WO2019084640A1 - Vacina anti-zika vírus (zikv) compreendendo vesículas de membrana externa de neisseria meningitidis - Google Patents

Vacina anti-zika vírus (zikv) compreendendo vesículas de membrana externa de neisseria meningitidis Download PDF

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WO2019084640A1
WO2019084640A1 PCT/BR2018/000065 BR2018000065W WO2019084640A1 WO 2019084640 A1 WO2019084640 A1 WO 2019084640A1 BR 2018000065 W BR2018000065 W BR 2018000065W WO 2019084640 A1 WO2019084640 A1 WO 2019084640A1
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WO
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vaccine
omv
zikv
neisseria
viral
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PCT/BR2018/000065
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Inventor
Paula MARTINS
Daisy MACHADO
Thaís Holtz THEIZEN
Marcelo LANCELLOTTI
Original Assignee
Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
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Publication date
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    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Anti-Zika virus (ZIKV) vaccine comprising Nelsseria meningitidis outer membrane vesicles
  • the present invention is within the scope of the application of nanotechnology, more specifically in the field of medicinal preparations containing viral antigens, since it relates to a combined Neisseria outer membrane vesicle anti-zika virus (ZIKV) vaccine meningitidis (OMV) and vaccine adjuvant nanoparticles.
  • ZIKV Neisseria outer membrane vesicle anti-zika virus
  • OMV vaccine meningitidis
  • Zika virus was first isolated in 1947 from the blood of a Rhesus monkey in the Zika Forest, Kenya, and only one year later its presence was also confirmed in Aec ⁇ es africanus mosquitoes in the same forest.
  • Another comorbidity that appears to occur with ZIKV infections is Guillain-Barré syndrome, acute peripheral neuropathy that is clinically characterized by pain, numbness, paresthesia, or limb weakness.
  • the present invention proposes a vaccine that uses nanotechnology as the main focus to combat the Zika virus. It comprises N.membrane vesicles (OMV) with nanoparticles of vaccine adjuvant such as mesoporous silica and graphene.
  • OMV N.membrane vesicles
  • vaccine adjuvant such as mesoporous silica and graphene.
  • the present invention relates to. an anti-Zika virus vaccine (ZIKV) arranged between IxlO 4 and IxlO 6 forming units of viral plate (pfu great IxlO 5) Zika virus inactivated and acellular by 1 to vesicle 50 ⁇ , outer membrane of Neisseria menxngit ⁇ dis ⁇ OMV) and 100 to 250 ⁇ de nanoparticles of nanoencapsulated vaccine adjuvant.
  • ZIKV anti-Zika virus vaccine
  • Figure 1 is a schematic representation of
  • OMV extracted from N. meningitidis strain C2135 in small yellow and blue circles
  • ZIKV red circles
  • the stirring force promotes the melting of OMV with virus particles that produce the QMV / ZIKV fusion particles (orange and blue circles).
  • Figure 2 graphically depicts the ELISA analysis of mice immunized with OMV / ZIKVfusion (group II) and OMV / ZIKV + SBal6 fusion (group III).
  • Figure 3 depicts the expression of inflammatory chemokines from mice vaccinated in splenocytes
  • Figure 4 depicts the seroneutralization virus expressed in ng / g of detected ZIKV particles in a total amount of 1 ⁇ g of RNA.
  • Figure 5 shows. also viral seroneutralization expressing the number of copies of detected ZIKV particles in a total amount of 1 ⁇ g of RNA.
  • the present invention relates to a Neisseria meningitidis (OMV) outer membrane vesicle combined vaccine (ZIKV) vaccine and vaccine adjuvant nanoparticles.
  • OMV Neisseria meningitidis
  • ZIKV outer membrane vesicle combined vaccine
  • Said anti-zika virus (ZIKV) vaccine comprises:
  • said QMV is produced by the bacterial strain C2135 vaccine strain or any other vaccine strain belonging to Neisseria meninitidis, Haemophilus influenzae, Neisseria lactamica, Haemophilus aegyptius,
  • V + ZIKV + C6 / 36 has a size ranging from 209.40 to 251.10 nm f pref rencialmente 230.25; polydispersity index (PI) ranging from 0 552 to 0.592, preferably 0, 572; zeta potential ranging from -0.139 to -0.719, preferably 0.429.
  • PI polydispersity index
  • Said vaccine adjuvant is selected from the group consisting of mesoporous silica, poloxamers, or any other type of vaccine adjuvant of future interest.
  • the vaccine of the present invention does not utilize the recombinant DNA technique either in the production of the prototype or in the increase of scale and industrial production.
  • Said method comprises the steps of: a) Selecting the cell line and the viral sample from the
  • said cell line is selected from the group consisting of C6 / 36 (ATCC® CRL-1660 TM) from the mosquito species albopictus, adapted to a temperature of 27 ° C, without COs; Vero (African green monkey - ATCC CCL 81), adapted at 37 ° C, with 5% CO, maintained with RPMI1640 (E) medium and 10% fetal bovine serum (FBS); among others, such as lineage U251-MG (ECACC 09063001) glia tumor cell, and M059J (glioblastoma ATCC CRL2366).
