JP6894237B2 - 変異体ブドウ球菌抗原 - Google Patents

Description

本出願は、欧州特許出願第14161861.1号(2014年3月26日出願)及び同第14192913.3号(2014年11月12日出願)の利益を主張し、これらの特許出願の両方の完全な内容は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、黄色ブドウ球菌(S. aureus)による感染に対する免疫化に関係する。

黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)はグラム陽性の球状の細菌である。年間の米国の死亡率は、HIV/エイズを含む任意の他の感染症の死亡率を上回り、黄色ブドウ球菌は、血流、下気道、皮膚及び軟部組織感染症の主な原因である。また、それは世界的に骨感染症の主な原因であり、これらの感染症は、痛みを伴い、消耗性であり、治療が難しい。

黄色ブドウ球菌の治療は、黄色ブドウ球菌の多くの株による抗生物質耐性の進行に起因して、ますます困難になってきている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)は、全てのコミュニティ及び病院感染症の半数超で見い出されている。近年、最終手段の抗生物質であるバンコマイシンにも耐性があり、本質的に治療不可能であるMRSA株の出現が見られている。

承認されたワクチンは現在ない。細菌型5及び8に由来する表面多糖の混合物に基づくワクチン、StaphVAX(商標)は、第III相臨床試験において、プラセボ群と比較した場合、感染を低下させることができなかった。同様に、IsdB抗原に基づく[2]、V710ワクチン[1]は、術後の黄色ブドウ球菌の感染率を低下させることができなかった[3]。

抗生物質耐性の問題、及び黄色ブドウ球菌感染症が、そのよく発達した免疫回避能力のおかげで将来の感染から免疫を提供しないという事実のために、ワクチンの必要性は特に緊急である。黄色ブドウ球菌の免疫回避特性は、次に、有効なワクチンの開発をより困難にする。免疫回避のメカニズムは完全には理解されていないが、免疫グロブリン(Ig)のFc及びVH3型B細胞受容体のFab部分に結合する黄色ブドウ球菌の表面分子であるブドウ球菌プロテインA(SpA)に少なくとも部分的に起因する。B細胞受容体とSpAの相互作用は、クローン増殖及びその後のB細胞集団の細胞死を導き、これが、適応免疫応答の除去をもたらす。Ig Fcに結合するSpAは、多形核白血球によるブドウ球菌のオプソニン食作用クリアランスを妨害する。

免疫グロブリンに対して低下した親和性を有するSpAの変異型が開発されている。WO2011/005341は、IgGと結合するタンパク質の能力を低下させる5つのIg結合ドメインのそれぞれにおける点変異を有するSpAを記載する。

参考文献4は、「コンボ(Combo)-1」及び「コンボ-2」と呼ばれる2つの好ましい免疫原の組合せを含む、改善された黄色ブドウ球菌ワクチンを提供する様々な手法を開示する。「コンボ-1」は、5つの抗原EsxA、EsxB、変異体Hla、FhuD2、及びSta011を含み、一方、「コンボ-2」は、変異体Hlaの代わりにIsdAの断片を使用した。これらの組み合わせの両方を、水酸化アルミニウムアジュバントを用いて試験し、それらは、緩衝液単独又はIsdB抗原と比較した場合、感染のマウスモデルにおいて生存期間中央値を増加させた。「コンボ-1」はまた、水酸化アルミニウムアジュバントとTLR7アゴニストを用いて試験され、TLR7アゴニストの添加が応答を改善した[5]。

WO2011/005341 WO2010/119343 WO2013/030378

Sheridan (2009) Nature Biotechnology 27:499-501. Kuklin et al. (2006) Infect Immun. 74(4):2215-23. Fowler et al. (2013) JAMA 309(13):1368-78.

「コンボ-1」及び「コンボ-2」を用いた肯定的な結果にもかかわらず、黄色ブドウ球菌に対する免疫化のためのさらなる、且つ改善された組成物が依然として必要とされている。

黄色ブドウ球菌の細胞壁にアンカーされている表面タンパク質であるプロテインA(SpA)(配列番号43)は、先天性免疫応答及び適応免疫応答からの細菌の回避を提供する。プロテインAは、そのFc部分で免疫グロブリンと結合し、B細胞増殖及びアポトーシスを不適切に刺激するB細胞受容体のVH3ドメインと相互作用し、フォンヴィレブランド因子のAlドメインに結合して細胞内凝固を活性化し、また、TNF受容体1に結合してブドウ球菌性肺炎の発症機序に寄与する。プロテインAが、免疫グロブリンを捕捉し、有毒な特性を表すという事実のため、この表面分子がヒトにおけるワクチンとして機能する可能性は、徹底的には追求されていない。ここで、本発明者らは、免疫グロブリンに結合することがもはやできないプロテインAバリアントが、それによってそれらの毒素原性の可能性が除去され、すなわち、非毒素原性であり、ブドウ球菌疾患に対して保護する体液性免疫応答を刺激することを実証する。

したがって、以下に説明するように、本発明は、変異体SpA抗原を提供する。当該変異体は、未改変SpAと比較して、ヒトIgGのFcγ部分に対して減少した親和性を好ましくは有する。変異体はまた、V_H3含有ヒトB細胞受容体のFab部分に対して、未改変のSpAと比較して、減少した親和性を有し得る。

本発明者らは、ヒトIgGのFcγ部分に対する及びV_H3含有B細胞受容体のFab部分に対するその親和性を減少させるように改変されている変異体ブドウ球菌プロテインA(SpA)を添加することによって、公知の「コンボ-1」ワクチンを改善できることを見い出した。この追加の抗原は、組み合わせの防御効果を増加させ、腎膿瘍モデルで著しい結果を提供する。参考文献4において試験された抗原の組み合わせのいずれも、SpA抗原を含まなかった。

したがって、本発明は、EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011、及びHla抗原を含む免疫原性組成物をさらに提供し、該組成物は、変異体SpA抗原をさらに含むことを特徴とし、該変異体は、ヒトIgGのFcγ部分に対して及びV_H3含有ヒトB細胞受容体のFab部分に対して、未改変SpAと比較して、減少した親和性を有する。

本発明はまた、(i)EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011、及びHla抗原からなる群から選択される少なくとも1つの抗原、及び(ii)ヒトIgGのFcγ部分に対して及びV_H3含有ヒトB細胞受容体のFab部分に対して、未改変SpAと比較して、減少した親和性を有する変異体SpA抗原、を含む免疫原性組成物を提供する。したがって、EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011、及びHlaの1、2、3、4又は好ましくは5つ全ては、変異体SpAと組み合わせて使用され得る。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、関連する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

便宜上、本明細書、実施例及び特許請求の範囲で用いられる特定の用語及び語句の意味は提供される。

黄色ブドウ球菌抗原
本発明は、とりわけ、変異体SpA抗原に関する。野生型SpA(ブドウ球菌プロテインA)は、肺感染症、敗血症及び膿瘍の進行についての重要な病原性因子であり、大部分の臨床黄色ブドウ球菌分離株によって発現される、細胞壁アンカー表面タンパク質である。野生型SpAは、ヒトIgGのFc部分に、V_H3含有B細胞受容体に、そのA1ドメインでフォンヴィレブランド因子に、及びTNF-α受容体1に、結合する。B細胞受容体とSpAの相互作用は、クローン増殖及びその後のB細胞集団の細胞死を導き、適応免疫応答及び先天性免疫応答に影響を有し、一方、IgGのFcγへのその結合は、多形核白血球によるブドウ球菌のオプソニン食作用クリアランスを妨害する。成熟SpAのN末端部分は、短いリンカーによって接続された三重らせん束に折り畳まれ、順にE、D、A、B、及びCと指定される、4又は5個の56〜61残基のIg結合ドメインから構成される[6]。これらのドメインは、アミノ酸レベルで約80％の同一性を示し、長さ56〜61残基であり、タンデムリピートとして構成される[7]。C末端領域は、高度に反復的であるがまだ可変的であるオクタペプチドである「Xr」、及びSpAの細胞壁アンカー構造に隣接するドメインである「Xc」から構成される。

NCTC 8325株では、spaは、SAOUHSC_00069であり、アミノ酸配列の配列番号43(GI:88193885)を有する。Newman株では、それは、nwmn_0055(GI:151220267)である。本発明で使用されるSpA抗原は、(例えば、ヒトに投与された場合)配列番号43を認識する抗体を誘発することができ、並びに/又は(a)配列番号43に対して50％以上の同一性(例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％又はそれより多く)を有する、及び/若しくは(b)配列番号43の少なくとも「n」個の連続アミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含んでよく、ここで、「n」は7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250又はそれより多く)である。これらのSpA抗原は、配列番号43のバリアントを含む。(b)の好ましい断片は、配列番号43に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号43の少なくとも1つのエピトープを保持しながら、配列番号43のC末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)及び/又はN末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)を欠く。配列番号43の最後の35個のC末端アミノ酸は、有用に除外することができる。配列番号43の最初の36個のN末端アミノ酸は、有用に除外することができる。参考文献8は、個々のIgG結合ドメインが、単独で又は組み合わせて、有用な免疫原であり得ることを示唆する。

配列番号43の有用な断片は、アミノ酸37〜325である。この断片は、5個全てのSpA Ig結合ドメイン(E、D、A、B、Cの順でN末端からC末端に自然に配列される)を含有し、SpAの最も露出したドメインを含む。それはまた、ヒトタンパク質との抗原の類似性を低減する。他の有用な断片は、spaがB細胞スーパー抗原として機能する場合に生じ得る、過剰なB細胞の増殖及びその後のアポトーシスを防止するために、天然のA、B、C、D及び/又はEドメインの1、2、3又は4個を除外してもよい。参考文献18で報告されているように、他の有用な断片は、天然のA、B、C、D及び/又はEドメインの1、2、3又は4個のみを含んでもよく、例えば、SpA(A)ドメインのを含むがB〜Eを含まず、又はSpA(D)ドメインのみを含みA、B、C若しくはEを含まない等であってもよい。したがって、本発明で有用なspa抗原は、1、2、3、4又は5個のIgG結合ドメインを含み得るが、理想的には4個以下を有する。

したがって、SpAの別の有用な断片は、配列番号50のアミノ酸配列を含むか又はこれからなり、ここで60及び61位におけるアミノ酸ダブレットはGln-Glnではない。前記ダブレットは、以下に説明するように、例えばLys-Argに、変異されてもよい。したがって、前記断片は、配列番号51又は52を含むか又はこれからなってよい。

抗原が、spaドメインの1種類のみ(例えば、Spa(A)、SpA(D)又はSpa(E)ドメインのみ)を含む場合、それは、単一のポリペプチド鎖中に、このドメインの2つ以上のコピー、例えば複数のSpA(E)ドメイン、を含んでよい。それはまた、SpAドメインの1種類と、別のタンパク質若しくはポリペプチドとを含んでもよい。したがって、本発明の抗原は、SpAドメインの1種類のみ、例えばSpA(E)ドメインと、別のタンパク質抗原、例えばEsxA; EsxB; FhuD2; Sta011; 及びHlaとを含む融合タンパク質であってもよい。

本発明のSpA抗原は、ヒトIgGのFcγ部分に対する減少した親和性を有するように、配列番号43に対して変異されている。例えば、配列番号43の残基60〜61におけるQQジペプチドは、免疫グロブリンに対する親和性を低下させるために変異され得る。QQジペプチドについての有用なジペプチド置換は、以下で論じられ、好ましい置換はKRジペプチドである。したがって、有用なSpA抗原は、配列番号49を含んでよく、ここでは、11個のXXジペプチドの1つ以上(好ましくは全て)が配列番号43内の対応するジペプチドとは異なる。例えば、SpA抗原は、配列番号46を含むことができ、配列番号46の好ましい例は、配列番号47である。N末端メチオニンと共に発現される場合、配列番号47を含むSpA抗原は、配列番号48からなってよい。

本発明で使用されるSpA抗原は、ヒトIgGのFcγ部分に対する及びV_H3含有ヒトB細胞受容体のFab部分に対する減少した親和性を有するように、配列番号43に対してさらに変異されてもよい。これは、例えば、参考文献9のガイダンスに従って、達成及び評価され得る。したがって、野生型SpAにおける少なくとも1つのGln-Glnジペプチドは、変異されることができ(例えば、Lys-Lysに; 他の可能性のある変異としては、Arg-Arg、Arg-Lys、Lys-Arg、Ala-Ala、Ser-Ser、Ser-Thr、Thr-Thr等がある)、及び/又は野生型SpAにおける少なくとも1つのAsp-Aspジペプチドは、変異されることができる(例えば、Ala-Alaに; 他の可能性のある変異としては、Lys-Lys、Arg-Arg、Lys-Arg、Arg-Lys、His-His、Val-Val等がある)。変異のためのこれらの標的配列は、以下で下線が引かれ、ここで、ダッシュは5個のIg結合ドメインを分離する:

抗原内の個々のドメインは、配列番号43に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多くのアミノ酸において変異されてよい(例えば、Gln-Gln及びAsp-Asp配列に関連して上記を参照されたいが、また、ドメインDの残基3及び/又は24、ドメインAの残基46及び/又は53等における変異を開示する、参考文献エラー!ブックマークは定義されていないも参照されたい)。このような変異は、配列番号43を認識する抗体を誘発する抗原の能力を除去すべきではないが、上述のように、IgG及び/又は他のヒトタンパク質(例えばヒト血液タンパク質)への抗原の結合を除去する。特に、変異体SpA抗原は、配列番号43の43、44、70、71、104、105、131、132、162、163、190、191、220、221、247、248、278、279、305及び/又は306位における少なくとも1つ、より具体的には少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19個、さらにより具体的には20個のアミノ酸において変異された配列番号43を含む又はこれからなる配列のものである。これらの位置について有用な置換は、上で述べられている。

さらに、天然のN末端は除去されてよく、且つ配列番号43の最初の36個のアミノ酸は有用に除外されてよい。同様に、天然のC末端は除去されてよく、且つ5番目のIg結合ドメインの下流の配列は有用に除外されてよい(すなわち、配列番号43におけるLys-327の下流)。したがって、有用なSpA抗原は、配列番号44を含む。

[ここで、10個の下線を引いたXXジペプチドは、配列番号43内の対応するジペプチドとは異なる。]したがって、配列番号43におけるこれらの位置のQQは、配列番号44においてQQではなく、理想的には、グルタミン残基を含まず、例えばそれはKKである。同様に、配列番号43におけるこれらの位置のDDは、配列番号44においてDDではなく、理想的には、アスパラギン酸残基を含まず、例えばそれはAAである。したがって、本発明で使用するためのSpAの好ましい形態は、配列番号45を含む。

配列番号44のXXジペプチドにおける置換に加えて、最大5個の単一アミノ変化でアミノ酸配列を改変することができる(但し、改変された配列が、配列番号44からなるポリペプチドに依然として結合する抗体を誘発できることを条件とする)。したがって、配列番号45は、配列番号44内のXXジペプチドの外側の位置で1、2又は3個の置換によって改変され得る。例えば、配列番号44の残基60〜61におけるQQジペプチドは、免疫グロブリンに対する親和性をさらに低下させるために変異され得る。QQジペプチドについての有用なジペプチド置換は上述され、好ましい置換はKRジペプチドである。したがって、有用なSpA抗原は、配列番号49を含むことができ、配列番号49では、11個のXXジペプチドの1つ以上(好ましくは全て)が、配列番号43内の対応するジペプチドとは異なる。例えば、SpA抗原は、配列番号46を含むことができ、配列番号46の好ましい例は、配列番号47である。N末端メチオニンと共に発現される場合、配列番号47を含むSpA抗原は、配列番号48からなることができる。

上述したように、SpAの有用な断片は、天然のA、B、C、D及び/又はEドメインの1、2、3又は4個のみを含んでよく、例えば、SpA(E)ドメインのみを含むがD、A、B又はCを含まなくてもよい。したがって、本発明で有用なSpA抗原は、上記のように変異されたSpA(E)ドメインのみ、すなわち、配列番号54の60及び61位における少なくとも1つのアミノ酸において変異された配列番号54を含むか若しくはこれからなるアミノ酸配列、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47若しくは配列番号49のアミノ酸1〜67、又は配列番号48のアミノ酸1〜68を含み得る。例えば、前記抗原は、配列番号50、配列番号51、配列番号52又は配列番号53を含み得る。前記抗原は、好ましくは、SpAに由来する他の配列を含まない。それは、SpA(E)ドメインの2つ以上のコピーを含んでよく、及び/又は本明細書に記載されるようにEsxA、EsxB、FhuD2、Sta011、又はHla抗原などの別のタンパク質抗原をさらに含んでもよい。

