CN1364171A - 用作诊断显象造影剂、生物活性物质和药物的单分子载体的多肽树状聚物 - Google Patents

用作诊断显象造影剂、生物活性物质和药物的单分子载体的多肽树状聚物 Download PDF

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Abstract

本发明描述了新的多肽树状聚物及其合成方法。本发明多肽树状聚物的结构由多官能核心部分和从核心部分上以辐射形式向外延伸出来的由短肽支化单位形成的高度支化多肽链构成。最远端的支链环绕成具有空腔和通道的低密度空间,在这样的空腔和通道内可包埋或共价连接用于诊断和治疗的生物活性物质。由于具有这些特征,所述多肽树状聚物可特别在很多生物和医药领域中用作递送生物活性物质包括药物的载体,或用作细菌、病毒和寄生虫抗原、基因治疗化合物以及诊断显象造影剂的载体。

Description

用作诊断显象造影剂、生物活性物质和药物 的单分子载体的多肽树状聚物
                        发明领域
本发明涉及多肽树状聚物，其合成方法，以及其作为递送生物活性物质包括药物的载体、或作为细菌、病毒和寄生虫抗原、基因治疗化合物和诊断显象造影剂(diagnostic imaging contrast agents)的载体的应用。
                        现有技术
树状聚物(dendrimer)是高度分支的聚合物，其中有多个从多官能核心部分辐射出的基本支链(单树突)形成与标准高度分支星形聚合物非常不同的结构和形态(D.A.Tomalia等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1990，29，138-175；D.A.Tomalia和H.DupontDurst，＂Topics in Current Chemistry＂，1993，165，193-313)。随着世代的增加，树状聚物的结构成分，即a)核心部分，b)由形成以辐射状连接在核心上的单树突的分支单位组成的内层(世代)，和c)外部紧密间隔的表面基团与发展良好的内腔和通道形成球状结构。内腔和通道产生可被用来包埋或共价偶联客体分子的微环境。聚酰氨基胺(PAMAM)starburst树状聚物的最高达10代的逐步合成以及其作为宿主分子的应用已在多个专利和文件(O.A.Matthews等人，Progr.Polym.Sci.，1997，23，1-56)中报道过。PAMAM树状聚物的计算机模拟已经表明空腔的数目和大小是如何取决于a)核心部分的官能团的数目(Nc)，b)分支单位的反应位点的数目(Nb)，和c)分支单位的大小和刚性。当Nc＝3或4，且Nb＝2时，PAMAM树状聚物系列的直径每代增加约10埃，从盘形样(0-2代)变成扁球形(3、4代)，在第5代或更高代变成几乎对称球形。
存在着制备高代树状聚物的两条概念不同的合成方法：散开型和会聚型方法。这两种方法都是基于反应步骤的重复，每一重复都产生另外所有反应都是在一个分子中进行的。因为每个反应步骤在每一指数生长的终点(平均选择度低于100％)都不完全，所以仅获得有限量的完整的树状聚物。例如，每个反应步骤平均99.5％的选择度仅生成29％的5聚(丙烯胺)树状聚物。通过散开型方法获得的树状聚物的纯化难以完成，这是因为它们具有与其副产物非常类似的结构。在会聚型方法中，树状聚物的合成从核心的外围开始并终止于核心，首先是制备具有所需世代数的一个单树突，然后将其与核心部分连接。通过该方法合成的树状聚物很纯，因为对于任一世代-加成步骤，都仅需恒定且为数不多的反应。使用核心(超核)和分支单位(支化单体)的预支化类似物，或者采用“双指数”和混合生长合成方法，还可以以更少的步骤和更高的产率获得树状聚物。
树状聚物的结构特征，即球形表面、内部空隙和纳空间大小已表明其可用作能在内部(作为内受体的树状聚物)或表面(作为外受体的树状聚物)结合客体分子的宿主分子。已将各种小分子量的有机分子包埋到末端为羧酸酯的烃树状聚物内。已将乙酰基水杨酸和2，4-氯苯氧基乙酸包封到第4、5和6代的PAMAM树状聚物内或靠近其表面，并且已通过使用分子动力学计算研究了10-20个多巴胺分子在第6代PAMAM树状聚物内的螯合(D.A.Tomalia，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1990，29，138-175)。Meijer与同事已通过在第5代聚(丙烯胺)树状聚物表面上构建Boc-苯丙氨酸壳制备了“树状盒”(J.F.G.A.Jansen等人，Science，1994，266，1226-1229)。当在客体分子例如玫瑰红或四氰醌二甲烷存在下形成壳时，存在于树状聚物空隙中的分子被空间捕集。只有在该壳被破坏，即酸解掉Boc基团时，才能释放出客体分子。可被捕集的客体分子的数目取决于客体分子的大小。涉及树状聚物的生物相容性和药动学的公开文件非常有限。据发现第3-6代PAMAM树状聚物具有低毒性，而第7代树状聚物在体内具有毒性。对于第7代树状聚物，还观察到了高胰腺摄取和无法解释的高尿排出。对于末端为胺的PAMAMs，已观察到了溶血和细胞毒性，但是末端为羧酸酯基团的其类似物则没有这种不利作用(R.Duncan和N.Malik，Proc.Int.Symp.Control.Relat.Bioact.Mater.，1996，23，105-106)。还研究了金属树状聚合螯合物的诊断应用。PAMAM-硫脲-二亚乙基三胺五乙酸的Gd(III)螯合物核磁共振造影剂(Gd(Ill)-PAMAM-TU-DTPA)在血液中循环的时间比单体螯合物长，第6代螯合物是比基于多溶素、白蛋白和葡聚糖载体的螯合缀合物更有效的造影剂。通过给在表面上用四乙酸或五乙酸衍生物进行官能化修饰以用于螯合90Y、111In、212Bi和Gd(III)的第2代PAMAM树状聚物连接上一个单克隆抗体，证实了单克隆抗体引导的放射疗法和造影的可行性。在电子能谱造影中已成功地使用了硼化的树状聚物-单克隆抗体缀合物作为蛋白探针。已经使用PAMAM树状聚物在体外将反义寡核苷酸转染到多种多种细胞系中。此外，已制备了作为肽缀合多价骨架物的由赖氨酰残基组成的第2和3代多肽单树突(MAP，多抗原肽)，并用作免疫原和免疫诊断剂(J.P.Tam，J.Immunol.Methods，1996，196，17-32)。然而，该作者没有提及制备与高代球状聚(酰氨基胺)类似的用于在其内部空隙中包封客体分子的球状多肽树状聚物的可能性。
对PAMAM树状聚物以及其从树状盒释放客体分子所需的严格条件所做的体外和体内初步观察表明，这两个微容器都不适于用作递送生物活性物质和药物的载体。除了良好的药动学特征以外，这样的载体还应当具有：1)生物隐蔽性(生物相容性)。2)有限的且受控制的对酶的稳定性。酶作用过程不仅是防止由于在体内非特异性聚集所致的慢性毒性所必需的，而且还是通过树状聚物结构的逐步水解来受控地释放客体分子所必需的。3)高携带能力。PAMAMs的内部空隙不足以包封住大量低分子量分子或适当数目的大分子客体例如胰岛素。4)受控的大小，例如大小为10-100nm，以防止快速的尿清除和RES(网状内皮系统)摄取。
                             发明概述
现在本申请人已令人惊奇地发现，具有多肽骨架的树状聚物可具有上述特征，并且能符合本发明的下述目的。本发明的第一个目的是提供水溶性多肽载体，所述载体具有树状聚物结构、球形和精确限定的大小(单分子树状聚物载体)，并具有能包容分子量最高达5-7kDa的生物活性物质和药物分子的通道和空腔。本发明的第二个目的是提供具有下述特征的多肽树状聚物载体：其在体内、在血液中或靶细胞位点的逐步破坏是通过酶水解(是可以控制的，并且可通过在骨架中插入D氨基酸残基来调节)和通过UV照射(如果载体含有光不稳定的键时)而发生的。本发明的第三个目的是，提供准确限定了其大小和表面以防止RES摄取以及快速尿清除的有负载的多肽树状聚物载体。本发明的另一个目的是，合成具有共价连接到其表面反应性基团上的抗原部分(源自相关致病物的肽、寡核苷酸、糖、和寡糖)的多肽树状聚物载体。本发明的再一个目的是，用生物受体配体例如叶酸、唾液酸、甘露糖、脂肪酸、维生素、激素、寡核苷酸、单克隆抗体、短肽、蛋白和寡核苷酸修饰多肽树状聚物载体的表面以便于细胞靶向。
因此，本发明的主题是具有下述部分的由式(I)代表的多肽树状聚物：i.多官能核心部分；ii.构成以辐射状连接在核心上的支化多肽链末端(单树突)的外部紧密间隔基团，其又形成iii.具有特征空腔和通道的短肽分支单位(增殖子)的内层(世代)，其中每一增殖子含有三官能氨基酸，该氨基酸的不对称碳(增殖子的分支点)连接到携带相同末端反应性基团的两个等长臂和携带可活化官能团的第三个臂(增殖子干)上，
