CN113940994A - 壳聚糖-Pickering乳液白细胞介素12佐剂体系的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫学领域，具体涉及壳聚糖‑Pickering乳液白细胞介素12佐剂体系的制备方法及其应用；将壳聚糖与水混合得到水相；其水相于油相液体石蜡混合、超声得到壳聚糖‑Pickering乳液。将壳聚糖‑Pickering乳液与IL‑12结合形成佐剂，所述的佐剂再与pORF5形成疫苗；本发明人提供了一种壳聚糖‑Pickering乳液/IL‑12佐剂体系与沙眼衣原体重组蛋白制备为疫苗制剂，实验证实壳聚糖‑Pickering乳液/IL‑12佐剂体系增强抗原的体液免疫和细胞免疫水平优于不含佐剂或者单独佐剂。

Description

壳聚糖-Pickering乳液白细胞介素12佐剂体系的制备方法及 其应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及Pickering乳液白细胞介素12佐剂体系在制备沙眼衣原体疫苗中的应用，即一种沙眼衣原体重组亚单位疫苗优选一种壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系混合制备的沙眼衣原体疫苗制剂、其制备方法、及其在防治沙眼衣原体感染中的应用。

背景技术

沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，Ct)作为一种革兰阴性专性胞内寄生菌，是世界上最常见的性传播病原体之一，可感染人眼部，呼吸道和生殖道系统，引起眼部瘢痕、失明，男性尿道炎、直肠炎，女性宫颈炎、盆腔炎、异位妊娠甚至不孕等疾病，严重危害人类健康。Ct感染常伴有其它病原体如人乳头瘤病毒(HPV)、艾滋病病毒(HIV)的混合感染，并能够促进HPV、HIV的传播和感染，导致宫颈癌、艾滋病的发生。目前在全球范围内沙眼衣原体感染病例稳步上升，特别是给发展中国家带来了严重的公共卫生负担，且沙眼衣原体感染性疾病还没有一种有效的防治方法，感染沙眼衣原体后也常常无症状不能及时诊断和治疗，治疗后也极易复发。因此，寻求有效疫苗是预防和控制沙眼衣原体感染的根本措施。

Ct疫苗分为全菌疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、重组亚单位疫苗和核酸疫苗。早期的动物实验表明无毒的全菌疫苗可产生有效的保护性免疫，但可能会毒力返祖，且大量繁殖和冷藏条件都显示全菌疫苗存在较大的安全性问题，因此疫苗研究转向了安全性较高的减毒活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗。亚单位疫苗研究研究已有十余年，其安全性高不含毒性成分但存在蛋白质提取、纯化困难，成本高昂等问题。重组亚单位疫苗是近几年较为热门的方向，借助DNA重组和蛋白质工程技术可以表达大量的蛋白疫苗，因此重组亚单位疫苗有着安全性高，成本节约等优越性，但激发高效的特异性免疫反应特别是抗Ct细胞免疫和黏膜免疫还远远不够，因此优选一种靶向蛋白疫苗激发细胞免疫和体液免疫的佐剂可以起到事半功倍的效果。

目前已批准使用的佐剂有铝佐剂、油乳佐剂(MF59、ASO2、AS03、AF03)、Toll样受体激动剂类等，其它佐剂如病毒样颗粒、脂质体、免疫刺激复合物、寡核苷酸类、纳米颗粒、多糖类、细胞因子类等可改善多种免疫类型，但目前均尚未实现临床应用。铝佐剂已经广泛应用于疫苗，然而这种传统佐剂只能激发体液免疫无法诱导产生理想的细胞免疫和黏膜免疫反应对胞内病原体有一定的局限性。乳液佐剂也是一种广泛使用的佐剂类型，具有以下优点：1.保护、缓释抗原，2.增加抗原吸附表面积，3.调节免疫应答类型，4.成本节约可大规模生产。但也存在问题如使用表明活性剂等带来安全稳定隐患，免疫剂量、方法和具体免疫增强的机制还未阐明。

