EA020998B1

EA020998B1 - Способ получения антирабической вакцины путём адаптации штамма pitman moore

Info

Publication number: EA020998B1
Application number: EA201070092A
Authority: EA
Inventors: Прадип Маганлал Пател; Панкадж Раманбхаи Пател
Original assignee: Кадила Хелзкэр Лимитед
Priority date: 2007-07-03
Filing date: 2008-04-24
Publication date: 2015-03-31
Also published as: CA2691629A1; US8361776B2; US20100189746A1; CN101730544A; EP2187962B1; EP2540313A1; CN101730544B; AU2008272428A1; CA2691629C; WO2009004641A2; EP2187962A2; EA201070092A1; AU2008272428B2; WO2009004641A3; IL202925A; BRPI0812612A2

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу адаптации штамма Pitman Moore вируса бешенства к первичным фибробластным клеткам куриных эмбрионов для получения антирабической вакцины, к штамму DE 42/74 пас. 12 12.11.1974 Pitman Moore, адаптированному к первичному куриному фибробласту для получения антирабической вакцины, к способу получения указанного штамма и к фармацевтической композиции, содержащей инактивированную антирабическую вакцину и подходящий эксципиент. Настоящее изобретение используется для лечения бешенства у человека и животных.

Description

Настоящее изобретение относится к области вакцин, а именно к адаптации штамма вируса бешенства Рйтап Мооге (штамм РМ) в очищенной клеточной культуре фибробластов куриных эмбрионов для производства усовершенствованной и высокоочищенной вакцины. В частности, адаптированный штамм РМ вируса бешенства дает высокий вирусный титр, что, в свою очередь, обеспечивает высокий выход вакцины по количеству доз на яйцо, при этом вакцина также является высокоиммуногенной.

Уровень техники

Бешенство является зоонозным вирусным заболеванием, которое поражает домашних и диких животных. При развитии симптомов болезни бешенство может являться летальным и для животных, и для человека. Однако если лица получали антирабическую вакцину либо до контакта с вирусом, либо после контакта, в сочетании с тщательной очисткой раны с применением антисептика и антирабических антител, люди в большинстве случаев хорошо защищены. Человеческие антирабические вакцины получают из инактивированного или аттенуированного вируса бешенства, при этом со времен Пастера они подвергаются последовательным усовершенствованиям. Первая вакцина против бешенства, разработанная Пастером, была получена на основе нервной ткани, а вирус был инактивирован путем сушки, однако данная вакцина представляла опасность, обусловленную возможностью активации вируса и развития аллергической реакции из-за присутствия нервной ткани или миелина. Вакцины, не содержащие миелин, приготовленные на основе мозга новорожденных мышей, были предложены Риеп/аПба е1 а1. (Уассшек: РоиПк ебйюп, сНар1ег 37, ΡΙοίΡίη. РирртесЫ апб КоргстЧб).

Впоследствии была разработана вакцина против бешенства, выращиваемая на утиных эмбрионах (ΌΕν). ΌΕν против бешенства получали из вируса, выращенного в яйцах уток с эмбрионами. Она обладала меньшей иммуногенностью по сравнению с вакциной из ткани мозга. Для ΌΕν рекомендовали от четырнадцати до двадцати трех ежедневных прививок, но иногда даже такие высокие дозы не защищали от бешенства после интенсивного контакта с источником заражения (Уассшек: РоиПк ебйюп, скар1ег 37, Раде питЬет 1018, Р1о!кш, РирртесЫ апб Кор\у\У51б). Другой недостаток ΌΕν состоял в том, что она также содержала белки миелина, которые вызывали побочные реакции, вследствие чего позже ΌΕν была запрещена ВОЗ. Таким образом, существовала длительная потребность в высокоиммуногенной антирабической вакцине, которая могла благополучно и эффективно применяться в низких дозах как для первичной иммунизации, так и в терапии после контакта с источником заражения. Эти вакцины также могли бы снизить количество и тяжесть поствакцинальных реакций.

Такая потребность была удовлетворена с развитием вакцин, получаемых в культурах тканей/клеток. Вакцина, приготовленная на культуре клеток, не только более безопасна по сравнению с прежними вакцинами на основе мозговой ткани вследствие отсутствия нейронной ткани, но и более эффективна. На основе культур клеток, с целью достичь высокой иммуногенности и безопасности, было получено несколько вакцин, таких как очищенная утиная эмбриональная вакцина (РЭЕУ), вакцины 1-го поколения, такие как вакцина на основе диплоидных клеток человека (^У1к1ог е1 а1., 1964. 1. 1ттипо1. 93:353-366), и вакцины 2-го поколения, такие как очищенная вакцина на основе клеток куриных эмбрионов (РСЕСУ), очищенная антирабическая вакцина на основе клеток Веро, вакцина антирабическая адсорбированная (РУА) и вакцина, полученная в первичной культуре клеток почек хомяков (РНКСУ), и т.д. (см. ЛАСМ 2006; 7(1):39-46).

Технологический прогресс, ведущий к разработке вышеуказанных вакцин, включал адаптацию штамма Рктап Мооге вируса бешенства к стабильным клеточным линиям, таким как клетки Веро (например, очищенная антирабическая вакцина на основе клеток Веро АЬйаутаЬ™ и УетотаЬ™) и линия диплоидных клеток человека МРС-5 [например, вакцина на основе диплоидных клеток человека (ХДСВ), в Индии -М1РУ-НОС] [См. ЛАСМ 2006; 7(1):39-46] или в утиных эмбрионах ш 8Йи (например, очищенная утиная эмбриональная вакцина - РОЕУ-Ьуккауас Ν) (см. ЬаЬога1огу Тескпкщех ш РаЫек; Роийй Ебйюп, Ε6ί. Ьу Р.Х. Мекйп, М.М. Кар1ап & Н. Кортотекц \УНО Оепеуа-1996).