本発明の抗原の組み合わせは、以下の抗原の1、2、3、4又は5個全てを使用する: EsxA; EsxB; FhuD2; Sta011; 及びHla。これらの5つの抗原は、当技術分野ですでに公知であり(例えば、参考文献4〜14を参照)、さらなる詳細が以下に示される。特に有用な組成物は、これらの抗原の5個全てを含む(好ましくは、Hlaは、非毒性(すなわち、解毒化)変異型である)。

NCTC 8325株における「EsxA」抗原は、アミノ酸配列 配列番号1(GI:88194063)を有する。本発明で使用されるEsxA抗原は、(例えばヒトに投与されたとき)配列番号1を認識する抗体を誘発することができ、並びに/又は(a)配列番号1に対して50％以上の同一性(例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％又はそれより多く)を有する、及び/若しくは(b)配列番号1の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含んでよく、ここで、「n」は、7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90又はそれより多く)である。これらのEsxAポリペプチドは、配列番号1のバリアントを含む。(b)の好ましい断片は、配列番号1に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号1の少なくとも1つのエピトープを保持しながら、配列番号1のC末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)を欠き、及び/又はN末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)を欠く。

NCTC 8325株における「EsxB」抗原は、アミノ酸配列 配列番号2(GI:88194070)を有する。本発明で使用されるEsxB抗原は、(例えばヒトに投与されたとき)配列番号2を認識する抗体を誘発することができ、並びに/又は(a)配列番号2に対して50％以上の同一性(例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％又はそれより多く)を有する、及び/若しくは(b)配列番号2の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含んでよく、ここで、「n」は、7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100又はそれより多く)である。これらのEsxBポリペプチドは、配列番号2のバリアントを含む。(b)の好ましい断片は、配列番号2に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号2の少なくとも1つのエピトープを保持しながら、配列番号2のC末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)を欠き、及び/又はN末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)を欠く。有用なEsxB抗原は、配列番号2の内部システイン残基を欠き、例えば、それは配列番号35を含み、ここで、30位の残基Xは不在であるか又は(還元条件下で)遊離チオール基を有さないアミノ酸残基であり、例えば、システイン以外の任意の天然アミノ酸である。

「FhuD2」抗原は、「フェリクローム結合タンパク質」と注釈付けされており、また文献[15]で研究されている。それはまた、(例えば、参考文献4〜14において)「Sta006」として知られている。NCTC 8325株においてFhuD2は、アミノ酸配列 配列番号3(GI:88196199)を有する。本発明で使用されるFhuD2は、(例えばヒトに投与されたとき)配列番号3を認識する抗体を誘発することができ、並びに/又は(a)配列番号3に対して50％以上の同一性(例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％又はそれより多く)を有する、及び/若しくは(b)配列番号3の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含んでよく、ここで、「n」は、7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250又はそれより多く)である。これらのFhuD2ポリペプチドは、配列番号3のバリアントを含む。(b)の好ましい断片は、配列番号3に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号3の少なくとも1つのエピトープを保持しながら、配列番号3のC末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)を欠き、及び/又はN末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)を欠く。配列番号3の最初の17個のN末端アミノ酸は、有用に除外されてよい(配列番号6を提供するように)。FhuD2の変異型は、参考文献16に報告される。有用なFhuD2抗原は、配列番号3のシステイン残基を欠き、例えば、それは配列番号34を含み、且つ(還元条件下で)遊離チオール基を有する任意のアミノ酸残基を含まず、例えばそれはシステインフリーである。FhuD2抗原は、例えばアシル化N末端システインを用いて、脂質化されてもよい。1つの有用なFhuD2配列は、配列番号7であり、これはN末端におけるMet-Ala-Ser-配列を有し; 配列番号37は、別のそのような配列であるが、それは配列番号7に存在するシステインを欠く。

「Sta011」抗原は、NCTC 8325株においてアミノ酸配列 配列番号4(GI:88193872)を有する。本発明で使用されるSta011抗原は、(例えばヒトに投与されたとき)配列番号4を認識する抗体を誘発することができ、並びに/又は(a)配列番号4に対して50％以上の同一性(例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％又はそれより多く)を有する、及び/若しくは(b)配列番号4の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含んでよく、ここで、「n」は、7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250又はそれより多く)である。これらのSta011ポリペプチドは、配列番号4のバリアントを含む。(b)の好ましい断片は、配列番号4に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号4の少なくとも1つのエピトープを保持しながら、配列番号4のC末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)を欠き、及び/又はN末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)を欠く。配列番号4の最初の23個のN末端アミノ酸は、有用に除外されてよい(配列番号33を提供するように)。有用なSta011抗原は、配列番号4のシステイン残基を欠き、例えば、それは配列番号36を含み、且つ(還元条件下で)遊離チオール基を有する任意のアミノ酸残基を含まず、例えばそれはシステインフリーである。Sta011抗原は、例えばアシル化N末端システインを用いて、脂質化されてもよい。1つの有用なSta011配列は、配列番号8であり、これはN末端メチオニンを有し; 配列番号39は、別のそのような配列であるが、それは配列番号8に存在するシステインを欠く。Sta011抗原として又はSta011抗原を調製するために使用され得る配列番号4のバリアント型は、様々なIle/Val/Leu置換を有する配列番号9、10及び11を含むが、これらに限定されない(及びこれらの配列のCysフリーバリアントも本発明で使用され得る)。Sta011は、オリゴマー化に有利に働くCa⁺⁺イオンとともに、モノマー又はオリゴマーとして存在し得る。本発明は、Sta011のモノマー及び/又はオリゴマーを使用し得る。

「Hla」抗原は、「α毒素」又は単に「溶血素」としても知られる「α溶血素前駆体」である。NCTC 8325株においてHlaは、アミノ酸配列 配列番号5(GI:88194865)を有する。Hlaは、孔形成活性及び溶血活性を有する、黄色ブドウ球菌のほとんどの株によって産生される重要な毒性決定因子である。抗Hla抗体は、動物モデルにおいて毒素の有害な作用を中和することができ、Hlaは、肺炎に対して保護するために特に有用である。

有用なHla抗原は、(例えばヒトに投与されたとき)配列番号5を認識する抗体を誘発することができ、並びに/又は(a)配列番号5に対して50％以上の同一性(例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％又はそれより多く)を有する、及び/若しくは(b)配列番号5の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸の断片を含む、アミノ酸配列を含んでよく、ここで、「n」は、7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250又はそれより多く)である。これらのHla抗原は、配列番号5のバリアントを含む。(b)の好ましい断片は、配列番号5に由来するエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号5の少なくとも1つのエピトープを保持しながら、配列番号5のC末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)を欠き、及び/又はN末端から1つ以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25又はそれより多く)を欠く。配列番号5の最初の26個のN末端アミノ酸は、有用に除外されてよい(例えば配列番号12を与えるように)。C末端におけるトランケーションを用いて、例えば50アミノ酸(配列番号5の残基27〜76)のみを残してもよい[17]。

特に、Hla抗原は、解毒化Hla抗原、すなわち、Hlaの天然の毒性が除去されているHlaの変異型である。Hlaの毒性は、(例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド又は他の架橋試薬を用いて)化学的不活性化によって回避され得る。しかしながら、代わりに、その免疫原性を保持しながらその毒性活性を除去するHlaの変異型を使用することが好ましい。より具体的には、解毒化Hla抗原は、Hlaの免疫原性を保持しながらHlaの毒性が除去されているHlaの変異型である。そのような解毒化変異体は、当技術分野ですでに公知である。好ましいHla抗原は、配列番号5の残基61に変異を有する変異体黄色ブドウ球菌溶血素であり、配列番号5の残基61は、成熟抗原の残基35である(すなわち、最初の26個のN末端アミノ酸を除外した後＝配列番号12の残基35)。したがって、残基61は、ヒスチジンではなくてもよく、代わりに例えばIle、Val、又は好ましくはLeuであってもよい。この位置におけるHis-Arg変異を使用することもできる。例えば、配列番号13は、Hlaの成熟H35L変異型の配列であり(すなわち、H35L変異を有する配列番号12)、有用な解毒化Hla抗原は、配列番号13を含むか又はこれからなる配列のものである。別の有用な変異は、長いループを短い配列で置き換え、例えば、配列番号15(H35L変異も含む)及び配列番号16(H35L変異を含まない)におけるように、配列番号5の残基136〜174における39merをPSGS(配列番号14)などのテトラマーで置き換える。別の有用な変異は、残基Y101を、例えばロイシンで置き換える(配列番号17)。別の有用な変異は、残基D152を、例えばロイシンで置き換える(配列番号18)。別の有用な変異体は、残基H35及びY101を、例えばロイシンで置き換える(配列番号19)。別の有用な変異体は、残基H35及びD152を、例えばロイシンで置き換える(配列番号20)。

さらなる有用なHla抗原は、参考文献18及び19に開示されている。

配列番号21、22及び23は、配列番号5の3つの有用な断片である(それぞれ、「Hla_27-76」、「Hla_27-89」及び「Hla_27-79」)。配列番号24、25及び26は、配列番号13に由来する対応する断片である。

1つの有用なHla配列は、配列番号27である。それは、N末端Met、次いで発現ベクターに由来するAla-Serジペプチド、次いでH35L変異を含む配列番号13(NCTC8325株に由来する)を有する。

組成物が、EsxAとEsxB抗原の両方を含む場合、これらは、単一のポリペプチドとして(すなわち、EsxAとEsxBの両方を含む又はこれらからなる融合ポリペプチドとして)存在してもよい。したがって、単一ポリペプチドは、(例えばヒトに投与されたとき)配列番号1及び配列番号2の両方を認識する抗体を誘発できる。単一ポリペプチドは、(i)EsxAについて上に定義されるように、配列番号1に対して50％以上の同一性(例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％又はそれより多く)を有する、及び/若しくは配列番号1の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸の断片を含む、第一ポリペプチド、並びに(ii)EsxBについて上に定義されるように、配列番号2に対して50％以上の同一性(例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％又はそれより多く)を有する、及び/若しくは配列番号2の少なくとも「n」個の連続するアミノ酸の断片を含む、第二ポリペプチド、を含むことができる。第一及び第二のポリペプチド配列は、N末端からC末端へいずれかの順であってよい。配列番号28(「EsxAB」)及び29(「EsxBA」)は、そのようなポリペプチドの例であり、両者はヘキサペプチドリンカーASGGGS(配列番号30)を有する。別の「EsxAB」ハイブリッドは、配列番号31を含み、これはN末端メチオニンとともに提供されてよい(例えば、配列番号32)。EsxABの有用なバリアントは、EsxBの内部システイン残基を欠き、例えばそれは、配列番号40を含み、ここで、132位における残基Xは、不在であるか又は(還元条件下で)遊離チオール基を有さないアミノ酸残基であり、例えばシステイン以外の任意の天然アミノ酸である。したがって、本発明で使用するための好ましいEsxAB抗原は、アミノ酸配列 配列番号38を有する。

したがって有用なポリペプチドは、配列番号31に対して80％以上の同一性(例えば、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％又はそれより多く)を有する、並びに/又は(b)配列番号31のアミノ酸1〜96に由来する少なくとも「n」個の連続するアミノ酸の断片及び配列番号31のアミノ酸103〜205に由来する少なくとも「n」個の連続するアミノ酸の断片の両方を含む、アミノ酸配列を含み、ここで、「n」は、7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250又はそれより多く)である。これらのポリペプチド(例えば、配列番号32)は、(例えば、ヒトに投与された場合)配列番号1を含む野生型のブドウ球菌タンパク質及び配列番号2を含む野生型のブドウ球菌タンパク質の両方を認識する抗体を誘発することができる。したがって、免疫応答は抗原EsxA及びEsxBの両方を認識する。(b)の好ましい断片は、配列番号1に由来するエピトープ及び配列番号2に由来するエピトープを提供する。

本発明は、EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011、及びHla(好ましくは非毒性変異体Hla)の1、2、3、4、又は5個全てを使用する。上述のように、特に有用な組成物は、これらの抗原の5個全てを含むが、いくつかの実施形態では、本発明は、これらの5個の抗原の1、2、3、又は4個のみを含み、すなわち、EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011及びHlaの1、2、3又は4個は組成物中に存在しない。

好ましい組成物は、(i)例えば配列番号31を含む、EsxA抗原とEsxB抗原の両方を含む単一ポリペプチド、(ii)例えば配列番号6を含む、FhuD2抗原、(iii)例えば配列番号33を含む、Sta011抗原、及び(iv)例えば配列番号13を含む、HlaのH35L変異型、の4個全てを含む。

配列番号31、6、33及び13は、組み合わせにおいて有用なアミノ酸配列であるが、本発明はこれらの正確な配列に限定されない。したがって、これらの配列の1、2、3、又は4個全ては、最大5個の単一アミノ変化(すなわち、1、2、3、4又は5個の単一アミノ酸置換、欠失及び/又は挿入)によって独立に改変されてよい(但し、改変された配列が、未改変配列からなるポリペプチドに依然として結合する抗体を誘発できることを条件とする)。

別の有用な組成物は、(i)アミノ酸配列 配列番号32を有する第一ポリペプチド、(ii)アミノ酸配列 配列番号7を有する第二ポリペプチド、(iii)アミノ酸配列 配列番号8を有する第三ポリペプチド、及び(iv)アミノ酸配列 配列番号27を有する第四ポリペプチド、の4個全てを含む。

配列番号32、7、8及び27は、組み合わせにおいて有用なアミノ酸配列であるが、本発明はこれらの正確な配列に限定されない。したがって、これらの4個の配列の1、2、3、又は4個全ては、1、2、3、4、又は5個の単一アミノ変化(すなわち、1、2、3、4又は5個の単一アミノ酸置換、欠失及び/又は挿入)によって独立に改変されてよい(但し、改変された配列が、未改変配列からなるポリペプチドに依然として結合する抗体を誘発できることを条件とする)。したがって、好ましい実施形態では、組成物は、1個の単一アミノ酸置換、欠失及び/又は挿入によって独立に改変された配列番号32、7、8及び27の1、2、3、又は4個全てを有するこれらの4個の特定されたポリペプチドを含む。

例えば、野生型FhuD2、Sta011及びEsxABポリペプチド配列(例えば、配列番号6、31及び33)はそれぞれ、ホモダイマー及びヘテロダイマーの両方を形成する、ポリペプチド間ジスルフィド架橋をもたらし得る、単一システイン残基を含む。このような相互連結されたポリペプチドは望ましくなく、そのため、Sta006、Sta011及びEsxB配列は、それらが(還元条件下で)遊離チオール基を含有しないように、それらの天然システイン残基を除去するように改変され得る。野生型システインは、除去されてよく、又は異なるアミノ酸で置換されてもよい。

したがって、FhuD2抗原は、配列番号34を含むことができ、Sta011抗原は、配列番号36を含むことができ、EsxB抗原は、配列番号35を含むことができる(例えば配列番号40を含むEsxABハイブリッドとして)。そのような配列の例としては、限定されないが、配列番号37、39及び38が挙げられる。これらの配列は、対応する野生型配列の代替として個々に、又は組み合わせて、使用され得る。したがって、特に有用な組成物は、(i)アミノ酸配列 配列番号38を有する第一ポリペプチド、(ii)アミノ酸配列 配列番号37を有する第二ポリペプチド、(iii)アミノ酸配列 配列番号39を有する第三ポリペプチド、及び(iv)アミノ酸配列 配列番号27を有する第四ポリペプチド、の4個全てを含む。