  • C6 / 36 ATCC® CRL-1660 TM
  • Vero African green monkey - ATCC CCL 81
  • E RPMI1640
  • FBS fetal bovine serum
  • the cell line used is C6 / 36.
  • said lineage is maintained with special Leibovitz L-15 medium, with addition of 50-200 ⁇ g / ml of essential amino acids, pyruvate, penicillin, streptomycin, amphotericin (Vitrocell®) and 5% fetal bovine serum (FBS ).
  • step "b" the production of viral antigens is performed.
  • from 50 to 1000 L preferably 500 ⁇ l of the 21KV viral sample solution is incubated in 25 cm 2 bottles containing about 1.10 s cells per ml in confluent monolayer of the C6 / 36 or Vero cell line, prepared with 24 hours in advance.
  • the entire contents of the culture medium with 5% to 10% FBS of the cell line is removed and 500 ⁇ posteriormente inoculation is subsequently performed. of the viral solution.
  • the bottle is kept in a greenhouse for 45 minutes a. 1h30m na.
  • step c Neisseria m & n ⁇ ngit ⁇ dis is performed by ultrafiltration on membranes retention as described by Alves et al 2013 (Alves, Danilo Antonini, Mattos, Ives B, Hollanda, Luciana M, LANCELLOTTI, Marcelo) Use of mesoporous silica SSa-15 and SBa-16 in association of outer membrane vesicles - OMV fro Neisseria men ⁇ ngit ⁇ dis Journal of Vaccines & Vaccination, v. 4, p.6, 2013).
  • the bacterial strain used is preferably the C2135 vaccine strain or any other vaccine strain belonging to Neisseria meningit ⁇ dis, Eaemophilus influenzae, Neisseria lactamica. , Haemophius aegyptius.
  • a spare step of bacterial lipooligosaccharide (LOS) removal by a wash with. aqueous solution of 0.01% (w / v) sodium deoxycholate is performed to decrease the toxicity of this vaccine preparation.
  • step " the OMVs are lyophilized or already added to the ZIKV cell cultures in order to promote the extraction of viral particles at the time of viral budding.
  • step "d" the filters containing OMVs obtained in the previous step were placed in 0.9% saline and stored in an oven at 25-39 ° C for 20 minutes to liberate the membranes of the filter vesicles. The samples were then stored at -80 ° C. vaccine preparation was carried out following the same steps of the virus was added C6 / 36 cells, as the co step b. "Subsequently, were added different concentrations of OMV N. meninçitidis at different times (3 hours, 10 hours and 24 hours) to obtain the best vaccine preparation.
  • the quantification of the OMVs is performed by UV spectrometry by the scanning technique, where defined masses will provide an OMV quantification curve for the defined wavelength in the scanning analysis. Optimum amounts of OMVs should be defined for capture of the viral particles or proteins of the ZIKV for further analysis and characterization.
  • stage Î ⁇ 1 100 to 200 ⁇ g / dose of vaccine adjuvants selected from the group consisting of mesoporous silica, poloxamers, or the like are added to the formulations of OMVs extracted and adsorbed by ZIKV obtained in the previous step. Any other type of vaccine adjuvant of future interest.
  • Such nanovescules in contact with the vaccine antigens are characterized by the following techniques and defined in optimum amounts that allow increased immune response without compromising vaccine toxicity.
  • This analytical procedure determines the average length of the OMVs and the polydispersity index (PI), which is a dimensionless measure of the amplitude of the particular size distribution.
  • the analytical procedure is performed on a Zeta-sizer Nano series Zs Malvem (USA). Results are expressed as mean ⁇ standard deviation of at least three different batches of each OMV preparation. Zeta potential is determined by OMV Doppler Anemometry (LDA) followed by dilution in NaCl at a conductivity of approximately 120 ⁇ 20 S / cm 2 .
  • LDA OMV Doppler Anemometry
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • the NTA technique allows defining the size and the load of the vaccine formulations in population percentage of the formulation.
  • NTA allows us to characterize the size of these nanostructures and changes in size and residual load, if there are, after several steps in the vaccine production process, viral adsorption or adjuvant.
  • OMV OMV
  • the OMV (OMV) isolated had a lower value than the virus directly associated with OMV (OMV + ZIKV) and presented a smaller size when compared to virus-associated OMV and C6 / 36 (OMV + ZIK + C6 / 3 cells) -6).
  • Table 1 Characterization of the nanoparticle samples of OMV, OMV + ZIKV, and OMV + ZIKV + C6 / 36 by ZetaSizer.
  • KTA also represents the size of the nanoparticle, but it is a more accurate method. The speed of movement is directly related to the size of the particle, the larger the particle, the slower it is. Thus, the velocity of the particles varies greatly according to the size of the particles.
  • the NTA provides as data parameters: particles per frame (PPF) and particles per mL (PPmL) that were presented in the Table 2.
  • Muscle mu.sc lus - Swiss albino mice female, non - isogenic and with an appropriate sanitary standard (SPF) weighing between 18 and 22 g (5-6 weeks of age), kept in temperature controlled chambers ( 22 to 25 ° C) in light dark cycles of 12 hours, where they will receive ration and water ad libitum.