                        K(-L)p-M    (I)其中K是多官能核心部分，L是多肽单树突，p是从核心部分辐射下来的多肽单树突的数目，且M代表树状聚物的最远离中心的分支。
本发明的其它主题是合成所述多肽树状聚物的方法，和其在生物以及医药中作为递送生物活性物质包括药物的载体、或作为细菌、病毒和寄生虫抗原、和基因治疗化合物以及诊断造影剂的载体的应用。
                          发明详述
在下文中更详细地描述本发明多肽树状聚物、其合成方法、以及作为单分子载体的应用。
本发明多肽树状聚物是由高度支化的多肽链或单树突构成的，所述多肽链或树突得自反复缩合的从多官能核心部分向外辐射的短肽支链单位单位或增殖子，具有构成单树突末端的外部紧密间隔的基团，和具有特征空腔和通道的内层或增殖子世代，其中每一增殖子含有三官能氨基酸，该氨基酸的不对称碳(增殖子的分支点)连接到携带相同末端反应性基团的两个等长臂和携带可活化官能团的第三个臂(增殖子干)上。多肽树状聚物由式(I)代表：
                     K(-L)p-M    (I)其中：K是多官能核心部分，并且K可由下式代表：
(II)       X-(CH2)n-X1
其中X＝X1或X≠X1，且X、X1是NH或CO或S；或
(III)      Y[-(CH2)n-Z]i
其中Y＝C或Y＝N；Z是NH或S或Cl或Br或I或马来酰亚胺残基，n＝1-6，且i＝3、4；或(IV)         X-CH(R)-CO[-NH-CH(R)-CO]n-NH-CH(R)-COOR1，
其中R是(CH2)m-X1，m＝1-5，R1是甲基或乙基或丁基或异丙基，X＝X1或X≠X1，且X、X1是NH或CO或S，且n＝1-6；
L是其增殖子可由下式代表的单树突：(V)            -CO-CH(R2)-(CH2)n-NR3-其中R2＝H或者天然或合成氨基酸及其衍生物的侧链，R3＝H或任选被OH或SH或Cl或Br取代的直链烃基；R2-CH(CH2)n-NR3是具有5或6个原子的环；且n＝0-6；和(VI)                -CO-CH(R2)-CO-N(R3)-(CH2)m-N(R3)其中R2和R3具有上述含义，且m＝1-6；或L是其增殖子可由一个下述残基代表的单树突：-CO-CH2-NH-NH；-CO-CH(R2)-O-；-CO-CH2-O-N＝CH-CO-；-CO-CH(R2)-(CH2)n-S-
Figure A0081076900151
其中W＝-N(R3)-(CH2)m-NR3，Q＝H、-CH3；T是O或S，R2、R3和m具有上述含义，且p＝1-4；M是式(VII)所代表的残基：-Aq-B(Ar)-C-Ar[Aq-B(Ar)-C-Ar[Aq-B(Ar-D)-C-Ar-D]2]2     (VII)其中A＝-CO-CH(R2)-(CH2)n-NR3；R3和n具有上述含义；q＝1-6；r＝1-4，且R2除了具有上述含义以外还是天然或合成三官能氨基酸；B是-CO-CH[-(CH2)n-X1]-X，其中X＝X1或X≠X1，且X和X1是NH或CO或S；n＝1-5；C＝A或-CO(CH2)n-NH；-(CH2)n-S，其中n＝1-6；或C是其中一个下述残基：
Figure A0081076900152
Figure A0081076900161
D是式(VIII)-(XI)代表的残基：-Aq-B(Ar-E)-C-Aq-E                                                                  (VIII)-Aq-B(Ar)-C-Aq[Aq-B(Ar-E)-C-Aq-E]2                                             (IX)-Aq-B(Ar)-C-Aq[Aq-B(Ar)-C-Aq-[Aq-B(Ar-E)-C-Aq-E]2]2                      (X)-Aq-B(Ar)-C-Aq[Aq-B(Ar)-C-Aq-[Aq-B(Ar)-C-Aq[Aq-B(Ar-E)-C-Aq-E]2]2]2 (XI)其中A、B、C、q和r具有上述含义，且E由式(XII)和(XIII)代表：-Aq-B(Ar-P)-C-Aq-P1                                                                (XII)-Aq-B(Ar)-C-Aq[-Aq-B(Ar-P)-C-Aq-P1]2                                         (XIII)其中A、B、C、q和r具有上述含义；P＝P1或P≠P1；P和P1是H或直链烃基，所述烃基可任选被一个或多个直链或支链烷基、酰基、氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、糖、寡糖、蛋白、单克隆抗体、含有10-400个-CH2-CH2-O-重复单位的聚乙二醇、脂质、酶、金属配体取代。术语氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、糖、寡糖、蛋白包括天然或合成类似物和衍生物。
本发明多肽树状聚物的特征是，其骨架对血浆和细胞酶具有有限的稳定性，并且更重要的是，可通过用D氨基酸取代L氨基酸来调节在体内对酶的活性。该性质是多肽树状聚物与PAMAM、聚丙基胺、烃、聚醚、聚硫醚和基于硅的树状聚物的区别特征，后面这些物质都对酶稳定，可能在体内非特异性地聚集，从而产生毒性问题。通过调节多肽树状聚物的大小(从10-100nm以防止迅速的尿排泄和被RES系统摄取)和树状聚物骨架的易受影响性，可平衡多肽树状聚物载体在体内的维持和排泄。除了酶水解以外，当在骨架中插入有限数目的光不稳定残基来代替氨基酸残基时，树状聚物的毁坏而释放客体分子可通过紫外辐射所选键来实现。结果可在治疗应用位点启动生物活性客体分子或药物的释放，从而产生较小的全身副作用。
本申请人已惊奇地发现，依据本发明，多肽树状聚物可通过在核心部分上缩合上2、3或4个相同的官能团，2、3或4个预先使用短的三支肽增殖子作为构建单位通过逐步合成制备的多肽单树突而制得。或者，可将低代单树突缩合到预形成的树状聚物(扩大的核心)上以获得最终的树状聚物。本发明多肽树状聚物不仅能包封分子量范围很宽的客体分子，还令人惊奇地表现出在水中特别好的溶解性，甚至当表面极性基团例如NH2、OH、和COOH被疏水部分掩蔽时也是如此。下面是报道的方法和证实的实例：1)多肽树状聚物化学合成的可行性；2)将客体分子包埋和包封到树状聚物载体内的可能性；3)在体外和体内通过酶水解和紫外辐射来释放客体分子；和4)多肽树状聚物在小鼠中的非免疫原性和佐剂性。通过下面的描述可更好地理解本发明的很多实施方案和其它特征。一般合成方法
依据本发明，制备单分子多肽树状聚物的第一个一般方法包括：1)合成具有至少两个官能团的核心部分；2)分开合成单一多肽单树突；3)将多肽单树突共价缀合到核心部分上。制备多肽树状聚物的第二个一般方法包括：1)合成具有至少两个官能团的核心部分；2)将1-3个世代的在其末端用可除去基团保护的单树突缩合到核心部分上；3)将保护基从在步骤2中获得的低世代树状聚物上除去，然后将保护的单树突反复地缩合以获得目标高世代树状聚物；和4)从最终的树状聚物上除去保护基，然后在需要时进行表面修饰。不仅根据核心部分与增殖子的结构，还根据客体分子的化学和结构特征来选择保护基、缩合和脱保护剂、溶剂以及反应时间。
根据本发明通式(I)和上述两个一般方法，能够合成例如特征如下的结构简单的多肽树状聚物：共价连接有3-7个世代的单一树突的双官能核心如乙二胺，即2(2(2(H-Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly-HN-CH2-CH2-NH-Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly-H)2)2)2和2(2(2(2(2(2(2(H-Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly-HN-CH2-CH2-NH-Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly-H)2)2)2)2)2)2)2.