したがって、本発明の好ましい組成物は、(i)例えば配列番号31を含む、EsxA抗原とEsxB抗原の両方を含む単一ポリペプチド、(ii)例えば配列番号6を含む、FhuD2抗原、(iii)例えば配列番号33を含む、Sta011抗原、(iv)例えば配列番号13を含む、HlaのH35L変異型、及び(v)例えば配列番号45若しくは47を含む、変異体SpA、又はその単一ドメイン(例えば配列番号50、51、52若しくは53)を含む抗原、の5個全てを含む。そのため、特に、本発明に係る組成物は、
(i)特に配列番号31を含む若しくはこれからなる配列の、EsxA抗原とEsxB抗原の両方を含む単一ポリペプチド、
(ii)特に配列番号6を含む若しくはこれからなる配列の、FhuD2抗原、
(iii)特に配列番号33を含む若しくはこれからなる配列の、Sta011抗原、
(iv)特に配列番号13を含む若しくはこれからなる配列の、HlaのH35L変異型、及び
(v)特に配列番号45、配列番号47若しくは配列番号52を含む又はこれからなる配列の、変異体SpA抗原
を含む。

本発明に係る別の好ましい組成物は、
(i)配列番号32を含む又はこれからなる、より具体的には配列番号32からなる配列の第一ポリペプチド、
(ii)配列番号7を含む又はこれからなる、より具体的には配列番号7からなる配列の第二ポリペプチド、
(iii)配列番号8を含む又はこれからなる、より具体的には配列番号8からなる配列の第三ポリペプチド、
(iv)配列番号27を含む又はこれからなる、より具体的には配列番号27からなる配列の第四ポリペプチド、及び
(v)配列番号52を含む又はこれからなる、より具体的には最大3個のアミノ酸置換によって改変された配列番号45を含む又はこれからなる(例えば、配列番号47を含む又は配列番号48からなる)配列の第五ポリペプチド
を含む。

本発明に係る別の好ましい組成物は、
(i)配列番号38を含む又はこれからなる、より具体的には配列番号38からなる配列の第一ポリペプチド、
(ii)配列番号37を含む又はこれからなる、より具体的には配列番号37からなる配列の第二ポリペプチド、
(iii)配列番号39を含む又はこれからなる、より具体的には配列番号39からなる配列の第三ポリペプチド、
(iv)配列番号27を含む又はこれからなる、より具体的には配列番号27からなる配列の第四ポリペプチド、及び
(v)配列番号52、より具体的には最大3個のアミノ酸置換によって改変された配列番号45を含む又はこれからなる(例えば、配列番号47を含む又は配列番号48からなる)配列の第五ポリペプチド
を含む。

これらの組み合わせにおけるタンパク質(i)〜(v)は、上で説明したように、最大5個の単一アミノ変化によって独立に改変されてよい(但し、改変された配列が、未改変配列からなるポリペプチドに依然として結合する抗体を誘発できることを条件とする)。いくつかの実施形態では、組成物は、1つ以上のさらなるポリペプチドを含んでよく、他の実施形態では、組成物中の唯一のポリペプチドは、これらの5つの特定されたポリペプチドであり、これらのポリペプチドは、組成物中の唯一の免疫原性成分でさえあり得る。

2つ以上のポリペプチドが存在する場合、それらは、実質的に等しい質量で存在してもよく、すなわち、それらのそれぞれの質量は、全てのポリペプチドの平均質量の±5％以内である。したがって、5つのポリペプチドが存在する場合、それらは、a:b:c:d:eの質量比で存在してもよく、ここでa〜eのそれぞれは0.95〜1.05である。

EsxA、EsxB、Hla、FhuD2、Sta011、及びSpAとは別に、他の黄色ブドウ球菌抗原が存在し、組成物は、場合により、1つ以上のさらなる黄色ブドウ球菌抗原を含むことができる。例えば、糖抗原及びポリペプチド抗原の両方が、黄色ブドウ球菌について公知である。したがって、組成物は、黄色ブドウ球菌糖抗原を含んでよく、例えば、公知の糖抗原としては、ポリ-N-アセチルグルコサミン(PNAG)である黄色ブドウ球菌のエキソポリサッカライド(exopolysaccharide)、並びに、例えば5型、8型若しくは336型であり得る、黄色ブドウ球菌の莢膜糖類が挙げられる。組成物はまた、ClfA抗原、IsdA抗原、IsdB抗原、IsdC抗原、及び/又はIsdH抗原を含み得る(それぞれは参考文献15の15〜17頁に定義される)。

いくつかの実施形態では、組成物は、上で定義された黄色ブドウ球菌抗原、及び異なる生物由来(例えば、ウイルス由来又は別の細菌由来)の抗原もまた含む。

免疫原性組成物及び医薬
本発明に係る免疫原性組成物は、ワクチンとして有用であり得る。本発明に係るワクチンは、予防的(すなわち、感染を防ぐため)又は治療的(すなわち、感染を処置するため)のいずれかであり得るが、典型的には、予防的である。

したがって、組成物は、薬学的に許容可能であり得る。それらは通常、抗原に加えて成分を含み、例えば、それらは、典型的には、1つ以上の医薬担体及び/又は賦形剤を含む。このような成分の徹底的な議論は参考文献21で利用可能である。

組成物は、一般的に、哺乳動物に水性形態で投与される。しかしながら、投与前に、組成物は非水性形態であり得る。例えば、いくつかのワクチンは水性形態で製造され、次いで充填及び配送され、同じく水性形態で投与されるが、他のワクチンは製造中に凍結乾燥され、使用時に水性形態に再構成される。したがって、組成物は、凍結乾燥製剤のように乾燥され得る。参考文献10は、黄色ブドウ球菌免疫原性組成物を用いた凍結乾燥の使用を開示する。

組成物は、チオメルサール又は2-フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかしながら、好ましくは、ワクチンは、水銀性物質を実質的に含まない(すなわち、5μg/ml未満)、例えばチオメルサールを含まないようにすべきである。水銀を含まないワクチンがより好ましい。保存剤を含まないワクチンが特に好ましい。

熱安定性を改善するために、組成物は、温度保護剤を含み得る(下記を参照)。

張度を制御するために、ナトリウム塩などの生理的な塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム(NaCl)が好ましく、これは、1〜20mg/ml、例えば約10±2mg/ml NaClで存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。

組成物は、一般的に、200mOsm/kg〜400mOsm/kg、好ましくは240〜360mOsm/kgのオスモル濃度を有し、より好ましくは、290〜310mOsm/kgの範囲内にある。

組成物は、1種類以上の緩衝剤を含み得る。典型的な緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、Tris緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤(特に、水酸化アルミニウムアジュバントと共に)又はクエン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、典型的には、5〜20mMの範囲で含まれる。

組成物は、金属イオンキレート剤、特に、EDTAなどの二価金属イオンキレート剤を含み得る。参考文献10は、EDTAを含むことが、本明細書に開示される組成物の安定性を改善し得ることを開示する。免疫原性組成物中のEDTAの最終濃度は、約1〜50mM、約1〜10mM又は約1〜5mM、好ましくは約2.5mMであり得る。

組成物のpHは、一般的に、5.0〜8.1であり、より典型的には6.0〜8.0、例えば、6.5〜7.5、又は7.0〜7.8である。

組成物は、好ましくは滅菌されている。組成物は、好ましくは発熱物質を含まず、例えば、用量あたり＜1EU(内毒素単位、標準的な尺度)、好ましくは、用量あたり＜0.1EUを含有する。組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。

組成物は、単回免疫化のための物質を含んでもよいし、又は複数回免疫化(すなわち、「複数回用量」キット)のための物質を含んでもよい。複数回用量の配合物において、保存剤を含むことが好ましい。複数回用量組成物に保存剤を含める代わりに(又はそれに加えて)、組成物を、物質を取り出すための無菌アダプタを有する容器中に入れてよい。

黄色ブドウ球菌感染症は様々な身体領域に影響を与え得るので、組成物は、様々な形態で調製され得る。例えば、組成物は、液体溶液又は懸濁物のいずれかとしての注射剤として調製され得る。注射前に液体ビヒクルに溶解又は懸濁するのに適切な固体の形態も調製され得る(例えば、凍結乾燥組成物又は噴霧凍結乾燥組成物)。組成物は、局所投与用に、例えば、軟膏剤、クリーム又は粉末として調製され得る。組成物は、経口投与用に、例えば、錠剤若しくはカプセル剤として、噴霧剤として、又はシロップ剤(場合により矯味矯臭して)として調製され得る。組成物は、肺投与用に、例えば、微細粉末又は噴霧剤を使用する吸入剤として調製され得る。組成物は、坐剤又は膣坐剤として調製され得る。組成物は、鼻、耳又は眼の投与用に調製され得る(例えば滴剤として)。組成物は、組み合わせ組成物が、患者への投与の直前に再構成されるように設計されたキットの形態であり得る。このようなキットは、液体の形態の1つ以上の抗原と、凍結乾燥された1つ以上の抗原とを含み得る。

組成物が使用前に即時調製されることになっており(例えば、成分が凍結乾燥された形態である場合)、キットとして提示される場合、キットは2つのバイアルを含み得、あるいは1つの充填済み(ready-filled)シリンジと1つのバイアルとを含み得、シリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化するのに使用される。

ヒト用ワクチンは、典型的には、約0.5mlの投薬容量で投与されるが、半分の容量(すなわち、約0.25ml)も、例えば小児用に、有用であり得る。

本発明に従って投与される免疫原性組成物はまた、1つ以上の免疫調節剤を含んでもよい。好ましくは、免疫調節剤の1つ以上は、1つ以上のアジュバント(下記参照)を含む。

組成物は、細胞媒介免疫応答と体液性免疫応答の両方を誘発し得る。この免疫応答は、好ましくは、長く残る(例えば、中和)抗体、及び黄色ブドウ球菌への曝露の際に迅速に応答することができる細胞媒介免疫を誘導する。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原(複数可)と、必要に応じて任意の他の成分とを含む。「免疫学的有効量」は、単回用量又は一連の一部としてその量を個体に投与することが処置又は予防に効果的であることを意味する。この量は、処置される個体の健康及び身体の状態、年齢、処置される個体の分類群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類など)、個体の免疫系の抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの製剤形態、医学的状態についての処置医師の評価、及び他の関連する因子に依存して変動する。この量は、通例の試験により決定され得る比較的広い範囲内に収まることが期待される。2個以上の抗原が組成物に含まれる場合、2個の抗原は、互いに同じ用量又は異なる用量で存在し得る。

上記のように、組成物は、温度保護剤を含み得、この成分は、アジュバント化組成物(特にアルミニウム塩などの無機物アジュバントを含有するもの)において特に有用であり得る。参考文献20に記載されているように、液体の温度保護剤を、その凝固点を低下させ、例えば、この凝固点を0℃未満に低減させるために水性ワクチン組成物に加えてよい。したがって、組成物は、温度による分解を阻害するために、0℃未満であるがその凝固点より上で貯蔵され得る。温度保護剤はまた、無機塩アジュバントを凍結及び解凍の後の凝集又は沈降から保護しながら組成物の凍結を可能にし、且つ、上昇した温度、例えば、40℃を超える温度にて組成物を保護し得る。開始水性ワクチン及び液体の温度保護剤は、この液体の温度保護剤が、最終混合物の1〜80体積％を形成するように混合され得る。好適な温度保護剤は、ヒト投与に対して安全であり、水に容易に混和/可溶性であるべきであり、組成物中の他の成分(例えば、抗原及びアジュバント)に損傷を与えないものであるべきである。例として、グリセリン、プロピレングリコール及び/又はポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。好適なPEGは、200〜20,000Daの範囲の平均分子量を有し得る。好ましい実施形態では、ポリエチレングリコールは、約300Daの平均分子量を有し得る(「PEG-300」)。

治療、及び免疫原性組成物の投与の方法
本発明は、医薬として使用するための本発明に係る免疫原性組成物に関する。

本発明はまた、黄色ブドウ球菌感染症の予防及び/又は治療における医薬として使用するための本発明に係る免疫原性組成物に関する。

本発明はまた、哺乳動物における黄色ブドウ球菌感染症の予防及び/又は治療方法であって、免疫学的有効量の上で定義された本発明に係る免疫原性組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む、方法を提供する。有利な実施形態は、上に定義されたとおりである。

本発明はまた、(i)EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011、及びHla抗原からなる群から選択される少なくとも1つの抗原、及び(ii)ヒトIgGのFcγ部分に対して及びV_H3含有ヒトB細胞受容体のFab部分に対して、未改変SpAと比較して、減少した親和性を有する変異体SpA抗原の、哺乳動物において黄色ブドウ球菌感染症を予防又は治療するための医薬の製造における使用を提供する。有利な実施形態は、上に定義されたとおりである。

本発明はまた、黄色ブドウ球菌感染症を予防又は治療するために哺乳動物の免疫化に使用するための、(i)EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011、及びHla抗原からなる群から選択される少なくとも1つの抗原、及び(ii)ヒトIgGのFcγ部分に対して及びV_H3含有ヒトB細胞受容体のFab部分に対して、未改変SpAと比較して、減少した親和性を有する変異体SpA抗原を提供する。有利な実施形態は、上に定義されたとおりである。

本発明はまた、哺乳動物に治療上有効量の抗原を投与することにより、黄色ブドウ球菌感染症を予防又は治療するために哺乳動物を免疫化する方法で使用するための、(i)EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011、及びHla抗原からなる群から選択される少なくとも1つの抗原、及び(ii)ヒトIgGのFcγ部分に対して及びV_H3含有ヒトB細胞受容体のFab部分に対して、未改変SpAと比較して、減少した親和性を有する変異体SpA抗原を提供する。有利な実施形態は、上に定義されたとおりである。

上述したように、EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011及びHlaの1、2、3、4又は好ましくは5個全てが、変異体SpAと組み合わせて使用され得る。このようにして、本発明の方法、使用、組成物及び抗原の組み合わせは、黄色ブドウ球菌感染症の予防又は治療に有効な免疫応答を誘発する。免疫応答は、抗体及び/又は細胞媒介免疫を含み得る。これらの使用及び方法によって哺乳動物において免疫応答を上昇させることによって、哺乳動物は、院内感染を含む黄色ブドウ球菌感染症に対して保護され得る。より具体的には、哺乳動物は、皮膚感染症、肺炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、毒素性ショック症候群、及び/又は敗血症に対して保護され得る。本発明はまた、哺乳動物の骨及び関節の黄色ブドウ球菌感染に対して保護するのに(並びにしたがって骨髄炎、敗血症性関節炎、及び人工関節感染症を含むがこれらに限定されない障害を予防するのに)有用である。多くの場合、これらの障害は、黄色ブドウ球菌バイオフィルムの形成に関連し得る。

黄色ブドウ球菌は、種々の哺乳動物(ウシ、イヌ、ウマ、及びブタを含む)に感染するが、本発明で使用するための好ましい哺乳動物はヒトである。ヒトは、小児(例えば、幼児又は乳児)、10代の若者又は成人であり得る。いくつかの実施形態では、ヒトは、人工骨若しくは関節を有していてもよく、又はそのような人工装具の将来のレシピエント(例えば、手術前の整形外科手術患者)であってもよい。小児のために意図されたワクチンは、例えば安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、成人に投与されてもよい。しかし、ワクチンは、これらの群のみに適したものではなく、ヒト集団においてより一般的に使用されてよい。

治療的処置の有効性を確認する1つの方法は、本発明に係る組成物又は抗原の投与後に黄色ブドウ球菌感染症をモニタリングすることを含む。予防的処置の有効性を確認する1つの方法は、その投与後に投与された組成物中の抗原に対する免疫応答を、全身的に(例えばIgG1及びIgG2a産生レベルをモニターすることなど)及び/又は粘膜的に(例えば、IgA産生のレベルをモニターすることなど)モニターすることを含む。組成物の免疫原性を評価する別の方法は、免疫ブロット及び/又はマイクロアレイによって患者の血清又は粘膜分泌物をスクリーニングするために組換え的に抗原を発現することである。タンパク質と患者サンプルの間の陽性反応は、患者が問題のタンパク質に対する免疫応答を高めていることを示す。