  • SPF sanitary standard
  • the immunization protocol was approved by CSUA-UNICAMP. Swiss females were used, non isogenic and with adequate sanitary standard (SPF).
  • the animals were separated into 4 groups, being: control (PBS only); were vaccinated with OMV, vaccinated with OMV + nanoparticles, and vaccinated with OMV + nanoparticles ⁇ ZI V. Immunizations were performed by the subcutaneous route and the number of animals per group was defined by the minimum number of animals that responded in a statistically significant way to the production of antibodies vaccines.
  • mice do not usually succumb or clinical signs after infection with the Zika virus. However, viremia may be observed between days 3 to 6 after viral inoculation. Therefore, the viral titer in serum, liver, spleen and kidneys was determined on the third day after infection with ZIKV in immunized S 1S3 mice and controls. ⁇ viral infection was performed by injecting 10 5 PIFU of ZIKV into 50 pL by the subcutaneous route into the paw, three weeks after the last vaccine dose. All animals were sacrificed on the third day of infection to collect the organs after infusion with 20 mL of PBS. The organs were maintained at -80 ⁇ C in 1 ml of MEM medium with 10% fetal bovine serum until viral titration.
  • Viral titration was determined by lysis plate assay in Vero cells in 24-well plates. After five days of infection, the cells were fixed for 10 minutes with. 10% formaldehyde was PBS and the development occurred by observation of the formation of lysis plates after Violet Crystal staining.
  • mice immunized with OMV and ZIKV with and without association of the nanoparticles were performed by the method for the recognition of antibodies produced with dilutions of antibody titers against the ZIKV coating with about 1.10 3 plate per well. Indirect ELISA tests were performed on the detection of IgM, IgG1 and IgG2 and IgAs.
  • Figure 2 graphically depicts the ELISA analysis of mice immunized with OV / ZIKVfusion (group II) and OMV / ZIKV + SBalô (Group III) fusion, where the recognized antibody was compared to the non-immunized control group ( group I) and significant values were obtained until titers 1: 160 in both groups (II and III).
  • the ELISA assay showed a significant increase in antibody production (Figure 2) compared to the group of naive mice.
  • antibody titers determined for these tests demonstrated the similar effect when compared to the adjuvanted preparations (with mesoporous silica) and not adjuvanted vaccines. In fact, such formulations showed similar effect in. antibody stimuli that indicated the use of less expansive vaccine.
  • the vaccinated animals had their sera analyzed for the production of inflammatory chemokines for the TH1 and TH2 response using the 3lexPlex 200 [Biorad] multiassay kit with the support of LACTAD-UNICAMP. Spleens were also removed from these animals and the TH1 and TH2 responses were also evaluated by qP.T-PCR using specific pzimers for each of the chemokines analyzed. Chemokines evaluated by both methodologies: IL1, IL1, IL8, IL12, IL13, IL4, IL4, IL4, IL4, IL4, IL12, IL13, IL13, TNFÎ ⁇ .
  • Figure 3 depicts the expression of inflammatory chemokines from mice vaccinated in splenocytes.
  • qRTPCR was performed using specific primers for IL2 (TH1 marker), IL4 ( ⁇ . ⁇ 2 marker), IL10, IM FY and ⁇ (memory marker).
  • IL2 TH1 marker
  • IL4 ⁇ . ⁇ 2 marker
  • IL10 IL10
  • IM FY IM FY
  • ⁇ memory marker
  • chemokine expression by splenocytes was determined for TH1 and TH2 differentiation in vaccine mice (Figure 3). This activation showed increased TH1 (IL2 and INFy) and strong activation of TH2 (IL4, IL6, IL10). Other chemokine markers were also observed as ⁇ ' ⁇ , ⁇ 1.1 ⁇ and TNF ⁇ . This study is the qualitative analysis of the cellular immune response by demonstrating an activation of TH1 and TH2 immune response.
  • Plaque Reduction Neutralization Test PRK
  • Serum samples were collected after three weeks of immunization and serial (1:20, 1:40 and 1: 80) serial dilutions of these sera were incubated.
  • 100 plaque forming units (PFU) from a viral stock of ZIKV. After one hour of incubation, the mixture between the sera and the samples were inoculated in. M059J cells and incubated for twenty four hours at 37 ⁇ C with 5% CO 2. This monolayer was washed with PBS and viral RNA was extracted with the aid of the Trizol ® reagent or equivalent.
  • the toxicity test was performed in. that the test is conducted according to the Brazilian Pharmacopoeia (2010). Five healthy mice are submitted to doses similar to the probable clinical doses of the vaccines. Mice are observed for 15 days for signs of animal mismatch, weight, behavior and death. The data are compared to the control group of animals that did not receive the vaccine.

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Abstract

A presente invenção refere-se a uma vacina eficaz anti-zika vírus (ZIKV) de unidades formadoras de placa virais (UFP) de Zika vírus inativada associadas a vesícula de membrana externa de Neisseria meningitidus (OMV) e de nanopartículas de adjuvante vacinal

Description

Vacina anti-Zika vírus (ZIKV) compreendendo vesículas de membrana externa de Nelsseria meningitidis
Caaspo da Invenção:
[001] A presente invenção se insere no campo de aplicação da nanoteenològia, mais especificamente na área de preparações medicinais contendo antigenos virais, uma vez que se refere a uma vacina .anti-zika vírus (ZIKV) combinada de vesícula de membrana externa de Neisseria meningitidis (OMV) e nanopartícuias de adjuvante vacinai.
