MX2008009024A - Emulsion de aceite en agua termorreversible. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona a una emulsión de aceite en agua termorreversible que comprende: un agonista de TLR4 cuya estructura química no incluye un anillo de azúcar, escualeno, un surfactante no iónico que pertenece al grupo químico de éter alquílico de polioxietileno, un surfactante hidrofílico y un solvente acuoso, y que exhibe propiedades inmunoestimulantes.

Description

EMULSIÓN DE ACEITE EN AGUA TERMORREVERSIBLE CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a una composición inmunoestimulante en la forma de una emulsión de aceite en agua termorreversible (0/W) que comprende un agonista de TLR4, llamado TLA . El TLR4 (receptor similar a toll tipo 4) es un receptor expresado por células que presentan antigeno del sistema inmune; se involucra en los mecanismos de defensa tempranos contra infecciones bacterianas gram. El lipopolisacárido (LPS) de bacterias gram es un ligando natural para TLR ; éste activa el receptor, que impulsa una cascada de eventos bioquímicos, en particular la activación del factor de transcripción Nf-Kappa B y la producción de citoquinas proinflamatorias . El monofosforil lípido A, que proviene de la hidrólisis de LPS, también es un ligando para TLR4, con la ventaja de que es menos tóxico que LPS. El documento WO 2004/060396 describe formulaciones en la forma de emulsiones de O/W que contienen un adyuvante de fosfolípido. Las emulsiones, que tienen un tamaño submicrónico, se obtienen por medio de un homogeni zador de alta presión (microfluidizador) . El método de producción usa altas energías mecánicas para obtener fuerzas de esfuerzo cortante suficientemente grandes para reducir el tamaño de las gotitas de aceite. De acuerdo con esta enseñanza, la emulsión obtenida contiene gotitas cuyo tamaño es aproximadamente 500 nm. Es deseable ser capaz de tener una formulación alternativa a aquella propuesta en esa solicitud de patente, y especialmente una que se pueda obtener por medio de un método más simple (no requiriendo tecnología de esfuerzo cortante específica) , que involucre baja energía mientras que al mismo tiempo que sea reproductible , confiable y usable sobre una gran escala; además, la formulación de adyuvante debe ser capaz de mejorar la eficacia de las vacunas, al incrementar la respuesta inmune a un antígeno, mientras que al mismo tiempo no exhiba ningún signo de toxicidad que sería perjudicial a la administración completamente segura de la misma. Para este efecto, un objetivo de la invención es: Una emulsión de Aceite en Agua (0/W) que comprende: i) un agonista de TLR , llamado TLA4 , la estructura química del cual no comprende un anillo de azúcar, ii) escualeno, iii) un solvente acuoso, iv) un surfactante hidrofílico no iónico que es un éter alquílico de polioxietileno, v) un surfactante hidrofóbico no iónico, y que es termorreversible .

El agonista de TLR4 contenido en la emulsión, de acuerdo con la invención, no es lipido A o un derivado de lipido A o una molécula que imita la estructura de lipido A. Típicamente, el TLA4 es un compuesto químico de la fórmula I, II, III o IV: Compuesto de la fórmula I Compuesto de la fórmula II Compuesto de la fórmula III Compuesto de la fórmula 15 en los cuales, para cada una de las fórmulas I, II, III o IV, R1 se selecciona del grupo que consiste de: a) C(O); b) C (O) -(alquil de C1-C14) -C (O) , en el cual el alquilo de 20 C1-C14 es opcionalmente sustituido con un hidroxilo, un alcoxi de C1-C5, un alquilendioxi de C1-C5, un (alquil de Ci-C5)amino o un (alquil de C1-C5) arilo, en el cual la porción de arilo del (alquil de C1-C5) arilo es opcionalmente sustituido con un alcoxi de C1-C5, un 25 (alquil de Ci-C5)amino, un (alcoxi de Ci-C5)amino, un (alquil de C1-C5) amino (alcoxi de C1-C5) , -O- (alquil de C1-C5) amino (alcoxi de C1-C5) , -O- (alquil de C}-C5) amino-C (O) - (alquil de C1-C5) -C (O) OH o -O- (alquil de C1-C5) amino-C (O) - (alquil de C1-C5) -C (O) -alquilo de (Cx-C5) ; un alquilo que comprende una cadena lineal o ramificada de C2-Ci5, opcionalmente sustituida con un hidroxilo o un alcoxi; y -C (O) - (arileno de C6-Ci2 ) -C (0) - en el cual el arileno es opcionalmente sustituido con un hidroxilo, un halógeno, un nitro o un amino; a y b son independientemente 0, 1, 2, 3 o 4; d, d' , d", e, e' y e" son independientemente 0, 1, 2, 3 o 4; X1, X2, .Y1 y Y2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de nulo, un oxigeno, NH y N(C(0) (alquilo de Ci-C4) ) y N (alquilo de C1-C4) ; W1 y W2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un carbonilo, un metileno, una sulfona y un sulfóxido; R2 y R5 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de: a) un alquilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C2o, que es opcionalmente sustituido con un oxo, un hidroxilo o un alcoxi; b) un alquenilo o dialquenilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C2o, que es opcionalmente sustituido con un oxo, un hidroxilo o un alcoxi; c) un alcoxi de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C20, que es opcionalmente sustituido con un oxo, un hidroxilo o un alcoxi; d) NH- (alquilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C2o) en el cual el grupo alquilo es opcionalmente sustituido con un oxo, un hidroxilo o un alcoxi; y e) en el cual Z se selecciona del grupo que consiste de un O y NH, y M y N son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, un alquenilo, un alcoxi, un aciloxi, un alquilamino y un acilamino que comprende una cadena lineal o ramificada de C2-C2o; R3 y R6 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un alquilo o alquenilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C2o, opcionalmente sustituido con un oxo o un fluoro; R4 y R7 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un C (0) - (alquilo o alquenilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C20) , un alquilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C20, un alcoxi de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C2o y un alquenilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C20; en los cuales los grupos alquilo, alquenilo o alcoxi pueden ser independientemente y opcionalmente sustituidos con un hidroxilo, un fluoro o alcoxi de Ci-C5; Gi, G2, G3 y G4 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un oxigeno, un metileno, un amino, un tiol, -C(0)NH-, -NHC(O)- y -N (C (0) (alquilo de Ci~C4))-; o G2R4 o G4R7 pueden ser conjuntamente un átomo de hidrógeno o un hidroxilo; y en el cual, para la fórmula III: a' y b' son independientemente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, de preferencia 2; Z1 se selecciona del grupo que consiste de -OP(0) (0H)2, -P(0) (OH) 2, -0P(0) (OR8) (OH) donde R8 es una cadena de alquilo de C1-C4, -OS(0)2OH, -S(0)20H, -C02H, -OB(OH)2, -OH, -CH3, -NH2 y -NR93 donde R9 es una cadena de alquilo de C1-C4; Z2 se selecciona del grupo que consiste de -0P(0) (0H)2, -P(0) (OH) 2, -OP(O) (OR10) (OH) donde R10 es una cadena de alquilo de C1-C4, -OS(0)2OH, -S(0)2OH, -C02H, -OB(OH)2, -OH, -CH3, -NH2 y -NR11 donde R11 es una cadena de alquilo de Ci-C4; y en el cual, para la fórmula IV: R12 es H o una cadena de alquilo de Ci-C4; o una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de la fórmula I, II, III o IV. La emulsión de acuerdo con la invención es termorreversible , que significa que esta cambia del estado de una emulsión de O/W al estado de una emulsión de /O cuando se calienta a una temperatura por lo menos igual a una "temperatura de inversión de fase". Sobre la escala microscópica, la temperatura de inversión de fase refleja el cambio de una curvatura dirigida hacia la fase aceitosa a una curvatura dirigida hacia la fase acuosa, esta transición necesariamente que involucra el paso a través de una fase de curvatura media de cero (el sistema que luego es relacionado ya sea a una fase laminar o a una microemulsión) . La emulsión de acuerdo con la invención se puede obtener mediante un proceso de inversión de fase de variación de temperatura, que es altamente ventajoso desde un punto de vista industrial puesto que puede ser fácilmente controlado y adaptado a volúmenes de producción grandes. Tal proceso garantiza seguridad y eficacia en costo, ambos de los cuales son necesarios para la industria farmacéutica. Además, en virtud de este proceso, es posible obtener una emulsión monodispersa en la cual el tamaño de gotita es pequeño, que hace la emulsión fácilmente filtrable por medio de filtros de esterilización para los cuales el corte es 200 nm. Ventajosamente, por lo menos 90% de la población por volumen de las gotitas de aceite de la emulsión de acuerdo con la invención tiene un tamaño <200 nm. En general, por lo menos 50% de la población por volumen de las gotitas de aceite de estas emulsiones tiene un tamaño < 110 nm. De acuerdo con una característica específica, por lo menos 90% de la población por volumen de las gotitas de aceite tiene un tamaño de < 180 nm y por lo menos 50% de la población por volumen de las gotitas tiene un tamaño < 110 nm. En general, la emulsión termorreversible de acuerdo con la invención es homogénea.' El término "emulsión homogénea" se propone para dar a entender una emulsión para la cual la representación gráfica de distribución de tamaño ("granulogramo") de las gotitas de aceite es unimodal. Típicamente, esta representación gráfica es del tipo "Gaussiano" . El tamaño de las gotitas se puede medir por varios medios, y en particular utilizando analizadores de tamaño de partícula de difracción láser tales como dispositivos Beckman Coulter del intervalo LS (en particular el LS230) o dispositivos Malvern del intervalo Mastersizer (en particular el Mastersizer 2000) . El principio de medición de estos dispositivos se basa en analizar la intensidad de la luz esparcida por las partículas como una función del ángulo (detectores de ángulo grande, medio y pequeño) cuando la muestra es iluminada por un haz de láser. Este análisis se lleva a cabo por medio de modelos matemáticos seleccionados de acuerdo con el tamaño y la naturaleza del material utilizado. En el caso de la medición del tamaño de partículas submicrónicas , es necesario aplicar un modelo óptico específico (teoría Mié) tomando en cuenta los índices refractivos de la fase de aceite (en este caso, 1.495 para escualeno) y de la fase acuosa (por ejemplo, es 1.332 para agua); también es necesario ser capaz de detectar la intensidades débiles emitidas por las partículas muy finas, que requiere optimizar el análisis con : - una celda de detección adicional para la medición de dispersión diferencial de intensidad polarizada de ángulo grande (sistema PIDS de Coulter, que permite la medición de 40 nm) , - un sistema de detección que combina 2 longitudes de onda, luz azul y roja, de Malvern. La fuente de luz azul de longitud de onda más corta, asociada con los detectores de dispersión y retrodispersión de ángulo amplio refuerza los niveles de desempeño del análisis del intervalo submicrónico . Dependiendo de los dispositivos utilizados, las mediciones pueden variar ligeramente de acuerdo con los componentes del dispositivo y el software de procesamiento de datos utilizado. La temperatura de inversión de fase de una emulsión termorreversible de acuerdo con la invención es una característica especifica para cada emulsión y varia de acuerdo con la naturaleza de sus componentes y con sus concentraciones relativas. Venta osamente, la composición de la emulsión de acuerdo con la invención se selecciona tal que la inversión de fase ocurre a una temperatura de entre' 45°C y 80°C de preferencia de entre 50 y 65°C. Este intervalo de temperatura es ventajoso debido a que no existe riesgo del estado cambiante de la emulsión si se almacena a una temperatura relativamente alta (»37°C). Además, como en el método para preparar la emulsión termorreversible, el calentamiento de los componentes no excede 80°C, que contribuye a mantener la estructura e integridad de los componentes y en particular del TLA4. Cuando la temperatura de inversión de fase de la emulsión es alta, en particular cuando es mayor que o cercana a 80 °C, puede ser útil disminuirla al adicionar a la composición de la emulsión un alditol, que es usualmente seleccionado de sorbitol, manitol, glicerol, xilitol o eritritol. Cuando el alditol es utilizado en un intervalo de concentración de 0.1 a 10% (p/p) , de preferencia en un intervalo de concentración de 1 a 10% (p/p) y en particular en un intervalo de concentración de 2 a 7% (p/p) , la temperatura de inversión de fase de la emulsión puede ser disminuida por aproximadamente 10°C. La temperatura de inversión de fase de la emulsión también puede ser disminuida al reemplazar la fase acuosa que consiste solamente de agua con una fase acuosa salina regulada. Una solución reguladora TRIS, una solución reguladora de fosfato tal como PBS, la solución reguladora de PBS de Dulbecco sin Ca2+ o Mg2+ o una solución reguladora de citrato es normalmente utilizada . Los compuestos químicos de la fórmula I, II, III o IV se obtienen mediante síntesis de acuerdo con los procesos descritos en particular en el documento US 2003/0153532 o en el documento US 2005/0164988. En particular, el TLA4 de acuerdo con la invención es un compuesto químico de la fórmula I, H O ¦OH o una sal farmacéuticamente aceptable de este compuesto . De preferencia, Rl es C(O) o C (O) - (CH2) n-C (0) , n que es 1, 2, 3 o 4, a, b, d, d' , d", e, e' y e" son independientemente 1 o 2, XI, X2, Yl y Y2 son NH, Wl y W2 son C (O) , R2 y R5 con independientemente seleccionados del grupo que consiste de un alquilo de cadena recta de C10-C15 opcionalmente sustituido con un oxo, un NH- (alquilo de cadena recta de Ci0-Ci5), y en la cual y N son independientemente un alquilo o alquenilo de cadena recta de C2 a C2o, R3 y R6 son alquilos de cadena recta de C5-C10, R4 y R7 se seleccionan del grupo que consiste dé un hidrógeno, C (0) - (alquilo de cadena recta de C8-Ci2) o C (0) -(alquenilo de cadena recta de C8-C12) , Gl y G3 son un oxigeno o -NH(CO)-, G2 y G4 son un oxigeno. El TLA4 ejerce una actividad inmunoestimulante in vitro y/o in vivo. La actividad inmunoestimulante in vitro se evalúa en particular: 1) al medir el incremento en la producción de TNFa por las células de sangre humana entera, o 2) al medir el incremento en la producción de fosfatasa alcalina por una linea de THP-1 transfectada con el gen de fosfatasa alcalina bajo el control del promotor de TNFa, o 3) al medir