CN108743939A - 共载抗原、mpla与imq的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用 - Google Patents

共载抗原、mpla与imq的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种共载抗原、MPLA与IMQ的阳离子磷脂‑聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用，该疫苗佐剂在疏水性内核包载TLR7激动剂咪喹莫特，在磷脂层包载TLR4激动剂单磷酰脂质A，通过磷脂层中的阳离子磷脂DOTAP吸附抗原，通过杂化纳米粒保护抗原并提高树突状细胞对抗原的摄取，通过TLR激动剂显著增强抗原刺激后的免疫应答并显著改善抗原交叉呈递；本发明的杂化纳米粒作为疫苗佐剂能够同时共负载抗原及不同类别的TLR激动剂，能以多种免疫途径递送抗原，促进DC活化与成熟，提高交叉提呈水平，产生强有力的T细胞杀伤效应，诱导细胞因子分泌，产生长效记忆性T细胞反应，对肿瘤有较好的预防能力。

Description

共载抗原、MPLA与IMQ的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗 佐剂及制备方法与应用
技术领域
本发明涉及疫苗佐剂技术领域，具体涉及一种共载抗原、MPLA与IMQ的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用。
背景技术
接种疫苗是预防传染病或抗癌的最有效方法之一。成功的疫苗应该能够产生针对特定病原体长期的体液和细胞免疫应答。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是专职性抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells,APCs)，在先天性和适应性免疫应答的联系中起着关键作用。捕获和提呈抗原后，DCs将它们呈递给T细胞并通过MHC-I类分子激发CD8+杀伤性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)应答或通过MHC-Ⅱ类分子激活CD4+T细胞介导的体液免疫。然而，游离状态的蛋白质或肽抗原经常被迅速清除且免疫原性较差，因此只能产生短暂和较弱的免疫应答。纳米技术为克服这些缺点提供了可能。纳米粒具有许多的优点使得它们适用于抗原递送和疫苗接种，包括有效的抗原包载、保护抗原免受降解、增强DCs对抗原的捕获以及共同递送抗原和免疫刺激佐剂等。
一些成功的疫苗如黄热病疫苗(YF-17D)的研究表明，经由多种Toll样受体(Tolllike receptors,TLRs)有效地激活DCs并增加促炎因子的分泌可以达到免疫系统的有效应答。TLRs是先天性免疫的主要传感器，可以激活一系列的免疫细胞。根据TLRs位置将其细分为两种类型：细胞膜相关受体(TLRs1,2,4,5和6)，主要识别细菌细胞壁成分；内体相关受体(TLRs3,4,7,8和9)，它们对细菌或病毒核酸特别敏感。已有研究表明使用TLR激动剂作为佐剂能显著增强抗原刺激后的免疫应答并显著改善抗原交叉呈递。最近，对疫苗递送的进一步研究表明了通过组合多个TLRs触发不同信号传导途径以激活协同免疫应答的重要性。
单磷酰脂质A(Monophosphoryl lipid A,MPLA)(位于细胞膜上和内体上的TLR4激动剂)为脂质A的非毒性衍生物，它的毒性比脂多糖(Lipopolysac charide，LPS)的毒性小100至10000倍，且仍具有LPS的许多免疫调节性，能够诱导强烈的Th1-极化免疫应答。作为第一个被批准作为佐剂使用的TLR激动剂，MPLA已成功用于治疗宫颈癌肝炎和疟疾(RTS,)等商业疫苗。咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)是TLR7激动剂，是一种有前景的DCs激活剂，已被FDA批准为免疫调节剂。IMQ的局部给药在几种皮肤病的治疗中已经显示出了有效性，(IMQ 5％乳膏)已被批准用于治疗浅表性基底细胞癌，光化性角化病和HPV介导的外生殖器和肛周疣。然而，游离的TLRs在体内容易快速降解和清除，因此妨碍其作为疫苗佐剂的临床表现。
纳米疫苗递送系统能够对包载的生物活性分子提供保护，并对抗原和多种佐剂进行共传递，与此同时可以在时间和空间等方式控制其递送和功能的发挥。其中，脂质体和聚合物纳米粒已经作为潜在的疫苗平台被广泛研究。然而，脂质体存在载药量较低和药物快速泄漏等缺点，聚合物纳米粒除了亲水性药物载药量低等缺点外，与脂质体相比其生物相容性较低。脂质聚合物杂化纳米粒(Lipid-polymer hybrid nanoparticles,LPNPs)是一种在聚合物内核外包裹单层或多层脂质壳的药物载体，不但结合了脂质体和聚合物纳米粒的优点，同时减轻了载药量低、生物相容性低、药物快速泄露等固有的缺点。LPNPs具有以下优点：1)高稳定性，对药物进行缓控释并改善对疏水性药物的包封率；2)由于脂质层的存在减少了疏水性药物的泄露并具有较好的生物相容性。因此，LPNPs迅速发展成为一种有效的药物或亚单位疫苗递送平台。此外，由于LPNPs的结构与病毒结构相似，因此成为了一种潜在的新型疫苗佐剂。纳米疫苗具有良好的灵活性、多样性，高抗原包封率，能够对包载的生物活性分子提供保护，以及可以在时间和空间等方式控制其递送和功能的发挥。与此同时可将纳米粒进行靶向修饰从而特定递送到靶器官中，并将抗原与佐剂以共传递等方式实现最佳免疫应答目的并克服佐剂应用的限制，是一种非常有前景的疫苗平台。除了纳米粒的优点，添加了带正电荷的1,2-二油酰基-3-三甲铵基丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)构成的阳离子脂质纳米粒同时可用作免疫佐剂以提高细胞和体液应答。由于“储库效应”的存在，阳离子脂质纳米粒延长了在注射部位的抗原暴露时间，从而起到了良好的佐剂作用。阳离子脂质纳米粒的另一个优点是它可以轻易地与阴离子抗原蛋白和编码抗原的核酸形成纳米复合物以增强T、B细胞免疫应答。此外，由于阳离子脂质纳米粒的结构与病毒结构相似并且可促进抗原的摄取，因此成为了一种潜在的新型疫苗佐剂。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种共载抗原、MPLA与IMQ的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用。