一种新型的乳液佐剂即Pickering乳液佐剂是用固体颗粒代替表面活性剂作为乳化剂稳定油水界面而得到的乳状液，即由吸附到两相界面的固体微粒稳定的乳浊液。除了具备传统乳液的优点，Pickering乳液消除了表面活性剂带来的生物相互作用或刺激等不利影响，安全性得到提高，其中吸附在油水界面上的疏水固体颗粒阻碍了液滴的紧密连接，从而有效阻止乳液的聚结，提高了乳液的稳定性，且利用了乳液的柔性和固体颗粒模拟病原体的形貌和表面电荷将抗原递呈给APC细胞，可改善免疫强度和多样化免疫类型。此外，细胞因子IL-12因其独特的生物学效应也是一种强有力的疫苗免疫佐剂，它主要是由单核细胞和巨噬细胞产生的能在细胞间传递信息，具有免疫调节、抗肿瘤、抗感染等多种生物学功能的糖蛋白。IL-12能够诱导免疫细胞活化、增殖并产生伽马干扰素(IFN-γ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-壳聚糖F)和肿瘤坏死因子(TNF)-α从而改变TH1/TH2平衡向TH1方向发展。因此，IL-12是一种良好的免疫刺激剂，且有关研究表明IL-12的刺激作用越久疫苗的免疫效果越强，如果能如将IL-12和Pickering乳液混合形成一种新的佐剂系统，其Pickering乳液缓释能力延长了IL-12的作用时间，从而促进疫苗更强的免疫水平。

本明基于现有的研究基础，利用一种新型Pickering乳液/IL-12佐剂体系增强沙眼衣原体重组亚单位疫苗的免疫水平，并通过一系列的动物实验证明了该疫苗制剂能够刺激动物机体产生有效的体液免疫和细胞免疫水平，这对于预防和控制沙眼衣原体感染具有重要的价值和意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供沙眼衣原体疫苗制剂，其中含有一种沙眼衣原体重组亚单位疫苗如沙眼衣原体质粒编码蛋白pORF5并优选一种Pickering乳液/IL-12佐剂体系递送抗原引起针对沙眼衣原体感染的保护性免疫应答。

技术方案：

为实现本发明的目的，提供以下技术方案：

在本发明的第一方面，提供一种沙眼衣原体疫苗。

在本发明的一些实施方式中，所述疫苗为沙眼衣原体重组亚单位疫苗，一些具体实施方式中，所述疫苗具体为pORF5重组蛋白疫苗。

在本发明的第二方面，提供一种Pickering乳液的构建方法，包括：

(1)将壳聚糖(CS)与水混合，得到壳聚糖水相；

(2)将壳聚糖水相于油相液体石蜡(LiquidParaffin,LP)混合、超声得到壳聚糖-Pickering乳液。

在本发明的一些实施方式中，水相油相体积比4：(1～4)，一些具体实施方式中水相油相体积比4:1。

在本发明的一些实施方式中，所述水相中，壳聚糖的浓度为1～3mg/mL，一些具体实施方式中，所述水相中，壳聚糖的浓度为2mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，所述水相pH4.9-8.5，一些具体实施方式中，所述水相pH为6.7。

在本发明的一些实施方式中，所述超声条件功率55w～440w，间隔4s超声4s，超声4min。一些具体实施方式中，所述超声条件为功率110w，间隔4s超声4s，超声4min。

在本发明的一些实施方式中，所述壳聚糖分子量为5万、10万和15万，一些具体实施方式中，所述壳聚糖分子量为15万。

在本发明提供了由具体实施方式得到的壳聚糖-Pickering乳液，其中，所述Pickering乳液的平均粒径为789.47±44.26nm，平均Zeta电位为33.2±3mV。

在本发明的第三方面，提供了壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系，所述的佐剂体系包含了壳聚糖-Pickering乳液递送缓释蛋白系统和IL-12诱导TH1型免疫反应系统。

在本发明的一些实施方式中，所述壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系是将IL-12和壳聚糖-Pickering乳液混合后，IL-12吸附到壳聚糖-Pickering乳液中实现持久效应，一些具体实施方式中，所述IL-12是重组小鼠IL-12。

适宜地，所述的壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系显示出明显的免疫增强效果，在一些实施方式中，以沙眼衣原体pORF5重组蛋白疫苗搭配壳聚糖-Pickering乳液IL-12佐剂体系制备成疫苗制剂免疫小鼠，评估该疫苗制剂对感染沙眼衣原体小鼠模型的免疫保护力。

作用原理：

1、乳液是两种互不相溶的液体组成的热力学不稳定体系，作为疫苗佐剂已有一定的研究基础，为了形成的稳定和载药量的乳液体系往往需要添加乳化剂降低两相界面张力，传统乳液是添加表面活性剂，Pickering乳液是添加固体颗粒作为乳化剂形成颗粒稳定的乳液。