el incremento en la producción de citoquinas tales como IL-10 e interferona ? por esplenocitos de murino, o 4) al medir el incremento en la producción de TNF por la linea de macrófago de murino RAW264, o 5) al medir el incremento en . la producción de IL-6 por astrocitoma de humano U373, o 6) al medir el incremento en la activación/- maduración de células dendriticas derivadas de monocitos de humano, sobre la base de la expresión de marcadores de activación tales como CD25, CD80/CD83, mediante citometria de flujo. Todos estos ensayos de medición son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica y son en particular descritos en el ejemplo 7 del documento US 2003/0153532 o en el Journal of Biological Chemistry, (2001), volumen 276/3, páginas 1873-1880. La actividad inmunoestimulante in vivo se refleja por un incremento en la respuesta humoral y/o en la respuesta de células especifica. Para evaluar la respuesta humoral, la producción de anticuerpos específicos dirigidos contra un antígeno es medida. A manera de ejemplo, la referencia se puede hacer por los ensayos que son descritos en el ejemplo 8 del documento US 2003/0153532 para evaluar esta respuesta. Cuando la producción de anticuerpos específicos (dentro de la forma de inmunoglobulinas totales o de un isotipo específico) observados después de la inyección de un antígeno relacionado con TLA4 es mayor que aquel que se observa subsecuente a la administración de la misma cantidad de antigeno solo, el TLA4 se considera para ejercer una actividad inmunoestimulante in vivo. La actividad inmunoestimulante de TLA4 también se puede evaluar utilizando ensayos para medir la respuesta celular especifica, que son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, por ejemplo al medir la actividad de linfocitos T citotóxicos (CTLs) o la linfoproliferación . De preferencia, el TLA4 se selecciona del grupo que consiste de los compuestos químicos identificados y descritos en el documento US 2003/0153532 bajo los nombres ER803022, ER803058, ER803732, ER803789, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804764, ER111232, ER112022, ER112048, ER 112065, ER112066, ER113651, ER118989, ER119327 y ER119328. Los compuestos pueden estar en la forma de diastereoisómeros o en una forma racémica (mezcla de diastereoisómeros ) cuando la estructura química comprende varios carbonos asimétricos. Por ejemplo, ER804057 y ER804053, que tienen 4 carbonos asimétricos, son diastereoisómeros de ER12066, que es la forma racémica. ER804057 está en una configuración isomérica de tipo (R,R,R,R), mientras que ER804053 está en una configuración de tipo (R,S,S,R). De manera similar, ER804058, que está en una configuración isomérica de tipo (R,R,R,R), y ER804059, que está en una configuración isomérica de tipo (R,S,S,R), son diastereoisómeros de ER113651, que es la forma racémica. ER803022, que está en una configuración de tipo (R,R,R,R), ER803732, que está en una configuración (R,S,S,R) y ER803789, que está en una configuración (R,R,S,R), también son diastereoisómeros de una y la misma molécula química. Los diastereoisómeros que tienen una configuración de tipo R,R,R,R, que son generalmente más activos que las otras formas, son de preferencia utilizadas. Entre estos, ER804057 es particularmente preferido. Esto es éster (IR, 6R, 22R,21R) -1, 27-diheptil-9, 19-dihidroxi-9, 19-dióxido-14-oxo-6, 22-bis [ (1, 3-dioxotetradecil) amino]-4, 8, 10, 18, 20, 24-hexaoxa-13, 15-diaza-9, 19-difosfaheptacosano-1 , 27-diílico de ácido dodecanoico ; está en la forma de un ácido libre o en la forma de una sal. El peso molecular de la forma de ácido libre es 1579, aquella de la sal de disodio es 1624. La fórmula empírica de la sal de disodio es C83Hi58N4 a20i9P2. Desde un punto de vista estructural, el agonista de TLR4 de acuerdo con el objetivo de la invención es una molécula anfifílica. Las moléculas anfifílicas tienen un comportamiento que es tanto hidrofílico como hidrofóbico y tienen una tendencia a precipitar durante el tiempo. Frecuentemente se disuelven incompletamente en solventes orgánicos o acuosos y son frecuentemente la causa de soluciones inestables o soluciones que son difíciles de reproducir. Existe una necesidad para mejorar la formulación de estas moléculas. La emulsión como es descrita en la invención satisface esta necesidad al proporcionar emulsiones que son estables durante el tiempo. Una emulsión de acuerdo con la invención que se almacena durante 6 meses a +4°C conserva las características que inicialmente tuvo: la distribución de tamaño de las gotitas de aceite no varía sustancialmente ; el aspecto lechoso, fluido y homogéneo de la invención es conservado; y, manifiestamente, la integridad estructural del TLA4 no es deteriorada, como se muestra en el ejemplo II. Aun ha sido notado que una emulsión de acuerdo con la invención se puede almacenar a una temperatura de -2°C por al menos 48 horas sin cualquier variación notable que es observada en términos de la distribución de tamaño de gotita de aceite. Por otra parte, la emulsión de acuerdo con la invención disminuye la capacidad pirogénica de ciertos agonistas de TLR4. La relación de la cantidad de. TLA4 a la cantidad total de surfactantes hidrofílicos e hidrofóbicos de la emulsión está usualmente entre O.OlxlO"2 y 5xl0~2, de preferencia entre 0.1 xlCT2, y 2xl0"2. En este intervalo de relación, la cantidad de TLA4 es suficientemente pequeña para no ejercer cualquier influencia sobre la capacidad de emulsificación de los surfactantes, pero está presente en suficiente cantidad para ejercer una actividad inmunoest imulante in vitro y/o in vivo.

El surfactante hidrofílico de acuerdo con la invención tiene un HLB (balance hidrofilico/lipofilico) > 10 y pertenece al grupo químico de éter alquílico de polioxietileno (PAE), también llamados éteres de alcohol graso polioxietllenados . Estos surfactantes no iónicos se obtienen mediante la condensación química entre un alcohol graso y óxido de etileno. Tienen un fórmula química general del tipo de R- (0-CH2-CH2) n-OH en la cual el radical R usualmente representa un residuo de alquilo saturado o no saturado y n representa el número de unidades de óxido de etileno. De acuerdo con el objetivo de la invención, R contiene entre 1 y 50 átomos de carbono, de preferencia entre 4 y 20 átomos de carbono y particularmente de preferencia entre 10 y 20 átomos de carbono, n es > 2, generalmente entre 4 y 50. La emulsión de acuerdo con la invención usualmente comprende un PAE hidrofílico individual. Una mezcla de varios PAEs también es adecuada con la condición de que el HLB total sea > 10. Los éteres de alcohol graso polioxietilenados que son adecuados para el objetivo de la invención pueden estar en una forma que es líquida o sólida a temperatura ambiente. Entre los compuestos sólidos, se da preferencia a aquellos que se disuelven directamente en la fase acuosa o que no requieren calentamiento sustancial. Hasta donde el número de unidades de óxido de etileno sea suficiente, los éteres polioxietilenados de alcohol laurilico, alcohol miristilico, alcohol cetilico, alcohol oleico y/o alcohol estearilico son particularmente adecuados para el objetivo de la invención. En particular pueden ser encontrados en el intervalo de productos conocidos bajo los nombres comerciales Brij®, Eumulgin® o Simulsol®. Una emulsión particularmente preferida de acuerdo con la invención contiene, como surfactante hidrofilico no iónico, un éter alquilico de polioxietileno seleccionado del grupo que consiste de éter de cetoestearilico de polioxietileno (12) (cetearet-12) (vendido bajo el nombre Eumulgin® Bl), éter cetoestearilico de polioxietileno (20) (cetearet-20) (Eumulgin® B2), éter estearilico de polioxietileno (21) ( estearet-21 ) (Eumulgin® 21), éter cetilico de polioxietileno (20) (cetet-20) (Simulsol® 58 o Brij® 58), éter cetilico de polioxietileno (10) (cetet-10) (Brij® 56), éter estearilico de polioxietileno (10) (estearet-10 ) (Brij® 76), éter estearilico de polioxietileno (20) (estearet-20) (Brij® 78), éter oleilico de polioxietileno (10) (olet-10) (Brij® 96 o Brij® 97) y éter oleico de polioxietileno (20) (olet-20) (Brij® 98 o Brij® 99) . El número exhibido enseguida de cada nombre químico corresponde al número de unidades de óxido de etileno en la fórmula química. Un compuesto que es particularmente adecuado y preferido debido a su origen semisintético es EumulginMR Bl (cetearet-12 ) proporcionado por la compañía Cognis. La emulsión de acuerdo con la invención también contiene un surfactante hidrofóbico no iónico, el HLB del cual es < 6. La emulsión usualmente comprende un surfactante hidrofóbico no iónico individual. Una mezcla de varios surfactantes hidrofóbicos no iónicos también es adecuada con la condición de que el HLB total sea < 6. Típicamente, involucra un éster de sorbitan hidrofóbico o un éster de manuro hidrofóbico. Los ésteres de sorbitan son usualmente obtenidos por una reacción de esterificación entre un ácido graso y sorbitol, monohidruro de sorbitol o dianhídrido de sorbitol. Los ésteres de manuro son normalmente obtenidos por una reacción de esterificación entre un ácido graso y monoanhidruro de manitol o dianhídrido. De preferencia, involucra monooleato de manuro (vendido por la compañía Sigma o proporcionado por la compañía Seppic bajo el nombre Montanide 80MR) o monooleato de sorbitan (vendido bajo el nombre Span® 80, Dehymuls SMO™ (Cognis) o Montane 80MR (Seppic) ) . En virtud de la selección de estos surfactantes particulares entre todos los surfactantes propuestos en la técnica previa para preparar emulsiones, ahora se ha encontrado que una emulsión de O/W adyuvante puede ser muy ventajosamente producida utilizando un método de inversión de fase que es fácil de implementar . Cuando las concentraciones respectivas de surfactantes hidrofilicos e hidrofóbicos son tales que el HLB de la mezcla (HLBm está entre 8.5 y 10, y más particularmente entre 8.6 y 9.6, las emulsiones son generalmente homogéneas y frecuentemente por lo menos 90% de la población por volumen de las gotitas de aceite tienen un tamaño < 0.2 µ??a. Estas emulsiones son, por otra parte, particularmente estables. Las cantidades de surfactantes hidrofilicos e hidrofóbicos en la emulsión de escualeno son de preferencia ajustadas tales que el HLBm está entre 8.5 y 10 y más particularmente tal que el HLBm está entre 8.6 y 9.6. Para determinar las concentraciones respectivas de surfactantes hidrofilicos e hidropónicos en la composición de la emulsión, la siguiente fórmula es utilizada: HLBm = HLBe x M+ HLB pae x (1-M) en la cual, HLBm corresponde al HLB de la mezcla, que es de preferencia entre 8.5 y 10, y más particularmente entre 8.6 y 9.6. HLBe corresponde al HLB del surfactante hidrofóbico. M corresponde al porcentaje en peso del surfactante hidrofóbico en la mezcla constituida del surfactante hidrofóbico y PAE. HLBpae corresponde al HLB del PAE. Escualeno, que representa la fase aceitosa de la emulsión, tiene la fórmula química empírica C30H50 y comprende 6 enlaces dobles. Este aceite es metabolizable y tiene las cantidades requeridas para ser utilizado en un producto farmacéutico inyectable. Este proviene del hígado de tiburón (origen animal) pero también puede ser extraído desde el aceite de olivo (origen de planta) . Los buenos resultados han sido en particular obtenidos utilizando el escualeno proporcionado por la compañía Fluka, que es de origen animal. Generalmente, la cantidad de escualeno representa entre 5 y 45% del peso total de la emulsión. La relación en masa de la cantidad de escualeno a la cantidad total de surfactantes en la emulsión de acuerdo con la invención está usualmente entre 2.0 y 4.0, de preferencia entre 2.5 y 3.5. Una composición de la emulsión de acuerdo con la invención que es particularmente preferida comprende: escualeno, una solución reguladora de fosfato o una solución reguladora de citrato como solvente acuoso, el compuesto ER 804057 como agonista de TLR4 - cetearet-12 (Eumulgin® Bl) como surfactante hidrofilico , monooleato de sorbitan como surfactante hidrofóbico . La cantidad de escualeno representa entre 5 y 45% del peso total de la emulsión. La cantidad del compuesto ER804057 usualmente representa entre 0.05% y 2% del peso de los dos surfactantes . De preferencia, las cantidades de cetearet-12 y monooleato de sorbitan son tales que el HLB de la mezcla de los dos surfactantes está entre 8.5 y 10 y más particularmente entre 8.6 y 9.6. La relación de la cantidad del escualeno a la cantidad total de cetearet-12 y de monooleato de. sorbitan está entre 2.0 y 4.0, de preferencia entre 2.5 y 3.5. Además, esta composición puede contener manitol, la cantidad de la cual usualmente representa entre 0.1% y 10% del peso total de la emulsión. La fase acuosa de la emulsión de acuerdo con la invención también puede contener un sustrato de liofilización que contiene uno más agentes crioprotectores . Los agentes crioprotectores son usualmente seleccionados de azúcares tales como sacarosa, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, o derivados de azúcar tales como poliglicósidos de alquilo, por ejemplo uronato de decil-D-galactósido de sodio o ß-maltósido de dodecilo. Un sustrato de liofilización que contiene sacarosa, manitol y ß-maltósido de dodecilo conforme una mezcla es normalmente utilizada. La emulsión de acuerdo con la invención luego se puede liofilizar y conservar en la forma de un liofilizado. Sin embargo, esta conserva, todas sus características, puesto que se toma en una fase acuosa, nuevamente que llega a ser una emulsión de O/W termorreversible, lechosa, estable y fluida con una distribución de tamaño de gotita de aceite similar a aquella que preexistió antes de la liofilización . La emulsión de acuerdo con la invención también desempeña la función de adyuvante de la respuesta inmune a un antigeno. Para el propósito de la presente invención, el término "antigeno" se propone para dar entender cualquier antigeno que puede ser utilizado en una vacuna, si es un microorganismo viviente, atenuado o exterminado completo, un extracto de un microorganismo o una forma de subunidad. Cuando está en una forma de subunidad, la naturaleza del antigeno es de poca importancia: puede ser un péptido, una proteina, una glicoproteina, un polisacárido, un glicolipido, un lipopéptido o un ácido nucleico. Entre los antigenos que son adecuados para el objétivo de la invención, la mención se hace de los antigenos bacterianos originados de Clostridium tetani, de Clostridium