Esta.do da técnica:
[002] São cada vez mais prevalentes as doenças infecciosas emergentes, enfermidades com potencial de causar graves epidemias ou pandemias. A probabilidade de ocorrência natural dessas doenças vem sendo reforçada pelas mudanças sociais e demográficas que são características da sociedade atual, tais como a livre circulação de pessoas em viagens e migrações internacionais e o aumento da importação e exportação de produtos alimentares. Estas doenças podem durar de semanas a meses, alterando o curso cotidiano da sociedade e causando impactos de curto, médio e de longo prazo sobre as populações e economias ao redor do globo.
[003] Portanto, iniciativas que visem mitigar os impactos destas doenças sobre as populações devem ser prioritárias entre as diferentes nações no mundo.
[004} O vírus Zika (ZIKV) foi isolado pela primeira vez em 1947 a partir do sangue de um macaco Rhesus na floresta Zika, Uganda, sendo que apenas um ano depois sua presença também foi confirmada em mosquitos Aecíes africanus na mesma floresta .
[005] Do ponto de vista clínico, a maioria dos sintomas associados à infecção pelo vírus são considerados relativamente leves como febre, dor de cabeça, dores no corpo e erupções cutâneas. Contudo, a grande preocupação que tem cercado os casos de infecção pelo vírus diz respeito ao aumento da incidência de microcefalia entre os recém- nascidos cujas mães foram infectadas por ZIKV durante a gestação.
[006] Outra comorbidade que parece suceder as infecções por ZIKV é a síndrome de Guillain-Barré , neuropatia periférica aguda que se caracteriza clinicamente por dor, dormência, parestesia, ou fraqueza nos membros.
[007] Desse modo, a situação epidemiológica do ZIKV no Brasil, sua relação com complicações neurológicas, como as microcefalias e a síndrome de GuíIlain-Sarré e a presença do vetor Aedes egyptí em todo território brasileiro, torna prioritário o desenvolvimento de metodologias profiláticas como vacinas e medidas imunológicas para o diagnóstico virai.
[008] Dentre as medidas profiláticas se encontra o desenvolvimento de vacinas contra o ZIKV. Taís vacinas podem ter diferentes abordagens, englobando as vacinas de primeira e segunda geração (celulares e acelulares respectivamente) , assim como àquelas baseadas na tecnologia de DNA recombínante como as vacinas de DNA.
[009] A presente invenção propõe uma vacina que utiliza a nanotecnologia como foco principal para combater o vírus do Zika. A mesma compreende vesículas de membrana externa (OMV) de N. menígitídis com nanopartícuias de adjuvante vacinai, tais como sílica mesoporosa e grafeno. Assim, a referida vacina apresenta alta inovação já que se busca uma vacina para tal patógeno que não envolva o uso de técnica de DNA recombínante, que facilitaria a sua implantação em escala industrial e transferências de tecnologia.
[010] Portanto, nenhum documento do estado da técnica descreve uma vacina anti-zíka virus fZIKV) , tal como proposto pela presente invenção.
Breve âascxlção da. Invenção:
[Gil] A presente invenção refere-se a. uma vacina anti-zika virus (ZIKV) combinada entre IxlO4 e IxlO6 unidades formadoras de placa virais (ufp ótímo IxlO5) de Zika virus inativada e acelular por 1 a 50μς de vesícula, de membrana externa de Neissería menxngitídis {OMV) e 100 a 250μς de nanopartlcuias de adjuvante vacinai nanoencapsulado .
Breve descrição das figuzas:
[012] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção,, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.
[013] A Figura 1 é uma representação esquemática de
OMV (extraído de N. meningítidis estirpe C2135 em círculos pequenos amarelos e azuis) no processo de fusão de ZIKV (círculos vermelhos) replicados em células C6/36, em que a força de agitação promove a fusão de OMV com partículas de vírus que produzem as partículas de fusão QMV/ZIKV (círculos de laranja e azul) .
[014] A Figura 2 representa graficamente a análise de ELISA de camundongos imunizados com OMV/ZIKVfusíon (grupo II) e fusão OMV / ZIKV + SBal6 (grupo III) .
[015] A Figura 3 representa a expressão de quimiocinas inflamatórias de camundongos vacinados em esplenócitos ,
[016] A Figura 4 representa a soroneutralização virai expressa em ng/ g cie partículas de ZIKV detectadas em uma quantidade total de 1 ug de RNA.
[017] A Figura 5 representa. também a soroneutralização virai expressando o número de cópias de partículas de ZIKV detectadas em uma quantidade total de 1 ug de RNA.
O sezrIção det&lh&da da xnvsnção:
[018] A presente invenção refere-se a uma vacina anti-zika vírus (ZIKV) combinada de vesícula de membrana externa de Neisseria meníngitidis (OMV) e nanopartículas de adjuvante vacinai.