把分子量在1000 Da以上的分子包埋在多肽树状聚物内这一目标是通过两个步骤完成的：1)使用短肽衍生物作为构建单位在固体载体上装配多肽单树突(固相肽合成，SPPS)(散开型方法)，和2)在客体分子存在下，在水相中，通过常用于蛋白合成的“化学连接”法(P.Lloyd-Williams，F.Albericio和E.Giralt，＂合成蛋白和肽的化学方法＂，1997，CRC Press，Boca Raton，175-200)将多肽单树突缩合到核心部分上。
把分子量在1000 Da以下的分子包埋在多肽树状聚物内这一目标是通过如上所述的在树状聚物合成期间捕获客体分子，以及首先制备“空载体”，然后通过在其空腔中扩散小客体分子来填充该载体来实现的。采用上述方法，并使用具有一个或多个其骨架被光不稳定部分取代的氨基酸残基的单树突，可获得具有光不稳定键的多肽树状聚物。制备具有共价连接在其内部的客体分子的多肽载体这一目标是这样实现的：1)首先通过扩散将客体分子包埋到树状聚物空隙内，和2)共价偶联到树状聚物载体的反应性基团上。将生物活性分子缀合到多肽树状聚物表面上进行受体靶向这一目标是通过将对受体识别不很重要的生物活性分子的反应性基团共价缩合而实现的。
通过下面的描述可更好地理解本发明的很多实施方案和其它特征。下文中的实施例不是为了限制本发明，源自合成与树状聚物装载方法的天然进步的进一步改进是本发明实质和范围。
HPLC分析是用装配有UV Bruker LC313检测器的Bruker LC21-C装置进行的，并且使用Pico Tag Waters柱和乙腈-水缓冲液A)10％(v/v)乙腈在0.1％TFA水溶液中的混合物，和B)60％(v/v)乙腈在0.1％TFA水溶液中的混合物；梯度(I)在25分钟内从0到100％B，和(II)在25分钟内从50到100％B；流速为1ml/分钟，在220nm检测。采用相同洗脱剂和条件，在Delta Pack C18-300(30mm×30cm，15μ)柱上用Waters Delta Prep 3000装置通过制备HPLC纯化肽。流速为30ml/分钟，在220nm检测。薄层色谱是在F 254硅胶板(Merck)上进行的，使用1-丁醇/乙酸/水(3∶1∶1 v/v/v)作为洗脱剂。使用1％茚三酮的乙醇溶液和Cl2-碘作为检测试剂。1H NMR测定是用200 MHz FT Bruker装置进行的。分子量是在Voyager-DE装置上(PerSeptive Biosystems，MA，USA)通过质谱法确定的。
实施例1
本实施例描述的是，通过将在固体基质上装配的4代单树突在液相中缩合到三胺核心上来合成4代树状聚物。1.合成N[CH2-CH2-NH-CO-CH(CH2-苯基)-NH2]3·4HCl
在0℃，将1.91g Boc-Phe-OH(7.2mmol)，150μlN(CH2-CH2-NH2)3(2.0mmol)、1.43g WSC·HCl(7.5mmol)、1.15g HOBt(7.5mmol)和560μl三乙胺(4.0mmol)溶解在10ml无水DMF中，并在室温搅拌24小时。蒸发掉DMF后，将固体溶解在100ml乙酸乙酯中，并用5％NaHCO3(3×20ml)和盐水(3×20ml)萃取。将有机溶液酸化，把溶剂蒸发，并将所得产物溶解在70ml乙酸乙酯中，在0℃用4N HCl进一步处理。将该混合物在室温搅拌30分钟。将溶剂蒸发，然后把所得残余物溶解在20ml甲醇中，并用乙醚-石油醚(1/1，v/v)沉淀。将过滤所得固体用乙醚-石油醚(1/1，v/v)反复洗涤。M.p.：167℃；[α]D 22-1.8(c1，DMF)；R.f.：0.5；HPLC：8.97分钟；梯度(I)；MS：589Da，611 Da和627 Da，分别是M-H+，M-Na+，M-K+的值。2.合成Fmoc-Gly-Orn(Fmoc)-Gly-Gly-OH
在0℃、搅拌下，将14.9g Boc-Orn(Fmoc)-OSu(27mmol)在30ml DMF中的溶液加到3.92g H-Gly-Gly-OH(29.7mmol)在45ml5％NaHCO3和100ml DMF内的溶液中。在0℃保持1小时后，将该反应继续在室温保持过夜。将DMF蒸发后，将残余物溶解在150ml 10％柠檬酸中，并用200ml乙酸乙酯萃取产物。然后用盐水洗涤该溶液，用硫酸钠干燥，过滤并通过除去溶剂浓缩至终体积为50ml。通过用含有2ml甲醇的150ml乙醚沉淀来收集产物。产量为13.9g。M.p.：125-128℃；R.f.：0.7，在1-丁醇/乙酸/水(3∶1∶1，v/v/v)中；HPLC：19.25分钟；梯度(I)。
将13.9g Boc-Orn(Fmoc)-Gly-Gly-OH溶解在20ml TFA中，并在室温保持1小时。将TFA蒸发后，将残余物用乙醚研制，并干燥。在0℃将所得盐(14.5g TFA·H-Orn(Fmoc)-Gly-Gly-OH，24.8mmol)溶解在50ml 5％NaHCO3和150ml DMF中，并与8.78g Fmoc-Gly-OSu(22.3mmol)在0℃反应1小时，并在室温反应过夜。将DMF蒸发后，把残余物溶解在10％柠檬酸中，过滤并用水洗涤数次。用乙酸乙酯将粗产物结晶。产量：14g；M.P.：208-210℃；R.f.：0.63；HPLC，23.68分钟；梯度(I)；[α]D 22-20(c1，DMF)。NMR(DMSO)δppm：1.32-1.8，m 4H；2.92-3.06，m 2H；3.65-3.79，m 6H；4.18-4.36，m 7H；7.31-7.9，m 18H；7.98，d 1H；8.1，t1H；8.25，t1H；12.5，bs 1H.MS：748 Da。3.合成2[2[2[Ac-Gly-Orn(Ac)-Gly-Gly]Gly-Orn-Gly-Gly]Gly-Orn-Gly-Gly)]Gly-Orn-Gly-Gly-OH.