dlphtheríae, de Bordetella pertussls , de Haemophilus influenzae type b, de Streptococcus pneumoniae, de Nelsseria meningltldis , de Shigella sp. , de Salmonella typhi, de Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis , de Mycobacterium tuberculosis , de Chlamydia trachomatis o de Streptococcus sp, antigenos virales originados del virus de hepatitis A, B o C, del virus de gripe, del virus sincitial respiratorio, del virus del Nilo del Oeste, del virus de rabia, del poliovirus, del virus de HIV, del virus de dengue, del virus de encefalitis Japonesa, del virus de fiebre amarilla, del citomegalovirus o del virus de herpes, de antigenos parasíticos originados en particular de Plasmodium sp. o de antígenos tumorales. Estos antígenos se pueden obtener utilizando métodos de recombinación genética o utilizando métodos de extracción bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. La emulsión de acuerdo con la invención actúa sobre inmunidad humoral al incrementar la producción de anticuerpos específicos y/o inmunidad celular no específica al promover en particular la proliferación de linfocitos T, el desarrollo de una respuesta citolítica específica (respuesta CTL) y/o la producción de citoquinas, quimioquinas y factores de crecimiento, producidas por los linfocitos activados. Por esta razón, un objetivo de la invención también es el uso de una emulsión de acuerdo con la invención, para preparar una composición de vacuna. La composición de vacuna obtenida se prueba que es más inmunogénica , por ejemplo debido a que la composición induce una respuesta inmune específica mayor, si es de tipo humoral y/o de tipo celular, o debido a que la cantidad más pequeña del antígeno es necesaria para obtener una respuesta inmune de la misma intensidad y de duración comparable. La composición de vacuna obtenida de una emulsión de acuerdo con la invención se puede administrar por cualquiera de las rutas normalmente utilizadas o recomendadas para vacunas: parenteralmente , intradérmicamente, subcutáneamente, intramuscularmente o mucosalmente , y pueden estar en varias formas, en particular liquido o liofilizado ., Se pueden administrar por medio de una jeringa o por medio de inyector libre de aguja por inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica , o por medio de un rociador nasal. La composición de vacuna está generalmente en la forma de una mezcla del antigeno con una emulsión de acuerdo con la invención. También puede estar en la forma de una formulación extemporánea. En este caso, el antigeno y la emulsión entran en contacto justo antes o en el tiempo de la administración de la composición de vacuna. Por ejemplo, el antigeno se puede liofilizar y tomar con la emulsión justo antes de la administración o, a la inversa, la emulsión puede estar en una forma liofilizada y tomada con una solución del antigeno. La composición de vacuna también puede estar en un dispositivo de inyección especifico tal como la jeringa de "desviación" cuando no se desea mezclar el antigeno con la emulsión . Cuando la composición de vacuna está en la forma de una mezcla obtenida mediante dilución de una emulsión de acuerdo con la invención con una solución de antigeno, esta usualmente está en la forma de una emulsión de 0/W en la cual la cantidad de escualeno en general representa en peso entre 0.5 y 5% del peso total de la composición. También puede estar en la forma de una emulsión de O/ termorreversible cuando la cantidad de escualeno en la composición de vacuna reacciona o excede 5% (p/p) . Cuando la composición de vacuna es una emulsión de O/W termorreversible, puede estar en particular en una forma en la cual por lo menos 90% de la población por volumen de las gotitas de aceite tiene un tamaño < 0.2 µt? . Sorprendentemente, la emulsión de acuerdo con la invención tiene una habilidad mayor para inducir anticuerpos neutralizantes que una emulsión de O/W de la técnica previa obtenida mediante microfluidización, la composición de la cual contiene escualeno, monooleato de sorbitan de polioxietileno (Tween®80) y trioleato de sorbitan (Span®85) (emulsión de O/W de la técnica previa) . Los anticuerpos neutralizantes son anticuerpos funcionales dirigidos contra un microorganismo infeccioso, producido por un individuo quién ha sido inmunizado con un antigeno relacionado con o derivado de este microorganismo o quién ha estado en contacto con este microorganismo y que previene infecciones de las células por este microorganismo. Ellos desempeñan una función muy importante en la prevención o tratamiento de infecciones causadas por microorganismos intracelulares , en particular virus y parásitos de célula individual, en particular plasmodium sp.. Antigenos originados de la forma "esporozoito" de Plasmodium falciparum , (tal como la mayor proteina de superficie del esporozoito (proteína circumesporozoito ) , LSA3 o el antígeno Pfs 16) y antígenos originados de la forma "merozoito" de Plasmod'ium falciparum (tal como el antígeno MSPl , MSP2 , MSP3, EBA-175, Rhop-1, Rhop-2, Rhop-3, RAP-1, RAP-2, RAP-3, PÍ155/RESA o AMA-1) induce anticuerpos neutralizantes. El uso de una emulsión de acuerdo con la invención para preparar una composición de vacuna que contiene uno o más antígenos derivados de esporozoitos o merozoitos de Plasmodium falciparum se indica para amplificar la respuesta inmune neutralizantes. Una emulsión de acuerdo con la invención puede se en particular utilizada para preparar una composición de vacuna que comprende, como antígeno de vacuna, la proteína LSA3 de Plasmodium falciparum . El gen que codifica esta proteína se identificó por Gardner y colaboradores, (Science (1998), 282, 1126-1132) y está sobre el cromosoma 2 de Plasmodium falciparum (cepa 3D7). La secuencia completa del gen es 12240 pares de base a lo largo y codifica una proteína de 1558 aminoácidos. Las secuencias de nucleótido y de proteína son descritas en el banco de datos EMBL bajo el número de acceso AE001424 y número uniprot 096275-PLAF7. La proteína completa como es descrita, los péptidós o fragmentos de esta proteína, tales como aquellos descritos en el documento WO 02/38176, se pueden utilizar como antígeno de vacuna. La proteína completa (que puede contener una o más mutaciones puntuales para tomar en cuenta las variaciones que existen entre las cepas de Plasmodium falciparum) o un fragmento de esta proteina, la. secuencia de aminoácidos de la cual tiene por lo menos 80% de identidad con respecto a la secuencia completa descrita en uniprot 096275-PLAF7 , es normalmente utilizada. La eficacia de ciertas vacunas antivirales es, en ciertos casos, evaluada sobre las bases del titulo de anticuerpos neutralizantes que ellos inducen. Este es el caso de la vacuna de gripe, la eficacia de la cual se relaciona al titulo de anticuerpos que inhiben la hemaglutinación (HAI). La emulsión de acuerdo con la invención se utiliza para preparar una composición de vacuna para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas en humanos o animales (aves, caballos) enlazados con el virus de gripe. Dependiendo de la naturaleza de la vacuna de gripe, la composición de vacuna puede estar en varias formas: - Cuando la vacuna de gripe contiene una o más cepas de virus completa inactivada o "dividida", o está en la forma de una vacuna de subunidad que contiene hemaglutinina purificada de una o más cepas virales, o en la forma de virosomas (vacuna Berna) , la composición de vacuna está usualmente en la forma de una mezcla, de una emulsión de O/W o de una emulsión de O/W termorreversible. - Cuando la vacuna de gripe, contiene una o más cepas de virus vivientes atenuadas, la composición de vacuna está de preferencia en un dispositivo, del tipo jeringa de desviación, tal como el virus viviente no está en contacto directo con la emulsión. La suspensión y emulsión viral de acuerdo con la invención están en dos diferentes compartimentos de la jeringa. Las vacunas de gripe se manufacturan de virus de gripe cultivados en huevos o en células de acuerdo con los métodos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, y todos comprenden, como un componente esencial, la hemaglutinina de una o más cepas de virus. Un objetivo de la invención es por lo tanto también el uso de una emulsión de acuerdo con la invención, para preparar una composición de vacuna que comprende, como antigeno de vacuna, una o más hemaglutininas de virus de gripe. Esta composición de vacuna se puede utilizar para inmunizar : 1) poblaciones de individuos quienes son seronegativos con respecto al virus de gripe: estos son individuos quienes nunca han estado en contacto o sensibilizados con el virus de gripe o sus componentes inmunogénicos , individuos quienes nunca han estado en contacto con una nueva cepa del virus de gripe responsable para una pandemia; 2) poblaciones de individuos quienes son seropositivos con respecto al virus de gripe: estos son individuos quienes ya han estado en contacto o sensibilizados con el virus de gripe o sus componentes inmunogénicos ; 3) poblaciones de individuos de avanzada edad quienes comúnmente exhiben un deterioro de inmunidad celular y/o humoral, que se observa en particular con respecto al virus de gripe. La emulsión de acuerdo con la invención también se utiliza para ' preparar una composición de vacuna para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas causadas por el virus de herpes (HSV1, HSV2, citomegalovirus (CMV) ) . Los antigenos de envoltura viral son generalmente utilizados en la composición de vacuna. En infecciones de CMV, los anticuerpos que se dirigen contra las proteínas de envoltura viral, principalmente glicoproteína B (gB) y glicoproteína H (gH) y que neutraliza la infección viral, desempeña una función muy importante en el desarrollo de una inmunidad protectora. El uso de una emulsión de acuerdo con la invención en la preparación de una composición de vacuna que contiene una proteína de envoltura de CMV tiene el efecto de incrementar la producción de anticuerpos neutralizantes. Un objetivo de la invención por lo tanto es el uso de una emulsión de acuerdo con la invención, para preparar una composición de vacuna que comprende, como antígeno de vacuna, un antigeno de envoltura de CMV. Típicamente, el antígeno es la glicoproteína gB y/o la glicoproteina gH . También puede ser un péptido o un derivado de polipéptido de gB y/o de gH, que comprende uno o más épitopes neutralizantes. gB en su forma nativa (gpl30), codificada por el gen UL 55 de CMV, es una glicoproteína de 906 o 907 aminoácidos, dependiendo de si la cepa AD169 o la cepa Towne está involucrada. La secuencia de proteína de estas dos cepas son descritas en la Patente Norteamericana No. 2002/0102562 (figura 2) . La forma nativa de gB contiene una secuencia de señal seguido por un domino extracelular que contiene un sitio de segmentación endoproteolítico entre los residuos de arginina 460 y serina 461, por un domino transmembrana y por un dominio intracelular . Han sido descritos varios dominios antigénicos que inducen anticuerpos neutralizantes. Esto involucra en particular el dominio localizado entre los residuos de aminoácidos 461 y 680 de gp 130, este dominio que es subdividido en dos dominios discontinuos, el dominio entre los residuos 461 y 619 y el dominio entre los residuos 620 y 680 (Patente Norteamericana No. 5,547,834). También involucra el dominio AD-1 localizado entre los residuos de aminoácidos 552 y 635 o el dominio AD-2 localizado entre los residuos de aminoácidos 50 y 77 (Journal of General Virology (1999), 80, 2183-2191; Journal of Virology (2005), 79, 4066-4079).

Consecuentemente, un polipéptido que comprende, en su secuencia de aminoácidos, una secuencia homologa para uno de los dominios mencionados es adecuada para el objetivo de la invención. Típicamente, el polipéptido comprende, en su secuencia de aminoácidos, una secuencia homologa a esa que se localiza entre los residuos 461 y 680 de gp 130, o más específicamente a esa que se localiza entre los residuos 552 y 635. El término "secuencia homologa" se propone para dar a entender cualquier secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos del dominio antigénico bajo la consideración localizada sobre gp 130 de la cepa Towne o AD 169 (descrita en la Patente Norteamericana No. 2002/0102562) . Típicamente, la homología de secuencia está basada sobre una identidad de por lo menos 90%, y aun más particularmente, la homología de secuencia está basada sobre una identidad de secuencia de 100%. Entre los péptidos derivados de gB o polipéptidos que son adecuados para el objetivo de la invención, la mención es en particular hecha de gp 55 como es descrita en la Patente Norteamericana No. 5,547,834. Esto se deriva de la segmentación de gB al sitio de segmentación endoproteolítico; su secuencia de aminoácidos corresponde a ese que está entre el residuo de serina 461 y el extremo C-terminal. Las formas truncadas de gp 55 también se pueden utilizar, tal como un gp 55 residuo de todo o parte de la secuencia transmembrana y de todo o parte del dominio C-terminal intracelular (por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia homologa a la secuencia de aminoácidos de gpl30 entre los residuos 461 y 646) o un gp 55 reducido de todo o parte del dominio C-terminal intracelular (por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia homologa a la secuencia de aminoácidos de gpl30 entre los residuos 461 y 680) que son descritos en la Patente Norteamericana No. 5,547,834. También es posible usar una forma mutada de gB que lleva una o más mutaciones al sitio de segmentación endoproteolitico tal que el último se hace ineficaz. La(s) mutación(es) es (son) localizada ( s ) entre los residuos 457 y 460 de la secuencia de gpl30, y más particularmente es (son) localizada (s) en arginina 460 y/o lisina y/o arginina 457. Un antigeno de envoltura de CMV que es particularmente adecuado para el objetivo de la invención es una forma truncada de gB deteriorada de todo o parte del dominio C-terminal y/o deteriorado de todo o parte de la secuencia transmembrana y en que el sitio de segmentación es ineficaz. Una forma truncada de gB que es particularmente preferida corresponde a esa que es descrita en la Patente Norteamericana No. 6,100,064, llamada gBdTM; esta lleva tres mutaciones al sitio de segmentación y una supresión en la región transmembrana entre los residuos de aminoácidos de valina 677 y arginina 752, tal que el dominio extracelular es directamente conectado al dominio citoplásmico .