[019] A referida vacina anti-zika vírus (ZIKV) compreende :
- pelo menos IxlO5 unidades formadoras de placa virais (UFP) de Zíka vírus inativada;
- de 1 a 50pg de vesícula de membrana externa de Neisseria meníngitidis (OMV) ; e
- de 100 a 250ug de nanopartículas de adjuvante vacinai nanoencapsulado .
[020] Preferencialmente, a referida QMV é produzida pela linhagem bacteriana cepa vacinai C2135 ou qualquer outra cepa vacinai pertencente a Neisseria meníngitidis, Haemophílus influenzae, Neisseria lactamica, Haemophílus aegyptius ,
[021] Ainda, a associação de IxlO5 UFP com as 1- 50 ug de OMV formam OMV+ZIKV+C6/36 fusionada que se refere à formulação vacinai;
[022] Ainda, a referida nanovesícula obtida
(O V+ZIKV+C6/36) possui tamanho que varia de 209,40 a 251,10 nmf pref rencialmente 230,25; índice de polidispersêo (IP) que varia de 0, 552 a 0,592, preferencialmente 0,, 572; potencial zeta que varia de -0,139 a -0,719, preferencialmente 0,429.
[023] O referido adjuvante vacinai é seiecionado do grupo que consiste em sílic mesoporosa, poloxâmeros, ou ainda qualquer outro tipo de adjuvante vacinai de interesse futuro .
[024] Desse modo, a vacina da presente invenção não utiliza a técnica de DNA recombinante nem na produção do protótipo nem no aumento de escala e produção industrial.
[025] Para a produção da referida vacina, foi realizado um processo, embora não reivindicado, considerado essencial para se atingir as características diferenciadas apresentadas pela vacina,
[026] 0 referido processo compreende as etapas de: a) Selecionar a linhagem celular e a amostra virai do
ZIKV;
b) Produzir os antígenos virais;
c) Produzir vesículas de membrana externa (OMV) de Neisseria menínglti.dis;
d) Conjugar nanopartícuias de ZIKV com as OMV obtidas; e
e) Realizar adjuvância vacinai.
[027] Na etapa ,a", a referida linhagem celular é selecionada do grupo que consiste em C6/36 (ATCC® CRL-1660™) proveniente da espécie de mosquito Ãedes albopictus, adaptadas a temperatura de 27 °C, sem COs; Vero (African green monkey - ATCC CCL 81) , adaptadas a temperatura de 37 "C, com 5% de COs, mantidas com meio RPMI1640 (E) e 10% de soro fetal bovino (SFB) ; entre outras, tais como a linhagem U251-MG (ECACC 09063001) célula tumoral de glia, e M059J (glioblastoma ATCC CRL2366) .
[028] Preferencialmente, a linhagem celular utilizada é a C6/36. Para tal., a referida linhagem é mantida com meio Leibovitz L-15 especial, com adição de 50 a 200 ug/mL de aminoácidos essenciais, piruvato, penicilina, estreptomicina, anfotericina (Vitrocell©) e 5% de soro fetal bovino (SFB) .
[029] Na etapa "b", é realizado a produção de antígénos virais. Para tal, de 50 a 1000 L, preferencialmente 500 uL da solução de amostras virais do 21KV é incubada em garrafas de 25 cm2 contendo cerca de 1.10s células por mL em monocamada confluente da linhagem celular C6/36 ou Vero, preparadas com 24 horas de antecedência. Primeiramente, previamente à inoculação, todo o conteúdo do meio de cultura com 5% a 10% de SFB da linhagem celular é removido e, posteriormente ocorre a inoculação de 500 μΐ. da solução virai. Assim, a garrafa é mantida em estufa por 45 minutos a. Ih30mi na. temperatura de 28-39°C (ótimo 37 °C) sendo levemente movimentada de 5 a 15 em 15-30 minutos para que a amostra virai entre em contato co toda a monocamada. Após o período de adsorção, são adicionados 5 a lOmL do mesmo meio de manutenção celular, sem soro. Assim, observações diárias são realizadas até que o efeito citopático do vírus se espalhe por cerca de 80% da monocamada celular. O sobrenadante é coletado após centrifugação a 2000-4000 rpm durante 5-15 minutos, para então serem preparadas aliquotas para o estoque virai.
[030] Na etapa wc", a produção de OMVs de Neisseria m&níngitídis é realizada por ultrafiltraçao em membranas de retenção conforme descrito por Alves et al 2013 (Alves, Danilo Antonini ; Mattos, Ives B ; Hollanda, Luciana M ; LANCELLOTTI, Marcelo. Use of mesoporous silica SSa-15 and SBa-16 in assocíation of outer membrane vesicles - OMV fro Neisseria meníngitídis . Journal of Vaccines & Vaccination, v. 4, p. 6, 2013} .
[031] A linhagem bacteriana utilizada é preferencialmente a cepa vacinai C2135 ou qualquer outra cepa vacinai pertencente a Neisseria meníngitídis , Eaemophilus influenzae, Neisseria lactamica. , Haemophíius aegyptíus .