Линии клеток Веро и МРС-5 представляют собой стабильные линии клеток и, следовательно, требуют анализа на присутствие остаточной клеточной ДНК в готовом продукте (см. европейской Еигореап Рйагтасорое1а, 2004), которая может представлять риск из-за переноса латентных вирусов и других агентов. Кроме того, выходы, получаемые с клетками Веро, существенно ниже, даже когда для получения вакцины используется штамм РМ. РЭЕУ является суспензионной вакциной, и, следовательно, данная вакцина не может соответствовать требованиям для внутрикожного (ΙΌ) применения. Кроме того, данная методика не позволяет достичь высоких выходов (1,8-2,2 доз/яйцо). Продолжительность процесса также составляет 88 дней, что слишком длительно. В коммерческой вакцине РЭЕУ используется консервант тиомерсал, который связывали с возможностью развития аутизма у маленьких детей (см. Ьйр://№№№.пс1Г8.и8уб.еби.аи/Рас18/Р-1Ыотег8а1.Ыт1).

Кроме того, процесс производства РЭЕУ является длительным, тяжелым и неподходящим для крупномасштабного производства, поскольку он дает низкий выход.

ХДСВ считается вакциной золотого стандарта, но она очень дорогостоящая. Таким образом, существует потребность в получении усовершенствованной и высокоиммуногенной антирабической вакцины, с более высоким выходом, а также с меньшими затратами, с применением технологии клеточных культур.

- 1 020998

В υδ 4115195 (Βιιύοίρΐι Ваткй с1 а1.) описан способ получения антирабической вакцины. Описано, что культуры фибробластов куриных эмбрионов, наряду с другими культурами клеток, могут использоваться для получения антирабической вакцины с различными вирусами, такими как вирусы штамма УР 11, штамма Пастера, штамма РМ, или с гомогенизированным материалом куриных эмбрионов, содержащим вирусы штамма Р1шу ЬЕР (кратковременное пассирование на куриных эмбрионах) или Р1иту НЕР (длительное пассирование на куриных эмбрионах). В этом патенте также приведены, в частности, примеры применения вируса бешенства фиксированного штамма УР 11, Р1шу НЕР и Р1иту ЬЕР для заражения фибробластов куриных эмбрионов. Однако в этом документе не описана адаптация штамма Рйтап Мооге (штамм \У151аг РМ-ΗΌΟδ, 1503-3М) ни к первичной культуре фибробластов утиных эмбрионов, ни к первичной культуре фибробластов куриных эмбрионов. Кроме того, среды, используемые в настоящем изобретении, представляют собой уникальную комбинированную среду, которая не описана в υδ 4115195 и разработана исключительно для вируса бешенства РМ, для заражения первичной клеточной культуры фибробластов куриных эмбрионов.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что штамм Рйтап Мооге может быть адаптирован к первичной клеточной культуре фибробласта цыпленка. Такая адаптация обеспечивает способ получения антирабической вакцины в больших количествах с превосходным выходом, малой продолжительностью производственного цикла и легкостью масштабирования. Получаемая вакцина подходит для внутрикожного применения в дополнение к внутримышечному применению (1М), поскольку вакцина не является суспензией.

Согласно настоящему изобретению антирабическая вакцина, полученная посредством адаптации Рйтап Мооге к первичной клеточной культуре куриных фибробластов, более выгодна, чем многие другие антирабические вакцины на основе стабильных линий клеток, и с большей легкостью адаптируется к крупномасштабному коммерческому производству вакцины. Вакцина, полученная настоящим способом, имеет очень высокий выход, эффективность, безопасность, кроме того, способ является более рентабельным по сравнению со многими другими известными способами получения антирабических вакцин, предпочтительно, когда способ осуществляют, используя ПЭТ роллер-флаконы для культур тканей (ТС).

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что вирусом Рйтап Мооге можно тяжело инфицировать первичную клеточную культуру куриных фибробластов в уникальной комбинированной среде, описанной далее, при подходящих условиях процесса, как подробно описано ниже, с использованием ПЭТ роллер-флаконов ТС. Такие предпочтительные варианты осуществления обеспечивают получение вакцины с высоким выходом, большую эффективность и иммуногенность, что делает вакцину сравнительно рентабельной.

Цель изобретения

Первая цель настоящего изобретения состоит в адаптации штамма вируса бешенства Рйтап Мооге к клеточной культуре фибробластов куриных эмбрионов с целью получения антирабической вакцины.

В варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения иммуногенной и высокоочищенной вакцины, полученной на клетках куриных эмбрионов (далее называемой РСЕСУ^РМ) с использованием штамма Рйтап Мооге, которая предназначена для активной иммунизации против бешенства.

Другой вариант осуществления изобретения заключается в разработке высокоэффективного уникального способа получения вакцины посредством более простого процесса.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к подходящей композиции сред, которая обеспечивает высокую инфекционность вируса бешенства штамма Рйтап Мооге в культуре фибробластов куриных эмбрионов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу адаптации штамма вируса бешенства Рйтап Мооге к клеточной культуре фибробластов куриных эмбрионов. Исходный штамм Рйтап Мооге (штамм \У151аг РМ-НЭС'Ъ. 1503-3М) вначале адаптировали к мышам посредством одного интрацеребрального пассажа, а затем в яйцах утки с помощью повторных пассажей, которые авторы настоящего изобретения дополнительно адаптировали к культуре фибробластов утиных эмбрионов с помощью последовательных пассажей, с последующей адаптацией к первичной культуре фибробластов куриных эмбрионов с помощью дополнительных серийных пассажей, используя подходящую среду и другие подходящие параметры культивирования, с целью получения антирабической вакцины.

Другой аспект настоящего изобретения относится к уникальной комбинированной среде, которая позволяет достичь высокой и тяжелой инфекционности штамма вируса бешенства Рйтап Мооге в очищенной культуре фибробластов куриных эмбрионов.

В другом аспекте изобретение относится к инактивированной очищенной антирабической вакцине, полученной на клетках куриного эмбриона, с использованием штамма вируса бешенства РМ, обладающей высокой чистотой и иммуногенностью.

- 2 020998

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Показана специфичная флюоресценция к бешенству 03РМ/Эиск/§.Ра8.07 в культуре клеток утки на 5-й день.

Фиг. 2. Показана специфичная флюоресценция к бешенству 04РМ/СЫск/§.Ра8.09 в культуре клеток куриных эмбрионов (СЕС) на 5-й день.

Фиг. 3. Показана специфичная флюоресценция к бешенству 04РМ/СЫск/§.Ра8.10 в культуре клеток куриных эмбрионов (СЕС) на 3-й день.

Фиг. 4. Показана специфичная флуоресценция к бешенству 04РМ/СЫск/§.Ра8.11 в культуре клеток куриных эмбрионов (СЕС) на 3-й день.