La proteína gB o los péptidos o polipéptidos derivados de los mismos se obtienen por medio de los métodos de recombinación genética y purificados de acuerdo con los métodos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Los métodos descritos en la Patente Norteamericana No. 6,100,064 y en la Patente Norteamericana No. 2002/0102562, incorporadas a manera de referencia, pueden en particular ser utilizadas. Para incrementar su inmunogenicidad, pueden ser secundariamente conjugados a una proteína portadora fusionada a otras proteínas, en particular a proteínas que forman partículas tales como el antígeno de superficie de hepatitis B (HbS) . La proteína gB o los péptidos derivados de los mismos también se pueden expresar mediante virus recombinantes , en particular mediante adenovirus recombinantes o poxvirus recombinante . Para preparar estos vectores recombinantes que expresan gB o derivados de péptidos, los métodos que son descritos en particular en la Patente Norteamericana No. 6,162,620, Patente Norteamericana No. 5,866,383, Patente Norteamericana No. 5,552,143, Patente Norteamericana No. 6,183,750, Patente Norteamericana No. 5,33,8,683 o Documento WO 9215672 o en el Documento WO 9639491 son utilizados. La gB también se puede proporcionar mediante una cepa de C V que ha sido atenuada mediante pasajes sucesivos sobre los cultivos celulares, en particular la cepa Towne que ya ha sido probada para propósitos de vacuna . La proteína gH es codificada por el gen UL 75 de CMV. Es una glicoproteína de 742 o 743 aminoácidos dependiendo de si la cepa es la cepa Towne o la cepa AD169. Las secuencias son descritas en la Patente Norteamericana No. 5,474,914 (figura 1) y en la Patente Norteamericana No. 6,610,295 (figura 5(a)). La secuencia de proteína de la gH deduce de su secuencia de nucleótido que contiene un péptido de señal seguido por un dominio extracelular que no tiene un sitio de segmentación endoproteolítico, por un dominio transmembrana y por un dominio citoplásmico C-terminal. Los épitopes neutralizantes están en el dominio extracelular, principalmente en la porción N-terminal de este dominio, más específicamente entre residuos de aminoácidos 15 y 142 de ña secuencia de proteína de gH nativo, y aun más específicamente entre residuos de aminoácidos 33 y 142. Un mayor épitope neutralizante de la cepa AD 169 se ha identificado y está entre los residuos 33 y 43 de la secuencia de gH y tiene la secuencia LDPHAFHLLL (Urban M y colaboradores, : J. Virol (1992, volumen 66/3, páginas 1303-1311)). Consecuentemente, un polipéptido que comprende, en su secuencia de aminoácidos, una secuencia homologa a la secuencia LDPHAFHLLL o una secuencia homologa a esa que está entre los residuos 15 y 142 o entre los residuos 33 y 142 de la secuencia de proteína de gH es adecuada para objetivo de la invención. El término "secuencia homologa" se propone para dar a entender una secuencia de aminoácidos que tiene has por lo menos 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos que está ya sea entre los residuos 15 y 142 o entre los residuos 33 y 142 de la secuencia de proteina de gH de la cepa AD 169, o con la secuencia LDPHAFHLLL. Más particularmente, la homología de secuencia está basada sobre una identidad de por lo menos 90% y aun más particularmente la homología de secuencia está basada sobre una secuencia de identidad de 100%. Como péptidos o polipéptidos derivados de gH que son adecuados para el objetivo de la invención, la mención se hace de gH agotado de todo o parte de su región transmembrana y/o agotado de todo o parte de su región citoplásmica . Típicamente, esto corresponde a una proteína gH de la cual por lo menos 5 residuos C-terminales , de preferencia por lo menos 10 residuos C-terminales y aun más de preferencia entre 20 y 34 residuos del extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos ha sido suprimidos. La proteína gH y los polipéptidos o los péptidos derivados de los mismos se obtienen por medio de métodos de recombinación genética y purificados de acuerdo con métodos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, en particular aquellos descritos en la Patente Norteamericana No. 5,474,914 o en la Patente Norteamericana No. 5,314,800, incorporadas a manera de referencia. Para incrementar su inmunogenicidad, pueden ser secundariamente conjugadas a una proteina portadora. También se pueden producir en la forma de proteínas de fusión, como es descrito en J. Virol (1992, volumen 66/3, páginas 1303-1311). La proteína gH y los polipéptidos y los péptidos derivados de los mismos también se pueden expresar mediante virus recombinantes , en particular mediante adenovirus recombinantes o poxvirus recombinantes. Para preparar estos vectores recombinantes que expresan gH o derivadas formas, los métodos que son descritos en particular en la Patente Norteamericana No. 6,162,620, la Patente Norteamericana No. 5,866,383 o la Patente Norteamericana No. 5,552,143, o en el Documento WO 9639491 son utilizados. La proteína gH también se puede proporcionar mediante una cepa de CMV que ha sido atenuada por pasajes sucesivos sobre cultivos celulares, en particular la cepa Towne que ya ha sido probada para propósitos de vacuna. También es posible usar, como antígeno de vacuna, una proteína resultante de fusión entre la glicoproteína gB o la glicoproteína gH (o una forma truncada de las glicoproteínas ) y una proteína de membrana de HSV1 o de HSV2 (o una forma truncada de la misma) . A manera de ejemplo, la mención se hace de las proteínas de fusión descritas en el Documento EP 0759995, en particular gB 685* y gB 685** que resultan de la fusión entre una porción de la glicoproteína gB de CMV una porción de la glicoproteína gD de HSV.

Dependiendo de la naturaleza del antigeno CMV, la composición de vacuna puede estar en varias formas: - Cuando el antigeno es una proteina o un péptido, la composición de vacuna puede estar en la forma de una mezcla, de una emulsión de 0/W o de una emulsión de 0/ termorreversible . También puede estar en la forma de una preparación extemporánea que se prepara justo antes de la administración. La composición de vacuna también puede estar dentro del dispositivo, tal como una jeringa de "desviación" que físicamente separa el antígeno de la emulsión. - Cuando el antígeno CMV está en la forma de un virus recombinante que expresa gB; gH o péptido derivado de gB o gH, o cuando está en la forma de una cepa atenuada de un CMV, el antígeno y la emulsión de acuerdo con la invención no están usualmente en contacto directo en la composición dé vacuna. El antígeno y la emulsión pueden estar dentro de un dispositivo que físicamente los separa, tal como una jeringa de "desviación", pero se administran al mismo tiempo al mismo sitio de administración. La emulsión de acuerdo con la invención también orienta la respuesta celular T CD4+ específica hacia un perfil Thl al promover la producción de citoquinas Thl (IL2, IFN-?, etc.) y/o al disminuir la producción de citoquinas Th2 (IL4, IL5, IL10, etc.) en respuesta a un antígeno presentado en una contexto MHC clase II. Este efecto se evalúa al medir la cantidad de IFN-? y IL5 producida después de la reestipulación in vitro con un antigeno relacionado a ese que se utilizó para la inmunización in vivo al determinar la relación IFN-y/IL5. Entre más alta la relación, más la respuesta de CD4+ tiende hacia un tipo Thl. El perfil de respuesta celular T CD4+ también se puede evaluar indirectamente al medir la relación entre el titulo Ig2as especifico/IgGls especifico obtenido después de la inmunización de ratones con una composición de vacuna de acuerdo con la invención. La emulsión de acuerdo con la invención por lo tanto puede ser utilizada para corregir una desproporción en la respuesta celular T CD4+ que se observa en ciertas poblaciones de individuos quienes muestran una deficiencia inmune o un deterioro del sistema inmune. Estos son en particular individuos de avanzada edad quienes muestran un deficiencia en la producción de IFN-? y/o IL2 subsecuente a una estimulación in vitro con antigenos originados de microorganismos intracelulares , en particular con un antigeno de gripe (Ouyang y colaboradores, (Mechanisms of ageing and development ) , 2000, volumen 121, 131-137) . El objetivo de la invención es por lo tanto el uso de una emulsión, de acuerdo con la invención, para preparar una composición de vacuna propuesta para una población de individuos quienes muestran una desproporción en la respuesta celular T CD4 + . Un objetivo de la invención también es un método para preparar una emulsión de 0/W de acuerdo con la invención, que comprende una etapa en la cual una emulsión inversa de W/0 se obtiene al elevar la temperatura y una etapa en la cual la emulsión inversa de W/0 se convierte a una emulsión de 0/W al disminuir la temperatura. Esta conversión toma lugar cuando la emulsión de W/0 obtenida es inferior a una temperatura por debajo de la temperatura de inversión de fase de esta emulsión. De acuerdo con una modalidad del método, la emulsión de W/0 se obtiene al llevar cabo una primera etapa en la cual una fase acuosa que comprende un solvente acuoso, un éter alquilico de polioxietileno y un agonista de TLR4 se mezcla con una fase de aceite que comprende escualeno y un surfactante hidrofóbico no iónico para obtener una emulsión de 0/W, y una segunda etapa en la cual la emulsión de 0/W se calienta a una temperatura que es por lo menos la temperatura de inversión de fase de la emulsión. La fase acuosa que comprende la solución acuosa (usualmente una solución reguladora) , el agonista de TLR4 (si no está en la fase aceitosa) y el surfactante hidrofilico no iónico se incorpora en la fase aceitosa que comprende el escualeno, y el surfactante hidrofóbico no iónico, o vise versa: la fase aceitosa se incorpora en la fase acuosa. Esta incorporación se lleva a cabo con agitación mecánica. Se obtiene una emulsión de 0/W gruesa inestable, no calibrada (preemulsión) . Esta preemulsión se calienta con agitación mecánica hasta que la inversión de fase se obtiene, es decir, se obtiene una emulsión de W/0. La inversión de fase o transición se puede seguir por conductimetria . La temperatura a la- cual el cambio de curvatura refleja el pasaje desde un tipo de emulsión a otra ocurre es la temperatura de inversión de fase. En realidad, esta temperatura es un intervalo de temperatura antes que un valor puntual muy especifico; de hecho, se puede considerar que esta temperatura es capaz de variar por uno o dos grados, de modo que la emulsión entera se someta al fenómeno de inversión de fase. Cuando la emulsión está en la forma de una emulsión de W/O, se observa una gotita abrupta en la conductividad. El calentamiento se detiene y la mezcla se enfria. El enfriamiento se puede llevar a cabo pasivamente, al permitir simplemente que la temperatura regrese espontáneamente a la temperatura ambiente, o más activamente, por ejemplo, al sumergir la emulsión en un baño de hielo. Durante la disminución en temperatura, la emulsión de W/O nuevamente regresará a la temperatura de inversión de fase para nuevamente dar una emulsión de O/W. La emulsión se puede almacenar mientras que se espera la dilución con una solución que comprende el antigeno de vacuna. Esto es termorreversible, lo cual significa que, si es nuevamente conducida a una temperatura por lo menos igual a la temperatura de inversión de fase, nuevamente llegará a ser una emulsión de /0. La temperatura de inversión de fase está usualmente entre 45 y 80°C, y típicamente entre 50 y 65°C. Los componentes de la emulsión, en particular el agonista de TLR4 , son de esta manera sometidos al calentamiento moderado con evaporación previa de la fase acuosa o degradación química de los componentes. De acuerdo con otra modalidad, la emulsión de W/O se obtiene al calentar separadamente una fase acuosa que comprende un solvente acuoso, un éter alquílico de polioxietileno y un agonista de TLR4 y una fase aceitosa que comprende escualeno y un surfactante hidrofóbico no iónico, a una temperatura que es por 1? menos igual a la temperatura de inversión de fase de la emulsión y luego al mezclar la fase acuosa con la fase aceitosa mientras que al mismo tiempo se conserva la temperatura de la mezcla a una temperatura que es por lo menos igual a la temperatura de inversión de fase. En este caso, las fases acuosa y aceitosa se calientan separadamente a una temperatura ligeramente arriba de la temperatura de inversión de fase, antes del mezclado para dar una emulsión inversa de W/O, que subsecuentemente será enfriada hasta que la emulsión de O/W submicrónica se obtiene. Estas operaciones se llevan a cabo en contenedores separados para una preparación de lotes.