[032] Uma etapa sobressalente de retirada de lipooligossacarideo bacteriano (LOS) por uma lavagem com. solução aquosa de desoxicolato de sódio a 0,01% (m/v) é realizada para diminuir a toxicidade desta preparação vacinai .
[033] Posteriormente, na etapa ", as OMVs são liofílizadas ou já adicionadas às culturas celulares de ZIKV, afim de promover a extração das partículas virais no momento do "budding" virai.
[034] Nesse sentido, ainda na etapa "d", os filtros contendo OMVs obtidos na etapa anterior foram colocados em solução salina a 0,9% e armazenados em uma estufa na temperatura de 25-39 °C durante 20 minutos para libertar as membranas das vesículas do filtro. .Assim., as amostras foram armazenadas a -80 °C. preparação da vacina foi realizada seguindo os mesmos passos de adição do vírus era células C6/36, tal co o etapa ,b". Posteriormente, foram adicionadas em diferentes concentrações de OMV de N. meninçitidis em diferentes momentos (3 horas, 10 horas e 24 horas) , para obter a melhor preparação da vacina.
[035] 0 sobrenadante foi .recolhido contendo a fusão de antígeno ZIKV em OMV. A possível presença de vírus foi inatívada (56 ° C durante 1 hora) e depois foi liofilizada. Os mecanismos de obtenção de antígenos por fusão de OMV com vesículas de ZIKV são demonstrados na Figura 1.
[036] A quantificação das OMVs é realizada por espectrometria de UV pela técnica de varredura , onde massas definidas fornecerão uma curva de quantificação de OMV pelo comprimento de onda definido na análise de varredura. Quantidades ótimas de OMVs deverão ser definidas para a captura das partículas ou proteínas virais do ZIKV para análises e caracterizações posteriores.
[037] Por fim, na etapa ^e", são adicionadas às formulações de OMVs extraídas e adsorvidas por ZIKV obtidas na etapa anterior, de 100 a 200ug/dose de adjuvantes vacinais selecíonados do grupo que consiste em sílica mesoporosa, poloxâmeros, ou ainda qualquer outro tipo de adjuvante vacinai de interesse futuro.
[033] Tais nanovesícuias em contato com os antígenos vacinais são caracterizadas pelas técnicas que se seguem e definidas em quantidades ótimas que permitam aumento da resposta imune sem comprometimento da toxicidade da vacina .
[039] Para avaliar o potencial das nanovesícuias da presente invenção, a seguir são apresentados os resultados dos testes realizados.
-Caracterização das nanoestruturas :
[040] Este procedimento analítico determina o comprimento médio das OMVs e o índice de polidispersão (IP) , que é uma medida adimensional da amplitude da distribuição do tamanho de particular. O procedimento analítico é realizado em um Zeta-sizer Nano series Zs da marca Malvem (USA) . Os resultados são expressos na forma de média ± desvio padrão de pelo menos três lotes diferentes de cada preparação de OMV. O potencial zeta é determinado por laser Doppler Anemometria (LDA) de OMV seguida de diluição em NaCl a uma condutibilidade de aproximadamente 120± 20 S/cm2.
[041] A técnica de NTA (nanoparticle tracking analysis) permite definir em porcentagem populacional da formulação o tamanho e a carga das formulações vacinais. Muito semelhante à citornetria de fluxo o NTA nos permite caracterizar o tamanho destas nanoestruturas e mudanças no tamanho e na carga residual , caso houver, após diversas etapas do processo de produção vacinai, adsorção virai ou adjuvãncia .
[Q42] Nesse sentido, os resultados da caracterização das nanoestruturas foram resumidos na Tabela 1.
[043] 0 OMV (OMV) isolado teve um valor menor que o vírus diretamente associado a OMV (OMV + ZIKV) e apresentou tamanho menor quando comparado ao OMV associado ao vírus e às células C6/36 (OMV + ZIK + C6/3-6) .
[044.] Quanto menor o IP, melhor o aspecto da amostra, uma vez que isso resulta em garantir que não há agregação das nanopartículas. Esse resultado também mostra, que não existe presença de interferentes na amostra, já que os dados se aproximaram de zero.
[045] Além disso, é possível observar o valor de carga dessas nanopartículas. A carga OMV (OMV) se aproxima de -12,0 mV, enquanto a carga OMV + ZIKV e OMV + ZI V + C6/36 se aproxima de zero: (± 0,371 -0,179 mV) e {- 0,429 ± 0,29 mV) , respectivamente. Este resultado mostra que a estrutura foi rauito mais positiva e, portanto, houve mais estabilidade em conexão entre OMV e ZIKV, além da conexão com o mosquito.
Tabela 1 - Caracterização das amostras de nanoparticulas de OMV, OMV+ZIKV, e OMV+ZIKV+C6/36 por Zeta- sizer.
Figure imgf000012_0001
[046] A caracterização por teste MTA foi realizada para obter a validação da. caracterização das nanovesiculas . Os resultados foram resumidos na Tabela 2. Como o dispositivo Zetasizer, a KTA também representa o tamanho da nanopartícula, mas é um método mais preciso. A velocidade do movimento está diretamente relacionada ao tamanho da partícula, quanto maior a partícula, mais lenta é a mesma. Assim, a velocidade das partículas varia muito conforme o tamanho das partículas .
