게이션된 재조합 백신 항원을 이용한 Luminex 기술에 의해 측정하였다.
신장 농양 모델: 면역화된 동물을 치사량에 가까운 용량의 S. 아우레우스(~ 2-6 x107 CFU, 여기서 특정 접종물은 공격 균주에 따라 다양함)의 정맥내 주사에 의해 24일에 공격하였다. 28일에, 마우스를 안락사시키고, 신장을 분리시키고, 2 mL의 PBS 중에서 균질화시키고, 콜로니 형성 단위(CFU)의 결정을 위해 이중으로 아가 배지 상에 플레이팅하였다. 신장을 또한 조직병리학을 위해 처리하였다.
복막염 모델: 별개로, 면역화된 동물을 치사 용량의 S. 아우레우스(~ 2-5x108 CFU)의 복막내 주사에 의해 24일에 공격하였고, 이후 14일 동안 매일 모니터하였다.
피부 감염 모델: 면역화된 마우스에 면도된 우측 옆구리에 2x107 CFU의 S. 아우레우스 LAC 균주(USA300 클론, 이는 전세계에서 가장 중요한 클론 중 하나이며, 지역-획득 피부 감염과 매우 관련됨)를 피하 주사에 의해 접종시켰다. 종괴 및 농양 형성(크기 및 피부괴사)을 7일의 과정에 걸쳐 24시간 간격으로 모니터하였다. 농양 및 관련된 위에 존재하는 피부괴사 병소의 크기를 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 결정하였다. 마우스 피부 및 농양을 CFU 계산을 위해 접종 7일 후에 수거하였다. 이러한 모델은 단지 Al-H/K1 애쥬번트와 함께 이용하였다.
결과는 하기와 같았다:
Figure pct00008
이들 결과는 돌연변이 SpAkR이 둘 모두의 모델에서 5가 Combo-1 생성물을 개선시키는 것을 입증한다. 또한, Al-H/K1 애쥬번트를 이용하여 최적의 결과가 관찰되었다. 두드러지게는, 신장 농양 모델에서 Al-H/K1을 갖는 6가 백신의 결과는 무균에 가까웠다.
복막염 모델에서, Al-H/K1을 갖는 6가 백신은 음성 대조군과 비교하는 경우(상기 표 참조), 그리고 또한 5가 Al-H 백신과 비교하는 경우 통계적으로 우수하였다. 농양 모델에서, Al-H/K1을 갖는 6가 백신은 음성 대조군(상기 표 참조), 5가 Al-H 백신, 및 5가 Al-H/K1 백신과 비교하는 경우 통계적으로 우수하였고, 따라서 이는 돌연변이 SpA의 기여가 K1 효능제 단독으로 인한 향상을 능가하는 것을 나타낸다.
피부 감염 모델에서, 5가 및 6가 백신 둘 모두는 농양 형성 및 CFU 수를 유의하게 감소시켰다(상기 표 참조). 피부괴사는 예방접종된 마우스에서는 부재한 반면, 이는 애쥬번트 단독이 투여된 모든 마우스(표에서 'N/A')에서 관찰되었다. 또한, CFU 감소는 백신 내의 SpAkR의 포함에 의해 유의하게 개선되었고, 더 적은 마우스에서 육안 수준에서 구별가능한 농양이 관찰되었다(71% 대 88%).
항-SpA 역가를 또한 3개의 애쥬번트에 대해 비교하였다. Al-H 또는 MF59를 이용한 중간 역가는 유의하게 상이하지 않았으나, Al-H/K1을 이용한 역가는 Al-H 단독(p=0.0047, 만-휘트니 검정) 및 MF59(p=0.01)보다 유의하게 더 높았다. 따라서, 기능 검정에서 최적으로 수행된 제형은 가장 높은 항-SpA 항체 역가를 유도한 것이었으며, 이는 백신 항원으로서의 SpA의 활성이 이에 결합할 수 있고 이의 면역 회피 활성을 억제할 수 있는 항체에 의존한다는 가설과 일치한다.