También es posible usar un método de manufactura en linea. El método consiste en mezclar, bajo condiciones calientes, las dos fases acuosa y aceitosa preparadas separadamente, a través de un mezclador estático de termostato, seguido por el enfriamiento en linea a través de un intercambiador de calor refrigerado conectado a la salida del mezclador estático, y luego mediante la recuperación final de la emulsión de acuerdo con la invención en un contenedor apropiado (matraz o reactor) . Un mezclador estático que consiste de una sucesión de elementos de mezclado compuestos de cuchillas cruzadas que están inclinadas con respecto al eje del tubo en el cual están introducidas han sido utilizadas exitosamente. La energía requerida para el mezclado se proporciona por las bombas que transportan los fluidos y el mezclado se lleva a cabo sin partes móviles, a través de los elementos de mezclado mediante separación sucesiva, desplazamiento y combinación de los constituyentes de la mezcla. El método de manufactura en línea se lleva a cabo de la siguiente manera: la fase acuosa y la fase aceitosa se preparan separadamente, como en lo anterior, en dos matraces o reactores. Las dos fases se calientan con agitación a una temperatura ligeramente arriba de la temperatura de inversión de fase. Las dos fases luego se introducen en un mezclador estático de termostato por medio de 2 bombas, las velocidades de flujo de las cuales se regulan para obtener la composición de la emulsión de acuerdo con la invención. La emulsión inversa de W/0 se obtiene durante el pasaje de las dos fases a través del mezclador estático. La emulsión inversa se enfria subsecuentemente mediante el pasaje en linea a través de un intercambiador de calor refrigerado conectado a la salida del mezclador estático. La emulsión de W/0 luego regresará a través del intercambiador de calor refrigerado para dar elevación a una emulsión de 0/W, la cual será recolectada en un matraz o reactor y las características de la cual son idénticos a aquellos de la emulsión obtenida por medio de un método de lotes . Alternativas a las modalidades del método que ha sido precisamente descrito existen; cuando el comportamiento o el agonista de TLR4 es más hidrofóbico que hidrofílico, se introduce en la fase aceitosa antes que en la fase acuosa. El agonista de TLR4 también se puede introducir después de que el mezclado de la fase aceitosa y la fase acuosa ha sido llevado a cabo, o cuando la emulsión ha sido ya calentada y está en una forma de emulsión de W/0. La fase acuosa también puede contener un alditol. Finalmente, el método para preparar la emulsión de acuerdo con la invención puede comprender varios ciclos de termoinversión sucesivos. Un objetivo de la invención también es un método para preparar una composición de vacuna, en la cual por lo I menos un antígeno de vacuna se mezcla con una emulsión de 0/W que contiene un agonista de TLR4 , la estructura química de la cual no comprende un anillo de azúcar, caracterizado en que la emulsión de 0/W que contiene el agonista de TLR4 se ha preparado de acuerdo con un método de inversión de fase que comprende una etapa en la cual una emulsión se obtiene en la forma de una emulsión inversa de W/0 al incrementar la temperatura y una etapa en la cual la emulsión de W/0 se convierte a una emulsión de 0/W al bajar la temperatura. Una modalidad simple consiste en mezclar una solución acuosa de un antígeno de vacuna en una emulsión de 0/W termorreversible obtenida de acuerdo con una de las modalidades que han sido descritas. La composición de vacuna obtenida está en la forma .de una emulsión de 0/W o en la forma de una emulsión de 0/W termorreversible cuando la cantidad de escualeno representa en peso por lo menos 5% del peso total de la composición de vacuna. Alternativamente, el antígeno se puede mezclar con la fase acuosa o con la fase aceitosa antes de preparar la emulsión. Llevando a cabo el procedimiento de esta manera por supuesto implica que estos son antígenos que son compatibles con el método de termoinversión . Las soluciones de antígeno también pueden contener sales minerales y una o más soluciones reguladoras y también cualquier otro compuesto normalmente utilizado en vacunas, tales como estabilizadores; conservadores u opcionalmente , además, otros adyuvantes. ? manera de indicación, la concentración de antigeno en la solución acuosa está generalmente entre 1 µ?/ml y 1 mg/ml. El método de acuerdo con la invención también puede incluir una etapa de liofilización . Una concentración liquida concentrada primero se prepara como ha sido descrita, pero de preferencia se selecciona, como solución acuosa, agua antes que una solución reguladora. Esta emulsión se diluye subsecuentemente en un sustrato de liofilización que comprende un alditol, un azúcar y un alquilpoliglicósido . Un sustrato de liofilización normalmente utilizado comprende manitol, sacarosa y maltósido de dodecilo. La emulsión diluida luego se divide en muestras (por ejemplo 0.5 mi) y se somete a un ciclo de liofilización que se puede llevar a cabo de la siguiente manera: - cargar las muestras a +4°C, - congelar durante aproximadamente 2 horas a una temperatura ajustada de -45°C, - desecación primaria durante 14 a 19 horas a una temperatura ajustada de 0°C, - desecación secundaria durante 3 horas 30 min a una temperatura ajustada de +25°C. El liofilizado obtenido generalmente se conserva a una temperatura en la región de +4°C antes de que se mezcle con uno o más antigenos de vacuna. Una composición de vacuna de acuerdo con la invención de esta manera se puede preparar al tomar la emulsión liofilizada con una solución acuosa de antigenos y luego se puede conservar como está (es decir en el estado liquido) , o se puede someter a un ciclo de liofilización adicional para ser conservada en la forma de un liofilizado, si la naturaleza de los antigenos permite esto. Alternativamente, es posible diluir directamente la emulsión concentrada con una solución acuosa que comprende tanto los antigenos de vacuna como el alditol, el azúcar y el alquilpoliglicósido y para someter subsecuentemente la composición obtenida a la liofilización . Una manera tal de llevar a cabo el procedimiento implica, por supuesto, que los antigenos sean compatibles con un proceso de liofilización . Los ejemplos que siguen ilustran varias modalidades de la invención de una manera no limitativa. Ejemplo I: Preparación de una emulsión de 0/ termorreversible concentrada que contiene 32.4% de escualeno (p/p) Una solución de manitol a 18% en solución reguladora de fosfato (p/p) se preparó con agitación mecánica a 40°C. 0:093 g de EumulginMR Bl se adicionó a 0.454 g de esta solución, que se homogenizó con agitación mecánica a 40°C durante 5 min. Una suspensión de extracto que contiene 1000 µg/ml del compuesto químico ER804057 en una solución reguladora Tris 50 mM se preparó. 390 µ? de la suspensión de extracto de ER804057 se adicionaron a la mezcla ™Bl/manitol. En otro contenedor, 0.073 g de DehymulsMR SMO se mezcló con 0.484 g de escualeno y la mezcla se homogenizó mediante agitación mecánica durante 5 minutos a 30°C. El contenido de la fase acuosa que contiene ER804057 se incorporó subsecuentemente, con agitación a aproximadamente 30°C, en la fase aceitosa que contiene la mezcla Dehymuls™ S O/escualeno . La emulsión cruda obtenida se calentó, con agitación mecánica, hasta que la temperatura alcanzó 60°C. Esta temperatura corresponde a la temperatura de inversión de fase de esta composición. La emulsión luego está en la forma de una emulsión inversa (emulsión W/O) . El calentamiento se detuvo subsecuentemente, pero la agitación se mantuvo hasta que la temperatura alcanzó la temperatura ambiente del laboratorio («20°C). La emulsión regresa a la forma de una emulsión de O/W. Una emulsión de O/W termorreversible homogénea se obtuvo de esta manera, en la cual más de 90% de la población por volumen de las gotitas de aceite tiene un tamaño < 200 nm y en la cual la composición en peso es como sigue: 32.4% de escualeno, 6.2% de cetearet-12 (Emulgin Bl), 4.9% de monooleato de sorbitan (dehymuls SMO), 5.5% de manitol, 0.026% de ER804057. La cantidad de escualeno en esta emulsión de adyuvante por lo tanto representa 32.4% del peso total de la emulsión. En otra variante, una mezcla que contiene 50.5 g de una solución reguladora de fosfato', 6 g de manitol, 6.18 g de Eumulgin™ Bl y 0.026 g de ER804057 se preparó en una vaso de laboratorio. Esta mezcla se conservó agitando a aproximadamente 40°C. La fase aceitosa se preparó, en otro recipiente, al mezclar 32.5 g de escualeno con 4.8 g de Dehymuls SMO, con agitación magnética, hasta que el Dehymuls SMO tuvo completamente disuelto. Cuando las fases homogéneas se han obtenido, la incorporación de la fase acuosa en la fase aceitosa y las etapas de incremento de temperatura seguido por la etapa de disminución de temperatura se llevaron a cabo como en lo anterior. Una emulsión de O/W termorreversible homogénea se obtuvo, en la cual más de 90% de la población por volumen de las gotitas de aceite tienen un tamaño < 200 nm y en la cual la composición en peso es como sigue: 32.5% de escualeno, 6.2% de cetearet-12 (Eumulgin Bl), 4.8% de monooleato de sorbitan (Dehymuls SMO), 6% de manitol, 0.026% de ER804057, 50.5% de PBS. En otra variante del método, una solución reguladora de citrato, pH 6.04, se preparó al mezclar 0.83 mM de monohidrato de ácido cítrico con 9·.14 mM de citrato de sodio, se utilizó en lugar de la solución reguladora de PBS. Esta emulsión de escualeno concentrada se utilizó como una emulsión de "extracto", de la cual se derivaron emulsiones de.. O/W termorreversibles diluidas mediante la dilución en una solución reguladora de fosfato, una solución reguladora de Tris o una solución reguladora de citrato, las cuales luego se esterilizaron mediante filtración (ver ejemplo II) . Estas emulsiones de O/W diluidas se mezclan subsecuentemente con uno o más antígenos de vacuna (ver ejemplos III, IV y V) . Ejemplo II: Estudio de la estabilidad de una emulsión de O/W termorreversible diluida que contiene 5% de escualeno (p/p) La emulsión concentrada del ejemplo 1 se diluyó en una solución reguladora de fosfato 9.6 mM (pH = 7.4) para obtener una emulsión diluida en la cual la cantidad de escualeno representa 5% del peso total de la emulsión. La composición de la emulsión diluida, llamada PIT-ER804057 a 5%, fue como sigue: Escualeno: 50 mg/ml Cetearet-12 (Emulgin Bl) : 9.5 mg/ml Monooleato de sorbitan (dehymuls SMO) : 7.4 mg/ml Manitol: 9 mg/ml ER804057: 40 µ9 ??1 La estabilidad de esta emulsión termorreversible se evaluó después del almacenamiento durante 6 meses a una temperatura de +4°C al verificar el contenido de ER804057 en la emulsión y el tamaño de distribución de la emulsión. Al ensayo ER804057, una extracción selectiva de ER804057 de la emulsión se llevó a cabo, seguido por el análisis mediante la cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) acoplada a un detector de arreglo de diodo (detección UV) . El contenido de ER804057 de la emulsión que es verificado se determinó utilizando un intervalo estándar que contiene entre 5 y 25 de ER804057. Para compensar las variaciones en rendimientos de extracción, una cantidad constante de un estándar interno, la estructura química de la cual es muy similar a esa de ER804057, se introdujo a cada muestra que es analizada (que se incluye en las muestras de intervalo estándar) . Este estándar interno es la molécula química llamada ER803022. El intervalo estándar se preparó de una emulsión termorreversible la cual tiene la misma composición y se ha preparado de la misma manera como la emulsión PIT-ER804057 al 5% (cf. ejemplo 11), excepto que no contuvo cualquier ER804057 (emulsión PIT al 5%), a la cual se adicionaron una cantidad variante de ER804057 tomada de una solución de extracto de ER804057 a 0.1 mg/ml de una mezcla que contiene 2 volúmenes de cloroformo por volumen de metanol (mezcla CM 2:1) y una cantidad fija de un estándar interno (10 µg) , tomada de una solución de extracto de un estándar interno a 0.1 mg/ml de la mezcla CM 2:1, la cual se diluyó conforme es apropiado en agua para la preparación inyectable. La muestra de PIT-ER804057 al 5% que es analizada se preparó al tomar una alícuota de la emulsión PIT-ER804057 al 5%, a la cual 10 iq del estándar interno se adicionaron, y a la cual se diluyó en agua para la preparación inyectable. La extracción de ER804057 de las muestras del intervalo estándar o de las muestras de PIT-ER804057 al 5% se llevó a cabo de la siguiente manera: La muestra se solubilizó con CM 2 : 1. El sistema de fase dos obtenido está compuesto de una fase de cloroformo que contiene predominantemente ER804057 y una fase acuosa que contiene los otros compuestos de la emulsión. La fase de cloroformo se recuperó y evaporó bajo condiciones calientes bajo una corriente de nitrógeno. El extracto seco obtenido se tomó y nuevamente se solubilizó en la mezcla CM 2:1. La mezcla se cargó en un cartucho de intercambio de anión pre-equilibrado en la mezcla CM 2:1. Esto selectivamente retuvo ER804057 y el estándar interno que se cargan negativamente, mientras que los otros componentes de la emulsión, que no se cargaron, se eliminaron. ER804057 y el estándar interno se eluyeron por medio de una mezcla que contiene 2 volúmenes de cloroformo y 3 volúmenes de metanol, por volumen de NaCl 1 M. El eluido se secó subsecuentemente bajo condiciones de calor bajo una corriente de nitrógeno. Finalmente, una extracción final se llevó a cabo con agua y CM 2:1 para eliminar las sales residuales y recuperar el ER804057 y el estándar interno en la fase de cloroformo, el cual se evaporó finalmente bajo condiciones de calor bajo una corriente de nitrógeno. El extracto seco derivado de cada muestra se conservó a -20°C antes de que sea analizado mediante la HPLC. El extracto seco de cada muestra se tomó con 50 µ? de CM 4:1, y luego se diluyó a 1/2 en metanol, luego a 1/10-en una mezcla de acetonitrilo-agua al 30% para la formulación inyectable. 20 µ? de la dilución se inyectaron n un aparato de cromatografía líquida (Merck Hitachi HPLC, Lachrom series 7000) que comprende una columna Waters XTerraMR RP8 pre-equilibrada en .una fase móvil que consiste de 80% de fase A (50/50 de agua para la preparación inyectable/etanol que contiene 2% de H3P04) y 20% de fase B (etanol que contiene 2% de H3PO4) . El ER804057 y el estándar interno se eluyeron utilizando un gradiente de etanol que contiene 2% de H3PO4. A la salida de la HPLC, el eluido alcanzó el detector de arreglo de diodo y las moléculas se detectaron en la longitud de onda de 215 nm. En el cromatógrama obtenido, las áreas de superficie de los 2 picos (analito y referencia) se integraron y se correlacionaron. Para corregir las variaciones relacionadas con la preparación de la muestra, la curva estándar se estabilizó entre la relación de las áreas de superficie de los picos correspondientes a la ER 804057 (molécula cuantificada) y la ER803022 (estándar interno) acoplado y la relación de las concentraciones correspondientes para ER804057 y ER803022 (estándar interno) . Una vez que la curva se estabilizó, la cantidad de ER804057 presente en la emulsión PIT-ER804057 al 5% se determinó al medir la relación de las áreas de superficie de los picos ER804057 /estándar interno y al comparar con la curva estándar .

Los resultados mencionados en la tabla anterior muestran que ER804057 conserva su integridad estructural y que su concentración en la emulsión PIT-ER804057 al 5% no es sustancialmente variada después de que la emulsión ha sido conservada durante 6 meses a + 4°C. Los análisis de distribución de tamaño se llevaron a cabo, después de la dilución de la emulsión a 1/100, con el Mastersizer 2000, utilizando los siguientes parámetros: partícula IR = 1.495; medio IR = 1.332; valor de absorpción = 0; límite de obscurecimiento inferior = 4%; límite de obscurecimiento superior = 7%; "propósito general" modelo de análisis. Para cada análisis de distribución de tamaño, los siguientes parámetros se evaluaron: dlO, d50 y d90, los cuales representan respectivamente los valores de los diámetros de partícula medios por debajo de los cuales 10%, 50% and 90%, respectivamente, de la población por volumen de las gotitas de aceite es encontrada.