[047] Após a triagem do tamanho das nanoparticulas isoladas, pode~se ver que a média da população desses (D90) é 268,9 ± 23,5 nm. OMV mostrou um valor menor (192,6 ± 6,1 nm) do que OMV + ZIKV (293,1 ± 11,9 nm) . Além do tamanho, o NTA fornece como parâmetros de dados: partículas por quadro (PPF) e partículas por mL (PPmL) que foram apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2 - Caracterização das amostras de nanopartículas de OMV, OMV+ZIKV, e OMV-+ZIKV-+C6/36 por NTA.
Figure imgf000013_0001
~ V&zifícâção da ativida.de antigêníca vacinai:
[048] São utilizados camundongos albinos Mus mu.sc lus - Swiss, fêmeas, não isogênicos e cora padrão sanitário adequado (SPF) com pesos entre 18 a 22 g (5-6 semanas de idade), mantidos em câmaras com temperatura controlada (22 a 25 °C) em ciclos claro-escuro de 12 horas, onde receberão ração e água ad libitum. 0 protocolo de imunizações foi aprovado pela CSUA-UNICAMP. Foram utilizadas fêmeas de Swiss, não isogênicos e com padrão sanitário adequado (SPF) . Os animais foram separados em 4 grupos, sendo eles: controle (somente PBS) ; vacinados com OMV, vacinados com OMV+ nanopartículas, e vacinados cora OMV + nanopartículas ÷ ZI V. As imunizações foram realizadas pela via subcutânea sendo o número de animais por grupo foi definido pelo número mínimo de animais que respondam de maneira estatisticamente significativa à produção de anticorpos vacinais.
[0 9] Camundongos normalmente não sucumbem ou demonstram sinais clínicos visíveis após infecção com o vírus Zika. Entretanto, é possível observar viremia entre os dias 3 a 6 após inoculação virai. Por isso, foi determinado o título virai no soro, fígado, baço e rins no terceiro dia após infecção com ZIKV em camundongos S 1S3 imunizados e controles. Ά infecção virai foi realizada pela injeção de 10 5 PFU de ZIKV em 50 pL pela via subcutânea na pata, três semanas após a última dose vacinai. Todos os animais foram sacrificados no terceiro dia de infecção para coleta dos órgãos após perfusão com 20 mL de PBS. Os órgãos foram mantidos a -80 °C em 1 mL de meio MEM com 10% de soro fetal bovino até titulação virai.
[050] A titulação virai foi determinada por ensaio de formação de placa de lise, em células Vero em placas de 24 poços. Após cinco dias de infecção, as células foram fixadas por 10 minutos com. 10% de formaldeído era PBS e a revelação se deu pela observação da formação de placas de líse após coloração com Cristal de Violeta.
[051] Através deste método foi feita a análise do soro dos camundongos imunizados com OMV e ZIKV com e sem associação das nanopartículas para o reconhecimento de anticorpos produzidos com diluições de títulos de anticorpos frente ao coating de ZIKV com cerca de 1.103 unidades formadoras de placa por poço. Foram ensaiados testes de ELISA índireto na detecção de IgM, IgGl e IgG2 e IgAs.
[052] A Figura 2 representa graficamente a análise de ELISA de camundongos imunizados com O V/ZIKVfusíon (grupo II) e fusão OMV / ZIKV + SBalô (grupo III), em que o anticorpo reconhecido foi comparado com o grupo de controle não imunizado (grupo I) e os valores significativos foram obtidos até os títulos 1: 160 em ambos os grupos (II e III).
[053] O ensaio ELISA mostrou um aumento importante da produção de anticorpos {Figura 2) em comparação com o grupo de ratos naive. Além disso, os títulos de anticorpos determinados para esses testes demonstraram o efeito semelhante quando comparados com as preparações adjuvadas (com sílica mesoporosa) e não vacinas adjuvadas. De fato, tais formulações mostraram efeito semelhante em. estímulos de anticorpos que indicaram o uso de vacina menos expansiva.
[054] Ainda, os animais vacinados tiveram seus soros analisados quando à produção de quimíocinas inflamatórias referentes à resposta TH1 e TH2 utilizando o kit de multiensaios do 3íoPlex200 [Biorad) com o apoio do LACTAD - UNICAMP . Também foram retirados os baços destes animais e as .respostas TH1 e TH2 também foram avaliadas por qP.T-PCR utilizando pzimers específicos para cada uma das quimíocinas analisadas. Quimíocinas avaliadas por ambas as metodologias: ILl, 112, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12, 1113, TNFa, IISfFy.
[055] A Figura 3 representa a expressão de quimíocinas inflamatórias de camundongos vacinados em esplenócitos . Nesta análise foram realizados o qRTPCR usando primers específicos para IL2 (marcador THl), IL4 (marcador Ϊ.Η2), IL10, IM FY e ΤΘΕβ (marcador de memória}. O (*} indica a significativa resposta imune e comparação com o grupo controle não vacinado.