ワクチン組成物の有効性はまた、ワクチン組成物を用いて、黄色ブドウ球菌感染の動物モデル、例えば、モルモット又はマウスをチャレンジすることによって、in vivoで決定され得る。黄色ブドウ球菌感染症の研究のための3つの一般的に有用な動物モデル、すなわち、(i)マウス膿瘍モデル[21]、(ii)マウス致死感染モデル[21]、及び(iii)マウス肺炎モデル[22]がある。膿瘍モデルは、静脈内チャレンジ後のマウス腎臓における膿瘍を見る。致死感染モデルは、静脈内又は腹腔内経路によって通常致死量の黄色ブドウ球菌に感染された後に生き残るマウスの数を見る。肺炎モデルは、生存率も見るが、鼻腔内感染を使用する。さらなる有用なモデルは、バイオフィルム媒介インプラント感染、皮膚及び軟組織感染(SSTI)に関連した黄色ブドウ球菌疾患と、敗血症の両方の研究について参考文献23に開示される。有用なワクチンは、これらのモデルの1つ以上において有効であり得る。例えば、いくつかの臨床的状況では、血液拡散(hematic spread)を防止する必要なく、又はオプソニン作用を促進する必要なく、肺炎に対して防御することが望ましく、その他の状況において、主要な望みは、血液拡散又は敗血症を防止することであり得る。異なる抗原、及び異なる抗原の組み合わせは、有効なワクチンの異なる局面に寄与し得る。

組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射(例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、又は組織の間質腔への注射)、又は粘膜、例えば、直腸、経口(例えば、錠剤、噴霧剤)、膣、局所、経皮(transdermal)若しくは経皮(transcutaneous)、鼻腔内、眼、耳、肺又はその他の粘膜投与によって達成され得る。筋肉内注射は、本発明に係る組成物を投与するための最も一般的な経路である。

本発明は、全身及び/又は粘膜免疫を誘発するために、好ましくは増強された全身及び/又は粘膜免疫を誘発するために使用され得る。好ましくは、増強された全身及び/又は粘膜免疫は、増強されたTH1及び/又はTH2免疫応答に反映される。好ましくは、増強された免疫応答は、IgG1及び/又はIgG2a及び/又はIgAの産生の増加を含む。

投薬は、単回用量計画又は複数回用量計画によるものであり得る。複数回用量は、初回免疫化計画及び/又は追加免疫化計画で使用され得る。複数回用量計画において、様々な用量を、同じ又は異なる経路により与えてよく、例えば、非経口による初回免疫及び粘膜による追加免疫、粘膜による初回免疫及び非経口による追加免疫などがある。複数回用量は、典型的には、少なくとも1週間隔てて投与される(例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など)。

免疫原性組成物は、他のワクチンと実質的に同時に(例えば、医療専門家又はワクチン接種センターへの同一の医療相談又は訪問中に)患者に投与されてもよい。

免疫原性組成物は、抗生物質と組み合わせて患者に投与され得る。例えば、それらは、抗生物質と実質的に同時に投与され得る。同様に、それらは、抗生物質療法を受けている被験体に投与され得る。同様に、それらは、本明細書で説明される組成物と、抗生物質の両方の投与を含む併用療法の一部として投与され得る。抗生物質は、黄色ブドウ球菌の細菌に対して有効であり、例えばβ-ラクタムがある。

株及びバリアント
抗原は、既存の命名法(例えば「EsxA」)、並びにGI番号として及び配列表にも与えられた例示的な配列を参照することにより、上記で論じられる。本発明はこれらの正確な配列に限定されない。黄色ブドウ球菌のいくつかの株のゲノム配列が利用可能であり、例えば、MRSA株N315及びMu50[24]、MW2、N315、COL、MRSA252、MSSA476、RF122、USA300(非常に毒性の強い)、JH1、JH9、NCTC 8325、及びNewmanのものがある。標準的な検索及びアラインメント技術を使用して、これらの(又は他の)さらなるゲノム配列のいずれかにおいて、本明細書に記載の任意の特定の配列のホモログを同定することができる。さらに、本明細書中に開示される具体的な配列を使用して、他の株由来の相同配列の増幅のためのプライマーを設計することができる。したがって、本発明は、黄色ブドウ球菌の任意の株に由来するこのようなバリアント及びホモログ、並びに非天然バリアントを包含する。一般的に、特定の配列番号の好適なバリアントは、その対立遺伝子バリアント、その多型体、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その変異体等を含む。

したがって、例えば、本発明で使用されるポリペプチドは、本明細書中の配列番号と比較して、保存的置換(すなわち、あるアミノ酸の、関連側鎖を有する別のアミノ酸での置換)などの1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9個など)のアミノ酸置換を含み得る。遺伝子によりコードされるアミノ酸は、一般的に、4つのファミリーに分けられる: (1)酸性、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸; (2)塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン; (3)非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン; 及び(4)非荷電極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、一緒に芳香族アミノ酸として分類されることもある。一般的に、これらのファミリー内での単一アミノ酸の置換は、生物学的活性に対して大きな影響を有しない。ポリペプチドはまた、配列番号の配列に対して1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9個など)の単一アミノ酸欠失を含み得る。ポリペプチドはまた、配列番号の配列に対して1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9個など)の挿入(例えば、それぞれ、1、2、3、4又は5アミノ酸のもの)を含み得る。

同様に、本発明で使用されるポリペプチドは、
(a)配列表に開示されている配列と同一(すなわち、100％同一)のアミノ酸配列;
(b)配列表に開示されている配列と配列同一性(例えば、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％又はそれより多く)を有するアミノ酸配列(理想的には前記配列の全長にわたって);
(c)(a)又は(b)の配列と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個(あるいはそれより多く)の単一アミノ酸変化(欠失、挿入、置換)(これは、別々の位置にあってもよいし、又は連続的であってもよい)を有するアミノ酸配列;
(d)ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列表からの特定の配列とアラインメントさせた場合に、N末端からC末端へのxアミノ酸の各移動ウィンドウ(pアミノ酸(p＞x)にわたるアラインメントの場合、p−x＋1個のこのようなウィンドウが存在するように)が、少なくともx・y個の同一のアラインメントされたアミノ酸(xは、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200から選択され；ｙは、0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99から選択され；x・yが整数ではない場合、最も近い整数まで端数を切り上げる)を有するアミノ酸配列
を含み得る。好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータ(例えば、EBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用して、ギャップオープニングペナルティ＝10.0及びギャップ伸長ペナルティ＝0.5)を使用するNeedleman-Wunschグローバルアラインメントアルゴリズム[25]である。このアルゴリズムは、便利なことに、EMBOSSパッケージのneedleツールに実装されている[26]。

ハイブリッドポリペプチドが使用される場合、ハイブリッド内の個々の抗原(すなわち、個々の-X-部分)は、1つ以上の株に由来し得る。n=2の場合、例えば、X₂は、X₁と同じ株又は異なる株に由来し得る。n=3の場合、株は、(i)X₁=X₂=X₃、(ii)X₁=X₂≠X₃、(iii)X₁≠X₂=X₃、(iv)X₁≠X₂≠X₃又は(v)X₁=X₃≠X₂などであり得る。

群(c)のうち、欠失又は置換は、N末端及び/若しくはC末端にあってもよいし、又は2つの末端の間にあってもよい。したがって、トランケーションは、欠失の例である。トランケーションは、N末端及び/又はC末端における最大40アミノ酸(又はそれより多く)の欠失を含み得る。N末端トランケーションは、リーダーペプチドを除去し得る(例えば、異種宿主における組換え発現を促進するために)。C末端トランケーションは、アンカー配列を除去し得る(例えば、異種宿主における組換え発現を促進するために)。

一般的に、抗原が、配列表からの完全黄色ブドウ球菌配列と同一ではない配列を含む場合(例えば、抗原が、完全黄色ブドウ球菌配列と100％未満の配列同一性を有する配列表を含む場合、又は抗原がその断片を含む場合)、個々の各場合において、この抗原がそれぞれの完全黄色ブドウ球菌配列を認識する抗体を誘発し得ることが好ましい。

本発明で使用されるポリペプチド
本発明で使用されるポリペプチドは、様々な形態をとり得る(例えば、天然型、融合体、グリコシル化、非グリコシル化、脂質化、非脂質化、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化、非ミリストイル化、単量体、多量体等)。

本発明で使用されるポリペプチドは、様々な手段によって調製され得る(例えば、組換え発現、細胞培養からの精製、化学合成等)。組換え発現されたタンパク質は、特にハイブリッドポリペプチドの場合に、好ましい。

本発明で使用されるポリペプチドは、好ましくは、精製された形態又は実質的に精製された形態で提供され、すなわち、他のポリペプチドを実質的に含まず(例えば、天然に存在するポリペプチドを含まず)、特に、他のブドウ球菌又は宿主細胞のポリペプチドを実質的に含まず、一般に、少なくとも約50(重量)％純粋であり、通常、少なくとも約90％純粋であり、すなわち、組成物の約50％未満、より好ましくは、約10％未満(例えば、5％)が、他の発現ポリペプチドから構成されている。したがって、組成物中の抗原は、分子が発現されている生物全体から分離されている。

用語「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状であっても又は分岐状であってもよく、改変されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって分断されてもよい。この用語はまた、天然に改変された又は介入により; 例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化又は他の任意の操作若しくは改変、例えば、標識化成分とのコンジュゲーション、によって改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の1つ以上のアナログ(例えば、非天然アミノ酸などを含む)並びに当該分野で公知の他の改変を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、一本鎖又は会合された鎖として生じ得る。

本発明のポリペプチドの発現は、ブドウ球菌(Staphylococcus)で起こり得るが、本発明は、通常、発現(組換え発現)のための異種宿主を使用する。異種宿主は、原核生物(例えば細菌)又は真核生物であってもよい。これは、大腸菌であってもよいが、他の好適な宿主としては、枯草菌、コレラ菌、チフス菌、ネズミチフス菌、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)、マイコバクテリア(例えば、結核菌)、酵母等が挙げられる。本発明のポリペプチドをコードする野生型ブドウ球菌遺伝子と比較して、そのコードされたアミノ酸に影響を与えることなく、そのような宿主における発現効率を最適化するためにコドンを変更することが有用である。

アジュバント
上記のように、本発明に従って使用される免疫原性組成物は、1つ以上のアジュバントを含んでもよい。本発明で使用され得るアジュバントとしては、限定されないが
、以下を含む:

A. 無機物含有組成物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した無機物含有組成物は、アルミニウム塩及びカルシウム塩(又はその混合物)などの無機塩を含む。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム(例えば、参考文献27に開示されている「CAP」粒子)が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物及びリン酸塩などが挙げられ、塩は任意の適切な形態を取る(例えば、ゲル、結晶、アモルファス等)。これらの塩への吸着が好ましい(例えば、全ての抗原は吸着され得る)。無機物含有組成物はまた、金属塩の粒子として製剤化され得る[28]。

水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントが使用され得る。これらの名称は、慣習的なものであるが、便宜上のためにのみ使用され、いずれも、存在する実際の化合物の正確な記述ではない(例えば、参考文献29の第9章を参照)。本発明は、アジュバントとして一般に使用される「水酸化物」又は「リン酸塩」アジュバントのいずれも使用できる。「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、多くの場合、少量の硫酸塩も含有しているヒドロキシリン酸アルミニウムである(すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート)。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿中の反応条件及び濃度は、塩中のヒドロキシルに対するホスフェートの置換の程度に影響する。

水酸化アルミニウムアジュバントについて、繊維状の形態(例えば、透過型電子顕微鏡写真で観察されるような)が典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのpIは、典型的には約11であり、すなわちアジュバント自体は生理的pHにおいて正の表面電荷を有する。pH7.4においてAl⁺⁺⁺1mgあたり1.8〜2.6mgのタンパク質吸着能が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。

リン酸アルミニウムアジュバントは、一般的に、0.3〜1.2、好ましくは0.8〜1.2、より好ましくは0.95±0.1のPO₄/Alモル比を有する。リン酸アルミニウムは、ヒドロキシリン酸塩については特に、一般的に非晶質である。典型的なアジュバントは、0.84〜0.92のPO₄/Alモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、0.6mg Al³⁺/mlで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般的に粒子状である(例えば、透過型電子顕微鏡写真で観察されるようなプレート様の形態)。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後に、0.5〜20μmの範囲(例えば、約5〜10μm)である。pH7.4おいてAl⁺⁺⁺1mgあたり0.7〜1.5mgのタンパク質吸着能が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。

リン酸アルミニウムのゼロ電荷点(PZC)は、ヒドロキシルに対するホスフェートの置換の程度と反比例し、この置換の程度は、沈殿により塩を調製するのに使用される反応条件及び反応物の濃度に依存して変動し得る。PZCはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させること(より多いホスフェート＝より酸性側のPZC)、又はヒスチジン緩衝剤などの緩衝剤を加えること(PZCをより塩基性にする)により変更される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般的に、4.0〜7.0、より好ましくは5.0〜6.5、例えば約5.7のPZCを有する。

本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝剤(例えば、リン酸緩衝剤又はヒスチジン緩衝剤又はTris緩衝剤)を含有し得るが、これは常に必要というわけではない。懸濁物は、好ましくは、滅菌されており、発熱物質を含まない。懸濁物は、遊離の水性リン酸イオンを含み得、これは例えば、1.0〜20mM、好ましくは5〜15mM、より好ましくは約10mMの濃度で存在する。懸濁物は、塩化ナトリウムも含み得る。

本発明は、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムとの両方の混合物を使用し得る。この場合、リン酸アルミニウムは水酸化アルミニウムよりも多く存在してよく、例えば、少なくとも2:1、例えば≧5:1、≧6:1、≧7:1、≧8:1、≧9:1などの重量比であり得る。

患者に投与するための組成物中のAl⁺⁺⁺の濃度は、好ましくは10mg/ml未満、例えば、≦5mg/ml、≦4mg/ml、≦3mg/ml、≦2mg/ml、≦1mg/mlなどである。好ましい範囲は、0.3〜1mg/mlである。最大0.85mg/用量が好ましい。

B. 水中油型エマルジョン
本発明においてアジュバントとして使用するのに適切な水中油型エマルジョン組成物としては、水中スクアレン型エマルジョン、例えば、MF59(参考文献29の第10章を参照; 参考文献30も参照)及びAS03[31]が挙げられる。

様々な水中油型エマルジョンアジュバントが公知であり、これらは、典型的には、少なくとも1種類の油と少なくとも1種類の界面活性剤とを含み、この油及び界面活性剤は、生分解性(代謝可能)であり、生体適合性である。エマルジョンはサブミクロンの油滴を含み、220nm未満の直径を有する液滴を有するエマルジョンは、フィルター滅菌に供することができるので好ましい。

エマルジョンは、1種以上の油を含む。好適な油としては、例えば、動物(例えば、魚類)又は植物供給源由来のものが挙げられる。油は、理想的には、生分解性(代謝可能)であり、生体適合性である。植物油の供給源は、ナッツ、種子及び穀粒を含む。ピーナッツ油、大豆油、ココナッツ油及びオリーブ油が、最も一般的に入手可能であり、ナッツ油の例である。ホホバ油が使用され得る(例えば、ホホバ豆から得られる)。種子油として、紅花油、綿実油、ひまわり種子油、ごま油などが挙げられる。穀粒の群において、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、オート麦、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなどの他の穀類の穀粒の油も使用され得る。グリセロール及び1,2-プロパンジオールの6〜10炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然には存在しないが、ナッツ油及び種子油から出発する、適切な材料の加水分解、分離及びエステル化により調製され得る。哺乳動物の乳由来の脂肪及び油は代謝可能であるので、使用され得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化及び他の手段の手順は、当技術分野で周知である。

ほとんどの魚類は、容易に収集し得る代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油及び鯨ろうなどの鯨油は、本明細書に使用され得る魚油のいくつかの例である。いくつかの分岐鎖油が、5炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般に、テルペノイドと称される。好ましいエマルジョンは、スクアレン、サメ肝油を含み、これは、分岐不飽和テルペノイドである。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも使用され得る。スクアレン及びスクアランを含む魚油は、商業的な供給源から容易に入手可能であるか、又は当技術分野で公知の方法により得ることができる。

他の有用な油は、トコフェロールである(特にスクアレンとの組み合わせで)。エマルジョンの油相がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε又はζトコフェロールのいずれも使用することができるが、α-トコフェロールが好ましい。D-α-トコフェロール及びDL-α-トコフェロールは両方とも使用できる。好ましいα-トコフェロールは、DL-α-トコフェロールである。スクアレン及びトコフェロール(例えば、DL-α-トコフェロール)を含む油の組み合わせが使用され得る。