壳聚糖(英语：Chitosan)，是一种线性多糖，当中由氨基葡萄糖(脱乙酰单位)和N-乙酰葡糖胺(乙酰单位)随机分布，并透过β-(1-4)糖苷键组合而成，微溶于水；壳聚糖具有低毒性，生物相容性，来源丰富等优势，将壳聚糖颗粒引入两相界面，因其疏水性强烈吸附在两相界面以阻止液滴的聚集，形成壳聚糖-Pickering乳液，提高了乳液的稳定性。壳聚糖颗粒游离的氨基还可以结合蛋白或多肽，因此乳液界面上的壳聚糖可以结合IL-12形成佐剂体系，再有效装载pORF5蛋白抗原形成疫苗制剂。因此本发明主要目的是形成小而均一、稳定的壳聚糖-Pickering乳液，并从可能影响乳液制备因素如超声功率，水油比，壳聚糖颗粒浓度，壳聚糖分子量，水相pH以及油相类型这六方面开展相关优化，以确定最佳的壳聚糖-Pickering乳液。

具体而言：

本发明主要以粒径和表面电位作为考察指标，乳液超声前后的外观如图1-A和1-B，图1-C、1-D、1-E、1-F、和1-G是马尔文粒度仪检测不同条件下乳液粒径大小，1-H是利用不同油相形成乳液外观和显微镜下图。结果可知超声功率、壳聚糖浓度和pH是影响乳液粒径大小的关键因素，如图1-C超声功率太低，乳液不能得到有效剪切，超声后上层有油花，粒径太大，超声功率太高时，乳液超声后有块状物质产生，且粒径太大，稳定性差，功率为110w和220w两者粒径无明显差异，较高功率产热会影响乳液的状态，因此优选超声温和且能达到较小粒径的功率；水油比和5-15万分子量的壳聚糖(图1-D、图1-F)并不影响其粒径大小，但随着油相增多，其超声后上层油花较多，油相未被充分利用超声，影响乳液的稳定性，5-15万分子量的壳聚糖在一个合适的范围，都具有形成最佳粒径的稳定的乳液，后续实验统一15万分子量的壳聚糖；此外壳聚糖浓度为1mg/mL时，稳定乳液的颗粒数量较少，形成的乳液粒径大，当壳聚糖浓度增加为2mg/mL和3mg/mL，乳液的粒径相差不大，不再减小，说明浓度为2mg/mL油水界面已经有足够的颗粒稳定乳液(图1-E)；如图1-G，当壳聚糖溶液pH≥6.7(壳聚糖的pKa≈6.7)时，颗粒表面的氨基酸质子化程度低，亲水性减少形成壳聚糖颗粒能稳定油水界面，但pH＝4.9时，壳聚糖表面氨基大量质子化，亲水性増加致乳液的粒径变大；油相的物化性质可能对乳液有一定的影响，如图1-H，壳聚糖颗粒能稳定不同类型的油相，但所形成的乳液粒径大小和稳定性有差别，从外观上可以得知利用角鲨烯和大豆油形成的乳液并不是精细的流体状，存在块状物质，正己烷黏度低，容易从乳液析出，稳定性低，显微镜下观察到大豆油的正己烷形成的乳液粒径大，不均一，液体石蜡制备出的乳液外观上呈现细腻流体状，显微镜下也是小而均一的液滴，故而选择液体石蜡作为油相。

表1为优化后乳液的平均Size、平均Zeta电位和均匀度检测数据

Size	789.47±44.26nm
		Zate电位	33.2±3mV
PDI	0.427±0.12

综上诉述，优选条件为液体石蜡油相、超声功率为110w、水油比4:1、壳聚糖浓度为2mg/mL、壳聚糖溶液pH6.7以及统一壳聚糖分子量为15万来制备乳液。

2、通过优化制备出稳定的壳聚糖-Pickering乳液，其油水界面具有巨大的比表面积，可实现抗原和蛋白的高效负载，IL-12是目前发现诱导细胞免疫最强的细胞因子，具有免疫调节、抗肿瘤和抗感染等作用。有关研究表明0.5μgIL-12作为疫苗佐剂能够很好的增强抗原的细胞免疫应答，且文献中提到延长IL-12的作用时间会增强其功效，本发明就以0.5μgIL-12以吸附方式装载到壳聚糖-Pickering乳液界面形成复合佐剂，该佐剂体系延长IL-12的作用时间又具有吸附蛋白抗原的Pickering乳液界面，能够递送缓释蛋白抗原促进细胞免疫和体液免疫的产生。