본 발명은 단지 예시에 의해 기재되었으며, 본 발명의 범위 및 사상 내에서 유지되면서 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
참고문헌
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
서열목록
SEQ ID NO:1 ( EsxA )
Figure pct00014
SEQ ID NO:2 ( EsxB )
Figure pct00015
SEQ ID NO:3 ( FhuD2 )
Figure pct00016
SEQ ID NO:4 ( Sta011 )
Figure pct00017
SEQ ID NO:5 ( Hla )
Figure pct00018
SEQ ID NO:6 ( SEQ ID NO:3의 N-말단 트렁케이션된 FhuD2 )
Figure pct00019
SEQ ID NO:7 (예시적 FhuD2 서열)
Figure pct00020
SEQ ID NO:8 (예시적 Sta011 서열)
Figure pct00021
SEQ ID NO:9 (예시적 Sta011 서열)
Figure pct00022
SEQ ID NO:10 (예시적 Sta011 서열)
Figure pct00023
SEQ ID NO:11 (예시적 Sta011 서열)
Figure pct00024
SEQ ID NO:12 (N-말단 트렁케이션된 Hla SEQ ID NO:5 )
Figure pct00025
SEQ ID NO:13 (성숙 Hla - H35L )
Figure pct00026
SEQ ID NO:14 ( 테트라머 )
Figure pct00027
SEQ ID NO:15 ( PSGS 치환을 갖는 Hla - H35L )
Figure pct00028
SEQ ID NO:16 ( PSGS 치환을 갖는 Hla )
Figure pct00029
SEQ ID NO:17 (Y101 돌연변이를 갖는 Hla )
Figure pct00030
SEQ ID NO:18 (D152 돌연변이를 갖는 Hla )
Figure pct00031
SEQ ID NO:19 (H35 및 Y101 돌연변이를 갖는 Hla )
Figure pct00032
SEQ ID NO:20 (H53 및 D152 돌연변이를 갖는 Hla )
Figure pct00033
SEQ ID NO:21 ( Hla 단편)
Figure pct00034
SEQ ID NO:22 ( Hla 단편)
Figure pct00035
SEQ ID NO:23 ( Hla 단편)
Figure pct00036
SEQ ID NO:24 ( Hla - H35L 단편)
Figure pct00037
SEQ ID NO:25 ( Hla - H35L 단편)
Figure pct00038
SEQ ID NO:26 ( Hla - H35L 단편)
Figure pct00039
SEQ ID NO:27 ( H35L 돌연변이를 갖는 유용한 HLA 서열)
Figure pct00040
SEQ ID NO:28 ( EsxAB 예)
Figure pct00041
SEQ ID NO:29 ( EsxBA 예)
Figure pct00042
SEQ ID NO:30 (링커)
Figure pct00043
SEQ ID NO:31 ( EsxAB 예)
Figure pct00044
SEQ ID NO:32 ( EsxAB 예)
Figure pct00045
SEQ ID NO:33 (N-말단 트렁케이션된 SEQ ID NO:4 )
Figure pct00046
SEQ ID NO:34 ( FhuD2 )
Figure pct00047
SEQ ID NO:35 ( Cys 비함유 EsxB 서열)
Figure pct00048
SEQ ID NO:36 ( Sta011 SEQ ID NO:4의 Cys 비함유 형태)
Figure pct00049
SEQ ID NO:37 ( FhuD2 SEQ ID NO:7의 Cys 비함유 형태)
Figure pct00050
SEQ ID NO:38 ( EsxAB Cys -Ala 돌연변이)
Figure pct00051
SEQ ID NO:39 (유용한 Sta011 서열)
Figure pct00052
SEQ ID NO:40 ( Cys 비함유 EsxAB 예)
Figure pct00053
SEQ ID NO:41
Figure pct00054
SEQ ID NO:42
Figure pct00055
SEQ ID NO:43 ( SpA )
Figure pct00056
SEQ ID NO:44 ( SpAkkAA )
Figure pct00057
SEQ ID NO:45 ( SpAkkAA )
Figure pct00058
SEQ ID NO:46 ( SpAkR )
Figure pct00059
SEQ ID NO:47 ( SpAkR )
Figure pct00060
SEQ ID NO:48 ( 실시예에서 사용된 SpAkR )
Figure pct00061
SEQ ID NO:49 ( SpAkR )
Figure pct00062
SEQ ID NO:50 ( SpAkR E 도메인)
Figure pct00063
SEQ ID NO:51 ( SpAkR E 도메인)
Figure pct00064
SEQ ID NO:52 ( SpAkR E 도메인)
Figure pct00065
SEQ ID NO:53 ( 실시예에서 사용된 SpAkR의 E 도메인)
Figure pct00066
SEQ ID NO:54 ( SpA E 도메인)
Figure pct00067
SEQUENCE LISTING <110> GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA <120> MUTANT STAPHYLOCOCCAL ANTIGENS <130> VN56501-WO-PCT <140> <141> <150> EP 14192913.3 <151> 2014-11-12 <150> EP 14161861.1 <151> 2014-03-26 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 97 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1 Met Ala Met Ile Lys Met Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys Ser Gln 1 5 10 15 Ser Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Gln Ile Arg Gln Ile Leu Ser Asp Leu 20 25 30 Thr Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ala Ala Asn Trp Glu Gly Gln Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Phe Glu Glu Gln Phe Gln Gln Leu Ser Pro Lys Val Glu Lys 50 55 60 Phe Ala Gln Leu Leu Glu Glu Ile Lys Gln Gln Leu Asn Ser Thr Ala 65 70 75 80 Asp Ala Val Gln Glu Gln Asp Gln Gln Leu Ser Asn Asn Phe Gly Leu 85 90 95 Gln <210> 2 <211> 104 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 2 Met Gly Gly Tyr Lys Gly Ile Lys Ala Asp Gly Gly Lys Val Asp Gln 1 5 10 15 Ala Lys Gln Leu Ala Ala Lys Thr Ala Lys Asp Ile Glu Ala Cys Gln 20 25 30 Lys Gln Thr Gln Gln Leu