Estos resultados muestran que la distribución de tamaño de la emulsión es estable a +4°C durante un período de tiempo de por lo menos 6 meses. Ejemplo III: Composición de vacuna contra infecciones de citomegalovirus, preparadas de una emulsión de O/W de acuerdo con la invención Las composiciones de vacuna que comprenden, como antígeno de vacuna, una proteína recombinante la cual se deriva de la glicoproteína gB de CMV se prepararon. Esta proteína recombinante se produjo mediante una línea de CRO recombinante transfectada con- un plásmido llamado pPRgB27clv4, que contiene un gen gB modificado. Para facilitar la producción de esta proteina recombinante por la linea de CRO, el gen gB, la secuencia de la cual es descrita en la Patente Norteamericana No. 5,834,307, se modificó previamente al suprimir la parte del gen que codifica la región transmembrana de la proteina gB correspondiente con la secuencia de aminoácidos entre valina 677 y arginina 752 y al introducir 3 mutaciones puntuales al sitio de segmentación. La proteina producida por la linea CRO, llamada gBdTM, corresponde a una proteina gB truncada reducida del sitio de segmentación y de la región transmembrana. La construcción del plásmido pPRgB27clv4 y la producción de la proteina gB truncada (gBdTM) mediante la linea CRO recombinante son descritos en la Patente Norteamericana No. 6,100,064. La proteina gBdTM producida en el medio de cultivo se purifica subsecuentemente mediante la cromatografía por afinidad utilizando el anticuerpo monoclonal 15D8 descrito por Rasmussen L y colaboradores, (J. Virol. (1985) 55:274-280). La proteína purificada se almacenó en la forma de una solución de extracto que contiene 0.975 mg/ml de gBdTM en solución reguladora de fosfato. Las composiciones inmunoestimulantes de gBdTM y formuladas con varias composiciones de emulsiones de O/W o con una suspensión de hidróxido de aluminio se prepararon. Composición No. 1 contuvo 2 iq de gBdTM en solución reguladora de citrato a pR 6 en 50 µ? (grupo gB) . Composición No. 2 contuvo 2 µg de gBdTM, 1.075 mg de escualeno, 0.133 mg de trioleato de sorbitan (MontaneMR VG 85) y 0.125 mg de TweenMR80 en solución reguladora de citrato a pH 6 en 50 µ? (grupo gB+emulsión O/W) . Esta composición se obtuvo al mezclar, volumen por volumen, una solución de gB con una emulsión de O/W de la técnica previa la cual se obtuvo mediante microfluidi zación . Composición No. 3 contuvo 2 iq de gBdTM y 60 µg de hidróxido de aluminio en solución reguladora de fosfato 50/11 (grupo gB+AL) . Composición No. 4 contuvo 2 µq de gB, 1.25 mg de escualeno, 0.187 mg de DehymulsMR SMO, 0.237 mg de EumulginMRBl y 0.225 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4 en 50 µ? . Esta composición se obtuvo al mezclar, volumen por volumen, una solución de gB con una emulsión de O/W termorreversible que contiene 5% de escualeno (grupo gB+PIT) . La emulsión de O/W termorreversible utilizada para preparar esta composición se obtuvo mediante la dilución de una emulsión de O/W termorreversible concentrada que contiene 32.5% de escualeno (p/p) , la cual ha sido preparada utilizando el mismo método como es descrito en el ejemplo 1, excepto por el hecho de que la fase acuosa no contuvo cualquier ER804057. Composición No. 5 contuvo 2 µg de gBdTM y 1 de ER804057, en una solución reguladora de citrato, pH 6, en 50 µ? (grupo gB+ER804057) . Composición No. 6 contuvo 2 µg de gBdTM, 1.25 mg de escualeno, 0.145 mg de MontaneMR VG 85, 0.147 mg de TweenMR80 y 1 µg de ER804057 en solución reguladora de citrato a pH 6 en 50 µ? (grupo gB+emulsión O/W+ER804057 ) . Esta composición se obtuvo al mezclar, volumen por volumen, una solución de gB con una emulsión de O/W de . la técnica previa obtenida mediante microfluidización, a la cual ER804057 se ha adicionado. Composición No. 7 contuvo 2 µg de gBdTM, 1 µg de ER804057 y 60 µg de hidróxido de aluminio en una solución reguladora de fosfato en 50 µ? (grupo gB+Al+ER804057 ) . Composición No. 8 contuvo 2 µg de gB, 1.25 mg de escualeno, 0.189 mg de DehymulsMR SMO, 0.240 mg de EumulginMR Bl, 0.211 mg de manitol y 1 9 de ER804057 en solución reguladora de PBS a pH 7.4 en 50 µ? . Esta composición se obtuvo al mezclar, volumen por volumen, una solución de gB con una emulsión de O/W termorreversible PIT-ER804057 al 5% de escualeno, obtenida mediante la dilución de la emulsión de extracto del ejemplo 1 (grupo gB+PIT+ER804057 ) . Ocho grupos de diez ratones OF1 exogámicos hembras de 8 semanas de edad se inmunizaron subcutáneamente, en los dias DO y D21, con las composiciones indicadas anteriormente (a cada grupo de ratones se les dio 2 inyecciones de la misma composición) . Las muestras de sangre se tomaron del seno retro-orbital sobre D20 y sobre D34 y se utilizaron para determinar las concentraciones de anticuerpo IgGl e IgG2a especifico de gBdTM. Estos ensayos se llevaron a cabo mediante ELISA, al recubrir las cavidades de microplacas de 96 cavidades Dynex con 100 ng (100 µ?) de gBdTM en solución reguladora de carbonato 0.05 M a pH 9.6, a +4°C durante la noche. Para determinar los anticuerpos neutralizantes, se utilizó el protocolo descrito por Gonczol E. y colaboradores, en J. Virolgical Methods, 14 : 37-41 ¦( 1986) . Se utilizaron células MRC5 cultivadas en un medio MEM que contiene suero bovino fetal al 10%, entre los pasajes 28 y 38, para los análisis de microneutralización . La cepa CMV Towne (Wistar Institute, Filadelfia, US) purificada y propagada sobre células MRC5, que tienen un titulo de aproximadamente 2 x 106 PFU/ml se utilizó como la cepa de infección. Una fuente de complemento obtenida del suero de ratones de la Virion Ltd Institute (Suiza) también se utilizó. Una mezcla de suero humano que tiene un titulo a 1:128 se utilizó como un control positivo y se incluye en cada ensayo de microneutralización. Los sueros a ser probados se inactivaron al calentar a 56°C durante 30 minutos. 105 µ? de medio de cultivo (MEM + suero bovino fetal al 10%) se adicionaron a una alícuota 15 µ? de cada suero inactivado, en placas de cultivo de 96 cavidades de fondo plano (1/8 de dilución) . Luego se prepararon diluciones 2 veces en serie. Los sueros de control se probaron de la misma manera. 60 µ? de suspensión de virus que contiene 3000 PFü y 5 µ? de complemento de ratón se adicionaron a cada cavidad. Después de la incubación durante 1 hora a 37°C bajo C02, células RC5 3-4 x 104 en un volumen de 150 µ? de medio de cultivo se adicionaron a cada uno de las cavidades. Los microcultivos se cultivaron durante 4 días. La actividad citopática del virus fue 100% en las cavidades que no contuvieron cualquier suero. Por otra parte, una inhibición de la actividad citopática del virus se observó en las cavidades que contuvieron el suero neutralizante. El título anticuerpo neutralizante de un suero corresponde a la inversa de la dilución de la misma que inhibe la actividad citopática del virus por más de 90%. Los resultados que se obtuvieron para cada grupo de ratones se dan en las tablas después en la presente: Grupo de ratones IgGl a IgG2a a IgGl a IgG2a a relación a D20 D20 D34 D34 D34 IgGl/ IgG2a Grupo gB 2.47* 2.09 3.80 2.94 137 Grupo gB+emulsión de 4.06 2.98 5.49 4.18 143 O/ Grupo gB+AL 3.06 1.85 4.90 3.33 '357 Grupo gB+PIT 4.61 3.91 5.61 4.85 14 Grupo gB+ER804057 3.09 3.12 4.43 4.16 6 Grupo gB+PIT+ER804057 4.78 4.58 5.83 5.74 3 título medio de las diluciones del suero (expresado como 10) Estos resultados muestran que la emulsión PIT-ER804057 tiene una mayor capacidad inmunoestimulante que los otros adyuvantes puesto que los títulos IgGl e IgG2a específicos obtenidos en el grupo "gB+PIT+ ER804057" de ratones son significantemente más altos que aquellos obtenidos en los grupos "gB+AL" o "gB+emulsión O/W" de ratones. La capacidad inmunoest imulante de la emulsión de acuerdo con al invención no solamente es debido a la emulsión termorreversiblé (emulsión PIT) o al agonista de TLA4 , pero a la combinación de los dos productos. Los títulos IgGl e IgG2a específicos observados en los grupos "gB+PIT" y "gB+ER804057" son de hecho significantemente más bajos que aquellos que se observan en el grupo "gB+PIT+ER804057" . Tabla de resumen de producción de anticuerpo neutralizante Grupo de ratones Título de anticuerpo neutralizante medio Grupo gB 16** Grupo gB+emulsión O/W 32 Grupo gB+AL 32 Grupo gB+PIT 48 Grupo gB+ER804057 16 Grupo gB+emulsión O/W+ER804057 32 Grupo gB+AL+ER804057 32 Grupo gB+PIT+ER804057 128 inversa de la media de las diluciones de suero que inhiben el efecto citopático del virus por más de 90%. Estos resultados muestran que la composición inmunoestimulante de la mezcla de un antigeno de envoltura de CMV con una emulsión de O/W termorreversible que contiene un agonista de TLR4 como es descrito en la invención es aquel que induce el titulo de anticuerpo neutralizante más alto en los ratones. La emulsión PIT-ER804057 tiene una mayor capacidad para estimular la producción de anticuerpos neutralizantes que las otras pruebas de composiciones de adyuvante. La emulsión PIT-ER804057 se encuentra que es más efectiva (en términos de su capacidad para estimular la producción de anticuerpo neutralizante) que una emulsión de O/W basada en escualeno de la técnica previa que contiene los mismos componentes como la emulsión MF59, considerada hasta ahora que es el adyuvante de referencia para las proteínas CMV adyuvantes. También es notado que la adición de un agonista TLR4 a la emulsión de O/W de la técnica previa no incrementa la eficacia de esta emulsión (el título de anticuerpo neutralizante permanece al mismo) , mientras que la eficacia de una emulsión termorreversible (PIT) incrementa cuando contiene un agonista de TLR4 (el titulo de anticuerpo neutralizante se incrementa) . Ejemplo IV: Composición de vacuna contra la gripe preparada de una emulsión de 0/W de acuerdo con la invención Las composiciones inmunoestimulantes se prepararon de una composición de vacuna anti-gripe que comprende las 3 cepas de vacuna de la cepa de la campaña del 2004 (la A/New Caledonia (H1N1), la cepa A/Wyoming (H3N2) y la cepa B/Jiangsu, que se formula con varias composiciones de emulsiones de 0/W o con una suspensión de hidróxido de aluminio . Composición No. 1 contuvo 0.3 µg de hemaglutinina (HA) de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS en 30 µ? (grupo 0.3 µg HA) . Composición No. 2 contuvo 6.3 µg de hemaglutinina (HA) de cada una de las cepas virales en PBS en 30 µ? . (grupo HA 6.3 µ9) · Composición No. 3 contuvo 0.3 µg de hemaglutinina (HA) de cada una de las cepas virales, 0.65 mg de escualeno, 0.075 mg de trioleato de sorbitan (SpanMR 85) y 0.075 mg de TweenMRSO es solucióñ reguladora de PBS en 30 µ? (grupo 0.3 µg HA+emulsión 0/W) . Esta composición se obtuvo al mezclar la composición de vacuna anti-gripe con una emulsión de 0/W de la técnica previa obtenida mediante microfluidización . Composición No. 4 contuvo 0.3 µg de hemaglutinina (HA) de cada una de las cepas virales, 0.75 mg de escualeno, 0.11 mg de DehymulsMR SMO, 0.143 mg de EumulginMR Bl y 0.138 mg de manitol y 0.6 µg de ER804057 en solución reguladora de PBS a pH 7.4 en 30 µ? (grupo 0.3 µg HA+PIT+ERS04057 ) . Esta composición se obtuvo al mezclar la composición de vacuna anti-gripe con la emulsión termorreversible como es descrita en el ejemplo 1 y que se ha diluido por otra parte en la solución reguladora de PBS. Cuatro grupos de ocho ratones BALB/c hembra de 8 semanas de edad se inmunizaron al administrar intradérmicamente (cara interior de la oreja), en DO, una dosis de 30 µ? de una de las composiciones inmunoestimulantes indicadas anteriormente. Las muestras de sangre se tomaron del seno retro-orbital en D21 y se utilizaron para determinar los títulos de anticuerpos neutralizantes específicos para cada cepa viral (anticuerpos que inhiben la hemaglutinación (HAI)) obtenida en cada grupo de ratones inmunizados. El principio de este ensayo se basa en la habilidad de virus de gripe a células de glóbulos rojos aglutinantes mientras que un suero que contiene anticuerpos neutralizantes dirigidos específicamente contra al HA del virus que inhibe la actividad "hemaglutinante" del virus. Primeramente, los inhibidores no específicos contenidos en el suero se eliminaron al tratar el título con una enzima RDE (receptor que destruye enzima) proporcionada por Sigma y luego que entra en contacto con una solución al 10% de células de glóbulos rojos de pollo. Un sobrenadante liberado de inhibidores no específicos y que correspondió a un suero diluido a l/10th se obtuvo. Las diluciones 2 veces en serie del sobrenadante en solución reguladora de fosfato se prepararon subsecuentemente y luego 50 µ? de cada una de las diluciones se depositaron en las cavidades de una microplaca de fondo V. 50 µ? de una suspensión viral originada de un fluido alantoico clarificado titulado a 4 unidades de hemaglutinación (4HAU) se adicionaron a cada cavidad. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura de laboratorio antes de la adición de 50 µ? de una solución de células de glóbulos rojos de pollo o pavo a cada una de las cavidades. La placa se dejó reposar durante 1 hora a +4°C antes de que se leyera el ensayo. La presencia de la inhibición de hemaglutinación se reflejó por la presencia de una mancha roja en el fondo de la microcavidad, mientras que la presencia de la hemaglutinación se reflejó por la presencia de un halo rosáceo en la microcavidad. El título de anticuerpo HAI se representa a la inversa de la dilución final en que nada de hemaglutinación se observa en la microcavidad . Los resultados que se obtuvieron se dan en la tabla enseguida : Grupo de ratones HAI contra HAI contra HAI contra A/New Caledonia A/Wyoming B/Jiangsu (H1N1) (H3N2) 0.3 µ? HA 26*** 174 8 6.3 HA 247 907 73 0.3 µg HA+emulsión 135 987 57 O/W 0.3 µg 290 1522 98 HA+PIT+ER804057 medio de los títulos HAI obtenidos en los 8 sueros de cada grupo de ratones. Estos resultados muestran que la composición de vacuna obtenida al mezclar una vacuna de gripe con una emulsión de O/W termorreversible que contiene un agonista de TLR4 es aquella que induce el título de anticuerpo neutralizante más alto en el ratón irrespectivo de la cepa de vacuna probada, comparada con las otras composiciones de vacuna. La emulsión PIT-ER804057 se encuentra que es aun ligeramente más efectiva (en términos de su capacidad para estimular la producción de anticuerpo neutralizante) que una emulsión de O/W de la técnica previa, la composición de la cual es similar a MF59. La ventaja de esta emulsión también se encuentra en el hecho de que la cantidad de antígeno puede ser grandemente reducido puesto que los resultados obtenidos con una dosis de 0.3 µg de hemaglutinina mezclada con una emulsión PIT-ER804057 son mejores que aquellas que se obtienen con una dosis de hemaglutinina que es 20 veces más alta . En otro ensayo, la evaluación del titulo de anticuerpo que inhibe la hemaglutinina durante el tiempo fue seguido en grupos de ratones inmunizados con varias composiciones inmunoestimulantes preparadas de la misma vacuna de la campaña del 2004. Composición No. 1 contuvo 0.3 µg de hemaglutinina (HA) de cada una de las cepas virales en solución regulada de PBS en 30 µ? (grupo 0.3 µg HA). Composición No. 2 contuvo 6.3 µg de hemaglutinina (HA) de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS en 30 µ? (grupo 6.3 µg HA) . Composición No. 3 contuvo 0.3 µg de hemaglutinina (HA) de cada una de las cepas virales y 0.6 iq de ER804057 en una solución reguladora acuosa en 30 µ? (grupo 0.3 µg HA+ER804057) . Composición No. 4 contuvo 0.3 µg de hemaglutinina (HA) de cada una de las cepas virales, 0.30 mg de escualeno, 0.044 mg de DehymulsMR SMO, 0.057 mg de EumuIginMR Bl y 0.055 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4 en 30 µ? (grupo 0.3 µg HA+PIT al 1%). Composición No. 5 contuvo 0.3 µg de hemaglutinina (HA) de cada una de las cepas virales, 0.30 mg de escualeno, 0.044 mg de DehymulsMR SMO, 0.057 mg de EumulginMR Bl, 0.055 mg de manitol y 0.6 µ? de ER804057 en solución reguladora de PBS a pH 7.4 en 30 µ? (grupo 0.3 µg HA+PIT al 1%+ER804057 ) . Cinco grupos de cinco ratones BALB/c hembra de 8 semanas de edad se inmunizaron al administrar intradérmicamente (cara interior de la oreja), en DO, una dosis de 30 µ? de una de las indicaciones inmunoestimulantes indicadas anteriormente. Se tomaron muestras de sangre del seno retro-orbital en D23, D51 y D79 y se utilizaron para determinar los títulos de anticuerpos neutralizantes específicos para la cepa H1N1 (anticuerpos que inhiben la hemaglutinación (HAI) ) obtenida en cada grupo de ratones inmunizados. Los resultados que se obtuvieron se dan en la tabla que sigue. *: medio de los títulos de HAI obtenidos sobre los 5 sueros cada grupo de ratones. La eficacia de la emulsión PIT-ER804057 en términos de su habilidad para producir anticuerpos que inhiben la hemaglutinación del virus de gripe (anticuerpos protectores) es el resultado de la acción combinada de la emulsión y del agonista de TLR4 ; la emulsión PIT sola o ER804057 sola es menos efectiva. Ejemplo V: Composición de vacuna contra la gripe, preparada de una emulsión de acuerdo con la invención probada en una población de ratones jóvenes o viejos ya sensibilizados al virus de gripe La. eficacia de la emulsión de la invención se probó en el caso de una vacuna contra la gripe que seria administrada a individuos ya sensibilizados con el virus de gripe, ya sea debido a que estos individuos ya ha estado en contacto con el virus de gripe o debido a que ya han estado vacunados con una vacuna de gripe. Para llevar a cabo este tipo de evaluación, se pueden utilizar ratones preinmunizados intramuscularmente (1M) con una vacuna trivalente, de acuerdo con Potter y colaboradores, (Vaccine, 2003, 21:940-945), como un modelo animal que no es naive con respecto a la gripe. 5 grupos de 10 ratones C57B1/6 de 8-10 semanas edad recibieron mediante inyección 1M, una dosis de vacuna trivalente que contiene 1.5 µg de HA de cada una de las cepas A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Ne York/55/04 (H3N2) y B/Malaysia/2506/04.

En D28, con la excepción de un grupo (grupo PBS) el cual recibió una inyección de una solución reguladora de PBS, todos los otros grupos de ratones recibieron, intradérmicamente , en un volumen de 30 µ?, varias composiciones de vacuna que contienen una vacuna trivalente diferente que aquella que se utilizó para la inmunización primaria (A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Wellington/01/104 (H3N2) y B/Jiangsu/1/03) . Un grupo recibió una composición que contiene 0.3 µg de HA de cada una de las cepas en solución reguladora de PBS (grupo 0.3 µg HA). Otro grupo recibió una composición que contiene 6.3 ^ig de HA de cada una de las cepas en solución reguladora de PBS (grupo 6.3 µg HA) . Otro grupo recibió una composición que contiene 0.3 µg de HA de cada una de las cepas en solución reguladora de PBS en una emulsión de O/W al 1% de escualeno que contiene 0.3 mg de escualeno, 0.044 mg de DehymulsMR SMO, 0.057 mg de EumulginMR Bl y 0.055 mg de manitol en solución reguladora de PBS. Esta composición que contuvo 1% de escualeno se preparó al mezclar la vacuna de gripe con una emulsión de O/W obtenida al diluir una solución de extracto termorreversible concentrada preparada de acuerdo con el mismo método como ese descrito en el ejemplo 1, excepto para el hecho de que la fase acuosa no contuvo cualquier ER804057 (grupo 0.3 µg HA +PIT al 1%) . Finalmente, el último grupo recibió una composición que contiene 0.3 µ? de HA de cada una de las cepas en solución reguladora de PBS en una emulsión de O/W al 1% de escualeno que contiene 0.3 mg de escualeno, 0.44 mg de DehymulsMR SMO, 0.057 mg de EumulginMR Bl y 0.055 mg de manitol en solución reguladora de PBS y 0.6 µq de ER804057. Esta composición que contuvo 1% de escualeno y 0.6 µg de ER804057 se preparó al mezclar la vacuna de gripe con una emulsión de O/W obtenida al diluir una solución de extracto termorreversible concentrada preparada de acuerdo con el mismo método como ese descrito en el ejemplo 1 (grupo 0.3 µg HA+PIT al 1%/ER 804057). En D50, los ratones se sacrificaron mediante eutanasia para recolectar una muestra de sangre y para tomar una muestra del bazo. Un ensayo de las HAIs con respecto a las cepas A/New Caldedonia/20/99 (H1N1), A/Wellington/10/04 (H3N2) y B/Jiangsu/10/03 se llevan a cabo en cada muestra de sangre. Los resultados que se obtuvieron se dan en la tabla que sigue. Grupo de ratones HAI contra HAI contra HAI contra A/New A/Wellington B/Jiangsu Caledonia (H3N2) (H1N1) grupo PBS 52* 48 13 grupo 0.3 µg HA 95 226 57 grupo 6.3 µg HA 190 640 226 grupo 0.3 µg 431 640 290 HA+PIT al 1% * representa el valor medio de los títulos de HAI obtenidos sobre los 10 sueros de cada grupo de ratones Estos resultados muestran que el título de HAI promedio en el grupo de ratones inmunizados con las composiciones de vacuna "HA +PIT al 1%/ER804057" que contienen una baja dosis de escualeno (1%) y del agonista de TLR4 (contiene 0.6 µg de ER804057) es significantemente más alta que los títulos obtenidos después de la inmunización de los ratones con la vacuna de gripe no adyuvante a una dosis equivalente de HA (grupo 0.3 µg HA) o a una dosis de HA 20 veces más alta (grupo 6.3 µg HA) . Estos resultados muestran la ventaja de la emulsión PIT al 1%/ER 804057, aun con una población ya sensibilizada con el virus de gripe, puesto que la cantidad de antígeno de gripe de cada cepa se puede reducir por un factor de 20, mientras que al mismo tiempo que obtiene títulos de anticuerpo protectores más altos con respecto a las 3 cepas del virus. La respuesta inmune celular específica se analizó sobre cada muestra del bazo utilizando la técnica ELISPOT y la técnica CBA (Arreglo de Cuenta Citométrico) para analizar la interferona-? y la IL5 producida por los esplenocitos después de la estimulación especifica. Con respecto a la técnica ELISPOT, 2xl05 esplenocitos en 200 µ? de un medio de cultivo (RPMI 1640, 10% de suero bovino fetal, glutamina 2 mM, ß-mercaptoetanol 50 mM) se depositaron en las cavidades de microplacas de nitrocelulósa presensibilizadas con un anticuerpo IFNy antiratón de rata (Pharmingen ref: 551216) o con un anticuerpo IL5 anti-ratón de rata (Pharmingen ref: 554393). Los esplenocitos se incubaron durante la noche a 37 °C en la presencia de de murino IL-2 (Bohringer) (10 U/ml) y de varios antigenos de gripe a una concentración de 1 µg/ml. Para el análisis de la respuesta celular CD8+, se utilizó un péptido NP de gripe (TYQRTRALV) reconocido en el contexto H-2kd. Para el análisis de la respuesta celular CD4+, el antigeno de gripe se representa por la vacuna dividida inactivada trivalente que contiene las cepas A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Wellington/10/04 (H3N2) y B/Jiangsu/10/03. Las microplacas luego se lavaron y los esplenocitos que secretaron IFNy o IL5 se detectaron por medio de un anticuerpo IFNy anti-ratón de rata biotinilado (Pharmingen ref: 554410) o un anticuerpo IL5 anti-ratón de rata biotinilado (Pharmingen ref: 554393) y por medio de estreptavidina conjugada con peroxidasa (Southern Biotechnology-ref 7100-05) . Después de la revelación utilizando 3-amino-9-etilcarbazol , las manchas correspondientes a los esplenocitos que secretan IFNy o IL5 se contaron por medio de un lector ELISPOT automático. Los resultados se expresaron como número de células que secretan IFNy o IL5 por 106 esplenocitos. El umbral de detección positiva es 20 manchas por 106 de esplenocitos. Como considera la técnica CBA, 4xl05 de esplenocitos en 200 µ? de un medio de cultivo (RPMI 1640, 10% de suero bovino fetal, glutamina 2 mM, mercaptoetanol 50 mM) se depositaron en las cavidades de microplacas de cultivo. Los esplenocitos se incubaron durante 5 días a 37°C en la presencia de la vacuna trivalente (a 1 µ?/?t??) o en la ausencia de agente estimulante para evaluar la producción no especifica de citoquinas (medio de control). El contenido de IFNy o el contenido de IL5 de los sobrenadantes de cultivo luego se analizaron mediante la citometria de flujo utilizando el equipo CBA Thl/Th2 de ratón (Becton Dickinson -ref: 551287). El umbral de detección positivo fue 2.5 pg/ml para IFNy y 5 pg/ml para IL5. Para cada muestra del bazo, las concentraciones especificas de IFNy o de IL5 se calcularon al sustraer del resultado la cantidad de IFNy o IL5 que se produce no específicamente. Los resultados de los análisis de respuesta celular se dan en la tabla que sigue: ratones espleno- espleno- de IFNy en de IL5 en de IFNy/ citos que citos que el el IL5 secretan secretan sobrenasobrena¬ IFNy IL5 dante de dante de cultivo cultivo PBS 19* 23* 148** 355** 21*** 0.3 µg HA 17 66 295 400 1.3 6.3 µ? HA 30 13 780 523 0.3 µ? 31 74 691 1301 0.6 HA+PIT al 1% 0.3 µ? 66 22 1499 640 4.1 HA+PIT al 1%/ER80405 7 * representa el valor medio del número de esplenocitos que secretan IL5 o IFNy por 106 de esplenocitos después de la estimulación con la vacuna trivalente. El valor medio se calcula sobre las bases de los resultados ELISPOT obtenidos sobre las 10 muestras del bazo/grupo de ratones. ** representa la cantidad media (pg/ml) de IL5 o IFNy calculado sobre las base de los resultados obtenidos sobre las 10 muestras del bazo/grupo de ratones utilizando la técnica CBA. *** la relación representa la media aritmética de las relaciones de IFNy/IL5 en cada grupo. La relación de IFNy/IL5 se determinó para cada muestra sobre las bases de los valores de las concentraciones especificas de IFNy y de IL5 obtenidas de acuerdo con el método CBA después de que los esplenocitos se habían cultivado y luego la media aritmética de las relaciones se calculó para cada grupo de ratones. Estos resultados muestran que la emulsión PIT al 1%/ER804057 fuertemente orienta la respuesta celular de CD4+ hacia la producción de IFNy subsecuente a la reestipulación específica de las células con la vacuna de gripe. La respuesta de Thl mucho más pronunciada (relación de IFNy/IL5 más alta) se observó en el grupo de ratones que recibieron esta emulsión. La respuesta de Thl es de hecho más fuerte que aquella que se observa en el grupo de ratones que recibieron una vacuna de gripe que contiene una dosis más alta de 20 veces (grupo 6.3 µg) . Esta emulsión es por lo tanto recomendada en las poblaciones de individuos quienes tienen una pobre respuesta de Thl subsecuente a una vacunación de gripe, en particular individuos de avanzada edad. El mismo protocolo experimental se reprodujo utilizando ratones C57B16 machos de 17 meses de edad y luego el título de HAIs dirigido contra A/Wellington (H3N2) fue medido. Los resultados que se obtuvieron se dan en la tabla que sigue: Grupo de ratones HAIs contra A/Wellington (H3N2) grupo de 6.3 µg HA 104* grupo de 0.3 µg HA+PIT al 1% 247 grupo de 0.3 µg HA+PIT al 476 1%/ER804057 * representa el valor medio de los títulos de HAI obtenidos sobre los 10 sueros de cada grupo de ratones. Estos resultados muestran la ventaja de una composición de vacuna que se obtuvo al mezclar una vacuna de gripe en una emulsión de O/W que contiene una baja dosis de escualeno (1%) y del agonista de TLR4 (ER804057 a 0.6 µg) con el fin de vacunar una población de individuos de avanzada edad ya sensibilizados con el virus de gripe, puesto que la cantidad de antígeno de gripe de cada cepa se puede reducir por un factor de 20, mientras que al mismo tiempo se tienen títulos de anticuerpo protectores más altos con respecto a las 3 cepas de virus.