该合成是在Milligen 9050机器上，使用负载有0.5g Fmoc-Gly-PEG-PS(Millipore)树脂的0.5cm(I.D.)柱进行的。负载量：0.18mmol/g。第一个循环：a)脱保护：20％哌啶在DMF中的混合物，4分钟，流速：8.1ml/分钟；b)洗涤：DMF，10分钟，流速：4.0ml/分钟；c)偶联：用手将134mg Fmoc-Gly-Orn(Fmoc)-Gly-Gly-OH、68mg HBTU和28mg HOBt溶解在0.6ml 0.6M N-甲基吗啉(NMM)的DMF溶液和0.4mlDMF中，然后负载到柱(自动操作)中。再循环：5小时，流速：8.1ml/分钟；d)洗涤：DMF，15分钟，流速：4.0ml/分钟。第二个循环：使用溶解在1.2ml 0.6 M NMM的DMF溶液和0.3ml DMF中的268mg Fmoc-Gly-Orn(Fmoc)-Gly-Gly-OH、136mg HBTU和56mg HOBt进行偶联。从柱中取出少量树脂样本，用20％哌啶在DMF中的混合物处理，小心地干燥，并用TFA/水(95/5，v/v)在室温处理1小时。观察到了在2.8分钟的单一HPLC峰，梯度(I)。第三个循环：进行两个偶联。在第一个偶联中，使用溶解在1.8ml 0.6M NMM的DMF溶液和0.2ml DMF中的400mg Fmoc-Gly-Orn(Fmoc)-Gly-Gly-OH、208mg HBTU和80mg HOBt进行偶联。用DMF(20分钟，流速：4.0ml/分钟)、DCM(10分钟，流速：9.0ml/分钟)和DMF(5分钟，流速：4.0ml/分钟)进行3次连续洗涤。在第二个偶联中，使用溶解在0.9ml 0.6 M NMM的DMF溶液和0.1ml DMF中的200mgFmoc-Gly-Orn(Fmoc)-Gly-Gly-OH、104mg HBTU和40mg HOBt。循环：3h；流速：8.1ml/分钟；如上所述用DMF和DCM进行3次洗涤。如上所述从柱中取出少量树脂样本并进行分析，观察到了在6.3分钟的单一HPLC峰，梯度(II)。第四个循环：进行两个偶联。使用溶解在3.6ml 0.6 M NMM的DMF溶液和0.4ml DMF中的800mg Fmoc-Gly-Orn(Fmoc)-Gly-Gly-OH、416mg HBTU、160mg HOBt进行第一个偶联。再循环：3；5小时；流速：8.1ml/分钟；用DMF、DCM和DMF洗涤3次。在第二个偶联中，使用溶解在1.8ml 0.6 M NMM的DMF溶液中的400mg Fmoc-Gly-Orn(Fmoc)-Gly-Gly-OH、208mg HBTU和80mg HOBt。再循环：5h；流速：8.1ml/分钟。如上所述洗涤树脂并分析。观察到了在8.1分钟的单一宽的HPLC峰；梯度(II)。然后将树脂用20％哌啶在DMF中的混合物以8.1ml/分钟的流速处理10分钟，用DMF以4.0ml/分钟的流速洗涤15分钟，并用1M乙酸酐和1M NMM的DMF溶液乙酰化1小时，流速：8.1ml/分钟。最后，将树脂从柱中取出来，用DMF、甲醇、DCM和乙醚洗涤，并在真空下干燥过夜。通过在室温、搅拌下将树脂在15ml TFA/水(95/5，v/v)中悬浮1小时获得了肽单树突。过滤后，将树脂用1ml TFA洗涤，把TFA部分蒸发后，将合并的滤液加到冷的乙醚中以沉淀出多肽。将该混合物在-20℃保持约3小时。过滤后，将白色产物溶于水中，并冷冻干燥3次。产量：420mg。观察到了在8.1分钟的主要的宽HPLC峰(梯度(I))，以及与第二和第三循环产物相对应的两个非常小的峰。通过在Sephadex G-50上进行大小排阻色谱法(SEC)纯化产物，使用50％乙酸作为洗脱剂。用水稀释后，将含有目标肽的级分冷冻干燥2次。产量：350mg.MS：5,021 Da(理论值.5.022 Da)。4)合成N{CH2-CH2-NH-CO-CH(CH2-苯基)-NH-Gly-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-GlyOrn(Ac)GlyAc]2]2]2}3
将7.33mg N[CH2-CH2-NH-CO-CH(CH2-苯基)-NH2]3·4HCl(0.01mmol)、如在3)中制得的200.1mg单树突(0.04mmol)、9.6mgWSC·HCl(0.5mmol)、7.7mg HOBt(0.5mmol)和5.6μl三乙胺(TEA)(0.04mmol)溶解在15ml DMF中，用TEA处理以达到表观碱性pH，并在搅拌下于室温反应48小时。将DMF蒸发后，把残余物溶于10ml甲基乙基酮中，将该溶液用5％NaHCO3(3×10ml)和盐水(3×10ml)萃取，用0.1M HCl酸化，并用硫酸钠干燥。将溶剂蒸发后，把收集的固体用乙醚洗涤4次，真空干燥，溶于50％乙酸中，并如上所述在Sephadex G50上通过SEC纯化。产量：161mg；MS：15,605 Da(理论值：15,602 Da)。使用75HR10/30 Pharmacia Superdex柱(固定相：交联琼脂糖-葡聚糖，13μm)通过SEC HPLC进一步确定产物的特征，其中使用50mM NaH2PO4和100mM Na2SO4 pH6.5作为洗脱剂；流速：0.5ml/分钟；在220nm检测。在18分钟观察到了单宽峰。核糖核酸酶(MW＝13,400 Da)、牛血清白蛋白(BSA)单体(MW＝66,000 Da)和二聚物(MW＝112,000 Da)分别在25、20和18分钟表现出峰。这些结果表明，乙酰化的4代树状聚物在用于SEC HPLC的缓冲液中聚集。
实施例2
本实施例描述了完全在液相中制备的4代树状聚物的三步合成。在第一个步骤中，将具有用酸不稳定的基团保护的NH2末端的2代单树突缩合到三胺核心上以获得2代树状聚物。在第二步骤中，酸解后，将单树突再缩合到2代树状聚物的游离NH2末端上以获得4代树状聚物。在第三个步骤中，除去保护基后，将树状聚物的NH2末端乙酰化。1)合成Z-Orn(Boc)-Gly-Gly-OCH3
将10.44g Z-Orn(Boc)-OH(28.5mmol)、5.75g WSC·HCl(30mmol)、4.59g HOBt(30mmol)、5.47g HCl·H-Gly-Gly-OCH3(30mmol)、和5.6ml TEA(40mmol)溶解在90ml DMF中，用TEA处理达到碱性pH，然后在室温、搅拌下反应12小时。将DMF蒸发后，将残余物溶解在300ml乙酸乙酯中，并用0.1M HCl/盐水1/2(3×40ml)、5％NaHCO3/盐水2/1(5×40ml)和盐水(30ml)洗涤。然后将该溶液用0.1M HCl酸化，并用硫酸钠干燥。将溶剂几乎完全蒸发，并通过从乙醚/石油醚1/1 v/v中缓慢地结晶来收集目标产物。产量：13.7g。观察到了在18.2分钟的单HPLC峰，梯度(I)。2)合成Boc-Gly-Orn(Boc)-Gly-Gly-OH
将13g Z-Orn(Boc)-Gly-Gly-OCH3溶解在170ml甲醇中，并用750mg 10％C/Pd处理。在室温继续氢化2小时。通过过滤除去固体，将所得溶液浓缩，并用乙醚/石油醚1/1将产物缓慢地结晶。产量：9.7g。
将8.83g H-Orn(Boc)-Gly-Gly-OCH3(24.5mmol)、6.26gBoc-Gly-OSu(23mmol)溶解在30ml DMF中。在0℃保持7小时后，向该溶液中加入10mmol TEA。将该反应在室温继续24小时。将DMF蒸发并加入300ml乙酸乙酯后，将有机相用1M HCl/盐水1/2(3×30ml)、5％NaHCO3/盐水1/1(3×30ml)和盐水(2×30ml)萃取。用1MHCl酸化后，将溶剂蒸发，并通过从乙醚中结晶来分离出产物。产量：11.8g。观察到了在15.5分钟的单HPLC峰；梯度(I)。
将5.18g Boc-Gly-Orn(Boc)-Gly-Gly-OCH3(10mmol)与1MNaOH的甲醇溶液(50ml)在室温反应15小时。将醇蒸发后，把残余物溶解在200ml乙酸乙酯中，并用30ml用NaCl饱和的1M HCl和盐水(2×20ml)萃取。酸化并除去溶剂后，通过从乙醚/石油醚1/1 v/v中结晶来分离出产物。观察到了在14.48分钟的单HPLC峰；梯度(I)。MS：527 Da，543 Da，565 Da，分别是M-Na+，M-K+和M-K+-Na+的值(理论值：504Da)。3)合成[Boc-Gly-Orn(Boc)-Gly-Gly]2-Gly-Orn-Gly-Gly-OH