Фиг. 5. Показана специфичная флюоресценция к бешенству 04РМ/СЫск/§.Ра8.12 в культуре клеток куриных эмбрионов (СЕС) на 3-й день.

Фиг. 6. Сравнение экспериментальной вакцины настоящего изобретения с различными коммерческими антирабическими вакцинами.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к адаптации штамма вируса бешенства Рйтаи Мооге в первичных клеточных культурах куриных/утиных фибробластов. Используемые яйца являются куриными яйцами сорта 8РР (не содержащими патогенов). Куриные яйца 8РР и штамм вируса бешенства Рйтап Мооге являются субстратом и вирусным штаммом, одобренными ВОЗ для производства антирабической вакцины для людей. В предпочтительном варианте осуществления штамм вируса бешенства РМ адаптирован к куриным фибробластам в роллерных культурах с использованием ПЭТ роллер-флаконов ТС, что обеспечивает более высокий выход по сравнению с рядом других методик.

Исходный штамм Рйтап Мооге (штамм ХУМаг РМ-НИС8, 1503-3М) вначале адаптировали к мышам посредством одного интрацеребрального пассажа, а затем в яйцах утки с помощью повторных пассажей. В дальнейшем авторы настоящего изобретения попытались разработать способ адаптации штамма вируса бешенства РМ к первичной культуре фибробластов утиных эмбрионов, и только небольшая часть клеток, как определили, была инфицирована (фиг. 1). В ходе нескольких пассажей инфекционность не повысилась до удовлетворительной степени.

Например, из И8 4115195 известно, что достаточно высокий вирусный титр является предпосылкой эффективной антирабической вакцины. Следовательно, авторы изобретения перевели свое внимание на пассирование вируса в клеточную культуру фибробластов куриных эмбрионов. После нескольких экспериментов на предмет инфекционности и адаптации в клетках куриных эмбрионов были получены успешные результаты титрации вируса (фиг. 2-5).

Исходный штамм ХУМаг РМ-НОС8, 1503-3М, адаптированный к эмбриону утки, упоминается в настоящем изобретении как Исходный посевной материал ΌΕ 42/74 Пас. 12 12.11.1974, который является посевным материалом для производства вакцины РИЕУ. Указанный Исходный посевной материал ΌΕ 42/74 Пас. 12 12.11.1974 вируса бешенства первоначально адаптировали и выращивали в клетках утиных эмбрионов, а затем в первичной клеточной культуре куриных фибробластов, получив на клеточной культуре вакцину РСЕС (РСЕСУ^РМ) против бешенства согласно настоящему изобретению.

Первоначально авторы изобретения попытались адаптировать исходный посевной материал ΌΕ 42/74 Пас. 12 12.11.1974 вируса к первичной клеточной культуре фибробластов утиных эмбрионов посредством повторных пассажей. Однако поскольку фибробласты утиных эмбрионов не являются естественным хозяином для вируса бешенства РМ, авторы изобретения не получили признаков развития инфекции в первых экспериментах, а дальнейшая оптимизация привела лишь к очень слабой инфекции в последующих экспериментах. Поэтому процесс значительно изменили и пассирование в первичной культуре фибробластов утиных эмбрионов заменили пассированием в первичной культуре фибробластов куриных эмбрионов в подходящей среде и при подходящих параметрах культивирования. Такое пассирование штамма РМ вируса бешенства в первичную культуру фибробластов куриных эмбрионов является уникальной и нестандартной заменой, которая не описана в уровне техники и не является очевидной специалисту, квалифицированному в данной области, как рутинная, поскольку эти клетки также не являются естественным хозяином штамма РМ вируса бешенства.

В настоящем изобретении исходный посевной материал вируса ΌΕ 42/74 Пас. 12 12.11.1974 адаптировали к первичной культуре фибробластов утиных эмбрионов, а затем первичной культуре фибробластов куриных эмбрионов посредством повторных пассажей, как описано ниже:

- 3 020998

Обозначение различных штаммов, полученных в процессе пассирования, приведено в следующем общем формате: год получения (например, '04' для 2004)/штамм РИтаи Мооге (РМ)/субстрат, на котором проводили пассирование (утка или курица)/номер серийного пассажа/дата приготовления культуры.

Адаптированный штамм Рйтаи Мооге, который использовали в качестве исходного или рабочего посевного материала, получали путем заражения вирусом РМ (ΌΕ 42/74 пас. 12 12.11.1974) первичной культуры фибробластов, утиного эмбриона, а затем при температуре 33-36°С проводили 7 пассажей, адаптируя штамм в первичной культуре фибробластов утиного эмбриона, с получением 03 РМ/Утка/С. пас. 07 18.12.03. Затем штаммом 03 РМ/Утка/С. пас. 07 18.12.03 инфицировали первичную культуру фибробластов куриных эмбрионов по меньшей мере за 4 пассажа, получив исходный посевной материал 04 РМ/Курица/С. пас. 11 04.08.04. Можно выполнить 1-5 пассажей от исходного посевного материала, чтобы получить рабочий посевной материал для коммерческого производства вакцины. Один из примеров партии рабочего посевного материала, полученной согласно вышеуказанному способу, обозначили

- 4 020998 как 04 РМ/Курица/С. пас. 12 25.12.04.

Вирус, полученный из исходного посевного материала 04 РМ/Курица/С. пас. 11 04.08.04, имеет диковый титр по меньшей мере 10^6,5 ТСГО₅₀о_/о (инфекционных единиц) в мл. Титр вируса повышался логарифмически при последовательных пассажах на клетках куриного эмбриона, что позволяет предположить, что вирус имеет стабильный фенотипический признак.

В каждой стадии пассажа оценивали инфекционность путем окрашивания культуры ЛЬ ФИТЦмеченным конъюгатом, используя флуоресцентную микроскопию. После получения оптимальных и воспроизводимых условий инфекционности и культивирования, результаты подтверждали, прежде всего, с помощью флуоресцентной микроскопии, а затем с помощью нескольких тестов ίη νίίτο и ίη νίνο, как описано в различных изданиях РНагтасороаа.

Адаптацию вируса предпочтительно выполняли, используя ПЭТ роллер-флаконы ТС или многоярусные культуральные флаконы ТС.