Claims (38)

1. REIVI DICACIONES 1. Una emulsión de Aceite en Agua (0/W) , caracterizada porque comprende: i) un agonista de TLR , llamado TLA4, la estructura química del cual no comprende un anillo de azúcar, ii) escualeno, iii) un solvente acuoso, iv) un surfactante hidrofílico no iónico que es un éter alquílico de polioxietileno, v) un surfactante hidrofóbico no iónico, y que es termorreversible . 2. La emulsión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque TLA4 es un compuesto químico de la fórmula I, II, III o IV: Compuesto de la fórmula I
2. Compuesto de la fórmula II os cuales, para cada una de las fórmulas I, II, III o IV, selecciona del grupo que consiste de: a) C(0); b) C(0)- (alquil de C1-C14) -C (0) , en el cual el alquilo de C1-C14 es opcionalmente sustituido con un hidroxilo, un alcoxi de C1-C5, un alquilendioxi de C1-C5, un (alquil de C1-C5) amino o un (alquil de Ci-Cs)arilo, en el cual la porción de arilo del (alquil de Ci-C5)arilo es opcionalmente sustituido con un alcoxi de C1-C5, un (alquil de Ci-C5)amino, un (alcoxi de C1-C5) amino, un (alquil de C1-C5) amino (alcoxi de C1-C5) , -0- (alquil de C1-C5) amino (alcoxi de C1-C5) , -0- (alquil de Ci~ C5) amino-C (0) - (alquil de C1-C5) -C (0) OH o -0- (alquil de C1-C5) amino-C (0) - (alquil de C1-C5) -C (0) -alquilo de (Ci~ C5) ; c) un alquilo que comprende una cadena lineal o ramificada de C2-C15, opcionalmente sustituida con un hidroxilo o un alcoxi; y d) -C (0) - (arileno de C5-Ci2) -C (0) - en el cual el arileno es opcionalmente sustituido con un hidroxilo, un halógeno, un nitro o un amino; a y b son independientemente 0, 1, 2, 3 o 4; d, d' , d", e, e' y e" son independientemente 0, 1, 2,
3. 3 o 4; X1, X2, Y1 y Y2 son independientemente seleccionados. del grupo que consiste de nulo, un oxígeno, NH y N (C (0) (alquilo de C1-C4)) y N (alquilo de Ci-C4) ; W1 y W2 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un carbonilo, un metileno, una sulfona y un sulfóxido; R2 y R5 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de: a) un alquilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C2o, que es opcionalmente sustituido con un oxo, un hidroxilo o un alcoxi; b) un alquenilo o dialquenilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C20, que es opcionalmente sustituido con un oxo, un hidroxilo o un alcoxi; c) un alcoxi de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C2o, que es opcionalmente sustituido con un oxo, un hidroxilo o un alcoxi; d) NH- (alquilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C2o) r en el cual el grupo alquilo es opcionalmente sustituido con un oxo, un hidroxilo o un alcoxi; y en el cual Z se selecciona del grupo que consiste de un 0 y NH, y M y N son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, un alquenilo, un alcoxi, un aciloxi, un alquilamino y un acilamino que comprende una cadena lineal o ramificada de C2-C2o; R3 y R6 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un alquilo y alquenilo de cadena recta' o cadena ramificada de C2 a C2c opcionalmente sustituido con un oxo o un fluoro; R4 y R7 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de C (O) - (alquilo o alquenilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C2o) , un alquilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C20, un alcoxi de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C2o y un alquenilo de cadena recta o cadena ramificada de C2 a C20; en los cuales los grupos alquilo, alquenilo o alcoxi pueden ser independientemente y opcionalmente sustituidos con un hidroxilo, un fluoro o alcoxi de Ci-C5; Gi, G2, G3 y G4 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un oxigeno, un metileno, un amino, un tiol, -C(0)NH-, -NHC(O)- y -N (C (O) (alquilo de C1-C4) ) -; o G2R4 o G4R7 pueden ser conjuntamente un átomo de hidrógeno o un hidroxilo; y en el cual, para la fórmula III: a' y b' son independientemente 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, de preferencia 2 ; Z1 se selecciona del grupo que consiste de -0P(0) (OH) 2, -P(0) (OH) 2, -0P(0) (OR8) (OH) donde R8 es una cadena de alquilo de C1-C4, -OS(0)2OH, -S(0)2OH, -C02H, -OB(OH)2, -OH, -CH3, -NH2 y -NR93 donde R9 es una cadena de alquilo de C1-C4; Z2 se selecciona del grupo que consiste de -0P(0) (OH)2, -P(0) (OH) 2, -0P(0) (OR10) (OH) donde R10 es una cadena de alquilo de Ci-C4 -OS(0)2OH, -S(0)2OH, -C02H, -OB(OH)2, -OH, -CH3, -NH2 y -NR11 donde R11 es una cadena de alquilo de C1-C4; y en el cual, para la fórmula IV: R12 es H o una cadena de alquilo de C1-C4; 0 una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto de la fórmula I, II, III o IV. 3. La emulsión de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque por lo menos 90% de la población por volumen de las gotitas de aceite tienen un tamaño < 200 nm.
4. 4. The emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque por lo menos 50% de la población por volumen de las gotitas de aceite tienen un tamaño < 110 nm.
5. 5. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque ,1a inversión de fase ocurre a una temperatura de entre 45°C y 80°C, de preferencia de entre 5'0°C y 65°C.
6. 6. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque también comprende por lo menos un alditol.
7. 7. La emulsión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el alditol es sorbitol, manitol, glicerol, xilitol o eritritol.
8. 8. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la fase acuosa es una solución salina regulada.
9. 9. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el agonista de TLR4 es un compuesto químico de la fórmula I: H O OH O O o una sal farmacéuticamente aceptable de este compuesto.
10. 10. La emulsión de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque: Rl es C(O) o C (O) - (CH2 ) n-C (O) , n que .es 1, 2, 3 o 4, a, b, d, d' , d", e, e' y e" son independientemente 1 o 2, XI, X2, Yl y Y2 son NH, Wl y W2 son C (O) , R2 y R5 son independientemente seleccionados del grupo que consiste de un alquilo de cadena recta de C10-C15 opcionalmente sustituido con un oxo, un NH- (alquilo de cadena recta de C10-C15) , y en el cual M y N son independientemente un alquilo o alquenilo de cadena recta de C2-C20, R3 y R6 son alquilos de cadena recta de C5-C10, R4 y R7 se seleccionan del grupo que consiste de un hidrógeno, C (O) - (alquilo de cadena recta de C8-C12) y C (0) - (alquenilo de cadena recta de C8-Ci2) , Gl y G3 son un oxigeno o -NH(CO)-, G2 y G4 son un oxigeno.
11. 11. La emulsión de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizada porque el compuesto químico se selecciona del grupo que consiste de ER803022, ER803058, ER803732, ER803789, ER804053, ER804057, ER804058, ER804059, ER804442, ER804764, ER111232, ER112022, ER112048, ER112065, ER112066, ER113651, ' ER118989, ER119327 y ER119328.
12. 12. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la relación de ¦ la cantidad del agonista de TLR4 a la cantidad total de surfactante hidrofílico e hidrofóbico no iónico está entre O.OlxlO"2 y 5xl0"2, de preferencia entre 0.05xl0"2 y 2xl0"2 (peso/peso) .
13. 13. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque el éter alquilico de polioxietileno se selecciona del grupo que consiste de éter de cetoestearí lico de polioxietileno (12) (cetearet-12 ) , éter de cetoestearílico de polioxietileno (20) (cetearet-20) , éter estearílico de polioxietileno (21) (estearet-21) , éter cetílico de polioxietileno (20) (cetet- 20), éter cetílico de polioxietileno (10) (cetet-10), éter estearílico de polioxietileno (10) (estearet-10 ) , éter estearílico de polioxietileno (20) (estearet-20) , éter oleico de polioxietileno (10) (olet-10) y éter oleico de polioxietileno (20) (olet-20) .
14. 14. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque el surfactante hidrofóbico es un éster de sorbitan o un éster de manuro.
15. 15. La emulsión de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el surfactante hidrofóbico es monooleato de manuro.
16. 16. La emulsión de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el surfactante hidrofóbico es monooleato de sorbitan.
17. 17. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porque las cantidades de surfactantes hidrofilico e hidrofóbico son tales que el HLB total de los surfactantes está entre 8.5 y 10.
18. 18. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada porque la cantidad de escualeno representa entre 5% y 45% del peso total de la emulsión.
19. 19. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque la relación de la cantidad de escualeno a la cantidad de surfactantes está entre 2.0 y 4.0, de preferencia entre 2.5 y 3.5.
20. 20. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque el agonista de TLR4 es el compuesto químico ER804057, el surfactante hidrofilico no iónico es éter cetoestearí lico de polioxietileno (12) (cetearet-12 ) , el surfactante hidrofóbico no iónico es monooleato de sorbitan y el solvente acuoso es una solución reguladora de fosfato o una solución reguladora de citrato.
21. 21. La emulsión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque: a. la cantidad de escualeno representa entre 5% y 45% del peso total de la emulsión (peso/peso) , b. la relación de la cantidad de escualeno a la cantidad total de éter cetoestearilico de polioxietileno (12) (cetearet-12 ) y de monooleato de sorbitan está entre 2.0 y 4.0, c. las cantidades de cetearet-12 y de monooleato de sorbitan son tales que el HLB está entre 8.5 y 10, y d. la relación de la cantidad de ER 804057 a la cantidad total de éter cetoestearilico de polioxietileno (12) (cetearet-12) y de monooleato de sorbitan está entre O.OlxlO"2 y 2xl0"2.
22. 22. La emulsión de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque también comprende manitol, la cantidad del cual representa entre 0.1 y 10% del peso total de la emulsión.
23. 23. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizada porque también comprende un sustrato de liofilización .
24. 24. La emulsión de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el sustrato de liofilización es una solución acuosa de sacarosa, de manitol y de maltósido de dodecilo.
25. 25. El uso de una emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque es para preparar una composición de vacuna.
26. 26. El uso de una emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque es para preparar una composición de vacuna que comprende, como antigeno de vacuna, por lo menos una hemaglutinina de virus de gripe .
27. 27. El uso de una emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque es para preparar una composición de vacuna que comprende, como antigeno de vacuna, un antigeno de envoltura de citomegalovirus (CMV) .
28. 28. El uso de una emulsión de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el antigeno de envoltura de CMV es la proteina gB de CMV o un derivado de la misma que comprende por lo menos un epitope neutralizante.
29. 29. El uso de. una emulsión de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el antigeno de envoltura de CMV es la proteina gB de la cual el dominio de transmembrana ha sido suprimida y en la cual el sitio de segmentación es ineficaz.
30. 30. Un método para preparar una emulsión de 0/W de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque comprende una etapa en la cual una emulsión de W/O se obtiene al elevar la temperatura y una etapa en la cual esta emulsión inversa de W/O se convierte a una emulsión de O/W al disminuir la temperatura.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la emulsión de W/O se obtiene al llevar a cabo una primera etapa en la cual una fase acuosa que comprende un solvente acuoso, un éter alquilico de polioxietiieno y un agonista de TLR4 se mezcla con una fase aceitosa que comprende escualeno y un surfactante hidrofóbico no iónico para obtener una emulsión de O/W, y una segunda etapa en la cual la emulsión de O/W se calienta a una temperatura que es por lo menos la temperatura de inversión de fase de la emulsión.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la emulsión de W/O se obtiene al calentar separadamente una fase acuosa que comprende un solvente acuoso, un éter alquilico de polioxietiieno y un agonista de TLR4 y una fase aceitosa que comprende escualeno y un surfactante hidrofóbico no iónico a temperatura que es por lo menos la temperatura de inversión de fase de la emulsión y luego al mezclar la fase acuosa con la fase aceitosa mientras que al mismo tiempo conservar la temperatura de la mezcla a una temperatura que es por lo menos la temperatura de inversión de fase.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 31 o 32, caracterizado porque el agonista de TLR4 está en la fase aceitosa en lugar de estar en la fase acuosa.
34. 34. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 31 a 33, caracterizado porque la fase acuosa también comprende un alditol.
35. 35. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 31 a 34, caracterizado porque la temperatura de inversión de fase está entre 45°C y 80°C y de preferencia entre 50°C y 65°C.
36. 36. Un método para preparar una composición de vacuna, caracterizado porque por lo menos un antigeno de vacuna se mezcla con una emulsión de 0/W que contiene un agonista de TLR4 , la estructura química del cual no comprende un anillo de azúcar, representado en que la emulsión de 0/W que contiene el agonista de TLR4 se prepara de acuerdo con un método de inversión de fase que comprende una etapa en la cual una emulsión se obtiene en la forma de una emulsión inversa de W/0 al incrementar la temperatura y una etapa en la cual la emulsión de W/0 se convierte a una emulsión de 0/W al disminuir la temperatura.
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la emulsión de 0/W comprende: a) un agonista de TLR , como se define en la reivindicación 2, b) escualeno, c) un solvente acuoso, d) un surfactante hidrofilico no iónico que es un éter alquilico de polioxietileno , y e) un surfactante hidrofóbico no iónico.
38. 38. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 30 a 37, caracterizado porque también comprende una etapa de liofili zación .