在0℃，将4.03g Boc-Gly-Orn(Boc)-Gly-Gly-OH(8.0mmol)、1.48g HCl·H-Gly-Orn(HCl)-Gly-Gly-OCH3(3.8mmol)、1.69gWSC·HCl(8.8mmol)、1.35g HOBt(8.8mmol)和1.12ml TEA(8.0mmol)溶解在30ml DMF中。将该反应在室温、搅拌下保持15小时。将DMF蒸发后，把残余物溶解在200ml甲基乙基酮中。将该溶液用1MHCl/盐水1/1(4×20ml)、5％NaHCO3(3×20ml)和盐水(3×20ml)萃取。用1M HCl酸化后，将溶剂蒸发，并用乙酸乙酯/乙醚1/4 V/V将产物结晶。产量：用乙醚洗涤3次后分离到了约4g甲酯。将3.97g溶解在50ml温热的甲醇中，将该溶液在室温平衡，然后用4ml 1M NaOH处理16小时。将溶剂蒸发后，把残余物溶解在200ml甲基乙基酮中，并向该溶液中加入10ml 1M HCl和20ml盐水。小心地萃取该溶液，并用盐水(3×30ml)中和。然后用硫酸钠将有机层干燥，过滤，并将溶剂蒸发。用乙酸乙酯将粗产物结晶，将所得固体用乙酸乙酯洗涤3次。产量：3.7g。在19.14分钟显现了单一HPLC峰；梯度(I)。MS：1,298 Da和1,314 Da，分别是M-Na+和M-K+的值(理论值：1,275 Da)。4)合成N{CH2-CH2-NH-CO-CH(CH2-苯基)-NH-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn(Boc)-Gly-Boc]2}3
在室温，将510mg[Boc-Gly-Orn(Boc)-Gly-Gly]2-Gly-Orn-Gly-Gly-OH(0.4mmol)、73.3mg N[CH2-CH2-NH-CO-CH(CH2-苯基)-NH2]3-HCl(0.1mmol)、96.0mg WSC·HCl(0.5mmol)、77.0mg HOBt(0.5mmol)和56μl TEA溶解在20ml DMF中。加入TEA至碱性pH，并将该混合物在搅拌下反应48小时。将DMF蒸发后，把残余物溶解在100ml甲基乙基酮中，并将该溶液用0.5％NaHCO3(3×20ml)和盐水(3×20ml)萃取。用1M HCl酸化后，将该溶液用硫酸钠干燥，过滤，并蒸发，获得了白色粉状固体，用乙醚将其反复洗涤。产量：450mg。观察到了在22.69分钟的单一HPLC峰；梯度(I)。MS：4,359 Da和4,381 Da，分别是M-H+和M-Na+的值(理论值：4,355 Da)。5)合成N{CH2-CH2-NH-CO-CH(CH2-苯基)-NH-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn(Ac)-Gly-Ac]2]2]2}3
将436mg二N{CH2-CH2-NH-CO-CH(CH2-苯基)-NH-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn(Boc)-Gly-Boc]2}3(0.1mmol)溶解在2ml温热的DMSO中。然后向在室温放置平衡的该溶液中加入15ml 4M HCl的二氧杂环己烷溶液，并将该反应在搅拌下保持1小时。将所获得的盐研制，并通过在2000rpm离心来分离。用乙酸乙酯洗涤2次后，用P2O5将该吸湿性产物真空干燥。
将363mg盐(0.1mmol)溶解在2ml水中，用0.1M NaOH中和，并加到5ml含有1.53g[Boc-Gly-Orn(Boc)Gly-Gly]2-Gly-Orn-Gly-Gly-OH(1.2mmol)、250mg WSC·HCl(1.3mmol)、200mg HOBt(1.3mmol)和210μl TEA(1.5mmol)的DMF溶液中。将该溶液在室温、搅拌下反应48小时。将DMF蒸发后，把固体溶解在50ml甲基乙基酮中，并用5％NaHCO3(3×20ml)和盐水(3×20ml)萃取该溶液。用1MHCl酸化并用硫酸钠干燥后，将有机层过滤，并蒸发，获得了固体残余物，将残余物用乙醚反复洗涤。将真空干燥的该固体再溶于20ml TFA/水98/2 v/v中，并在搅拌下反应2小时。除去溶剂后，将所得残余物用乙醚反复洗涤，并真空干燥。
将800mg三氟乙酸盐(3.6mmol)溶解在含有905mg乙酸对硝基苯酯(5.0mmol)和700μl TEA(5mmol)的10ml DMF/水1/1 v/v中。将该溶液反应50小时。将溶剂蒸发后，用乙醚将残余物反复洗涤，并真空干燥。产量：1.1g。在Sephadex G-50上通过SEC纯化粗产物，用50％乙酸作为洗脱剂。合并含有目标产物的级分，并冷冻干燥。MS：15,439 Da(理论值：15,431 Da)。如实施例1)所述，使用75HR10/30 Pharmacia Superdex柱通过SEC HPLC测定该树状聚物的MW，R.t.：18分钟。因此该树状聚物与按照实施例1)的方法制得的树状聚物相同。实施例3
本实施例举例说明了含有4-[4-(1-(氨基)乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基]丁酸光可裂解残基的7代树状聚物的合成。1)合成
Figure A0081076900261
CH(CH3)-NH-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-
Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn(Ac)-Gly-Ac]2]2]2]2]2]2
该合成是在Milligen 9050机器上，使用负载有0.1g Fmoc-Cys(Trt)-PEG-PS(Millipore)树脂的0.5cm(I.D.)柱进行的。负载量：0.16mmol/g。
在第一个链装配循环中，用20％哌啶在DMF中的混合物除去Fmoc后将4-[4-(1-Fmoc-氨基乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基]丁酸缩合到在树脂上的半胱氨酸(Trt)残基上。随后按照在实施例1)中描述的方法，使用Fmoc-Gly-Orn(Fmoc)-Gly-Gly-OH和相同溶剂以及试剂，进行合成单树突的所有循环。产量：480mg。用TFA/水95/5 v/v裂解后，在Sephadex G50上通过SEC纯化粗产物，使用50％乙酸作为洗脱剂。用水将含有目标产物的级分稀释，并冷冻干燥3次。MS：41,980 Da(理论值：41,972 Da)。2)合成
Figure A0081076900262
Figure A0081076900263
Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn(Ac)-Gly-Ac]2]2]2]2]2]2}3
在室温、搅拌下，将3.86mg三(2-马来酰亚胺基乙基)胺(Pierce)(0.01mmol)和4.0g
Figure A0081076900271
Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-
Orn-Gly[Gly-Gly-Orn(Ac)-Gly-Ac]2]2]2]2]2]2(0.1mmole)溶解在5ml DMF/水10/90 v/v中，并在表观pH为7.0下反应3小时。然后向该溶液中加入用2，2′-二吡啶基二硫化物预活化的在7ml PBS缓冲液(pH7.3)中的10g巯基-琼脂糖4B树脂以通过巯基-二硫化物交换来螯合未反应的单树突。除去树脂后，将该溶液蒸发，用水稀释并冷冻干燥。在Sephadex G50上通过SEC纯化粗产物，使用50％乙酸作为洗脱剂。用水将含有目标产物的级分稀释，并冷冻干燥。产量：751mg.MS：126,309 Da(理论值：126,299 Da)。
实施例4
本实施例表示的是在实施例1-3中描述的多肽树状聚物在体外对酶水解的稳定性。
该体外降解是用从猪肾中分离出的亮氨酸-氨基肽酶VI(E.C.3.4.11.1)进行的，该酶的活性已经用N-亮氨酰-4-硝基苯胺(Leucine-4-nitroanilide)预先检测过。树状聚物浓度：1.10-3 M在含有5mM MgCl2的50mM Tris.HCl缓冲液，pH8.5中的溶液。酶浓度：3U/ml。在振荡浴中于37℃进行该实验。将以固定时间间隔抽取的样本(分别是100μl)用10％TFA阻断，并离心(10.000×g，5分钟)，然后在装配有Lichrosorb RP 18(10μm)柱的Waters mod.660装置上进行HPLC测定。检测是用Jasco Uvidec-100-11检测器进行的。洗脱剂A是0.1％TFA水溶液；洗脱剂B是0.1％TFA的乙腈溶液；梯度：在23分钟内从0％B到21％B。
如上所述，37℃下，使用浓度为约1.0nmol/ml血浆的树状聚物进行在肝素化人血浆中的降解实验。通过比较在给定时间显示的HPLC信号面积与最初记录的信号面积来获得随着时间的降解程度。具有游离氨基末端的4代树状聚物抗亮氨酸-氨基肽酶半衰期约为12小时，在人血浆中的半衰期约为8小时。乙酰化的4和7代树状聚物对亮氨酸-氨基肽酶VI的酶降解(半衰期为23小时)和在人血浆(半衰期为16小时)中的稳定性较好。
实施例5