Ala Glu Tyr Ile Glu Gly Ser Asp Trp Glu 35 40 45 Gly Gln Phe Ala Asn Lys Val Lys Asp Val Leu Leu Ile Met Ala Lys 50 55 60 Phe Gln Glu Glu Leu Val Gln Pro Met Ala Asp His Gln Lys Ala Ile 65 70 75 80 Asp Asn Leu Ser Gln Asn Leu Ala Lys Tyr Asp Thr Leu Ser Ile Lys 85 90 95 Gln Gly Leu Asp Arg Val Asn Pro 100 <210> 3 <211> 302 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 3 Met Lys Lys Leu Leu Leu Pro Leu Ile Ile Met Leu Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Cys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys Ser 20 25 30 Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro Lys 35 40 45 Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys Leu 50 55 60 Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys Val 65 70 75 80 Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp Val 85 90 95 Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser Thr 100 105 110 Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val Val 115 120 125 Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly Lys 130 135 140 Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp Glu 145 150 155 160 Glu Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly Gln 165 170 175 Asp Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr Thr 180 185 190 Tyr Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala Phe 195 200 205 Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala Gly 210 215 220 Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly Asp Tyr 225 230 235 240 Ile Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser Thr 245 250 255 Asn Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val Lys 260 265 270 Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp Phe 275 280 285 Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys 290 295 300 <210> 4 <211> 256 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 4 Met Met Lys Arg Leu Asn Lys Leu Val Leu Gly Ile Ile Phe Leu Phe 1 5 10 15 Leu Val Ile Ser Ile Thr Ala Gly Cys Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu 20 25 30 Val Lys Lys Ser Phe Glu Lys Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn 35 40 45 Leu Glu Asp Leu Tyr Asp Lys Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp 50 55 60 Lys Asn Asp Lys Gly Thr Trp Ile Ile Asn Ser Glu Met Val Ile Gln 65 70 75 80 Pro Asn Asn Glu Asp Met Val Ala Lys Gly Met Val Leu Tyr Met Asn 85 90 95 Arg Asn Thr Lys Thr Thr Asn Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Val Thr Lys 100 105 110 Asp Glu Asp Glu Gly Lys Pro His Asp Asn Glu Lys Arg Tyr Pro Val 115 120 125 Lys Met Val Asp Asn Lys Ile Ile Pro Thr Lys Glu Ile Lys Asp Glu 130 135 140 Lys Ile Lys Lys Glu Ile Glu Asn Phe Lys Phe Phe Val Gln Tyr Gly 145 150 155 160 Asp Phe Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Gly Asp Ile Ser Tyr Asn 165 170 175 Pro Glu Val Pro Ser Tyr Ser Ala Lys Tyr Gln Leu Thr Asn Asp Asp 180 185 190 Tyr Asn Val Lys Gln Leu Arg Lys Arg Tyr Asp Ile Pro Thr Ser Lys 195 200 205 Ala Pro Lys Leu Leu Leu Lys Gly Ser Gly Asn Leu Lys Gly Ser Ser 210 215 220 Val Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Phe Thr Phe Val Glu Lys Lys Glu Glu 225 230 235 240 Asn Ile Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Asp Tyr Lys Lys Ser Gly Asp Val 245 250 255 <210> 5 <211> 319 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 5 Met Lys Thr Arg Ile Val Ser Ser Val Thr Thr Thr Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ser Ile Leu Met Asn Pro Val Ala Asn Ala Ala Asp Ser Asp Ile Asn 20 25 30 Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser Asn Thr Thr Val Lys Thr 35 40 45 Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn Gly Met His Lys Lys Val 50 55 60 Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His