本发明提供了一种负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，包括步骤：将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与阳离子磷脂DOTAP溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，用氮气吹干残余溶剂后干燥；在干燥后的产物中加入溶剂进行水化，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声形成稳定乳液，将稳定乳液过滤，收集滤液，得到纳米粒溶液；将纳米粒溶液和抗原溶液混合后孵育，得到负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂。
制备方法中，还包括将TLR7激动剂和/或TLR4激动剂溶于有机溶剂的步骤；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与TLR7激动剂的质量比为20mg：(50-200)μg，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与TLR4激动剂的质量比为20mg：(5-20)μg；优选地，TLR7激动剂为咪喹莫特(IMQ)和/或咪唑喹啉(R848)，TLR4激动剂为单磷酰脂质A(Monophosphoryl lipidA,MPLA)。
两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与阳离子磷脂DOTAP的质量比为20mg：(0.5-2)mg。
有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；干燥为真空干燥，干燥的时间为12-24h。
溶剂为水或PBS溶液，水优选为双蒸水；溶剂的体积和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量的比值为(2-10)mL：20mg；水化的温度为65℃，水化的时间为2-12h，超声的时间为5-35min，过滤采用的是0.45μm滤膜。
抗原溶液中的抗原模型抗原卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)，也可以是蛋白质和多肽抗原等，包括乙肝表面抗原(HBsAg)、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)和肿瘤相关抗原等中的一种或多种的混合物；抗原溶液中抗原的浓度为1mg/mL，抗原和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为(1-3)mg：20mg。
孵育的温度为4℃，孵育的时间为0.5-3h，孵育过程伴随缓慢震荡。
两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，优选为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％。
本发明还保护根据上述方法制备得到的负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂。其具有聚合物内核-磷脂壳层的结构，能够通过杂化纳米粒的疏水性内核有效包载TLR7激动剂IMQ，通过磷脂层包载TLR4激动剂MPLA，并通过阳离子磷脂进一步负载抗原。
本发明还保护负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂在制备预防肿瘤和抗肿瘤免疫疗法药物中的应用。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：
(1)本发明利用具有良好生物相容性和可生物降解性的PCL-b-PEG-b-PCL两亲性三嵌段共聚物、阳离子磷脂DOTAP为制备磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的载体材料，通过薄膜-水化-超声-吸附法制备得到粒径均一、具有明显磷脂壳层、可有效共负载模型抗原OVA、两种TLR激动剂(TLR7激动剂IMQ和TLR4激动剂MPLA)的阳离子磷脂-聚合物纳米杂化纳米粒作为疫苗佐剂。
(2)本发明制备的共负载OVA抗原和TLR激动剂IMQ、MPLA的阳离子磷脂-聚合物纳米杂化纳米粒疫苗佐剂能有效保护抗原，显著提高DCs细胞对抗原的摄取、实现溶酶体逃逸，有效诱导体外DCs活化和成熟；皮下注射该疫苗佐剂后，能在注射部位形成抗原贮库，具有良好的佐剂作用；同时也促进体内DCs成熟、提高交叉提呈水平并向次级淋巴结的迁移，产生强有力的T细胞杀伤效应，诱导细胞因子分泌，产生长效记忆性T细胞反应，对肿瘤有良好的预防和免疫治疗效果。
(3)本发明制备的共负载OVA抗原和TLR激动剂IMQ、MPLA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒为可通过肌肉注射、皮下注射、胸腹腔内注射等方式进行免疫的疫苗佐剂，其可引发细胞及体液免疫，具有良好的免疫保护效果，同时其在体内是完全可生物降解的，降解后不产生对生物有害的物质。
(4)本发明提供的是一种具有生物相容性和可生物降解性、稳定性强、同时高效负载抗原与两种不同TLR激动剂的新型阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂；该疫苗佐剂在聚合物纳米粒疏水性内核包载TLR7激动剂IMQ，在磷脂壳层负载TLR4激动剂MPLA，并通过阳离子磷脂壳层DOTAP有效吸附模型抗原卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)，实现抗原与两种不同TLR激动剂的共负载与递送；本发明的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂可通过多种免疫途径递送抗原，促进DC活化与成熟，提高交叉提呈水平，产生强有力的T细胞杀伤效应，诱导细胞因子分泌，产生长效记忆性T细胞反应，通过细胞免疫及体液免疫对肿瘤有较好的预防能力及免疫治疗效果。
(5)在本发明的制备过程中无需使用乳化剂或表面活性剂，克服了传统制备亚单位疫苗载体系统需要大量使用乳化剂或表面活性剂的不足，避免了使用这些试剂而造成的对生物体的毒、副作用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备得到的负载模型抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的表征图；
图2为游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂与BMDCs共孵育16h后的激光共聚焦图；
图3为游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂与BMDCs共孵育24h后采用流式细胞术测定的BMDCs表面标记分子图；
图4为小鼠皮下注射罗丹明标记的OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂后观察注射部位的抗原储库效应和向引流淋巴结的迁移图；