エマルジョン中の油は、油の組合せ、例えばスクアレン及び少なくとも1種の他の油、を含んでもよい。

エマルジョンの水性成分は、混ぜ物の無い水(例えばw.f.i.)であってよく、又はさらなる成分、例えば溶質を含んでもよい。例えば、それは、緩衝剤を形成する塩、例えばクエン酸塩又はリン酸塩、例えばナトリウム塩、を含み得る。典型的な緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、Tris緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、又はクエン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝化水相が好ましく、緩衝剤は、典型的には、5〜20mMの範囲で含まれる。

油及びカチオン性脂質に加えて、エマルジョンは、非イオン性界面活性剤及び/又は両性イオン性界面活性剤を含むことができる。このような界面活性剤としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる: ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(通常Tweenと呼ばれる)、特にポリソルベート20及びポリソルベート80; エチレンオキシド(EO)、プロピレンオキシド(PO)、及び/又はブチレンオキシド(BO)のコポリマー(商品名DOWFAX(商標)で販売されている、例えば、直鎖状EO/POブロックコポリマー); オクトキシノール(エトキシ(オキシ-1,2-エタンジイル)基の繰り返し数が変動し得る)(オクトキシノール-9(Triton X-100、又はt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)は特に関心がある); (オクチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール(IGEPAL CA-630/NP-40); リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン(レシチン); ラウリル、セチル、ステアリル、及びオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル(Brij界面活性剤として公知である)、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル(Brij 30); ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル; 並びにソルビタンエステル(通常Spanとして公知である)、例えば、ソルビタントリオレエート(Span 85)及びソルビタンモノラウレート。エマルジョンに含まれる好ましい界面活性剤は、ポリソルベート80(Tween 80; ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)、Span 85(ソルビタントリオレエート)、レシチン、及びTriton X-100である。

界面活性剤の混合物、例えばTween 80/Span 85混合物、又はTween 80/Triton-X100混合物を使用し得る。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80)などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、t-オクチルフェノキシ-ポリエトキシエタノール(Triton X-100)などのオクトキシノールとの組み合わせも好適である。別の有用な組み合わせは、ラウレス9とポリオキシエチレンソルビタンエステル及び/又はオクトキシノールを含む。有用な混合物は、10〜20の範囲のHLB値を有する界面活性剤(例えば、15.0のHLBを有するポリソルベート80)、及び1〜10の範囲のHLB値を有する界面活性剤(例えば、1.8のHLBを有するソルビタントリオレエート)を含み得る。

最終エマルジョン中の油の好ましい量(体積％)は、2〜20％、例えば、5〜15％、6〜14％、7〜13％、8〜12％である。約4〜6％又は約9〜11％のスクアレン含有量が特に有用である。

最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量(重量％)は、0.001％〜8％である。例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル(例えば、ポリソルベート80)0.2〜4％、特に、0.4〜0.6％、0.45〜0.55％、約0.5％又は1.5〜2％、1.8〜2.2％、1.9〜2.1％、約2％、又は0.85〜0.95％、又は約1％; ソルビタンエステル(例えば、ソルビタントリオレエート)0.02〜2％、特に約0.5％又は約1％; オクチル-若しくはノニルフェノキシポリオキシエタノール(例えば、Triton X-100)0.001〜0.1％、特に0.005〜0.02％; ポリオキシエチレンエーテル(例えば、ラウレス9)0.1〜8％、好ましくは0.1〜10％及び特に0.1〜1％又は約0.5％。

油及び界面活性剤の絶対量、及びそれらの比は、依然としてエマルジョンを形成しながら、広い範囲内で変えることができる。当業者は、所望のエマルジョンを得るために、成分の相対比率を容易に変化させることができるが、油と界面活性剤の4：1〜5：1の重量比は、典型的である(過剰な油)。

エマルジョンの免疫刺激活性を確実にするための重要なパラメーターは、特に大型動物では、油滴サイズ(直径)である。最も効果的なエマルジョンは、サブミクロン範囲の液滴サイズを有する。適切には、液滴サイズは、50〜750nmの範囲にある。最も有用には、平均液滴サイズは、250nm未満、例えば、200nm未満、150nm未満である。平均液滴サイズは、有用には、80〜180nmの範囲内である。理想的には、エマルジョンの油滴の少なくとも80％(数による)が、直径250nm未満であり、好ましくは少なくとも90％がそうである。これらの液滴サイズは、好都合には、マイクロフルイダイゼーションなどの技術によって達成され得る。エマルジョンの平均液滴サイズ、及びサイズ分布を決定するための装置は、市販されている。これらは、典型的には、動的光散乱及び/又は単一粒子光学検知の技術を使用し、例えば、Particle Sizing Systems(Santa Barbara, USA)から入手できるAccusizer(商標)及びNicomp(商標)シリーズの装置、又はMalvern Instruments(UK)からZetasizer(商標)装置、又はHoriba(京都、日本)からParticle Size Distribution Analyzer装置を使用する。

理想的には、液滴サイズの分布(数による)は、たった1つの最大を有し、すなわち、平均(モード)の周りに分布した液滴の単一の集団が存在し、2つの最大を有するのではない。好適なエマルジョンは、＜0.4、例えば0.3、0.2又はそれ未満の多分散性を有する。

本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントは、以下のものを含むがこれらに限定されない:

・スクアレン、Tween 80、及びSpan 85のサブミクロンエマルジョン。体積によるエマルジョンの組成は、約5％のスクアレン、約0.5％のポリソルベート80、及び約0.5％のSpan 85であり得る。重量では、これらの比は4.3％のスクアレン、0.5％のポリソルベート80、及び0.48％のSpan 85になる。このアジュバントは、「MF59」として公知であり[32〜34]、参考文献35の第10章、及び参考文献36の第12章でより詳細に記載されている。MF59エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば10mMのクエン酸ナトリウム緩衝剤を有利に含む。

・スクアレン、トコフェロール、及びポリソルベート80を含むエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。これらのエマルジョンは、体積で2〜10％のスクアレン、2〜10％のトコフェロール、及び0.3〜3％のポリソルベート80を有してよく、スクアレン:トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンを生じ得るので、好ましくは＜1(例えば0.90)である。スクアレン及びポリソルベート80は、約5:2の体積比、又は約11:5の重量比で存在し得る。したがって、3つの成分(スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート80)は、1068:1186:485又は約55:61:25の重量比で存在し得る。1つのそのようなエマルジョン(「AS03」)を、Tween 80をPBS中に溶解して2％の溶液を生じ、次いで90mlのこの溶液を、(5gのDL α トコフェロール及び5mlのスクアレン)の混合物と混合し、次いでその混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製し得る。得られたエマルジョンは、サブミクロン、例えば100〜250nm、好ましくは約180nmの平均直径を有する油滴を有し得る。そのエマルジョンはまた、3-脱-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3d MPL)も含み得る。別の有用なこの型のエマルジョンは、ヒトの1用量あたり、0.5〜10mgのスクアレン、0.5〜11mgのトコフェロール、及び0.1〜4mgのポリソルベート80を、例えば上述の比で、含み得る[37]。

・スクアレン、トコフェロール、及びTriton洗浄剤(例えばTriton X-100)のエマルジョン。このエマルジョンはまた、3d-MPLも含み得る(以下を参照)。このエマルジョンは、リン酸緩衝剤を含有し得る。

・ポリソルベート(例えばポリソルベート80)、Triton洗浄剤(例えばTriton X-100)及びトコフェロール(例えばα-トコフェロールスクシネート)を含むエマルジョン。このエマルジョンは、これらの3つの成分を、約75:11:10の質量比で含み得(例えば750μg/mlのポリソルベート80、110μg/mlのTriton X-100、及び100μg/mlのα-トコフェロールスクシネート)、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分の任意の寄与も含むものとする。このエマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。このエマルジョンはまた、3d-MPLも含み得る(以下を参照)。水相は、リン酸緩衝剤を含み得る。

・スクアラン、ポリソルベート80及びポロキサマー401(「Pluronic(商標)L121」)のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4中で製剤化され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達ビヒクルであり、スレオニル-MDPと共に「SAF-1」アジュバント中で用いられている[38](0.05〜1％Thr-MDP、5％スクアラン、2.5％Pluronic L121及び0.2％ポリソルベート80)。これは、「AF」アジュバントにおけるようにThr-MDPなしでも使用され得る[39](5％スクアラン、１．25％Pluronic L121及び0.2％ポリソルベート80)。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。

・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤(例えば、ポリオキシエチレン(12)セトステアリルエーテル)及び疎水性非イオン性界面活性剤(例えば、ソルビタンモノオレエート又は「Span 80」などのソルビタンエステル又はマンニドエステル)を含むエマルジョン。エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、及び/又は少なくとも90％の油滴(体積による)が200nm未満のサイズである[40]。このエマルジョンは、以下の1つ以上も含み得る: アルジトール、凍結保護剤(例えば、ドデシルマルトシド及び/又はスクロースなどの糖)、及び/又はアルキルポリグリコシド。このエマルジョンは、TLR4アゴニストを含み得る[41]。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。

・スクアレン、ポロキサマー105及びAbil-Careのエマルジョン[42]。アジュバント化されたワクチンにおけるこれらの成分の最終濃度(重量)は、5％スクアレン、4％ポロキサマー105(プルロニックポリオール)及び2％Abil-Care 85(ビス-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16ジメチコン; カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド)である。

・0.5〜50％の油、0.1〜10％のリン脂質及び0.05〜5％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献43に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン及びカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。

・代謝不可能油(例えば、軽油)及び少なくとも1種類の界面活性剤(例えば、レシチン、Tween 80又はSpan 80)のサブミクロンの水中油型エマルジョン。QuilAサポニン、コレステロール、サポニン親油性コンジュゲート(例えば、脂肪族アミンをデスアシルサポニンに、グルクロン酸のカルボキシル基を介して付加することにより生産される、参考文献44に記載されているGPI-0100)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(dimethyidioctadecylammonium)ブロミド及び/又はN,N-ジオクタデシル-N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)プロパンジアミンなどの添加物を含み得る。

・サポニン(例えば、QuilA又はQS21)及びステロール(例えば、コレステロール)が、らせん状ミセルとして会合しているエマルジョン[45]。

・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール及び非イオン性親水性界面活性剤(例えば、エトキシル化脂肪アルコール及び/又はポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー)を含むエマルジョン[46]。

・鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコール及び非イオン性親油性界面活性剤(例えば、エトキシル化脂肪アルコール及び/又はポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックコポリマー)を含むエマルジョン[46]。

いくつかの実施形態では、エマルジョンを送達時に抗原(複数可)と即時に混合し得るので、アジュバント及び抗原(複数可)は、使用時の最終的な製剤化のために準備された、パッケージ化又は分配されたワクチンにおいて別々に保存され得る。他の実施形態では、エマルジョンは、製造中に抗原と混合され、したがって、組成物は、液体アジュバント化形態でパッケージ化される。抗原は、一般的に、ワクチンが2つの液体を混合することにより最終的に調製されるように水性の形態にある。混合するための2つの液体の体積比は変動し得る(例えば、5：1〜1：5)が、一般的には約1：1である。成分の濃度が具体的なエマルジョンに関する上記説明に示されている場合、これらの濃度は、典型的に、希釈されていない組成物についてのものであるので、抗原溶液と混合した後の濃度は減少する。

C. サポニン製剤[参考文献29の第22章]
サポニン製剤はまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根及び花でさえも見出されるステロールグリコシド及びトリテルペノイドグリコシドの異種群である。キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaia saponaria Molina)の木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンは、スミラックス・オルナタ(Smilax ornata)(サルサパリラ(sarsaprilla))、ジプソフィラ・パニキュラータ(Gypsophilla paniculata)(ブライズヴェイル(brides veil))及びサポナリア・オフィシアナリス(Saponaria officianalis)(ソープルート(soap root))から商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント製剤としては、QS21などの精製製剤及びISCOMなどの脂質製剤が挙げられる。QS21は、Stimulon(商標)として市販されている。

サポニン組成物は、HPLC及びRP-HPLCを使用して精製されている。これらの技術を使用した具体的な精製画分(QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B及びQH-Cを含む)が同定されている。好ましくは、サポニンはQS21である。QS21の生産方法は、参考文献47に開示されている。サポニン製剤は、コレステロールなどのステロールも含み得る[48]。

サポニンとコレステロールとの組み合わせを使用して、ISCOMと称される粒子を形成し得る[参考文献29の第23章]。ISCOMはまた、典型的には、ホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルコリンなどのリン脂質を含む。任意の公知のサポニンがISCOMで使用され得る。好ましくは、ISCOMは、QuilA、QHA及びQHCの1つ以上を含む。ISCOMは、参考文献48〜50にさらに記載されている。場合により、ISCOMSは、さらなる洗浄剤を欠いていてもよい[51]。

サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、参考文献52及び53に見出すことができる。

D. 細菌又は微生物の誘導体
本発明で使用するのに適切なアジュバントとしては、細菌又は微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖(LPS)の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチド並びにADP-リボシル化毒素及びその解毒化誘導体が挙げられる。

LPSの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドA(MPL)及び3-O-脱アシル化MPL(3dMPL)が挙げられる。3dMPLは、4個、5個又は6個のアシル化された鎖を有する3脱-O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。3脱-O-アシル化モノホスホリルリピドAの好ましい「小粒子」の形態は、参考文献54に開示されている。3dMPLのこのような「小粒子」は、0.22μmの膜を通して滅菌ろ過されるために十分小さい[54]。他の非毒性LPS誘導体としては、モノホスホリルリピドA模倣物、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えば、RC-529が挙げられる(以下を参照)。

リピドA誘導体としては、大腸菌(Escherichia coli)由来のリピドAの誘導体、例えばOM-174が挙げられる。OM-174は、例えば参考文献55及び56に記載されている。

本発明においてアジュバントとして使用するのに適切な免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、CpGモチーフ(リン酸結合によりグアノシンと連結された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列)を含有するヌクレオチド配列が挙げられる。二本鎖RNA、及びパリンドローム若しくはポリ(dG)配列を含有するオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示されている。

CpGは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾/類似体を含むことができ、二本鎖又は一本鎖であり得る。参考文献57、58及び59は、可能性のある類似体置換、例えば2'-デオキシ-7-デアザグアノシンでのグアノシンの置換を開示している。CpGオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献60〜65においてさらに論じられている。

CpG配列は、モチーフGTCGTT又はTTCGTTなど、TLR9に指向性を有し得る[66]。CpG配列は、CpG-A ODNなど、Th1免疫応答を誘導するのに特異的であり得るか、又はCpG-B ODNなど、B細胞応答を誘導するのにより特異的であり得る。CpG-A及びCpG-B ODNは、参考文献67〜69において論じられている。好ましくは、CpGは、CpG-A ODNである。

好ましくは、CpGオリゴヌクレオチドは、受容体認識のために5'末端がアクセス可能であるように構築される。場合により、2つのCpGオリゴヌクレオチド配列をそれらの3'末端で結合させて、「イムノマー」を形成し得る。例えば、参考文献66及び70〜72を参照のこと。

有用なCpGアジュバントは、ProMune(商標)(Coley Pharmaceutical Group, Inc.)としても公知のCpG7909である。別のものは、CpG1826である。CpG配列を使用する代わりに又はそれに加えて、TpG配列を使用することができ[73]、これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化CpGモチーフを含まなくてもよい。免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ピリミジンリッチであり得る。例えば、これは、2つ以上の連続チミジンヌクレオチド(例えば、参考文献73に開示されるようなTTTT)を含み得、及び/又はこれは、＞25％チミジン(例えば、＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％など)を有するヌクレオチド組成を有し得る。例えば、これは、2つ以上の連続シトシンヌクレオチド(例えば、参考文献73に開示されるようなCCCC)を含み得、及び/又はこれは、＞25％シトシン(例えば、＞35％、＞40％、＞50％、＞60％、＞80％など)を有するヌクレオチド組成を有し得る。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化CpGモチーフを含まなくてもよい。免疫刺激オリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも20個のヌクレオチドを含む。これらは、100個未満のヌクレオチドを含み得る。