Asn Lys Lys Leu Leu Val 65 70 75 80 Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln Tyr Arg Val Tyr Ser Glu 85 90 95 Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp Pro Ser Ala Phe Lys Val 100 105 110 Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr 115 120 125 Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr Met Ser Thr Leu Thr Tyr 130 135 140 Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp Thr Gly Lys Ile Gly Gly 145 150 155 160 Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His Thr Leu Lys Tyr Val Gln 165 170 175 Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro Thr Asp Lys Lys Val Gly 180 185 190 Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn Gln Asn Trp Gly Pro Tyr 195 200 205 Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly Asn Gln Leu Phe Met Lys 210 215 220 Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp Asn Phe Leu Asp Pro Asn 225 230 235 240 Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe Ser Pro Asp Phe Ala Thr 245 250 255 Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys Gln Gln Thr Asn Ile Asp 260 265 270 Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr Gln Leu His Trp Thr Ser 275 280 285 Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp Lys Trp Ile Asp Arg Ser 290 295 300 Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys Glu Glu Met Thr Asn 305 310 315 <210> 6 <211> 285 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 6 Cys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr Lys Ser Tyr 1 5 10 15 Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp Pro Lys Arg 20 25 30 Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly 35 40 45 Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser Lys Val Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly Asp Val Glu 65 70 75 80 Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr Ser Thr Asp 85 90 95 Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val Val Val Asp 100 105 110 Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu Gly Lys Ile 115 120 125 Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp Trp Glu Glu 130 135 140 Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile Gly Gln Asp 145 150 155 160 Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu Tyr Thr Tyr 165 170 175 Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln Ala Phe Gly 180 185 190 Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys Ala Gly Trp 195 200 205 Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly Asp Tyr Ile 210 215 220 Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu Ser Thr Asn 225 230 235 240 Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile Val Lys Val 245 250 255 Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu Asp Phe Met 260 265 270 Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys 275 280 285 <210> 7 <211> 288 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 7 Met Ala Ser Cys Gly Asn Gln Gly Glu Lys Asn Asn Lys Ala Glu Thr 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Lys Met Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Ile Pro Lys Asp 20 25 30 Pro Lys Arg Ile Ala Val Val Ala Pro Thr Tyr Ala Gly Gly Leu Lys 35 40 45 Lys Leu Gly Ala Asn Ile Val Ala Val Asn Gln Gln Val Asp Gln Ser 50 55 60 Lys Val Leu Lys Asp Lys Phe Lys Gly Val Thr Lys Ile Gly Asp Gly 65 70 75 80 Asp Val Glu Lys Val Ala Lys Glu Lys Pro Asp Leu Ile Ile Val Tyr 85 90 95 Ser Thr Asp Lys Asp Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Val Ala Pro Thr Val 100 105 110 Val Val Asp Tyr Asn Lys His Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Glu Met Leu 115 120 125 Gly Lys Ile Val Gly Lys Glu Asp Lys Val Lys Ala Trp Lys Lys Asp 130 135 140 Trp Glu Glu