Для надлежащей адаптации несколько сред и комбинации их компонентов применяли, как описано ниже, с помощью примера 1. Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами, которые представляют один из предпочтительных способов осуществления изобретения.

Следует понимать, что возможны некоторые модификации изобретения, очевидные специалисту, квалифицированному в данной области, которые, как полагают, входят в объем настоящего изобретения.

Пример 1. Выбор среды для адаптации вируса и оптимизации процесса.

Для адаптации вируса и оптимизации параметров процесса были выбраны следующие среды.

Продукционная культуральная среда 1 (РСМ 1).

Продукционная культуральная среда 2 (РСМ 2).

Продукционная культуральная среда (РСМ).

Вышеуказанная среда включает следующие компоненты:

СОСТАВ СРЕДЫ	РСМ 1	РСМ 2	РСМ
	мг/л	мг/л	мг/л
Неорганические соли
Безводный хлорид кальция	200	200	175-225
Нитрат железа {III) · 9ЩО	0,1		0,02-0,07
Безводный сульфат магния	97,7	97, 7	72,7-122,7
Хлорид калия	400	400	375-425
Хлорид натрия	6400	-	3175-3225
Дигидрофосфат натрия·Н2О	125	140	107,5-157,5
Гидрокарбоиат натрия	3700	2200	2925-2975
Витамины
П-пантотенат кальция	4	1	0,5-5,0
Холинхлорид	4	1	0,5-5,0
Фолиевая кислота	4	1	0,5-5,0
Миоинозит	7,2	2	0,6-8,6
Никотинамид	4	1	0,5-5,0
Пиридоксаль НС1	4	1	0,5-5,0
Рибофлавин	0,4	0,1	0,01-0,5
Тиамин НС1	4	1	0,5-5,0
Аминокислоты
Ъ-аргинин НС1	84	126	80-130
Ъ-цистин	48	24	5-30
Ъ-глутамин	584	292	413-463

- 5 020998

Глицин	30	-	20-40
Д-гистидин НС1'НгО	42	42	17-67
Ь-изолейцин	105	52	53,5-103,5
Ь-лейцин	105	52	53, 5-103,5
Ь-лизин НС1	146	72, 5	84,25-134,25
Ь-метионин	30	15	2,5-42,5
Ь-фенилаланин	66	32	24-74
Ь-серин	42	-	16-26
Ь-треонин	95	48	46, 5-96,5
Ь-триптофан	16	10	10-30
Ь-тирозин	72	36	29-79
Ь-валин	94	46	45-95
Другое
Безводная ϋ-глюкоза	4500	1000	2725-2775
Феноловый красный	15	11	10-30
Пируват натрия	110	-	30-80

В вышеуказанные среды дополнительно добавляли человеческий сывороточный альбумин, гидролизованный желатин, бикарбонат натрия и раствор антибиотиков с подходящими концентрациями.

Следующие эксперименты выполняли, используя различные среды, при этом сравнивали их эффективность на предмет формирования монослоя клеток и степени вирусной инфекции.

Отбирали 9-11-дневные эмбрионы и трипсинизировали 10-10-20 мин. Клетки центрифугировали, чтобы удалить трипсин, и ресуспендировали в равной плотности в РСМ 1, РСМ 2 и РСМ. В различных экспериментах количество клеток доводили приблизительно до 1,7х10⁶ клеток в 1 мл во всех трех средах. Во всех экспериментах использовали вирус 03 РМ/Утка/С. пас. 07 в разведении 1:1200. Время адсорбции составляло 90 мин для каждого эксперимента. Зараженные клетки пересевали во флаконы ТС и ПЭТ роллер-флаконы ТС (Отешет). Образцы зараженных клеток из флаконов/роллер-флаконов ТС также пересевали в 24-луночные планшеты ТС. Флаконы и роллер-флаконы ТС инкубировали при 34±1°С в течение 5 дней. 24-луночные планшеты инкубировали в атмосфере с 3% СО₂ при 34±1°С и окрашивали ФИТЦ-конъюгатом на 3-й день для оценки степени вирусной инфекции, которую определяли по специфичной флюоресценции к бешенству как хорошую (+), очень хорошую (++), превосходную (+++) или исключительную (++++).

На 4-й или 5-й день супернатант культуры клеток отбирали в каждом наборе экспериментов в качестве первого сбора и компенсировали свежей подходящей средой. После дальнейшего инкубирования, на 2-й, 3-й или 4-й день после первого сбора, в каждом наборе проводили второй сбор. Первый сбор и второй сбор анализировали на предмет вирусного титра и стерильности.

Было установлено, что в 24-луночном планшете клетки, инокулированные в РСМ 1 и РСМ 2, показывали плохой или хороший инфекционный процесс, тогда как клетки, инокулированные в РСМ, демонстрировали превосходный или исключительный инфекционный процесс, согласно оценке посредством специфичной иммунофлюоресценции к бешенству;

флаконы/роллер-флаконы ТС с культурой в РСМ демонстрировали хорошие титры по сравнению с РСМ 1 и РСМ 2. Значения титра в РСМ, РСМ 2 и РСМ составляли 10^5,6, 10^5,8 и 10^7,7 ТСГО₅о%.

На основании вышеприведенных результатов в различных экспериментах среду РСМ выбрали для адаптации в первичной клеточной культуре фибробластов куриных эмбрионов и последующего получения вакцины, которое дополнительно оптимизировали по различным параметрам процесса, что находится в компетенции специалистов, квалифицированных в данной области, и путем дополнительного подбора подходящих роллер-флаконов ТС.

Общая методика культивирования клеток, используемая для получения исходного посевного материала, рабочего посевного материала и производства антирабической вакцины.

Куриные яйца инкубировали в течение 8-11 дней при температуре 35-37°С и 70-90%-ной относительной влажности. После инкубации яйца просвечивали на наличие живых и здоровых эмбрионов. После просвечивания эмбрионы извлекали из каждого яйца в стерильных условиях, после чего головы отделяли путем отрыва. Затем головы немедленно отбрасывали, а тела эмбрионов объединяли во флаконе, промывали три-четыре раза стерильным РВ§ и трипсинизировали трипсином, предварительно нагретым до 35±2°С в течение 10-40 мин.