有益效果：

1、相比于使用无佐剂或者仅使用单独佐剂的抗原获得的应答，所述壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系与沙眼衣原体pORF5重组蛋白制备的疫苗制剂能够诱导更高的细胞免疫诱导和体液免疫应答。

具体而言：本发明人提供了一种壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系与沙眼衣原体重组蛋白制备为疫苗制剂，经过动物实验证实了该疫苗制剂能够增强动物机体抗沙眼衣原体感染的免疫水平，并且本发明人发现了壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系增强抗原的体液免疫和细胞免疫水平优于不含佐剂或者单独佐剂。

附图说明

图1：壳聚糖-Pickering乳液的制备筛选结果，其中A和B是液体超声前后外观照片，C-G分别为超声功率，水油比，CS浓度，CS分子量和pH对粒径影响测定结果，H是利用不同油相制备乳液的外观，I-L为液体石蜡，角鲨烯，大豆油，正己烷显微镜照片。

图2：乳液测定结果，A为乳液的显微镜下观；B是平均粒径测定结果；C是平均Zeta电位分布图；

图3：荧光显微镜观察结果；A是相对应显微镜下白光照片；B是壳聚糖在乳液液滴表面分布的荧光图；

图4：荧光显微镜观察结果；A和B分别是乳液吸附模式抗原白光图和相对应的荧光图，C是其吸附率结果，D是细胞摄取乳液的荧光图；

图5：抗体检测结果，其中A表示0、2、4、6周IgG抗体水平变化趋势，B、C和D分别为第6周各组IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平，E是壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系IgG1和IgG2a抗体水平比较，F、G和H分别为第6周各组小肠、大肠和阴道灌洗液的sIgA抗体水平；

图6：细胞因子检测结果，其中A、B、C和D分别为三免后两周各组脾细胞上清IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-4细胞因子的水平；E是各组脾细胞增殖指数图。

图7：各组小鼠攻击后生殖道病理H-E切片观察。

具体实施方式

本发明采用的各组试剂和耗材皆可在市场上购买，在此基础上，本发明人完成了本发明，具体而言：

实施例1

本发明人提供了一种壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系与沙眼衣原体重组蛋白制备为疫苗制剂，经过动物实验证实了该疫苗制剂能够增强动物机体抗沙眼衣原体感染的免疫水平，并且本发明人发现了壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系增强抗原的体液免疫和细胞免疫水平优于不含佐剂或者单独佐剂。本发明采用的各组试剂和耗材皆可在市场上购买，在此基础上，本发明人完成了本发明，具体而言：