Thr Thr Ala Lys Asp Gly Lys Glu Ile Lys Lys Ala Ile 145 150 155 160 Gly Gln Asp Ala Thr Val Ser Leu Phe Asp Glu Phe Asp Lys Lys Leu 165 170 175 Tyr Thr Tyr Gly Asp Asn Trp Gly Arg Gly Gly Glu Val Leu Tyr Gln 180 185 190 Ala Phe Gly Leu Lys Met Gln Pro Glu Gln Gln Lys Leu Thr Ala Lys 195 200 205 Ala Gly Trp Ala Glu Val Lys Gln Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Ala Gly 210 215 220 Asp Tyr Ile Val Ser Thr Ser Glu Gly Lys Pro Thr Pro Gly Tyr Glu 225 230 235 240 Ser Thr Asn Met Trp Lys Asn Leu Lys Ala Thr Lys Glu Gly His Ile 245 250 255 Val Lys Val Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Tyr Asn Asp Pro Tyr Thr Leu 260 265 270 Asp Phe Met Arg Lys Asp Leu Lys Glu Lys Leu Ile Lys Ala Ala Lys 275 280 285 <210> 8 <211> 234 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 8 Met Gly Cys Gly Ile Gly Lys Glu Ala Glu Val Lys Lys Ser Phe Glu 1 5 10 15 Lys Thr Leu Ser Met Tyr Pro Ile Lys Asn Leu Glu Asp Leu Tyr Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Tyr Arg Asp Asp Gln Phe Asp Lys Asn Asp Lys Gly Thr 35 40 45 Trp Ile Ile Asn Ser Glu Met Val Ile Gln Pro Asn Asn Glu Asp Met 50 55 60 Val Ala Lys Gly Met Val Leu Tyr Met Asn Arg Asn Thr Lys Thr Thr 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp Val Thr Lys Asp Glu Asp Glu Gly Lys 85 90 95 Pro His Asp Asn Glu 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Gln <220> <221> MOD_RES <222> (211)..(212) <223> Any amino acid except Asp <220> <221> MOD_RES <222> (242)..(243) <223> Any amino acid except Gln <220> <221> MOD_RES <222> (269)..(270) <223> Any amino acid except Asp <400> 44 Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Xaa Xaa Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 45 <211> 291 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 45 Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 46 <211> 291 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MOD_RES <222> (60)..(61) <223> Any amino acid except Gln <400> 46 Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Xaa Xaa Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 47 <211> 291 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 47 Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 48 <211> 292 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 48 Met Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu 1 5 10 15 Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln 35 40 45 Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn 50 55 60 Phe Asn Lys Asp Lys Lys Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro 65 70 75 80 Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala 85 90 95 Ala Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn 100 105 110 Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Lys Lys 115 120 125 Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln 130 135 140 Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala 145 150 155 160 Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 165 170 175 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 180 185 190 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 195 200 205 Ser Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 210 215 220 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn 225 230 235 240 Lys Glu Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 245 250 255 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Ala Ala Pro 260 265 270 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 275 280 285 Gln Ala Pro Lys 290 <210> 49 <211> 291 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Any amino acid except Gln <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(35) <223> Any amino acid except Asp <220> <221> MOD_RES <222> (60)..