免疫刺激オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、IC-31(商標)として公知である[74]。したがって、本発明で使用されるアジュバントは、(i)少なくとも1つ(好ましくは複数)のCpIモチーフ(すなわち、イノシンと連結されてジヌクレオチドを形成するシトシン)を含むオリゴヌクレオチド(例えば、15〜40個のヌクレオチド)、及び(ii)少なくとも1つ(好ましくは複数)のLys-Arg-Lysトリペプチド配列(複数可)を含むオリゴペプチド(例えば、5〜20個のアミノ酸)などのポリカチオン性ポリマー、の混合物を含み得る。オリゴヌクレオチドは、26マーの配列5'-(IC)₁₃-3'(配列番号41)を含むデオキシヌクレオチドであり得る。ポリカチオン性ポリマーは、11マーのアミノ酸配列KLKLLLLLKLK(配列番号42)を含むペプチドであってもよい。オリゴヌクレオチド及びポリマーは、例えば参考文献75及び76に開示されるように、複合体を形成することができる。

細菌ADPリボシル化毒素及びその解毒化誘導体は、本発明においてアジュバントとして使用され得る。好ましくは、タンパク質は、大腸菌(大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「LT」)、コレラ(「CT」)又は百日咳(「PT」)に由来する。解毒化ADPリボシル化毒素を粘膜アジュバントとして使用することは、参考文献77に記載され、非経口アジュバントとして使用することは、参考文献78に記載されている。毒素又はトキソイドは、好ましくは、A及びBのサブユニットをともに含むホロ毒素の形態にある。好ましくは、Aサブユニットは解毒化変異を含有し、好ましくは、Bサブユニットは変異されていない。好ましくは、アジュバントは、LT-K63、LT-R72及びLT-G192などの解毒化LT変異体である。アジュバントとしてADPリボシル化毒素及びその解毒化誘導体、特に、LT-K63及びLT-R72を使用することは、参考文献79〜86で見出すことができる。有用なCT変異体は、又はCT-E29Hである[87]。アミノ酸置換についての数字の参照は、好ましくは、参考文献88(その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる)に示されるADPリボシル化毒素のA及びBサブユニットのアラインメントに基づく。

E. TLRアゴニスト
組成物は、TLRアゴニスト、すなわち、Toll様受容体をアゴナイズすることができる化合物を含み得る。最も好ましくは、TLRアゴニストは、ヒトTLRのアゴニストである。TLRアゴニストは、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、又はTLR11のいずれかを活性化することができる; 好ましくは、ヒトTLR4又はヒトTLR7を活性化することができる。

任意の特定のToll様受容体に対する、化合物のアゴニスト活性は、標準的なアッセイによって測定することができる。Imgenex及びInvivogenなどの会社は、TLR活性化経路を測定するために、ヒトTLR遺伝子及びNFκBに加えて、適当なレポーター遺伝子によって安定に同時トランスフェクトされる細胞株を供給する。それらは、感度、幅広い動作範囲動態を求めてデザインされており、ハイスループットスクリーニングに使用することができる。1つ又は2つの特定のTLRの構成的発現は、そのような細胞株に特徴的である。参考文献89も参照されたい。多くのTLRアゴニストが当技術分野で知られているが、例えば、参考文献90は、TLR2アゴニストである特定のリポペプチド分子を記載し、参考文献91〜94はそれぞれ、TLR7の小分子アゴニスト類を記載し、参考文献95及び96は疾患治療のためのTLR7及びTLR8アゴニストを記載する。

本発明で使用されるTLRアゴニストは、理想的には、少なくとも1つの吸着部分を含む。TLRアゴニスト中にそのような部分を含むことは、それらが不溶性アルミニウム塩に吸着することを可能にし(例えばリガンド交換又は任意の他の適切な機構によって)、それらの免疫学的挙動を改善する[97]。リン含有吸着部分は、特に有用であり、そのため、吸着部分は、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、ホスホナイト、ホスフィナイト等を含んでよい。好ましくは、TLRアゴニストは、少なくとも1つのホスホネート基を含む。

したがって、好ましい実施形態では、組成物は、ホスホネート基を含むTLRアゴニスト(より好ましくはTLR7アゴニスト)を含む。このホスホネート基は、アゴニストの、不溶性アルミニウム塩への吸着を可能にする[97]。

本発明で有用なTLRアゴニストは、1つの吸着部分を含んでもよく、又は2つ以上、例えば、2〜15個の吸着部分を含んでもよい。典型的には、化合物は、1、2、又は3つの吸着部分を含む。

有用なリン含有TLRアゴニストは、式(A1)で表すことができる:

[式中、
R^X及びR^Yは、独立して、H及びC₁-C₆アルキルから選択され、
Xは、共有結合、O、及びNHから選択され、
Yは、共有結合、O、C(O)、S、及びNHから選択され、
Lはリンカーであって、例えば、C₁-C₆アルキレン、C₁-C₆アルケニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、C₁-C₆アルキレンオキシ、及び-((CH₂)_pO)_q(CH₂)_p-から選択されるが、それぞれ1〜4個の置換基で置換されていてもよく、置換基はハロ、OH、C₁-C₄アルキル、-OP(O)(OH)₂及びP(O)(OH)₂から独立して選択され、
それぞれのpは、1、2、3、4、5、及び6から独立して選択され、
qは、1、2、3、及び4から選択され、
nは、1、2、及び3から選択され、且つ
AはTLRアゴニスト部分である。]

一実施形態では、式(A1)のTLRアゴニストは、次のとおりである: R^X及びR^YはHであり、XはOであり、LはC₁-C₆アルキレン及び-((CH₂)_pO)_q(CH₂)_p-から選択されるが、それぞれ1〜2個のハロゲン原子で置換されていてもよく、pは1、2、及び3から選択され、qは1及び2から選択され、並びにnは1である。したがって、これらの実施形態では、吸着部分はホスフェート基を含む。

式(A1)の他の有用なTLRアゴニストは、参考文献98の6〜13頁に開示されている。

組成物は、イミダゾキノロン化合物、例えばイミキモド(「R-837」)[99、100]、レシキモド(「R-848」)[101]、及びそれらの類似体及びそれらの塩(例えば塩酸塩)を含み得る。免疫刺激性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献102〜106に見出され得る。

組成物は、TLR4アゴニスト、最も好ましくはヒトTLR4アゴニストを含み得る。TLR4は、従来の樹状細胞及びマクロファージ含む先天性免疫系の細胞によって発現される[107]。TLR4を介したトリガーは、MyD88-依存性経路及びTRIF-依存性経路の両方を利用するシグナル伝達カスケードを誘導し、それぞれNF-κB及びIRF3/7の活性化につながる。TLR4の活性化は、典型的には、強固なIL-12p70産生を誘導し、Th1型細胞性及び体液性免疫応答を強く増強する。

種々の有用なTLR4アゴニストは、当該技術分野で知られており、その多くは、エンドトキシン又はリポ多糖(LPS)の類似体である。例えば、TLR4アゴニストは以下であってもよい: 3d-MPL(すなわち3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA; GSKの「AS04」アジュバント中に存在し、さらなる詳細は参考文献108〜111にある)、グルコピラノシルリピドA(GLA)[112]又はそのアンモニウム塩; アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、例えば、RC-529又はCRX-524[113〜115]; E5564[116、117];又は参考文献118に定義される式I、II若しくはIIIの化合物、又はその塩、例えば、化合物「ER 803058」、「ER 803732」、「ER 804053」、「ER 804058」、「ER 804059」、「ER 804442」、「ER 804680」、「ER 803022」、「ER 804764」又は「ER 804057」(E6020としても知られる)。

本発明は、例えば、式(K)の化合物などの、ヒトTLR7アゴニストを使用する場合、特に有用である。これらのアゴニストは、参考文献119に詳細に説明される。

[式中、
R¹は、H、C₁-C₆アルキル、-C(R⁵)₂OH、-L¹R⁵、-L¹R⁶、-L²R⁵、-L²R⁶、-OL²R⁵、又は-OL²R⁶であり、
L¹は、-C(O)-又は-O-であり、
L²は、C₁-C₆アルキレン、C₂-C₆アルケニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン又は-((CR⁴R⁴)_pO)_q(CH₂)_p-であり、ここで、L²のC₁-C₆アルキレン及びC₂-C₆アルケニレンは、1〜4個のフルオロ基で置換されていてもよく、
それぞれのL³は、独立して、C₁-C₆アルキレン及び-((CR⁴R⁴)_pO)_q(CH₂)_p-から選択され、ここで、L³のC₁-C₆アルキレンは、1〜4個のフルオロ基で置換されていてもよく、
L⁴は、アリーレン又はヘテロアリーレンであり、
R²は、H又はC₁-C₆アルキルであり、
R³は、C₁-C₄アルキル、-L³R⁵、-L¹R⁵、-L³R⁷、-L³L⁴L³R⁷、-L³L⁴R⁵、-L³L⁴L³R⁵、-OL³R⁵、-OL³R⁷、-OL³L⁴R⁷、-OL³L⁴L³R⁷、-OR⁸、-OL³L⁴R⁵、-OL³L⁴L³R⁵及び-C(R⁵)₂OHから選択され、
それぞれのR⁴は、独立して、H及びフルオロから選択され、
R⁵は、-P(O)(OR⁹)₂であり、
R⁶は、-CF₂P(O)(OR⁹)₂又は-C(O)OR¹⁰であり、
R⁷は、-CF₂P(O)(OR⁹)₂又は-C(O)OR¹⁰であり、
R⁸は、H又はC₁-C₄アルキルであり、
それぞれのR⁹は、独立して、H及びC₁-C₆アルキルから選択され、
R¹⁰は、H又はC₁-C₄アルキルであり、
それぞれのpは、独立して、1、2、3、4、5及び6から選択され、且つ
qは、1、2、3又は4である。]

式(K)の化合物は、式(K')であることが好ましい。

[式中、
P¹は、H、COOHで置換されていてもよいC₁-C₆アルキル、及び-Y-L-X-P(O)(OR^X)(OR^Y)から選択され、
P²は、H、C₁-C₆アルキル、C₁-C₆アルコキシ及び-Y-L-X-P(O)(OR^X)(OR^Y)から選択され、
但し、P¹及びP²の少なくとも1つは-Y-L-X-P(O)(OR^X)(OR^Y)であることを条件とし、
R^Bは、H及びC₁-C₆アルキルから選択され、
R^X及びR^Yは、独立して、H及びC₁-C₆アルキルから選択され、
Xは、共有結合、O及びNHから選択され、
Yは、共有結合、O、C(O)、S及びNHから選択され、
Lは、共有結合、C₁-C₆アルキレン、C₁-C₆アルケニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、C₁-C₆アルキレンオキシ及び-((CH₂)_pO)_q(CH₂)_p-から選択され、それぞれは、1〜4個の置換基で置換されていてもよく、置換基は、独立して、ハロ、OH、C₁-C₄アルキル、-OP(O)(OH)₂及び-P(O)(OH)₂から選択され、
それぞれのpは、独立して、1、2、3、4、5及び6から選択され、且つ
qは、1、2、3及び4から選択される。]

式(K')のいくつかの実施形態では、P¹はCOOHで置換されていてもよいC₁-C₆アルキル、及び-Y-L-X-P(O)(OR^X)(OR^Y)から選択され、P²はC₁-C₆アルコキシ及び-Y-L-X-P(O)(OR^X)(OR^Y)から選択され、R^BはC₁-C₆アルキルであり、Xは共有結合であり、LはC₁-C₆アルキレン及び-((CH₂)_pO)_q(CH₂)_p-から選択され、それぞれは、1〜4個の置換基で置換されていてもよく、置換基は、独立して、ハロ、OH、C₁-C₄アルキル、-OP(O)(OH)₂及び-P(O)(OH)₂から選択され、それぞれのpは、独立して、1、2及び3から選択され、qは、1及び2から選択される。

本発明で用いる式(K)の好ましい化合物は、3-(5-アミノ-2-(2-メチル-4-(2-(2-(2-ホスホノエトキシ)エトキシ)エトキシ)フェネチル)ベンゾ[f][1,7]ナフチリジン-8-イル)プロパン酸又は化合物「K1」である。

この化合物は、遊離塩基として、又は薬学的に許容可能な塩、例えばアルギニン塩の形態で、使用され得る[120]。

F. 微粒子
微粒子はまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。生分解性且つ非毒性の材料(例えば、ポリ(α-ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど)と、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)とから形成される微粒子(すなわち、直径約100nm〜約150μm、より好ましくは、直径約200nm〜約30μm、最も好ましくは、直径約500nm〜約10μmの粒子)が、好ましく、場合により、処理されて、(例えば、SDSによる)負に荷電した表面又は(例えば、カチオン性洗剤、例えば、CTABによる)正に荷電した表面を有する。

アジュバントの組み合わせ
上記の個々のアジュバントはまた、組み合わせで含まれてもよい。例えば、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムアジュバントとの組み合わせを使用することができる。同様に、リン酸アルミニウムと3dMPLとの組み合わせを使用してもよい。

参考文献5及び97に開示されているように、特に好ましいアジュバントの組合せは、不溶性金属塩(例えば、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム)、及びTLRアゴニスト(例えば、ヒトTLR7アゴニスト、例えば、上に同定される化合物「K1」)である。そのため、特に、前記アジュバントは、以下からなる群から選択される:
- アルミニウム塩、特に水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、
- ヒトTLRアゴニスト、特にTLR7アゴニスト、及び
- それらの混合物。

TLRアゴニストは、好ましくは、金属塩に吸着され、黄色ブドウ球菌抗原(複数可)はまた、金属塩に吸着され得る。

金属塩に吸着された本発明のTLRアゴニストを含む組成物はまた、緩衝剤(例えば、リン酸又はヒスチジン又はTris緩衝剤)を含むことができる。しかしながら、このような組成物がリン酸緩衝剤を含む場合、緩衝剤中のリン酸イオンの濃度は、50mM未満、例えば＜40mM、＜30mM、＜20mM、＜10mM、若しくは＜5mM、又は1〜15mMであることが好ましい。ヒスチジン緩衝剤は、例えば、1〜50mM、5〜25mM又は約10mMが好ましい。

組成物は、オキシ水酸化アルミニウム及びヒドロキシリン酸アルミニウムの両方の混合物を含むことができ、TLRアゴニストは、これらの塩の1つ又は両方に吸着され得る。

上記のように、最大0.85mg/用量のAl⁺⁺⁺が好ましい。TLRアゴニストを含めることは、アルミニウム塩のアジュバント効果を改善し得るため、本発明は、有利には、用量あたりのAl⁺⁺⁺のより低い量を可能にし、そのため、組成物は、単位用量あたり10〜250μgのAl⁺⁺⁺を有用に含むことができる。現在の小児用ワクチンは、典型的には少なくとも300μgのAl⁺⁺⁺を含む。濃度に関して、組成物は、10〜500μg/ml、例えば10〜300μg/ml、10〜200μg/ml、又は10〜100μg/mlのAl⁺⁺⁺濃度を有し得る。

一般的に、組成物がTLRアゴニストとアルミニウム塩の両方を含む場合、アゴニストのAl⁺⁺⁺に対する重量比は、5:1未満、例えば、4:1未満、3:1未満、2:1未満、又は1:1未満である。したがって、例えば、0.5mg/mlのAl⁺⁺⁺濃度では、TLRアゴニストの最大濃度は、1.5mg/mlとなる。しかし、より高い又はより低いレベルを使用することができる。

組成物がTLRアゴニストと不溶性金属塩を含む場合、組成物中のアゴニストの少なくとも50％(質量による)、例えば、≧60％、≧70％、≧80％、≧85％、≧90％、≧92％、≧94％、≧95％、≧96％、≧97％、≧98％、≧99％、又はさらには100％が、金属塩に吸着されることが好ましい。