[056] Apesar da resposta imunológica celular, a expressão de quimíocinas por esplenócitos foi determinada visando a diferenciação THl e TH2 em camundongos vacinais (Figura 3) . Essa ativação mostrou aumento de THl (IL2 e INFy) e uma forte ativação de TH2 (IL4, IL6, IL10) . Outros marcadores de quimiocinas também foram, observados como ΊΌ'Γβ, Ι1.1β e TNFa. Esse estudo é a análise qualitativa da resposta imune celular por ter demonstrado uma ativação da resposta imune TH1 e TH2.
- Ensaio de soroneutralização (FRNT) :
[057] Para caracterizar a presença de anticorpos neutralizantes no soro dos animais imunizados, foi realizado um ensaio de soroneutralização denominado de ensaio de redução da formação de placas de lise (PRK do inglês Plaque Reduction Neutralization Test) . Sm suma, foi coletado o soro dos animais após três semanas da imunização e incubado diluições seriadas (1:20, 1:40 e 1;80) desses soros com. 100 unidades formadoras de placa (PFU) de um estoque virai de ZIKV. Após uma hora de incubação, a mistura entre os soros e as amostras foram inoculadas em. células M059J e incubados por vinte e quatro horas a 37 °C com 5% de CO2. Essa monocamada foi lavada com PBS e o RNA virai extraído com o auxílio do reagente Trizol ® ou equivalente.
[05S] Assim, a análise da seroneutrali zação em células M059J e Vero utilizando soros de camundongos imunizados com duas preparações diferentes (Figuras 4 e 5) demonstrou a eficácia desta nova vacina. Ά infecção por vírus major de 1000 copias de vírus diminui mais de 1,5 log de detecção de número de cópias ZIKV. As Figuras 4 e 5 mostraram esta diminuição em número de cópia de carga virai, em que os valores encontrados por qRTPCR expressos foram considerados muito significativos com. P <0, 005.
~ Produção em escala laboratorial e piloto formulações vacinais com ZIKV atenuado: [059] As formulações vacinais obtidas a partir dos processos anteriormente descritos seguiram as etapas de aumento de escala de laboratorial (utilizando um biorreator de 1 litro de volume útil), para a escala piloto (biorreator de 10 litros de volume útil) . Para isso, foram utilizados os parâmetros de bioprocessos {como manutenção de nutrientes, temperatura, pH, demanda de oxigénio e tipos celulares) . Contudo, alguns parâmetros desse bioprocesso devem ser alterados mediante a mudança de escala como a agitação, a qual deve obedecer algumas constâncias de escalonamento (constâncias de cisalhamento, potência do impelidor e número de Reynolds) sendo usadas para nortear o processo de aumento de escala. Tal processo deve manter a mesma produção de partículas virais a serem atenuadas, ou ainda, a mesma quantidade proteica de antígeno (no caso de utilizar proteínas de origem virai obtidas de Escherichia coli) .
- Testes de controle de qualidade das preparações vacinais :
[060] Os testes de controle de qualidade das preparações vacinais realizados nos protótipos vacinais foram eficazes em fases do processo caracterizadas como pontos críticos de controle de qualidade. Taís testes se baseiam da RDC17/2010 da A ISA visando as boas práticas de produção de ímunobiológicos, dentre eles as vacinas.
[061] Ainda, foi realizado o teste de toxicidade, em. que o teste é conduzido segundo a Farmacopeia Brasileira (2010) . Cinco camundongos sadios são submetidos às doses semelhantes as prováveis doses clinicas das vacinas. Os camundongos são observados por 15 dias quanto aos sinais de errfermidade, peso, comportamento e morte dos animais. Os dados são comparados ao grupo controle de animais que não receberam a vacina .

Claims

BEIVIHDICAÇÕES
1. Vacina anti-zika vírus caracterizada pelo fato de compreender :
- pelo menos IxlO5 unidades formadoras de placa virais (UFP) :
- de 1 a 50 p.g de vesícula de membrana externa de Neisseria menlngítidís (OMV) e
- de 100 a 250μσ de nanopartícuias de adjuvante vacinai,
2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de, preferencialmente, a referida OMV ser produzida pela linhagem bacteriana cepa vacinai C2135 (cepa Merieux) ou qualquer outra cepa vacinai pertencente a Neisseria meníngitídis r Haemophilus influenzae, Neisseria lacta ica, Haemophilus aegyptius.
3. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, earaçteri¾s&d¾ pelo fato de compreender uma nanovesícula obtida através da. associação de IxlO5 UFP com as 1- 50 ug de OM (O V+ZIKV+C6/36) .
4. Vacina, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizada pelo fato de a referida nanovesícula obtida (OMV+ZI V+C6 36) possuir tamanho que varia de 209,40 a 251,10 rira, preferencialmente 230,25; índice de polidispersão (IP) que varia de 0,552 a 0,592, preferencialmente 0,572; e potencial zeta que varia de -0,139 a -0,719, preferencialmente 0,429.
5. Vacina, de acordo corn a reivindicação 1, caracterizad pelo fato de o referido adjuvante vacinai ser selecionado do grupo que consiste em sílica mesoporosa, poloxâmeros, ou ainda qualquer outro tipo de adjuvante vacinai, preferencialmente sílica mesoporosa.
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