本实施例举例说明了通过扩散将脑啡肽酶抑制剂L-Trp-L-Ala负载到如在实施例1)中制得的6代多肽树状聚物中和其随着时间的释放。
将30mg如在实施例1)中制得的具有游离氨基末端的6代多肽树状聚物加到8mg L-Trp-L-Ala的2ml水溶液中，24小时后，在搅拌下用15ml乙醇沉淀该澄清溶液。将沉淀离心，用无水乙醇洗涤，并用P2O5真空干燥。产量：29mg。然后将10mg分离的产物溶于10ml水中，并将该溶液注射到3-15ml“Slide-A-Lyzer Dialyzer Cassette”(Pierce)(“截留分子量”，10,000 Da)中。在缓慢搅拌下用100ml水透析48小时。每30分钟测定一次用水稀释至终体积1ml的200μl等分试样溶液在280nm的吸收度。观察到在约12小时的透析期间吸收度在增加，这表明该二肽通过从树状聚物载体中缓慢地扩散出来而随时间逐渐释放。透析盒外溶液的A280比通过将10mg二肽溶于110ml水中所制得的参照溶液稍低(-6％)。
实施例6
本实施例举例说明了：a)通过在肝素存在下将7代单树突缩合到三官能核心上来把肝素包埋到含有光不稳定键的7代多肽树状聚物中，和b)通过负载的树状聚物的光解来释放肝素。1).将1.12g肝素钠(通过将牛肝素解聚而获得的，MW约为2,500 Da；活性约为180IU/mg.)加到在实施例3.2中合成7代树状聚物所用的表观pH为7.0的反应物中。将单树突缩合在室温延长3小时。加入用2，2′-二吡啶基二硫化物预活化的巯基-琼脂糖4B树脂除去过量单树突后，将树脂过滤，并将所得澄清溶液直接负载到Sephadex G-75柱上。用水以0.5ml/分钟的流速洗脱树状聚物，以将其与过量肝素分离开。产量：1.04g。2).将750mg“负载的”树状聚物溶解在6ml水中，并在石英瓶中在360nm辐射600分钟。然后将各1ml该辐射的溶液静脉内注射到6只在开始实验前禁食12小时的雄性大鼠中(体重约为600g)(大鼠3-8)。使用1ml通过将750mg“负载的”树状聚物溶解在6ml水中而制得的未辐射溶液与6只类似体重的雄性大鼠(大鼠9-14)重复相同操作。大鼠1根本不注射，给大鼠2静脉内注射溶解在1ml水中的250mg肝素。通过活化的部分促凝血酶测试(Activated-Partial ThromboplastinTest，APTT)确定肝素的抗凝血作用，即从尾静脉采集的血清样本形成血纤蛋白凝块所需的时间。测定结果如下。
                           血凝固时间(秒)大鼠      治疗                  t＝0    1小时  2小时  3小时  4小时  24小时1                                25      26     25      -      -      -2         肝素(iv)               27      54     ＞300   -      -      -3         辐射的树状聚物         25      53     ＞300   -      -      -4         id                     26      57     ＞300   -      -      -5         id                     25      54     ＞300   -      -      -6         id                     24      56     ＞300   -      -      -7         id                     26      55     ＞300   -      -      -8         id                     27      54     ＞300   -      -      -9         未辐射的树状聚物       27      36     85      130    260    2810        id                     26      39     91      149    252    2611        id                     25      34     90      141    257    2812        id                     26      37     89      153    260    2913        id                     25      40     94      160    268    2814        id                     26      38     89      156    259    25
在两个小时内，大鼠3-8表现出的凝血时间与仅用肝素治疗的大鼠2接近。在4个小时内，用未辐射的树状聚物治疗的大鼠9-14表现出凝血时间增加。在第一个小时，其凝血时间稍小于注射肝素2小时后对大鼠2观察到的凝血时间。对于大鼠9-14，凝血时间在24小时后变得正常。上述结果表明：a)低MW肝素被包埋到树状聚物载体内；b)掺入到树状聚物骨架内的光不稳定残基的光解决定了肝素从该载体中的释放，和c)随着其结构在血液中缓慢地被酶破坏，未辐射的树状聚物逐渐释放肝素。
实施例7
本实施例证实的是a)如在实施例2)中所述获得的4代树状聚物在小鼠中没有免疫原性，和b)当把某些NH2末端共价连接上八肽抗原Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro(Plasmodium falciparumCircumsporozoite蛋白的免疫显性表位的短片段)时其具有佐剂性。1)N{CH2-CH2-NH-CO-CH(CH2-苯基)-NH-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly-H]2]2]2}3的免疫原性
将50μg乙酰化的树状聚物溶解在50μl弗氏完全佐剂中，并注射到5组C57/8L/6小鼠(每组7-10只小鼠)的尾部中。3周后，采用相同方法将在25μl弗氏不完全佐剂中乳化的25μg树状聚物注射到小鼠中。10天后，通过穿刺眶后血管从每只小鼠中采集血样。在抗-树状聚物抗体存在下通过ELISA评估血浆样本。简言之，用在PBS(pH 7.2)中含有1μg/ml乙酰化树状聚物的100μl溶液将96-孔微量滴定板(Maxisorp F96，Nunc，Denmark)在湿润的室中包被过夜。然后将平板用PBS和5％脱脂奶粉在室温饱和2小时。洗涤3次(磷酸盐缓冲液，pH7.4和0.05％Tween-20)后，将血清在PBS中进行系列稀释，在室温向平板中加入2.5％脱脂奶粉和0.05％吐温20 1小时。洗涤后，将缀合到碱性磷酸酶上的兔子抗-小鼠IgG-特异性多价免疫球蛋白在PBS、2.5％脱脂奶粉和0.05％Tween20中稀释后，加入1小时。将平板洗涤，用对硝基苯基磷酸酯底物显示酶的存在。用Dynatech 25000 ELISA读数计测定在405nm的吸收度。没有检测到抗树状聚物抗体。为避免在反复洗涤期间树状聚物从孔中被除去的危险，将未乙酰化的树状聚物缀合(使用DCI/HOBt作为偶联剂，室温，24小时)到在6％v/v丙烯酸水溶液中γ-辐射的聚乙烯针上(M.Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1984，81，3998-4002)后，重复这些实验。如上所述通过将聚乙烯针浸到微量滴定板的孔中来检测抗树状聚物抗体。在小鼠血清中没有检测到任何抗树状聚物抗体。2)将Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro缀合到N{CH2-CH2-NH-CO-CH(CH2-苯基)-NH-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly-H]2]2]2}3上