Суспензию трипсинизированных клеток фильтровали через нейлоновый нетканый материал с последующим центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10-15 мин в охлаждаемой центрифуге. Осадок клеток суспендировали в свежей ростовой среде, тщательно перемешивали и повторно центри- 6 020998 фугировали полученную суспензию клеток аналогичным способом. Осадок клеток суспендировали в свежей ростовой среде и тщательно перемешивали. Суспензию клеток переносили в стерильный стеклянный флакон, содержащий вышеуказанную культуральную среду, и перемешивали в течение 5-10 мин при 35±2°С. Конечное количество клеток доводили до 1,4-2,2х10⁶/мл в 20-л стеклянных флаконах, используя культуральную среду.

Суспензию клеток инокулировали заданным исходным или рабочим посевным материалом вируса с оптимальным разведением и инкубировали с медленным перемешиванием при 35±2°С в течение 90-120 мин для адсорбции вируса на клетках. В конце адсорбции инфицированную вирусом суспензию распределяли либо в ПЭТ роллер-флаконы ТС (300+50 мл в роллер-флакон ТС) или в многоярусные флаконы ТС, такие как клеточные фабрики или многокамерные культуральные поверхности (3000±500 мл), или комбинация обоих. Затем суспензии инкубировали при 34,5±0,5°С в течение 4-6 дней. На 4-й или 5-й день культуральный супернатант отбирали в качестве первого сбора и добавляли свежую среду. После дальнейшей инкубации на 7-й или 8-й день проводили второй сбор. Третий сбор является необязательным. Различные сборы вируса хранили при 2-8°С. Многократный сбор делает изобретение рентабельным, поскольку обеспечивается получение большего выхода с хорошими титрами.

Объединенные собранные партии вируса очищали и концентрировали с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы на зональной центрифуге при 35000 об/мин. Разделение полосы вируса бешенства наилучшим образом происходит при концентрации сахарозы приблизительно 3540% и соответствующие полосы в градиенте сахарозы, содержащие активный живой вирус бешенства, отбирают как продуктивные фракции. Концентраты вируссодержащих фракций из различных объединенных собранных партий хранили ниже -60°С до получения результатов различных тестов, таких как ίη νίΐτο иммуноанализ, тест на стерильность и тесты на присутствие бактериальных эндотоксинов.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ инактивации вируса РМ в целях устранения его инфекционности с сохранением его антигенных свойств. Концентраты размораживали при 37°С и охлаждали при 4±2°С. Концентраты разводили стабилизатором вакцины, чтобы достичь соответствующего содержания антигена 8,5 МЕ/мл, и отбирали пробы для иммуноанализа ίη νίΐτο, такого как АВТ, ΕΕΙδΑ и δΚΌ-тест. Уровень рН смешанной массы измеряли и доводили до 8,0±1 10%-ным (мас./об.) стерилизованным раствором ЫаОН. Затем эффективное количество бета-пропиолактона, разведенного 1:100 в ΡΒδ, медленно добавляли в смешанную массу, получив конечную концентрацию 1:4000 (0,025%), после чего содержимое емкости переносили в другую предварительно стерилизованную инактивационную емкость. Инкубация с бета-пропиолактоном проводили при 2-6°С при постоянном перемешивании. По меньшей мере 48 ч потребовалось для полной инактивации вирусной инфекционности, без потери антигенных свойств вируса. Процесс инактивации вируса РМ при 2-6°С выбрали как предпочтительный благодаря его простоте при крупномасштабном культивировании.

Наконец инактивированную массу хранили при 5±3°С до последующей обработки при непрерывном перемешивании. Инактивированную массу разводили в подходящем стабилизирующем растворе с доведением антигенного значения по меньшей мере до 5 МЕ/мл. В ходе процесса перемешивания смешанную массу поддерживали при температуре 5±3°С с перемешиванием. Смешанную вакцину перемешивали в течение 30 мин перед фасовкой. Лиофилизацию проводили стандартными методами, известными из уровня техники. Используемый стабилизатор вакцины содержит сахарозу, гидролизованный желатин, человеческий альбумин и соли натрия. Вакцину приготавливали в лиофилизованной форме, восстанавливаемой стерильной водой перед инъекцией.

Эффективность и иммуногенность вакцины, полученной с использованием куриных фибробластов, аналогична соответствующим показателям вакцины международного стандарта (ВОЗ 5-й ΙΚΜ), которую оценивали на безопасность для различных животных, эффективность и сероконверсию. Кроме того, чистоту конечного продукта подтверждали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и сравнивали с другими коммерческими продуктами, выявив соответствие (фиг. 6). Продукт также высокостабилен при хранении при 2-8°С. Он также сохраняет эффективность и другие критические параметры при воздействии быстро меняющихся и экстремальных температур согласно руководству 1СН (Международной конференции по гармонизации) по стабильности биотехнологических и биологических материалов.

Пример 2. Адаптация штамма вируса бешенства Рйтап Мооге к первичной культуре фибробластов утиных эмбрионов и последующая адаптация полученного вируса к первичной культуре фибробластов куриных эмбрионов.

(А) Исходный штамм вируса бешенства Рйтап Мооге (штамм ХУМаг ΡМ-Н^Сδ, 1503-3М) вначале адаптировали посредством 1 церебрального пассажа в швейцарских мышах-альбиносах, затем 12 пассажами в яйцах утки с эмбрионами, и обозначили полученный вирус как ΌΕ 42/74 пас. 12 12.11.1974. В настоящем изобретении данный вирус применяется для дальнейшей адаптации к первичной культуре фибробластов утиных эмбрионов, а затем к культуре фибробластов куриных эмбрионов.

Эксперимент проводили с использованием беспатогенных (δΡΡ) 11-12-дневных утиных яиц. Количество клеток установили на уровне 1,8х10⁶ клеток/мл согласно известным методам, суспензию клеток приготовили с использованием продукционной культуральной среды 1 (РСМ 1, описана выше) с добав- 7 020998 лением 1,5% человеческого альбумина. Замороженную аликвоту 5 мл вышеназванного вируса БЕ 42/74 пас. 12 12.11.1974 размораживали при 37°С, разводили в стабилизаторе клеточной культуры, и использовали для заражения суспензии клеток утиных эмбрионов. Зараженную суспензию клеток переносили в ПЭТ роллер-флаконы ТС и инкубировали при 34°С. В пятый день после заражения из роллер-флаконов отбирали партию материала, анализировали вирусный титр в мышах и проверяли на предмет отсутствия загрязнения, например бактерий и грибов. Данный собранный вирус обозначили как 02 РМ/УТКА/С. пас. 01.