(61) <223> Any amino acid except Gln <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(69) <223> Any amino acid except Gln <220> <221> MOD_RES <222> (95)..(96) <223> Any amino acid except Asp <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(127) <223> Any amino acid except Gln <220> <221> MOD_RES <222> (153)..(154) <223> Any amino acid except Asp <220> <221> MOD_RES <222> (184)..(185) <223> Any amino acid except Gln <220> <221> MOD_RES <222> (211)..(212) <223> Any amino acid except Asp <220> <221> MOD_RES <222> (242)..(243) <223> Any amino acid except Gln <220> <221> MOD_RES <222> (269)..(270) <223> Any amino acid except Asp <400> 49 Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Xaa Xaa Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp Xaa Xaa Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 65 70 75 80 Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa 85 90 95 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn 115 120 125 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 130 135 140 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala 165 170 175 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 180 185 190 His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 195 200 205 Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 210 215 220 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys 225 230 235 240 Glu Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 245 250 255 Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Xaa Xaa Pro Ser 260 265 270 Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 275 280 285 Ala Pro Lys 290 <210> 50 <211> 67 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Any amino acid except Gln <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(35) <223> Any amino acid except Asp <220> <221> MOD_RES <222> (60)..(61) <223> Any amino acid except Gln <400> 50 Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Xaa Xaa Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp 65 <210> 51 <211> 67 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Any amino acid except Gln <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(35) <223> Any amino acid except Asp <400> 51 Ala Gln His Asp Glu Ala Xaa Xaa Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Xaa Xaa Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp 65 <210> 52 <211> 67 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 52 Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp 65 <210> 53 <211> 68 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 53 Met Ala Gln His Asp Glu Ala Lys Lys Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu 1 5 10 15 Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 20 25 30 Leu Lys Ala Ala Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln 35 40 45 Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Arg Asn Asn 50 55 60 Phe Asn Lys Asp 65 <210> 54 <211> 67 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 54 Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe 50 55 60 Asn Lys Asp 65

Claims (16)

  1. 돌연변이 SpA 항원으로서, 항원이 SEQ ID NO:50을 포함하거나 이로 구성되는 아미노산 서열을 포함하고, 위치 60 및 61의 디펩티드가 QQ가 아니고, 상기 디펩티드가 임의로 KR이고, 상기 서열이 임의로 SEQ ID NO:51 또는 SEQ ID NO:52인, 돌연변이 SpA 항원.
  2. 제 1항에 있어서, 항원이 SEQ ID NO:49를 포함하거나 이로 구성되는 아미노산 서열을 포함하고, 위치 96 및 97의 디펩티드가 QQ가 아니고, 상기 디펩티드가 임의로 KR이고, 상기 서열이 임의로 SEQ ID NO:47인 돌연변이 SpA 항원.
  3. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:50을 포함하거나 이로 구성되는 상기 아미노산 서열의 하나 초과의 카피를 포함하고, 위치 60 및 61의 디펩티드가 QQ가 아닌 돌연변이 SpA 항원.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 포유동물에서 SEQ ID NO:43 및/또는 SEQ ID NO:54를 인지하는 항체를 유도하는 돌연변이 SpA 항원.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG의 Fcγ 부분에 대해 변형되지 않은 SpA에 비해 감소된 친화성을 갖는 돌연변이 SpA 항원.