1、壳聚糖-Pickering乳液的制备

将干粉壳聚糖溶于水中，加入适量醋酸后于电磁搅拌器中以220rpm/min震荡过夜，再用G3砂芯漏斗抽滤，除掉杂质后得到壳聚糖溶液，再通过调节水相pH即可制备得到所需的壳聚糖颗粒。为了制备出稳定，小而均一的乳液，将从超声功率、水油比、壳聚糖浓度、壳聚糖分子量、壳聚糖水相pH以及油相类型这六方面开展了相关优化，以确定最佳的壳聚糖-Pickering乳液制备方式，图1是壳聚糖-Pickering乳液优化筛选结果。结果可知超声功率、壳聚糖浓度和pH是影响乳液粒径大小和稳定性的关键因素，如图1-C超声功率太低，乳液不能得到有效剪切导致粒径太大，超声后上层有油花，超声功率太高时，乳液超声后有块状物质产生，且粒径大，稳定性差，功率为110w和220w两者粒径无明显差异，较高功率产热会影响乳液的状态，因此优选超声温和且能达到较小粒径的功率；水油比和分子量在5-15万之间的壳聚糖(图1-D、图1-F)并不影响其粒径大小，但随着油相增多，其超声后上层油花较多，油相未被充分利用超声，影响乳液的稳定性，此外，壳聚糖分子量太长，颗粒粘连会导致乳液粒径大，太小颗粒易降解制备的乳液不稳定，但本发明中5-15万壳聚糖分子量形成的乳液粒径并没有差别，因此，5-15万分子量的壳聚糖在一个合适的范围，都具有形成最佳粒径的稳定的乳液，后续实验统一选择15万分子量；壳聚糖浓度为1mg/mL时，稳定乳液的颗粒数量较少，形成的乳液粒径大，壳聚糖浓度增加为2mg/mL和3mg/mL，乳液的粒径相差不大，不再减小，说明浓度为2mg/mL油水界面已经有足够的颗粒稳定乳液(图1-E)；图1-G表明壳聚糖溶液pH≥6.7(壳聚糖的pKa)时，颗粒表面的氨基酸质子化程度低，亲水性减少形成壳聚糖颗粒能稳定油水界面，但pH＝4.9时，壳聚糖表面氨基大量质子化，亲水性増加致乳液的粒径变大。综上诉述，优选条件为超声功率为110w、水油比4:1、壳聚糖浓度为2mg/mL、壳聚糖溶液pH6.7以及统一壳聚糖分子量15万来制备乳液；油相的物化性质可能对乳液有一定的影响，如图1-H，壳聚糖颗粒能稳定不同类型的油相，但所形成的乳液粒径大小和稳定性有差别，从外观上可以得知利用角鲨烯和大豆油形成的乳液并不是精细的流体状，存在块状物质，正己烷黏度低，容易从乳液析出，稳定性低。图1-I-K显微镜下观察到大豆油的正己烷形成的乳液粒径大，不均一，液体石蜡制备出的乳液外观上呈现细腻流体状，显微镜下也是小而均一的液滴，故而选择液体石蜡作为油相。

2、壳聚糖-Pickering乳液的测试和表征

最终确定以浓度为2mg/mL壳聚糖溶液；使壳聚糖溶液pH6.7后与液体石蜡以水油体积比为4:1混合，在功率110w下超声4s，间隔4s共超声4min，得到壳聚糖-Pickering乳液。显微镜下乳液形态如图2-A。取适量乳液稀释100倍后于马尔文粒度仪检测其平均粒径、Zeta电位以及聚合物分散性指数(PDI)。图2-B是马尔文粒度仪测得乳液的平均粒径分布图，图2-C是Zeta电位分布图，表1是乳液平均粒径、Zeta电位以及PDI参数。结果表明该乳液的粒径在纳米级别，乳液粒径小且具有较高吸附表面积，且Zeta电位和PDI表明该乳液具有良好的稳定性。

3、荧光标记分析壳聚糖的定位

配置1mg/ml溶于DMSO的FITC溶液，取适量FITC溶液与2mg/mL的壳聚糖水溶液充分混合37℃避光震荡4-10h。利用8000-14000透析袋透析混合溶液以去除未结合的荧光染料，直到透析液检测不到荧光，制备出FITC-壳聚糖溶液。利用该FITC-壳聚糖溶液与油相LP超声制备出Pickering乳液，荧光显微镜观察结果如图3，可知壳聚糖主要位于液滴的界面处。

4、体外评估壳聚糖-Pickering乳液

4.1、抗原吸附实验：选择牛血清白蛋白(BSA)作为模式抗原，将新制备的壳聚糖-Pickering与FITC-BSA按疫苗佐剂配方制备并于冰上混合4h，取乳液于荧光显微镜下观察，结果如图4-A和B。

将新制备的壳聚糖-Pickering与BSA冰上共混(总投入抗原量A)4h，之后将乳液与抗原的混合物用10万超滤管以转速6000g，离心10min,取下层澄清的水相，然后通过MicroBCA蛋白试剂盒测量下层澄清液体的蛋白浓度C，体系的总体积为V。乳液对抗原的吸附率(AdsorptionEfficiency)可通过以下公式计算：AdsorptionEfficiency＝(A-CV)/A×100％，结果如图4-C。

结果显示，FITC-BSA位于壳聚糖-Pickering乳液液滴的表面，乳液以吸附的方式装载抗原，且吸附率较高。

4.2、细胞摄取实验：用RPMI-1640培养基调整THP-1细胞至合适密度，24孔板中(提取放入爬片)每孔加入1mL，再用终浓度为100ng/mL的PMA处理THP-1细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养24h，使细胞贴壁。将新制备的壳聚糖-Pickering与FITC-BSA按疫苗佐剂配方制备并于冰上混合4h后再与贴壁的细胞共培养2h，培养后将细胞进行荧光染色，具体步骤如下：