Аналогичным образом далее сделали шесть таких же пассажей в культуре клеток утиных эмбрионов, и после каждого пассажа выход составлял приблизительно 7,0 л. После каждого пассажа полученные партии собирали, анализировали вирусный титр в мышах и проверяли на предмет отсутствия загрязнения, например бактерий и грибов. Материал, полученный после каждого пассажа, далее делили на аликвоты по 5 мл. Их обозначали следующим образом.

Дата культивирования	Кол-во яиц	Приблизительный объем получен- ного материала	Прим	1: Обозначение
14.04.02	180	07	литров	02 01	РМ/Утка/С.пас.
27.07.02	130	07	литров	02 02	РМ/Утка/С.пас.
30.11.02	180	07	литров	02 03	РМ/Утка/С.пас.
11.01.03	180	07	литров	03 04	РМ/Утка/С.пас.
04.10.03	180	07	литров	03 05	РМ/Утка/С.пас.
17.11.03	180	07	литров	03 06	РМ/Утка/С.пас.
13.12.03	180	07	литров	03 07	РМ/Утка/С.пас.

В течение вышеописанных экспериментов, после исходного пассажа, лишь немногие клетки были инфицированы и показывали специфичную флюоресценцию к бешенству. Инфекционность вируса постепенно и значительно возросла, начиная с четвертого пассажа. Это можно представить в виде диаграммы:

- 8 020998

После седьмого пассажа инфекционность была почти постоянной. Несколько альтернативных методик опробовали с весьма небольшим успехом. Неожиданно, когда вирусом 03 РМ/Утка/С. пас 07 18,02.03 заразили фибробласты куриных эмбрионов, инфекционность значительно увеличилась. На основе данного наблюдения вирусный штамм далее пассировали в фибробластах куриных эмбрионов, с целью получения требуемой инфекционности и вирусного титра, следующим образом.

(В) В процессе использовали приблизительно 9-11-дневные (180 эмбрионов) оплодотворенные куриные яйца 8РР, опять же, головную часть отделяли от части тела, обрабатывали только часть тела, тогда как головную часть отбрасывали. Объединенные части тела несколько раз промывали фосфатносоляным буфером, а затем эмбрионы трипсинизировали с использованием раствора трипсина. Суспензию клеток готовили в РСМ, плотность клеток доводили до 1,6х 10⁶ клеток/мл. Замороженную аликвоту 5 мл 03 РМ/Утка/С. пас. 07 размораживали при 37°С и разводили в стабилизаторе. Ее использовали для заражения суспензии клеток куриных эмбрионов. Полученную инфицированную суспензию клеток инкубировали при 37°С в течение 1,5 ч с медленным перемешиванием. Зараженные клетки распределяли в роллер-флаконы, а также в многоярусные флаконы ТС, и инкубировали при 34°С. В пятый день инфекции из роллер-флаконов и многоярусных флаконов ТС отбирали материал, приблизительно 7 л, и делили на подходящие аликвоты, при этом несколько из полученных аликвот 5 мл использовали для анализа вирусного титра в мышах и на предмет отсутствия загрязнений, например, бактерий и грибов.

Данную партию вирусного материала обозначили как 04 РМ/Курица/С. пас. 08

Дата культивирования	Кол-во яиц	Приблизительной объем полученного материала	Обозначение
27.04.04	180	07 литров	04 РМ/Курица/С.пас. 08
11.05.04	180	07 литров	04 РМ/Курица/С.пас. 09
16.07.04	180	07 литров	04 РМ/Курица/С.пас. 10
04.08.04	180	07 литров	04 РМ/Курица/С.пас. 11
25.12.04	180	07 литров	04 РМ/Курица/С.пас. 12

Далее 3 последующих последовательных пассажа вируса проводили в куриных фибробластах, отбирали аликвоты от каждого сбора, делили на аликвоты по 5 мл и обозначали, как указано выше. Все пассажи анализировали на вирусный титр и отсутствие бактерий и грибов.

На основе полученных данных вирус, полученный после 4-го пассажа и обозначенный как 04 РМ/Курица/С. пас. 11 04.08.04, который имел вирусный титр 10^7,7 ЬП₅₀о/_о в мл, рассматривали в настоящей заявке как исходный посевной вирусный материал. Данный вирус подвергали 1 следующему пассажу, получив рабочий посевной вирусный материал 04 РМ/Курица/С. пас. 12 25.12.04.

Пример 3. Получение вакцины из рабочего посевного материала.

Вирусным посевным материалом 04 РМ/Курица/С. пас. 12 25.12.04 заражали куриные фибробласты в соответствии со способом, аналогичным описанному в стадии 1(Ь) выше, и первую партию материала получали в 4-й или последующие дни, а вторую партию - через 2-3 дня первого отбора. Объединенный собранный вирусный материал очищали и концентрировали путем ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы на зональной центрифуге при 35000 об/мин. Разделение полосы вируса бешенства выполняли приблизительно при 35-40% концентрации сахарозы, при этом активный живой вирус бешенства отбирали в продуктивных фракциях. Вирусные концентраты из различных объединенных собранных партий хранили при температуре ниже -60°С до получения результатов различных тестов, таких как ίη νίίΓο иммуноанализ, тест на стерильность и тесты на присутствие бактериальных эндотоксинов.

Концентраты размораживали при 37°С и охлаждали при 4±2°С. Концентраты разводили стабилизатором вакцины, достигая соответствующего содержания антигена 8,5 МЕ/мл, при этом отбирали пробы для ίη νίίτο иммуноанализа, такого как АВТ, ЕША и δΡΌ тест. Показатель рН смешанной массы измеряли и доводили до 8,0±1 10%-ным мас./об. стерилизованным раствором ΝαΟΗ. Затем смешанную массу инактивировали путем добавления бета-пропиолактона до подходящей концентрации, используя известные методы.