したがって、一実施形態では、本発明は、以下を含む免疫原性組成物を使用する:
・水酸化アルミニウムアジュバント、
・式(K)のTLR7アゴニスト、例えば化合物K1、
・配列番号6、又は最大5個の単一アミノ変化によって配列番号6とは異なる改変アミノ酸配列、を含む第一ポリペプチド(但し、改変配列は、配列番号6からなるポリペプチドに結合する抗体を誘発できることを条件とする)、
・配列番号13、又は最大5個の単一アミノ変化によって配列番号13とは異なる改変アミノ酸配列、を含む第二ポリペプチド(但し、改変配列は、配列番号13からなるポリペプチドに結合する抗体を誘発できることを条件とする)、
・配列番号31、又は最大5個の単一アミノ変化によって配列番号31とは異なる改変アミノ酸配列、を含む第三ポリペプチド(但し、改変配列は、配列番号31からなるポリペプチドに結合する抗体を誘発できることを条件とする)、
・配列番号33、又は最大5個の単一アミノ変化によって配列番号33とは異なる改変アミノ酸配列、を含む第四ポリペプチド(但し、改変配列は、配列番号33からなるポリペプチドに結合する抗体を誘発できることを条件とする)、及び
・配列番号45、又は最大5個の単一アミノ変化によって配列番号45とは異なる改変アミノ酸配列、を含む第五ポリペプチド(但し、改変配列は、配列番号43からなるポリペプチドに結合する抗体を誘発できることを条件とする)、且つ
ここで、TLR7アゴニスト及び/又は、ポリペプチドの少なくとも1つは、水酸化アルミニウムアジュバントに吸着される。

例えば、本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、第一ポリペプチドは配列番号34を含むことができ、第二ポリペプチドは配列番号13を含むことができ、第三ポリペプチドは配列番号40を含むことができ、第四ポリペプチドは配列番号36を含むことができ、第五ポリペプチドは配列番号45を含むことができ、場合により最大3個のアミノ酸置換によって改変される(配列番号44においてXである位置以外)。したがって、組成物は、配列番号37、27、38、39、及び45(配列番号45が上述のように最大3個のアミノ酸置換によって改変され得ることを除く)を有する5個のポリペプチドの混合物を使用し得る。

化学基
他に特に定義されていない限り、本明細書に述べる化学基は、本明細書で使用する場合には以下の意味を有する。

用語「アルキル」は、飽和炭化水素残基を含み、以下のものが含まれる。
・最大10原子(C₁-C₁₀)、又は最大6原子(C₁-C₆)、又は最大4原子(C₁-C₄)の直鎖基。このようなアルキル基の例としては、限定されるものではないが、C₁-メチル、C₂-エチル、C₃-プロピル及びC₄-n-ブチルが挙げられる。
・3〜10原子(C₃-C₁₀)、又は最大7原子(C₃-C₇)、又は最大4原子(C₃-C₄)の分岐基。このようなアルキル基の例としては、限定されるものではないが、C₃-イソ-プロピル、C₄-sec-ブチル、C₄-イソ-ブチル、C₄-tert-ブチル及びC₅-ネオ-ペンチルが挙げられる。

用語「アルキレン」は、アルキル基から誘導される二価炭化水素基を意味し、上記の定義に従って解釈されるものとする。

用語「アルケニル」は、一不飽和炭化水素残基を意味し、以下のものが含まれる。
・2〜6原子(C₂-C₆)の直鎖基。このようなアルケニル基の例としては、限定されるものではないが、C₂-ビニル、C₃-1-プロペニル、C₃-アリル、C₄-2-ブテニルが挙げられる。
・3〜8原子(C₃-C₈)の分岐基。このようなアルケニル基の例としては、限定されるものではないが、C₄-2-メチル-2-プロペニル及びC₆-2,3-ジメチル-2-ブテニルが挙げられる。

用語アルケニレンは、アルケニル基から誘導される二価炭化水素基を意味し、上記の定義に従って解釈されるものとする。

用語「アルコキシ」は、O-結合炭化水素残基を含み、以下のものが含まれる。
・1〜6原子(C₁-C₆)、又は1〜4原子(C₁-C₄)の直鎖基。このようなアルコキシ基の例としては、限定されるものではないが、C₁-メトキシ、C₂-エトキシ、C₃-n-プロポキシ及びC₄-n-ブトキシが挙げられる。
・3〜6原子(C₃-C₆)又は3〜4原子(C₃-C₄)の分岐基。このようなアルコキシ基の例としては、限定されるものではないが、C₃-イソ-プロポキシ、ならびにC₄-sec-ブトキシ及びtert-ブトキシが挙げられる。

ハロは、Cl、F、Br及びIから選択される。ハロは好ましくはFである。

用語「アリール」は、6又は10個の炭素原子を含有する単環又は縮合芳香環系を含み、ここで、そうではないことが示されない限り、アリールの各存在は、上記に定義したように、(C₁-C₆)アルキル、(C₁-C₆)アルコキシ、OH、ハロ、CN、COOR¹⁴、CF₃及びNR¹⁴R¹⁵から独立して選択される最大5個の置換基で置換されていてもよい。典型的には、アリールは、1、2又は3個の置換基で置換されていてもよい。任意選択の置換基は、上記に示されたものから選択される。好適なアリール基の例としては、フェニル及びナフチル(それぞれ上記のように置換されていてもよい)が挙げられる。アリーレンは、アリール基から誘導される二価のラジカルを意味し、上記の定義に従って解釈されるものとする。

用語「ヘテロアリール」は、1又は2個のN原子並びに場合によりNR¹⁴原子、又は1個のNR¹⁴原子とS若しくはO原子、又は1個のS原子、又は1個のO原子を含有する5員、6員、9員又は10員の単環式又は二環式芳香環を含み、そうではないことが示されない限り、前記ヘテロアリールは、下記で定義されるように、(C₁-C₆)アルキル、(C₁-C₆)アルコキシ、OH、ハロ、CN、COOR¹⁴、CF₃及びNR¹⁴R¹⁵から独立して選択される1、2又は3個の置換基で置換されていてもよい。好適なヘテロアリール基の例としては、チエニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾイル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリニル及びイソキノリニル(上記で示したように置換されていてもよい)が挙げられる。ヘテロアリーレンは、ヘテロアリールから誘導される二価のラジカルを意味し、上記の定義に従って解釈されるものとする。

用語「ヘテロシクリル」は、C-結合又はN-結合した3〜10員の非芳香族、単環式又は二環式環であり、ここで、前記ヘテロシクロアルキル環は、可能であれば、N、NR¹⁴、S(O)_q及びOから独立して選択される1、2又は3個のヘテロ原子を含み、前記ヘテロシクロアルキル環は場合により、可能であれば、1又は2個の二重結合を含み、炭素上で、(C₁-C₆)アルキル、(C₁-C₆)アルコキシ、OH、CN、CF₃、ハロ、COOR¹⁴、NR¹⁴R¹⁵及びアリールから独立して選択される1又は2個の置換基で置換されていてもよい。

上記の定義において、R¹⁴及びR¹⁵は独立して、H及び(C₁-C₆)アルキルから選択される。

構造式が不特定の結合、又は「浮動」結合によって分子の核と結合している置換基で定義される場合には、例えば、式(C)の場合には基P³については、この定義は、その原子の許容価数に適合する限り、その不特定の置換基が、浮動結合が存在する環上の任意の原子と結合している場合を包含する。

互変異性型(すなわち、ケト又はエノール型)で存在し得る本発明の化合物の場合、例えば、式(C)又は(H)の化合物の場合、特定の化合物という際には、場合により、このような互変異性型の全てを含む。

一般事項
発明の実施は、他に示さない限り、当技術分野の技術の範囲内で、化学、生化学、分子生物学、免疫学及び薬理学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、参考文献121〜128等を参照のこと。

「GI」ナンバリングは、上で使用されている。GI番号又は「GenInfo Identifier」は、配列がNCBIのデータベースに加えられたときにNCBIによって処理された各配列レコードに連続して割り当てられるひと続きの数字である。そのGI番号は、配列レコードのアクセッション番号と類似していない。ある配列が更新されたとき(例えば、訂正のため、又はより多くのアノテーション若しくは情報を加えるために)、それは、新しいGI番号を受ける。したがって、所与のGI番号に関連する配列は、決して変化しない。

本発明が、「エピトープ」に関係する場合、このエピトープは、B細胞エピトープ及び/又はT細胞エピトープであり得る。そのようなエピトープは、経験的に同定され得るか(例えば、PEPSCAN[129、130]又は同様の方法を用いて)、又は予測され得る(例えば、Jameson-Wolf抗原性指標[131]、マトリックスベースのアプローチ[132]、MAPITOPE[133]、TEPITOPE[134、135]、ニューラルネットワーク[136]、OptiMer & EpiMer[137、138]、ADEPT[139]、Tsites[140]、親水性[141]、抗原性指標[142]又は参考文献143〜147に開示されている方法などを用いて)。エピトープは、抗体の抗原結合部位又はT細胞レセプターによって認識され、それらに結合する抗原の一部であり、それらは、「抗原決定基」とも称され得る。

抗原「ドメイン」が除外される場合、これはシグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン等の除外を含み得る。

用語「〜を含む(comprising)」は、「〜を含む(including)」及び「〜からなる(consisting)」を包含し、例えば、X「を含む(comprising)」組成物は、もっぱらXからなってもよいし、追加のもの、例えば、X+Yを含んでもよい。

数値xに関する用語「約」は、任意のものであり、例えば、x±10％を意味する。

2つのアミノ酸配列間の配列同一性パーセンテージに対する言及は、それらがアラインメントされたとき、そのパーセンテージのアミノ酸が、その2つの配列の比較において同じであることを意味する。このアラインメント及びパーセント相同性又はパーセント配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、参考文献148の第7.7.18項に記載されているものを用いて決定され得る。好ましいアラインメントは、12のギャップオープンペナルティ及び2のギャップ伸長ペナルティ、62のBLOSUMマトリックスを用いたアフィンギャップ検索を使用するSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムによって決定される。このSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムは、参考文献149に開示されている。任意の特定の配列に対する(例えば特定の配列番号に対する)同一性パーセンテージは、理想的には、その配列の全長にわたって計算される。

結合親和性は、表面プラズモン抵抗、等温滴定熱量測定法、競合的結合アッセイ、熱シフトアッセイなどを含む、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。異なる方法を用いて得られた絶対的な数値は変動し得るが、別のものと比較した1つのタンパク質の相対的結合親和性の測定は使用される方法に依存しないことが想定される。

本発明で用いるリン含有アジュバントは、周囲の環境のpH、例えば、それらが溶解している溶媒のpHに依存して、プロトン化又は脱プロトン化形態のいくつかにおいて存在し得る。したがって、特定の形態が例示され得るが、これらの例示は代表的なものにすぎず、特定のプロトン化又は脱プロトン化形態に限定されないことが意図される。例えば、ホスフェート基の場合、これは-OP(O)(OH)₂として例示されているが、定義は、酸性条件において存在し得るプロトン化形態[OP(O)(OH₂)(OH)]⁺及び-[OP(O)(OH)₂]²⁺及び塩基性条件において存在し得る脱プロトン化形態-[OP(O)(OH)(O)]^-及び[OP(O)(O)₂]^2-を含む。

化合物は、薬学的に許容可能な塩として存在し得る。したがって、化合物(例えば、アジュバント)は、それらの薬学的に許容可能な塩、すなわち、生理学的に又は毒物学的に許容される塩(適切な場合、薬学的に許容可能な塩基付加塩及び薬学的に許容可能な酸付加塩を含む)の形態で使用されてもよい。

単語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、単語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。

発明を実施するための形態
SpAkR変異体
SpAは、黄色ブドウ球菌において重要な毒性因子であり、それは細菌のオプソニン食作用クリアランスを妨害することによって、及び適応免疫応答を除去することによって作用する。野生型配列の配列番号43は、上記のように5個のIg結合ドメイン(IgBD)を含み、これらのドメイン内のアミノ酸残基を変異させて、免疫原性を保持しながら、Fc/Fab結合活性を破壊することが知られている。例えば、参考文献エラー!ブックマークは定義されていないを参照されたい。これは、Gln-GlnジペプチドをLys-Lysで置き換え、及び/又はAsp-AspジペプチドをAla-Alaで置き換える。

さらなるGln-GlnジペプチドがLys-Argに変異されている新しい変異体SpAが、製造されている。このジペプチドは、バイオインフォマティクス解析及びIg結合に関与する追加の部位の予測に基づいて同定された。特に、配列番号43の残基96及び97は、Ig結合に関与することが仮定された。この部位は、保存されたIgBDの外側にあり、解決された構造の一部ではないために、以前の研究では見落とされた。新たな変異体は「SpAkR」と呼ばれ、それは以下のアミノ酸配列を有する(以前の「SpAkkAA」変異体と比較した追加のQQ/KR置換が囲まれている)。

SpAkR変異体は、免疫原性を保持しながら、公知の変異体と比較して、免疫グロブリンに対して低下した親和性を有することが確認されている。

CD及びDSC分析は、KR変異体の導入がSpAの構造に実質的に影響を与えなかったことを示した。SpAkkAAとSpAKRのCDスペクトルは同一であった。DSC分析からのT_m1及びT_m2は以下の通りであった。T_m1: SpAkkAA 48.9℃; SpAKR 51.1℃。T_m2: SpAkkAA 68.1℃; SpAKR 68.0℃。

ヒトIgG、IgA及びIgMに対する、野生型SpA、SpAkkAA及びSpAkR変異体の親和性を、表面プラズモン共鳴を用いて試験した。タンパク質をセンサーチップ上に固定し、ヒトIgG、IgA及びIgMをアナライトとして用いた。両方の変異体は、野生型に比べて、大幅に低下した結合能を示したが、SpAkkAAは、IgG及びIgMへの残存結合を示し、一方、SpAkRでは、任意の免疫グロブリンとの検出可能な相互作用は見られなかった。IgG及びIgMに対するSpAkkAAの残存結合活性は非常に低かった(野生型より11〜12倍低かった)が、再現性があり、濃度依存性であった。

SpA(WT、SpAkkAA及びSpAkR)の存在下での黄色ブドウ球菌の生存率を、全血生存アッセイ(WBA)を通して評価した。50mg/lのレピルジン抗凝固剤(10μl/ml血液)を補充した、健康なドナー由来の1mlの全血を、0.15μMのSpA又はPBSと、15分間37℃でインキュベートし、その後、BHI中で希釈した約2.5×10⁵CFUの黄色ブドウ球菌USA300 LAC(OD₆₀₀ 0.4)を添加した。この培養物のアリコートを、BHI寒天上にプレーティングし、入力CFUを決定した。振とう(180 RPM)しながら2時間37℃でインキュベートした後、好中球を、氷上で3分間、0.5％サポニン-PBSで溶解した。生菌数を、BHI中の連続10倍希釈及び栄養寒天プレート上のプレーティングによって決定した。コロニーを、18時間37℃でプレートをインキュベートした後に計数した。コントロールは、PBSとともにプレインキュベートした血液サンプルであった。相対生存率を、インキュベーション後のCFUと比較した、入力CFUに基づいて計算した。実験を三連で実施し、実験間でほとんど変動はなかった。

WBAでは、SpAKRとインキュベートした場合、野生型SpA(p＜0.001、Mann-Whitney)又はSpAkkAA(p＜0.05)とインキュベートした場合よりも、ヒト全血中における黄色ブドウ球菌の相対生存率はかなり低かった。SpAwtとのインキュベーションは、コントロールと比較して、黄色ブドウ球菌の増加した生存率をもたらし(p＜0.001)、一方、SpAkkAAとインキュベートしたWBAにおける生存率は、コントロールと同等であった。SpAkRとのインキュベーションは、コントロールの約半分に生存率を低下させた。

水酸化アルミニウムアジュバントを用いて製剤化されたSpAkkAA又はSpAkRは、それら自身に対してマウスにおいて弱い免疫原性であることが判明したが、吸着されたTLR7アゴニスト「K1」を含めることは、抗体力価を大幅に増加させた。SpA免疫化に関連した作用機序は、主に抗体によって駆動されるように思われるので、これは重要な改善である。

黄色ブドウ球菌ワクチン
2mg/ml(合計塩)で水酸化アルミニウム(Al-H)でアジュバント化された、SpAkR、SpAkkAA、SpAkR Eドメイン単独及びHlaH35Lに融合されたSpAkR Eドメインを、腎膿瘍モデルで試験した。抗原は、筋肉内注射のための100μL用量中にそれぞれ10μgで存在した。