(1)用PBS清洗细胞三次，每孔加入200μL4％多聚甲醛，4℃固定细胞30min(注意：甲醇可以在固定过程中破坏肌动蛋白。因此最好避免含有任何甲醇的固定剂，优选的固定剂是不含甲醇的甲醛)；

(2)弃掉多聚甲醛，PBS清洗细胞三次后每孔加入200μL0.5％TritonX-100溶液，在室温下透化细胞10min；

(3)弃去TritonX-100，PBS清洗细胞后，每孔加入300μL含10％FBS的RPMI-1640培养基，37℃封闭1h；

(4)弃上清，PBS清洗细胞后，每孔加入200μL按照1:50-1:200的比例稀释荧光标记的鬼笔环肽储液，室温避光孵育2h，进行染色；

(5)PBS清洗细胞三次后，每孔加入200ulPBS稀释的DAPI溶液，37℃避光孵育30min；

(6)PBS清洗细胞三次后，夹出24孔板内的爬片进行封片，同时加入适量抗荧光猝灭剂，荧光显微镜下进行观察并拍照。

结果如图4-D所示，与PBS对照组相比较，吸附带有荧光蛋白质的壳聚糖-Pickering乳液组的细胞内有荧光乳滴，表明细胞能够摄取壳聚糖-Pickering乳液，这对于该乳液递送抗原被细胞摄取产生良好的细胞免疫水平具有重要意义。

5、疫苗制剂诱发的免疫水平

将实施方式1构建的壳聚糖-Pickering乳液与小鼠重组IL-12混合形成佐剂体系后，再与pORF5蛋白疫苗混合制备为疫苗制剂。选择4周龄雌性Balb/c小鼠，随机进行实验分组，每组10只，组别设置为：(1)PBS组(NS)、(2)单独疫苗组(pORF5)、(3)壳聚糖-Pickering+pORF5、(4)IL-12+pORF5、(5)壳聚糖-Pickering+IL-12+pORF5，饲养几天适应环境后，每只雌性Balb/c小鼠注射0.1mL含50μgpORF5蛋白的疫苗制剂，并于0、2、4周免疫三次。

5.1、体液免疫水平检测：于0、2、4周采用割尾取血法、6周采用眼球采血法取小鼠静脉血，4℃静置过夜后，于离心机5000rpm，离心10min，收集小鼠血清并储存于-20℃待用；用PBS冲洗小鼠生殖道，取生殖道分泌物灌洗液储存于-20℃待用；取小鼠小肠、大肠并用组织匀浆机匀浆后储存于-20℃待用。通过间接ELISA法检测各组小鼠的IgG、IgG1、IgG2a和sIgA水平，具体ELISA实验步骤如下：

(1)用1x包被液(0.05mmol/L碳酸盐缓冲液：1.59gNa2CO3+2.93gNaHCO3溶于1L无菌水中，调pH为9.6)稀释pORF5蛋白至100g/mL包被96孔ELSIA板，每孔加入100μL(10μg/孔)，4℃包被过夜；

(2)洗涤：弃去ELISA板内液体后每孔加入250μLPBST(1xPBS+0.05％Tween20)，共洗涤3次(每次停留1min以达到最大洗涤效果)，甩去孔内液体，并在吸水纸上充分拍干；

(3)封闭：每孔加入200μL封闭液(1xPBS+5％脱脂奶粉)，37℃恒温培养箱中封闭2h或4℃封闭过夜；

(4)重复步骤(2)；

(5)一抗孵育：采用倍比稀释的方法按比例稀释小鼠血清，每孔加入100μL稀释的血清、100μL生殖道分泌物灌洗原液或100μL小肠、大肠组织匀浆原液，每孔设置复孔，同时设置阴性对照组和空白孔，37℃恒温培养箱中孵育2h；

(6)洗涤：弃去酶标板内液体，每孔加入250μLPBST，共洗涤5次(每次停留2min以达到最大洗涤效果)，甩去孔内液体，并在吸水纸上充分拍干；

(7)二抗孵育：分别将稀释好的HRP标记羊抗鼠IgG(1:5000)、IgG1(1:5000)、IgG2a(1:5000)、IgA(1:100)加入至ELISA板中，每孔100μL，37℃恒温培养箱中孵育1h；