Наконец инактивированную массу хранили при 5±3°С при непрерывном перемешивании и разводили подходящим стабилизирующим раствором, доводя уровень концентрации антигена до >5 МЕ/мл, после чего смешанную массу выдерживали при 5±3°С при перемешивании в течение 30 мин. Смешанной массой заполняли флаконы, при этом использовали подходящую стабилизирующую композицию, включающую сахарозу, гидролизованный желатин, человеческий альбумин и соли натрия. Готовую вакцину приготавливали в лиофилизованной форме, восстанавливаемой стерильной водой для инъекций перед применением. Иммуногенность и эффективность вакцины тестировали следующим образом.

- 9 020998

Пример 4. Тест для оценки эффективности (ΝΙΗ) на мышах.

Тест для оценки эффективности ΝΙΗ (Национальный институт здравоохранения США) на мышах выполняли согласно ЬаЪога1огу ТесНп1цие5 ίη КаЫек, 4(1ι еб. \УНО 1996 и Фармакопеи Индии.

Эффективность антирабической вакцины определяли путем сравнения дозы экспериментальной вакцины, необходимой для защиты мышей при введении смертельной внутримозговой дозы вируса бешенства, с соответствующей дозой контрольной вакцины (ВОЗ 5'¹' КМ, 16,0 МЕ в ампуле), необходимой для обеспечения такой же защиты.

Использовали швейцарских мышей-альбиносов весом приблизительно 12-15 г.

Требуемое кол-во мышей
Контрольная вакцина	54 (15x4 разведений)
Тестируемая вакцина	54 (16x4 разведений)
Титрация вируса	(10x4 разведений)

Одну дозу контрольной вакцины международного стандарта восстанавливали в 2,0 мл воды для инъекций, и 0,5 мл полученного раствора тщательно смешивали с 12 мл фосфатно-соляного буфера (РВ§), получив 25-кратное разведение.

Одну дозу, по меньшей мере, с каждой полки лиофилизованных партий экспериментальной вакцины изобретения восстанавливали отдельно в 1,0 мл воды для инъекций, а затем смешивали вместе. Из полученного раствора отбирали 0,5 мл и тщательно смешивали с 12 мл РВ§, получив, таким образом, 25кратное разведение.

Затем три пятикратных разведения и контрольной вакцины, и экспериментальных вакцин готовили в РВ§ (рН 7,4). Диапазон разведений выбирали так, чтобы среднее разведение содержало количество вакцины, достаточное для защиты 50% от общего количества мышей, взятых для исследования, при заражении дозой вируса 10-50 БЭ₅₀. В диапазоне разведения 1:25, 1:125, 1:625, 1:3125 выявили хорошую эффективность и контрольной, и экспериментальной вакцины.

В ходе первой иммунизации шестнадцати мышам (8 самцов + 8 самок) вводили 0,5 мл каждого разведения, внутрибрюшинным путем, а вторую иммунизацию проводили через семь дней после первой иммунизации, повторяя те же стадии, как и при первой вакцинации.

Заражение вирусом (инфицирование) иммунизированных мышей.

Через 14 дней после первой иммунизации всех мышей заражали мозговой суспензией стандартного вируса для контрольного заражения (СУ8), дозу которого доводили до 10-50 ЬП₅₀.

Наблюдение за экспериментальными животными.

Зараженных мышей наблюдали в течение 14 дней. Смертельные случаи у мышей отмечали через пять дней инфекции.

Расчет эффективности.

Эффективность вычисляли с помощью метода Рида-Менча. Было установлено, что значения ΕΌ₅₀ тестируемой и стандартной вакцин находились между самой высокой и самой низкой дозой, которые вводили экспериментальным животным;

титрация суспензии для инфицирования показала, что 0,03 мл суспензии содержали 10-50 ЬП₅₀ и все животные, получившие суспензию данной концентрации, должны погибнуть.

Доверительный интервал уровня значимости (р=0,95) составлял не менее 25% и не более 400% расчетной эффективности.

Заключительные результаты приведены в таблице ниже.

Партия №	Тест	Эффективность	Доверительный интервал {95%)	Доза вируса при заражении	Средняя эффективность (МЕ/доза)
1	I	5, 42	2,567-10,928	26, 30	5,43
II	5, 50	2,541-11,926	26, 92

На основании вышеописанного эксперимента можно сделать вывод, что средняя эффективность экспериментальной вакцины составляет 5,43 МЕ/доза. Доверительный интервал 95% для каждого теста составляет 25-400% расчетной эффективности. Доза вируса для контрольного заражения (СУЭ), используемая в каждом тесте, составляла 10-50 БЭ₅₀. Значение ΕΌ₅₀ для контрольной и тестируемой вакцины в каждом тесте находилось между самым высоким и самым низким разведением. Следовательно, можно сделать вывод, что вакцина обеспечивает иммунную защиту, а уровень эффективности ΝΙΗ намного выше минимального требования 2,5 МЕ/доза.

Пример 5. Тест на сероконверсию и заражение на кроликах.

Исходя из положительных результатов, полученных на мышах в исследовании сероконверсии/заражения, разработали комбинированное исследование для подтверждения сероконверсии и защиты у кроликов. Использовали новозеландских белых кроликов весом в пределах 1,5-2,5 кг, в группу включили 5 самцов и 5 самок.

- 10 020998

В качестве контрольной вакцины использовали ВОЗ 5'¹' КМ, восстановленную в 2 мл стерильной воды для инъекций с получением концентрации 8 МЕ/мл. Экспериментальную вакцину настоящего изобретения восстанавливали в 1 мл стерильной воды для инъекций.

Всем кроликам в каждой группе внутримышечно вводили 0,5 мл соответствующих вакцин в день 0 и в день 7 и наблюдали в течение 14 дней. В день 14 у каждого кролика в асептических условиях забирали 2 мл крови из краевой ушной вены, после чего кровь оставляли свертываться в термостате при 37°С в течение 1 часа. Пробы крови центрифугировали при 1500 об/мин/10 мин для отделения сыворотки и сыворотки отбирали в асептических условиях в предварительно стерилизованные пробирки/криофлаконы. Пробы инактивировали нагреванием при 56°С в течение 30 мин и хранили при температуре ниже -60°С для дальнейшего определения титра.

Титр антител в каждой пробе определяли с помощью анализа быстрого ингибирования фокусов флюоресценции (КРИТ) и реакции нейтрализации на мышах (ΜΝΤ). Затем всех кроликов заражали внутримозговой инъекцией 30МЬП₅₀/0,3 мл стандартного вируса для контрольного заражения (СУ8-27) в условиях внутривенной анестезии (тиопентон натрия). Кроликов наблюдали в течение 14 дней на предмет развития специфических симптомов бешенства и смертности. Смертность вплоть до 5-го дня относили к случаям неспецифичной смерти.