  6. 제 5항에 있어서, VH3-함유 인간 B 세포 수용체의 Fab 부분에 대해 변형되지 않은 SpA에 비해 감소된 친화성을 갖는 돌연변이 SpA 항원.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 SpA 항원이 SEQ ID NO:43의 위치 43, 44, 70, 71, 96, 97, 104, 105, 131, 132, 162, 163, 190, 191, 220, 221, 247, 248, 278, 279, 305 및/또는 306에서 적어도 1개, 특히 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 및 더욱 특히 20개의 아미노산에서 돌연변이된 SEQ ID NO:43을 포함하거나 이로 구성되는 서열, 더욱 더 특히 SEQ ID NO:47 또는 SEQ ID NO:49를 포함하거나 이들로 구성된 서열의 돌연변이 SpA 항원인, 돌연변이 SpA 항원.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 특히 SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:47 또는 SEQ ID NO:48을 포함하는 서열의 돌연변이 SpA 항원.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 SpA 항원을 포함하는 융합 단백질.
  10. 제 X항에 따른 돌연변이 SpA 항원 또는 제 9항에 따른 융합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 또한 애쥬번트를 포함하는 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 애쥬번트가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물:
    - 알루미늄 염, 특히 알루미늄 하이드록시드 및 알루미늄 포스페이트;
    - 인간 TLR 효능제, 특히 TLR7 효능제; 및
    - 이들의 혼합물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 TLR7 효능제가 하기 화학식 (K)의 화합물, 특히 3-(5-아미노-2-(2-메틸-4-(2-(2-(2-포스포노에톡시) 에톡시)에톡시)펜에틸) 벤조[f][1,7] 나프티리딘-8-일)프로판산(K1)인 조성물:
    Figure pct00068

    상기 식에서,
    R1은 H, C1-C6알킬, -C(R5)2OH, -L1R5, -L1R6, -L2R5, -L2R6, -OL2R5, 또는 -OL2R6이고;
    L1은 -C(O)- 또는 -O-이고;
    L2는 C1-C6알킬렌, C2-C6알케닐렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌 또는 -((CR4R4)pO)q(CH2)p-이고, 여기서 L2의 C1-C6알킬렌 및 C2-C6알케닐렌은 1 내지 4개의 플루오로기로 임의로 치환되고;
    각각의 L3는 C1-C6알킬렌 및 -((CR4R4)pO)q(CH2)p-로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 L3의 C1-C6알킬렌은 1 내지 4개의 플루오로기로 임의로 치환되고;
    L4는 아릴렌 또는 헤테로아릴렌이고;
    R2는 H 또는 C1-C6알킬이고;
    R3는 C1-C4알킬, -L3R5, -L1R5, -L3R7, -L3L4L3R7, -L3L4R5, -L3L4L3R5, -OL3R5, -OL3R7, -OL3L4R7, -OL3L4L3R7, -OR8, -OL3L4R5, -OL3L4L3R5 및 -C(R5)2OH로부터 선택되고;
    각각의 R4는 H 및 플루오로부터 독립적으로 선택되고;
    R5는 -P(O)(OR9)2이고,
    R6는 -CF2P(O)(OR9)2 또는 -C(O)OR10이고;
    R7은 -CF2P(O)(OR9)2 또는 -C(O)OR10이고;
    R8은 H 또는 C1-C4알킬이고;
    각각의 R9은 H 및 C1-C6알킬로부터 독립적으로 선택되고;
    R10은 H 또는 C1-C4알킬이고;
    각각의 p는 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 독립적으로 선택되고;
    q는 1, 2, 3 또는 4이다.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 애쥬번트가 알루미늄 염에 흡착된 인간 TLR 효능제를 포함하는 조성물.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 임의로 인간에서 S. 아우레우스 감염의 예방 및/또는 치료에서 약제로 사용하기 위한 면역원성 조성물.
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