(8)重复步骤(6)；

(9)加入1×TMB显色液(100μL/孔)，37℃恒温培养箱避光孵育15min，随后加入50μL/孔终止液终止反应；

(10)酶标仪检测ELISA板各孔450nm处的吸光度值，并计算比较各组sIgA、IgG以及IgG亚类的抗体水平。

结果如图5，图5-A表示小鼠血清的总IgG抗体水平变化趋势，随着免疫次数的增加，其抗体水平呈增加趋势，表明该重组蛋白疫苗具有良好的免疫原性。并且通过分析第6周小鼠血清各组IgG、IgG1和IgG2a的抗体水平(分别见图5-B、5-C和5-D)可知，各佐剂组均高于单独蛋白疫苗组，其平均值约为单独疫苗组的10-100倍，第6周壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系组的IgG抗体平均值约为单独佐剂组的2-4倍，IgG1抗体平均值约为IL-12佐剂组的10倍以上，且壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系组的IgG1平均值显著高于IgG2(图5-E)，差异具有统计学意义(p<0.05)。各组小鼠小肠、大肠和生殖道灌洗液sIgA抗体水平分别见图5-F、5-G、5-H，可知各佐剂组的sIgA显著高于单独蛋白疫苗组，壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系组生殖道灌洗液sIgA平均值是单独佐剂组的2-3倍，且该佐剂体系组小肠和大肠sIgA平均值约为IL-12佐剂组的2倍，差异具有统计学意义(p<0.05)。以上数据表明使用佐剂能够增强蛋白疫苗的免疫水平，尤其是利用壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系能够显著增强体液免疫水平，并倾向于Th1型。

5.2、细胞免疫水平检测：收集小鼠末次免疫2周后的脾淋巴细胞，加入1mL调整好密度的脾淋巴细胞悬液至24孔培养板中，每孔加入10μgpORF5蛋白刺激淋巴细胞，充分混匀，37℃、5％CO2培养箱放置48h，刺激完成后，收集培养液上清液于-20℃冰箱保存，根据试剂盒说明书检测脾淋巴细胞上清细胞因子(IL-4、TNF-α、IL-2、IFN-γ)的表达水平；加入200μL脾淋巴细胞悬液至96孔培养板中，每孔加入10μgpORF5蛋白刺激淋巴细胞，同时设置刺激组和未刺激组，37℃、5％CO2培养箱中培养44h后，每孔加入10μL的CCK-B试剂继续培养4h，利用酶标仪检测培养后96孔培养板各孔450nm的吸光度值。小鼠脾细胞收集具体步骤如下：

(1)用无菌镊子摘除小鼠眼球并脱颈处死后放入酒精消毒2-3分钟，在超净工作台中置小鼠于操作板上固定后用无菌剪刀剪开小鼠腹部皮肤，无菌分离脾脏放入EP管内，冰上保存；

(2)将脾脏夹入一次性无菌细胞筛上，用5ml医用注射器内芯或研磨棒研磨脾脏(手法轻柔)，加入4mL不完全RPMI-1640培养基经细胞筛过滤，收集脾细胞悬液至50mL离心管中，4℃、1000g离心5分钟；

(3)弃上清，加入4mL红细胞裂解液(细胞量多时应酌情增加)充分吹打混匀，室温静置5分钟，加4mL不完全RPMI-1640培养基终止，4℃、1000g离心5分钟；

(4)弃上清，加入4mL含有双抗(青霉素+链霉素)Hanks液(1:100)充分吹打混匀，4℃、1000g离心5分钟；

(5)弃上清，加入4mL不完全RPMI-1640培养基充分吹打混匀，4℃、1000g离心5分钟；

(5)弃上清，加入1mL含有10％胎牛血清的完全RPMI-1640培养基充分吹打混匀，制成细胞悬液。

(6)吸取细胞悬液计算细胞密度，按细胞数目稀释成(1-4)×10⁶铺板。

按照细胞因子试剂盒说明书检测脾细胞上清细胞因子的水平如图6A-D，结果显示各佐剂组的IFN-γ(图6-A)、IL-2(图6-B)、TNF-α(图6-C)、IL-4(图6-D)均高于阴性对照组和单独疫苗组，但IL-12组并不增强IL-4的分泌，此外，壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系组的IFN-γ、IL-2和TNF-α显著高于单独佐剂组，差异具有统计学意义(p<0.05)。图6-E表示各组脾细胞的增殖能力，可知与阴性对照组和单独疫苗组相比，壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系组能够有效促进小鼠脾细胞的增殖能力，且高于单独佐剂组，差异具有统计学意义(p<0.05)。