Наблюдение.

Наблюдали, что ни один из кроликов в какой-либо группе не показывал развития специфических симптомов бешенства и не погиб. Тестируемая вакцина обладала аналогичной иммуногенностью по сравнению с контрольной вакциной, что можно видеть из таблицы.

Сероконверсия у кроликов.

Группа I: контрольная антирабическая вакцина (ВОЗ 5'¹' 1КМ)

Ν· кролика	Пол	Титр антител (МЕ/мл)
ΚΕΈΊΤ	ΜΝΤ
1	Самец	4,65-	9, 6
2	Самец	7,39	11,5
3	Самец	8,10	10,0
4	Самец	6,92	11,5
5	Самец	8,10	8, 91
6	Самка	5,86	11,0
7	Самка	11,73	10, 0
8	Самка	12,53	8, 91
9	Самка	8,1	6, 0
10	Самка	11,73	13,2
Среднее	-	8,51	10,06
Станд. откл.	-	2, 65	1, 95

Группа II: экспериментальная антирабическая вакцина (антирабическая вакцина РСЕС)

№ кролика	Пол	Титр антител (МЕ/мл)
	Β.ΡΕΙΤ	ΜΝΤ
1	Самец	11,73	9,12
2	Самец	8,10	9,14
3	Самец	5,86	8, 91
4	Самец	6, 92	11,48
5	Самец	7,39	12, 88
6	Самка	8, 10	13, 80
7	Самка	4, 65	13, 20
8	Самка	6, 92	11,48
9	Самка	12,53	12,0
10	Самка	8,10	6,70
Среднее	-	8,2	10, 87
Станд, откл.	-	3,2	2,29

- 11 020998

Вывод.

На основании титра антитела, полученного для экспериментальной тестируемой вакцины (среднее: 8,2 и 10,87 в КРИТ и ΜΝΤ соответственно), а также контрольной вакцины (среднее: 8,51 и 10,06 в КРИТ и ΜΝΤ соответственно), можно сделать вывод, что экспериментальная вакцина согласно настоящему изобретению обладает одинаковой иммуногенностью с контрольной вакциной.

Таким образом, из результатов, полученных после контрольного заражения, можно сделать заключение, что вакцина РСЕС (экспериментальная вакцина), полученная согласно способу по настоящему изобретению, обеспечивает одинаковую защиту с контрольным стандартом в отношении иммуногенности и эффективности.

Пример 6. Сравнение экспериментальной вакцины согласно настоящему изобретению с различными коммерческими антирабическими вакцинами.

Анализ с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ проводили для проверки и сравнения белкового состава экспериментальной антирабической вакцины и белкового состава других коммерческих продуктов с использованием известных маркеров.

В ходе исследования наблюдали (фиг. 6), что вирусный концентрат настоящего изобретения, приготовленный в той же форме, что и другие коммерческие антирабические вакцины, показывал идентичные белковые полосы.

На фиг. 6:

дорожка 1: маркер молекулярного веса (низкомолекулярный); дорожка 2: АФИ согласно настоящему изобретению;

дорожка 3: АФИ согласно настоящему изобретению, приготовленный в той же форме, что и другая коммерческая антирабическая вакцина РСЕС;

дорожка 4: коммерческая антирабическая вакцина РСЕС;

дорожка 5: коммерческая антирабическая вакцина на основе линии клеток Веро;

дорожка 6: АФИ согласно настоящему изобретению, приготовленный в той же форме, что и другая коммерческая антирабическая вакцина Веро.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ адаптации штамма ΌΕ 42/74 пас. 12 12.11.1974 РПтап Мооге вируса бешенства, полученного пассированием штамма \УНаг РМ-НИС8 1503-3М, к первичным фибробластам куриных эмбрионов для производства антирабической вакцины, где способ включает следующие стадии:

культивирование штамма вируса бешенства ΌΕ 42/74 пас. 12 12.11.1974 РПтап Мооге в первичных фибробластах утиных эмбрионов в подходящей среде посредством по меньшей мере 7 пассажей;

последующее культивирование вируса бешенства ΌΕ 42/74 пас. 12 12.11.1974 РПтап Мооге в первичных фибробластах куриных эмбрионов посредством по меньшей мере 4 пассажей в подходящей среде.
2. Способ по п.1, где используемая среда является средой РСМ.
3. Способ по п.2, где среда дополнительно включает человеческий сывороточный альбумин, гидролизованный желатин, бикарбонат натрия и подходящий раствор антибиотиков.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором количество фибробластов поддерживают в диапазоне 1,42,2х 10⁶ клеток/мл.
5. Способ по любому из пп.1-4, где адаптацию проводят в ПЭТ роллер-флаконах ТС или многоярусных флаконах ТС.
6. Штамм ΌΕ 42/74 пас. 12 12.11.1974 РПтап Мооге, адаптированный к первичным фибробластам куриных эмбрионов способом по п. 1 для получения антирабической вакцины.
7. Способ получения антирабической вакцины из штамма ΌΕ 42/74 пас. 12 12.11.1974 РПтап Мооге, охарактеризованного в п.6, включающий следующие стадии:

а) 1-5-кратное пассирование исходного штамма ΌΕ 42/74 пас. 12 12.11.1974 РПтап Мооге, охарактеризованного в п.6, в первичных фибробластах куриных эмбрионов;

б) наращивание вируса из указанных первичных фибробластов куриных эмбрионов;

в) выделение и очистка вируса;

г) инактивация вируса.
8. Антирабическая вакцина, полученная согласно способу по п.7.
9. Антирабическая вакцина по п.8, которая дополнительно лиофилизована.
10. Способ вакцинации млекопитающего, включающий введение вакцины по пп.8, 9.
11. Способ по п. 10, где вакцину вводят до контакта с патогенным вирусом бешенства.
12. Способ по п.10, где вакцину вводят после укуса животного, который может вызвать заражение бешенством.
13. Способ по п.10, где пациентом является человек.
14. Способ по п.10, где пациентом является домашнее или дикое животное.
15. Применение вакцины по пп.8, 9 для лечения бешенства у человека и животных.