将400.6mg N{CH2-CH2-NH-CO-CH(CH2-苯基)-NH-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly-H]2]2]2}3(1.8mmol)与636mg Fmoc-Asn-Ala-Asn-Pro-OH(1.0mmol)、192mg WSC·HCl(1.0mmol)、154mg HOBt(1.0mmol)和460μl TEA一起溶解在10ml DMF中。用TEA将该溶液调节至碱性pH，在室温搅拌10小时，加入500μl TEA，然后用218.1mg(Boc)2O(1.0mmol)处理。将该混合物搅拌10小时，用5ml哌啶处理，搅拌2小时，最后加入100ml乙醚来沉淀。将产物溶于10ml水中，并在Sephadex G50上通过SEC纯化，用50％乙酸作为洗脱剂。将含有目标产物的级分用水稀释，然后冷冻干燥回收。将400mg该固体溶于10mlDMF中，并再重复一次Fmoc-Asn-Ala-Asn-Pro-OH与该树状聚物的偶联。加入5ml 20％哌啶在DMF中的混合物，在室温搅拌3小时，然后加入100ml乙醚以沉淀出产物。产量：305mg。将该化合物再溶于5mlTFA/水95/5v/v中，在室温保持1小时后，加入100ml乙醚以沉淀出白色粉状固体。用P2O5真空干燥后，在Sephadex G-50 Superfine上通过SEC纯化粗产物，使用50％乙酸作为洗脱剂。产量：280mg。3)评价N{CH2-CH2-NH-CO-CH(CH2-苯基)-NH-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Orn(-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn)-Gly-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn]2]2]2}3的佐剂性质
如上所述给5组BALB/c雌性小鼠(OLAC，Bicester，Oxon，UK)(每组7-10只小鼠)各成员注射溶解在50ml水中的500μg抗原-树状聚物缀合物。同时并行给相同数目的C57/8L/6小鼠注射溶于50μl水中的50μg Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro。3周后，再给这两组小鼠注射25和250μg相同产物。10天后，如上所述从每只小鼠中采集血样。使用(Asn-Ala-Asn-Pro)40作为抗原，通过ELISA测试测定血清(G.Del Giudice等人，J.Clin.Microbiol，1997，25，91-96)。在45周，与Asn-Ala-Asn-Pro-Asn-Ala-Asn-Pro抗原(2.81±08)相比，抗原-树状聚物缀合物表现出更高的抗-Asn-Ala-Asn-Pro抗体效价(抗体效价的对数几何平均值±S.E.M.)(4.10±0.01)。
从所有上述结果可知，通过化学合成获得的本发明多肽树状聚物满足了上述目的。特别是，单分子多肽树状聚物可用所述合成方法获得，并且已证实了树状聚物负载的实用性，以及通过酶水解和通过使用紫外辐射来在体内控制客体分子释放的实用性。单分子载体多肽树状聚物/客体分子系统在医疗领域中具有可药用赋形剂的组合物中的应用很广泛，并且具有非常重要的价值，即用于癌症化疗、抗凝血和血凝块溶解药物治疗、抗病毒治疗、疫苗、激素以及相关生物活性物质的控制释放。对于医疗诊断，上述合成的控制方法使得能够制备具有精确限定的分子量的树状聚物金属螯合物载体，从而避免了由于存在不完整的载体结构所导致的缺陷。应用到医疗诊断和治疗并不意味着限于所描述的应用，许多其它可能应用对于医疗领域技术人员来说是显而易见的。

Claims (47)

1.式(I)代表的具有下述部分的多肽树状聚物：i)多官能核心部分；ii)构成以辐射状连接在核心上的支化多肽链(单树突)末端的外部紧密间隔基团，其又形成(iii)具有特征空腔和通道的短肽分支单位(增殖子)的内层(世代)，其中每一增殖子含有三官能氨基酸，该氨基酸的不对称碳(增殖子的分支点)连接到携带相同末端反应性基团的两个等长臂和携带可活化官能团的第三个臂(增殖子干)上，
                        K(-L)p-M   (I)
其中
K是多官能核心部分，
L是多肽单树突，
p是从核心部分辐射下来的多肽单树突的数目，且
M代表树状聚物的最远离中心的分支。
2.权利要求1的多肽树状聚物，其中K由式(II)代表：
                        X-(CH2)n-X1  (II)
其中X＝X1或X≠X1，且X、X1是NH或CO或S。
3.权利要求1的多肽树状聚物，其中K由式(III)代表：
                        Y[-(CH2)n-Z]i  (III)
其中Y＝C或Y＝N；Z是NH或S或Cl或Br或I或马来酰亚胺残基，n＝1-6，且i＝3、4。
4.权利要求1的多肽树状聚物，其中K由式(IV)代表：
     X-CH(R)-CO[-NH-CH(R)-CO]n-NH-CH(R)-COOR1   (IV)
其中R是(CH2)m-X1，m＝1-5，R1是甲基或乙基或丁基或异丙基，X＝X1或X≠X1，且X、X1是NH或CO或S，且n＝1-6。
5.权利要求1的多肽树状聚物，其中所述L是其增殖子可由式(V)代表的单树突：
             -CO-CH(R2)-(CH2)n-NR3-   (V)
其中R2＝H或者天然或合成氨基酸及其衍生物的侧链，R3＝H或任选被OH或SH或Cl或Br取代的直链烃基；R2-CH(CH2)n-NR3是具有5或6个原子的环；且n＝0-6。
6.权利要求1的多肽树状聚物，其中所述L是其增殖子可由式(VI)代表的单树突：
            -CO-CH(R2)-CO-N(R3)-(CH2)m-N(R3)      (VI)
其中R2和R3具有权利要求5中给出的含义，且m＝1-6。
7.权利要求1的多肽树状聚物，其中所述L是其增殖子可由一个下述残基代表的单树突：
-CO-CH2-NH-NH-；或-CO-CH(R2)-O-；或-CO-CH2-O-N＝CH-CO-；或
-CO-CH(R2)-(CH2)n-S-CH2-CO-W；或-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-W或
Figure A0081076900031
其中W＝-N(R3)-(CH2)m-NR3，Q＝H或-CH3；T是O或S，R2、R3和m具有在权利要求5中给出的含义。
8.权利要求1的多肽树状聚物，其中所述L是其增殖子可由一个下述残基代表的单树突：
Figure A0081076900032
9.权利要求1的多肽树状聚物，其中所述p是1或2或3或4。
10.权利要求1的多肽树状聚物，其中所述M是式(VII)所代表的残基：
-Aq-B(Ar)-C-Ar[Aq-B(Ar)-C-Ar[Aq-B(Ar-D)-C-Ar-D]2]2    (VII)
其中A＝-CO-CH(R2)-(CH2)n-NR3；R3和n具有在权利要求5中给出的含义；q＝1-6；r＝1-4，且R2除了具有在权利要求5中给出的含义以外还是天然或合成三官能氨基酸；B是-CO-CH[-(CH2)n-X1]-X，其中X＝X1或X≠X1，且X和X1是NH或CO或S；n＝1-5；C＝A或-CO(CH2)n-NH-或-(CH2)n-S，其中n＝1-6；或C是其中一个下述残基：
Figure A0081076900041
D是式(VIII)-(XI)代表的残基：-Aq-B(Ar-E)-C-Aq-E                                                     (VIII)-Aq-B(Ar)-C-Aq[Aq-B(Ar-E)-C-Aq-E]2                                    (IX)-Aq-B(Ar)-C-Aq[Aq-B(Ar)-C-Aq-[Aq-B(Ar-E)-C-Aq-E]2]2                  (X)-Aq-B(Ar)-C-Aq[Aq-B(Ar)-C-Aq-[Aq-B(Ar)-C-Aq[Aq-B(Ar-E)-C-Aq-E]2]2]2 (XI)
其中A、B、C、q和r具有上述含义，且E由式(XII)和(XIII)代表：-Aq-B(Ar-P)-C-Aq-P1                                      (XII)-Aq-B(Ar)-C-Aq[-Aq-B(Ar-P)-C-Aq-P1]2                    (XIII)
其中A、B、C、q和r具有上述含义；P＝P1或P≠P1；P和P1是H或直链烃基，所述烃基可任选被一个或多个直链或支链烷基、酰基、氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、糖、寡糖、蛋白质、单克隆抗体、含有10-400个-CH2-CH2-O-重复单位的聚乙二醇、脂质、酶、金属配体或者其合成类似物和衍生物取代。
11.权利要求1-10的多肽树状聚物，其中树状聚物的二维分子直径为约10-100nm。
12.树状聚物2(2(2(H-Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-
Orn-Gly-Gly-HN-CH2-CH2-NH-Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-
Gly(Gly-Gly-Orn-Gly-H)2)2)2.