6、疫苗制剂的抗感染保护性检测

三次免疫后一个月以2.5×10⁵IFU鼠衣原体从生殖道感染小鼠，感染后80天取出子宫组织，采用常规石蜡切片，H-E染色方法进行子宫病理损伤观察，结果如图7，PBS组小鼠输卵管管腔显著扩张，明显高于其它组别，并伴有明显炎性细胞侵润。对比单独疫苗组，壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系组未见输卵管管腔扩张，提示佐剂体系能够增强pORF5蛋白的免疫水平，对生殖道衣原体攻击具有良好的保护作用。

通过动物实验，分析了疫苗制剂的体液和细胞免疫水平以及抗衣原体感染保护性，结果证实壳聚糖-Pickering乳液/IL-12佐剂体系具有良好的佐剂效应，能够显著增强蛋白疫苗的细胞免疫和体液免疫，其中细胞免疫水平更显著，倾向于Th1型。

序列表

<110> 南华大学

<120> 壳聚糖-Pickering乳液白细胞介素12佐剂体系的制备方法及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> pORF5(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Met Gly Asn Ser Gly Phe Tyr Leu Tyr Asn Thr Glu Asn Cys Val Phe

1 5 10 15

Ala Asp Asn Ile Lys Val Gly Gln Met Thr Glu Pro Leu Lys Asp Gln

20 25 30

Gln Ile Ile Leu Gly Thr Thr Ser Thr Pro Val Ala Ala Lys Met Thr

35 40 45

Ala Ser Asp Gly Ile Ser Leu Thr Val Ser Asn Asn Ser Ser Thr Asn

50 55 60

Ala Ser Ile Thr Ile Gly Leu Asp Ala Glu Lys Ala Tyr Gln Leu Ile

65 70 75 80

Leu Glu Lys Leu Gly Asn Gln Ile Leu Asp Gly Ile Ala Asp Thr Ile

85 90 95

Val Asp Ser Thr Val Gln Asp Ile Leu Asp Lys Ile Thr Thr Asp Pro

100 105 110

Ser Leu Gly Leu Leu Lys Ala Phe Asn Asn Phe Pro Ile Thr Asn Lys

115 120 125

Ile Gln Cys Asn Gly Leu Phe Thr Pro Ser Asn Ile Glu Thr Leu Leu

130 135 140

Gly Gly Thr Glu Ile Gly Lys Phe Thr Val Thr Pro Lys Ser Ser Gly

145 150 155 160

Ser Met Phe Leu Val Ser Ala Asp Ile Ile Ala Ser Arg Met Glu Gly

165 170 175

Ser Val Val Leu Ala Leu Val Arg Glu Gly Asp Ser Lys Pro Cys Ala

180 185 190

Ile Ser Tyr Gly Tyr Ser Ser Gly Val Pro Asn Leu Cys Ser Leu Arg

195 200 205

Thr Ser Ile Thr Asn Thr Gly Leu Thr Pro Thr Thr Tyr Ser Leu Arg

210 215 220

Val Gly Gly Leu Glu Ser Gly Val Val Trp Val Asn Ala Leu Ser Asn

225 230 235 240

Gly Asn Asp Ile Leu Gly Ile Thr Asn Thr Ser Asn Val Ser Phe Leu

245 250 255

Glu Val Ile Pro Gln Thr Asn Ala

260

Claims (6)

1.壳聚糖-Pickering乳液的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：

将壳聚糖和水混合，得到水相；其壳聚糖水相于油相液体石蜡混合、超声得到壳聚糖-Pickering乳液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于水相油相体积比4:（1~4）；壳聚糖的浓度为1~3mg/mL；水相pH 4.9- 8.5；超声条件功率55w~440w，间隔4s超声4s，超声4min；壳聚糖分子量为5万、10万和15万。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于超声功率为110w、水油比4:1、壳聚糖浓度为2mg/mL和壳聚糖水相pH 6.7，壳聚糖为15万。

4.一种佐剂，其特征在于由权利要求1-3优化制备获得的最佳壳聚糖-Pickering乳液与IL-12结合形成复合佐剂。

5.一种疫苗，其特征在于由权利要求4所述的佐剂与pORF5形成疫苗。

6.根据权利要求6所述的疫苗在制备防治沙眼衣原体药物中的应用。

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