4又は5週齢のマウス(CD1)を、14日間隔で初回免疫-追加免疫注射で筋肉内(IM)に免疫化した。コントロールマウスは、等量のアジュバントのみを受けた。血清をワクチン接種前及び後の両方のマウスから採取し、混合ワクチン中の各タンパク質成分に対する血清抗体力価を記録した。これらの力価は、ミクロスフェアにコンジュゲートした組換えワクチン抗原を用いたLuminex技術によって測定した。

腎膿瘍モデル: 免疫された動物を、致死未満量の黄色ブドウ球菌Newman株の静脈内注射により24日目にチャレンジした(約2〜6×10⁷ CFU)。28日目に、マウスを安楽死させ、腎臓を取り出し、2mLのPBS中でホモジナイズし、コロニー形成単位(CFU)の測定のために二重で寒天培地上にプレーティングした。

アジュバントのみと比較して、SpAKR、SpAkkAA、SpAkR Eドメイン単独及びHlaH35Lに融合されたSpAkR Eドメインによるワクチン接種で、log₁₀ CFU/mlにおける同等の低下(約1 logの低下)が得られた。

混合黄色ブドウ球菌ワクチン
5価及び6価ワクチンを調製した。5価ワクチンは、配列番号7、8、27及び32(FhuD2、Sta011、Hla-H35L、及びEsxAB)からなる抗原を含み、6価ワクチンはSpAkR変異体も含んだ。ワクチンを、(i)水酸化アルミニウム、Al-H、(ii)Al-H＋吸着TLR7アゴニストK1、又は(iii)水中油型エマルジョンMF59を用いてアジュバント化した。Al-Hを2mg/ml(合計塩)で使用し、K1は用量あたり50μgで存在し、MF59は1:1の体積比で抗原と混合した。抗原は、筋肉内注射のための100μL用量中にそれぞれ10μgで存在した。

4又は5週齢のマウス(CD1)を、14日間隔で初回免疫-追加免疫注射で免疫化した。コントロールマウスは、等量のアジュバントのみを受けた。血清をワクチン接種前及び後の両方のマウスから採取し、混合ワクチン中の各タンパク質成分に対する血清抗体力価を記録した。これらの力価は、ミクロスフェアにコンジュゲートした組換えワクチン抗原を用いたLuminex技術によって測定した。

腎膿瘍モデル: 免疫された動物を、致死未満量の黄色ブドウ球菌の静脈内注射により24日目にチャレンジした(約2〜6×10⁷ CFU、チャレンジ株に応じて具体的な接種材料は変動した)。28日目に、マウスを安楽死させ、腎臓を取り出し、2mLのPBS中でホモジナイズし、コロニー形成単位(CFU)の測定のために二重で寒天培地上にプレーティングした。腎臓はまた、組織病理学のために処理した。

腹膜炎モデル: 別に、免疫された動物を、致死量の黄色ブドウ球菌の腹腔内注射により24日目にチャレンジし(約2〜5×10⁸ CFU)、その後14日間毎日モニターした。

皮膚感染モデル: 免疫されたマウスを、2×10⁷ CFUの黄色ブドウ球菌LAC株(世界的に最も重要なクローンの1つであり、市中皮膚感染症に非常に関連がある、USA300クローン)を用いて剃毛右脇腹に皮下注射によって接種した。質量と膿瘍形成(サイズ及び皮膚壊死)を、7日間にわたって24時間間隔でモニターした。膿瘍と、関連する上層の皮膚壊死病変のサイズを画像解析ソフトウェアを用いて測定した。マウスの皮膚及び膿瘍をCFU計数のために接種後7日目に採取した。このモデルは、Al-H/K1アジュバントでのみ用いた。

結果は以下の通りであった。

これらの結果は、変異体SpAkRが、両方のモデルで5価コンボ-1製品を改善することを実証する。また、最良の結果は、Al-H/K1アジュバントを使用して見られた。驚くべきことに、Al-H/K1を用いた6価ワクチンの腎膿瘍モデルでの結果は、無菌に近かった。

腹膜炎モデルでは、Al-H/K1を用いた6価ワクチンは、ネガティブコントロールと比較して統計的に優れており(上の表を参照)、5価Al-Hワクチンと比較した場合でも統計的に優れていた。膿瘍モデルでは、Al-H/K1を用いた6価ワクチンは、ネガティブコントロールと(上の表を参照)、5価Al-Hワクチンと、及び5価Al-H/K1ワクチンと比較して統計的に優れており、したがって、変異体SpAの寄与が、K1アゴニストのみに起因する増強を超えていることを示す。

皮膚感染モデルでは、5価ワクチンと6価ワクチンの両方は、膿瘍形成及びCFU数を有意に低下させた(上の表を参照)。ワクチン接種したマウスでは皮膚壊死は存在せず、一方、それは、アジュバントのみを受けた全てのマウスに観察された(表中の「N/A」)。さらに、CFU低下は、ワクチンにSpAkRを含めることによって有意に改善され、より少ないマウスに、巨視的レベルで区別できる膿瘍が観察された(71％対88％)。

抗SpA力価も3種のアジュバントについて比較した。Al-H又はMF59を使用した中央値力価に有意差はなかったが、Al-H/K1を使用した力価は、Al-H単独(p=0.0047、Mann-Whitney検定)及びMF59(p=0.01)を用いた場合よりも有意に高かった。したがって、機能アッセイで最もよく機能した製剤は、最も高い抗SpA抗体力価を誘発したものであり、これは、ワクチン抗原としてのSpAの活性が、抗体に依存するという仮説と一致し、抗体は、それに結合し、その免疫回避活性を阻害し得る。

本発明は例としてのみ記載され、本発明の範囲及び精神の範囲内にあるままで改変が為され得ることが理解される。
本発明は以下の態様も提供する。
［１］ 変異体SpA抗原であって、該抗原は、配列番号50を含む又はこれからなるアミノ酸配列を含み、60及び61位におけるジペプチドはQQではなく、前記ジペプチドはKRであってもよく、前記配列は配列番号51又は配列番号52であってもよい、変異体SpA抗原。
［２］ ［１］に記載の変異体SpA抗原であって、抗原は、配列番号49を含む又はこれからなるアミノ酸配列を含み、60及び61位におけるジペプチドはQQではなく、前記ジペプチドはKRであってもよく、前記配列は配列番号47であってもよい、変異体SpA抗原。
［３］ ［１］に記載の変異体SpA抗原であって、配列番号50を含む又はこれからなる前記アミノ酸配列の2つ以上のコピーを含み、60及び61位におけるジペプチドはQQではない、変異体SpA抗原。
［４］ 哺乳動物において配列番号43及び/又は配列番号54を認識する抗体を誘発する、［１］〜[３]のいずれか一に記載の変異体SpA抗原。
［５］ ヒトIgGのFcγ部分に対して、未改変SpAと比較して、減少した親和性を有する、［１］〜[４]のいずれか一に記載の変異体SpA抗原。
［６］ V _H 3含有ヒトB細胞受容体のFab部分に対して、未改変SpAと比較して、減少した親和性を有する、［５］に記載の変異体SpA抗原。
［７］ 配列番号43の43、44、70、71、96、97、104、105、131、132、162、163、190、191、220、221、247、248、278、279、305及び/又は306位における少なくとも1つ、特に、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19個、より具体的には20個のアミノ酸において変異された配列番号43を含む又はこれからなる配列のものであり、さらにより具体的には配列番号47又は配列番号49を含む又はこれからなる配列のものである、［１］〜[６]のいずれか一に記載の変異体SpA抗原。
［８］ 特に、配列番号52、配列番号47又は配列番号48を含む配列の、［１］〜[７]のいずれか一に記載の変異体SpA抗原。
［９］ ［１］〜[８]のいずれか一に記載の変異体SpA抗原を含む、融合タンパク質。
［１０］ ［１］〜[８]のいずれか一に記載の変異体SpA抗原又は［９］に記載の融合タンパク質を含む、免疫原性組成物。
［１１］ アジュバントも含む、[１０]に記載の組成物。
［１２］ 前記アジュバントが、以下:
- アルミニウム塩、特に水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、
- ヒトTLRアゴニスト、特にTLR7アゴニスト、及び
- それらの混合物
からなる群から選択される、［１１］に記載の組成物。
［１３］ 前記TLR7アゴニストが、以下の式(K):

[式中、
R ¹ は、H、C ₁ -C ₆ アルキル、-C(R ⁵ ) ₂ OH、-L ¹ R ⁵ 、-L ¹ R ⁶ 、-L ² R ⁵ 、-L ² R ⁶ 、-OL ² R ⁵ 、又は-OL ² R ⁶ であり、
L ¹ は、-C(O)-又は-O-であり、
L ² は、C ₁ -C ₆ アルキレン、C ₂ -C ₆ アルケニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン又は-((CR ⁴ R ⁴ ) _p O) _q (CH ₂ ) _p -であり、ここで、L ² のC ₁ -C ₆ アルキレン及びC ₂ -C ₆ アルケニレンは、1〜4個のフルオロ基で置換されていてもよく、
それぞれのL ³ は、独立して、C ₁ -C ₆ アルキレン及び-((CR ⁴ R ⁴ ) _p O) _q (CH ₂ ) _p -から選択され、ここで、L ³ のC ₁ -C ₆ アルキレンは、1〜4個のフルオロ基で置換されていてもよく、
L ⁴ は、アリーレン又はヘテロアリーレンであり、
R ² は、H又はC ₁ -C ₆ アルキルであり、
R ³ は、C ₁ -C ₄ アルキル、-L ³ R ⁵ 、-L ¹ R ⁵ 、-L ³ R ⁷ 、-L ³ L ⁴ L ³ R ⁷ 、-L ³ L ⁴ R ⁵ 、-L ³ L ⁴ L ³ R ⁵ 、-OL ³ R ⁵ 、-OL ³ R ⁷ 、-OL ³ L ⁴ R ⁷ 、-OL ³ L ⁴ L ³ R ⁷ 、-OR ⁸ 、-OL ³ L ⁴ R ⁵ 、-OL ³ L ⁴ L ³ R ⁵ 及び-C(R ⁵ ) ₂ OHから選択され、
それぞれのR ⁴ は、独立して、H及びフルオロから選択され、
R ⁵ は、-P(O)(OR ⁹ ) ₂ であり、
R ⁶ は、-CF ₂ P(O)(OR ⁹ ) ₂ 又は-C(O)OR ¹⁰ であり、
R ⁷ は、-CF ₂ P(O)(OR ⁹ ) ₂ 又は-C(O)OR ¹⁰ であり、
R ⁸ は、H又はC ₁ -C ₄ アルキルであり、
それぞれのR ⁹ は、独立して、H及びC ₁ -C ₆ アルキルから選択され、
R ¹⁰ は、H又はC ₁ -C ₄ アルキルであり、
それぞれのpは、独立して、1、2、3、4、5及び6から選択され、且つ
qは、1、2、3又は4である。]
の化合物、特に、3-(5-アミノ-2-(2-メチル-4-(2-(2-(2-ホスホノエトキシ)エトキシ)エトキシ)フェネチル)ベンゾ[f][1,7]ナフチリジン-8-イル)プロパン酸(K1)である、［１２］に記載の組成物。
［１４］ 前記アジュバントが、アルミニウム塩に吸着されたヒトTLRアゴニストを含む、［１２］又は[１３]に記載の組成物。
［１５］ 医薬として使用するための、［１］〜[１４]のいずれか一に記載の免疫原性組成物。
［１６］ 場合によりヒトにおける、黄色ブドウ球菌(S. aureus)感染症の予防及び/又は治療における医薬として使用するための、［１］〜[１５]のいずれか一に記載の免疫原性組成物。

参考文献

Claims (16)

1. 配列番号49を含む又はこれからなるアミノ酸配列を含む変異体SpA抗原であって、配列番号49の7〜8、60〜61、68〜69、126〜127、184〜185及び242〜243位のXXジペプチドがKK、RR、RK又はKRであり、配列番号49の34〜35、95〜96、153〜154、211〜212及び269〜270位のXXジペプチドがAAである、変異体SpA抗原。
2. 60及び61位におけるジペプチドがKK又はKRである、請求項１に記載の変異体SpA抗原。
3. 前記アミノ酸配列が配列番号47である、請求項１又は２に記載の変異体SpA抗原。
4. 哺乳動物において配列番号43及び/又は配列番号54を認識する抗体を誘発する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異体SpA抗原。
5. ヒトIgGのFcγ部分に対して、未改変SpAと比較して、減少した親和性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異体SpA抗原。
6. V_H3含有ヒトB細胞受容体のFab部分に対して、未改変SpAと比較して、減少した親和性を有する、請求項５に記載の変異体SpA抗原。
7. 前記アミノ酸配列が配列番号48である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異体SpA抗原。
8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体SpA抗原を含む、融合タンパク質。
9. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体SpA抗原又は請求項８に記載の融合タンパク質を含む、免疫原性組成物。
10. EsxA、EsxB、FhuD2、Sta011、及びHla抗原からなる群から選択される少なくとも1つの抗原をさらに含む、請求項９に記載の免疫原性組成物。
11. アジュバントも含む、請求項９又は１０に記載の組成物。
12. 前記アジュバントが、以下:
    - アルミニウム塩、又は水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、
    - ヒトTLRアゴニスト、又はTLR7アゴニスト、
    - 水中油型エマルジョン
    - サポニン製剤
    -腸内細菌リポ多糖(LPS)の非毒性誘導体、又はMPL (モノホスホリルリピドA) (MPL)若しくは3d-MPL（3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA）
    - リピドA誘導体、並びに
    - それらの混合物
    からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記TLR7アゴニストが、以下の式(K):
    

    

    [式中、
    R¹は、H、C₁-C₆アルキル、-C(R⁵)₂OH、-L¹R⁵、-L¹R⁶、-L²R⁵、-L²R⁶、-OL²R⁵、又は-OL²R⁶であり、
    L¹は、-C(O)-又は-O-であり、
    L²は、C₁-C₆アルキレン、C₂-C₆アルケニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン又は-((CR⁴R⁴)_pO)_q(CH₂)_p-であり、ここで、L²のC₁-C₆アルキレン及びC₂-C₆アルケニレンは、1〜4個のフルオロ基で置換されていてもよく、
    R ² は、H又はC₁-C₆アルキルであり、
    R³は、C₁-C₄アルキル、-L³R⁵、-L¹R⁵、-L³R⁷、-L³L⁴L³R⁷、-L³L⁴R⁵、-L³L⁴L³R⁵、-OL³R⁵、-OL³R⁷、-OL³L⁴R⁷、-OL³L⁴L³R⁷、-OR⁸、-OL³L⁴R⁵、-OL³L⁴L³R⁵及び-C(R⁵)₂OHから選択され、
    それぞれのL ³ は、独立して、C ₁ -C ₆ アルキレン及び-((CR ⁴ R ⁴ ) _p O) _q (CH ₂ ) _p -から選択され、ここで、L ³ のC ₁ -C ₆ アルキレンは、1〜4個のフルオロ基で置換されていてもよく、
    L ⁴ は、アリーレン又はヘテロアリーレンであり、
    それぞれのR⁴は、独立して、H及びフルオロから選択され、
    R⁵は、-P(O)(OR⁹)₂であり、
    R⁶は、-CF₂P(O)(OR⁹)₂又は-C(O)OR¹⁰であり、
    R⁷は、-CF₂P(O)(OR⁹)₂又は-C(O)OR¹⁰であり、
    R⁸は、H又はC₁-C₄アルキルであり、
    それぞれのR⁹は、独立して、H及びC₁-C₆アルキルから選択され、
    R¹⁰は、H又はC₁-C₄アルキルであり、
    それぞれのpは、独立して、1、2、3、4、5及び6から選択され、且つ
    qは、1、2、3又は4である。]
    の化合物、又は、3-(5-アミノ-2-(2-メチル-4-(2-(2-(2-ホスホノエトキシ)エトキシ)エトキシ)フェネチル)ベンゾ[f][1,7]ナフチリジン-8-イル)プロパン酸(K1)である、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記アジュバントが、アルミニウム塩に吸着されたヒトTLRアゴニストを含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 医薬として使用するための、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
16. 黄色ブドウ球菌(S. aureus)感染症の予防及び/又は治療における医薬として使用するための、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。