13.树状聚物2(2(2(2(H-Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orm-Gly-
Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly-HN-CH2-CH2-NH-Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-
Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly-H)2)2)2)2.
14.树状聚物2(2(2(2(2(H-Gly-Orn-Gly-Gly]Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-
Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly-HN-CH2-CH2-NH-Gly-Gly-
Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-
Gly-Orn-Gly-H)2)2)2)2)2.
15.树状聚物2(2(2(2(2(2(H-Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-
Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly-HN-CH2-
CH2-NH-Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-
Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly-H)2)2)2)2)2)2.
16.树状聚物2(2(2(2(2(2(2(H-Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly)Gly-Orn-Gly-Gly-HN-CH2-CH2-NH-Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly(Gly-Gly-Orn-Gly-H)2)2)2)2)2)2)2.
17.树状聚物N{-CH2-CH2-NH-CO-CH(-CH2-苯基)-NH-Gly-Gly-Gly-Orn-
Gly[Gly-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Gly-Orn-Gly-H]2]2]2}3.
18.树状聚物N(-CH2-CH2-NH-CO-CH(-CH2-苯基)-NH-Gly-Gly-Gly-Orn-
Gly[Gly-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Gly-
Orn-Gly-H]2]2]2]2}3.
19.树状聚物
Gly[Gly-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Gly-
Orn-Gly[Gly-Gly-Gly-Orn-Gly[Gly-Gly-Gly-Orn-Gly-H]2]2]2]2]2]2]2}3.
20.权利要求12-19的多肽树状聚物，其中NH2末端被乙酰化。
21.权利要求1的多肽树状聚物，其中在其表面上共价连接上至少一个生物活性或标记物分子。
22.权利要求21的多肽树状聚物，其中所述生物活性分子选自氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、脂质、糖、寡糖、和小的有机分子及其合成类似物和衍生物。
23.权利要求21的多肽树状聚物，其中所述生物活性分子选自药物，细胞受体配体，细菌、病毒和寄生虫抗原，以及基因治疗化合物。
24.权利要求21的多肽树状聚物，其中所述标记物分子是诊断显象造影剂。
25.权利要求1的多肽树状聚物，其中包埋有生物活性分子。
26.权利要求25的多肽树状聚物，其中所述生物活性分子选自氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、脂质、糖、寡糖、和小的有机分子及其合成类似物和衍生物。
27.权利要求25的多肽树状聚物，其中所述生物活性分子选自药物，细胞受体配体，细菌、病毒和寄生虫抗原，以及基因治疗化合物。
28.权利要求27的多肽树状聚物，其中所述生物活性分子是抗癌药物。
29.权利要求27的多肽树状聚物，其中所述生物活性分子是抗生素。
30.权利要求27的多肽树状聚物，其中所述生物活性分子是抗病毒物质。
31.制备权利要求1的多肽树状聚物的方法，其特征在于包括下述步骤：
i)合成具有至少两个反应性官能团的核心部分；
ii)在固相上分开合成具有临时或持久性受保护的末端的多肽单树突；
iii)将多肽单树突共价缩合到核心部分上。
32.制备权利要求1的多肽树状聚物的方法，其特征在于包括下述步骤：
i)合成具有至少两个反应性官能团的核心部分；
ii)将1-3世代的具有临时受保护的末端的多肽单树突共价缩合到核心部分上，以获得相应受保护的树状聚物；
iii)除去保护基后，将多肽单树突反复缩合到树状聚物的反应性末端上，以获得所需的最终树状聚物。
33.把分子量在1000Da以下的生物活性物质和药物包埋在权利要求1的多肽树状聚物内的方法，其特征在于包括下述步骤：
(a)将适当量的多肽树状聚物加到所述分子的浓或饱和溶液中，和
(b)在室温保持24小时后，用大量沉淀剂沉淀出有负载的多肽树状聚物。
34.把分子量在1000Da以上的生物活性物质和药物包埋在权利要求1的多肽树状聚物内的方法，其特征在于，在水性缓冲液中，在所述分子存在下，将多肽单树突选择性地化学连接到核心部分上。
35.在水性缓冲液中通过扩散负载到树状聚物载体上之后将生物活性物质和药物选择性地化学连接到权利要求1的多肽树状聚物的内部官能团上的方法。
36.权利要求1的多肽树状聚物作为生物活性分子的单分子载体的应用，其中至少一个生物活性或标记物分子共价连接在该载体的表面上。
37.权利要求36的多肽树状聚物的应用，其中所述生物活性分子选自氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、脂质、糖、寡糖、和小的有机分子及其合成类似物和衍生物。
38.权利要求36的多肽树状聚物的应用，其中所述生物活性分子选自药物，细胞受体配体，细菌、病毒和寄生虫抗原，以及基因治疗化合物。
39.权利要求36的多肽树状聚物的应用，其中所述标记物分子是诊断显象造影剂。
40.权利要求1的多肽树状聚物作为生物活性分子的单分子载体的应用，其中生物活性分子包封在该载体内。
41.权利要求40的多肽树状聚物的应用，其中所述生物活性分子选自氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、脂质、糖、寡糖、和小的有机分子及其合成类似物和衍生物。
42.权利要求40的多肽树状聚物的应用，其中所述生物活性分子选自药物，细胞受体配体，细菌、病毒和寄生虫抗原，以及基因治疗化合物。
43.权利要求40的多肽树状聚物的应用，其中所述生物活性分子是抗癌药物。
44.权利要求40的多肽树状聚物的应用，其中所述生物活性分子是抗生素。
45.权利要求40的多肽树状聚物的应用，其中所述生物活性分子是抗病毒物质。
46.具有可药用赋形剂的组合物，其中权利要求1的多肽树状聚物是共价连接在其表面上的生物活性或标记物分子的单分子载体。
47.具有可药用赋形剂的组合物，其中权利要求1的多肽树状聚物是包埋在其中的生物活性分子的单分子载体。
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