图5为小鼠在第0天和第14天分别用游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂免疫后小鼠脾细胞的CD4+CD3+、CD8+CD3+细胞群分布图；
图6为小鼠在第0天和第14天分别用游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂免疫后的CD4+T细胞活化、CD8+T细胞活化、B细胞活化、体内交叉提呈及效应性T细胞激活和IFN-γ细胞因子的分泌图；
图7为小鼠在第0天和第14天分别用游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂免疫后效应性与记忆性T细胞图；
图8为小鼠在第0天和第14天分别用游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂免疫后的体液免疫效果图；
图9为小鼠在第0天和第14天分别用游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂免疫后动物体内接种E.G7OVA肿瘤细胞的预防型肿瘤免疫效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供一种负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，包括步骤：
S1：将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与阳离子磷脂DOTAP溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀的薄膜，用氮气吹干残余溶剂，再放入真空干燥箱内，真空干燥12-24h；其中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，优选为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与阳离子磷脂DOTAP的质量比为20mg：(0.5-2)mg；有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；
优选地，还包括将TLR7激动剂和/或TLR4激动剂溶于有机溶剂的步骤；两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与TLR7激动剂的质量比为20mg：(50-200)μg，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与TLR4激动剂的质量比为20mg：(5-20)μg；TLR7激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA。
S2：在干燥后的产物中加入双蒸水或PBS溶液，65℃水化2-12h，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声5-35min形成稳定乳液，将稳定乳液采用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到纳米粒溶液；其中，溶剂的体积和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量的比值为(2-10)mL：20mg；。
S3：将S2得到的澄清且具有乳光的纳米粒溶液和1mg/mL的抗原溶液混合后，4℃缓慢震荡孵育0.5-3h，得到负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂；其中，抗原和两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为(1-3)mg：20mg，抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物。
下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种负载抗原OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂，制备方法包括步骤：
S1：将20mg两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与1mg阳离子磷脂DOTAP溶于二氯甲烷中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀的薄膜，用氮气吹干残余溶剂，再放入真空干燥箱内，真空干燥12-24h；其中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％。
S2：在干燥后的产物中加入10mL双蒸水，65℃水化5h，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声10min形成稳定乳液，将稳定乳液采用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒(Lipid-polymer hybrid nanoparticles,LPNPs)溶液。
S3：将S2得到的LPNPs纳米粒溶液和1.5mL 1mg/mL的OVA溶液混合后，4℃缓慢震荡孵育1h，得到负载模型抗原的OVA-LPNPs疫苗佐剂(负载模型抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂)。
图1为所制备的负载模型抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒的表征图，其中图A为用PE-罗丹明标记的LPNPs的共聚焦图像，表明其具有明显的内核和磷脂层外壳；图B为其粒径及粒径分布，表明粒径较小、分布均一；图C为体外模型抗原OVA的释放，表明其具有一定的缓释效果。
实施例2
本实施例提供一种负载TLR7激动剂IMQ和抗原OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂，制备方法包括步骤：
S1：将20mg两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与1mg阳离子磷脂DOTAP、100μgTLR7激动剂IMQ溶于二氯甲烷中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀的薄膜，用氮气吹干残余溶剂，再放入真空干燥箱内，真空干燥12h；其中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％。
S2：在干燥后的产物中加入10mL双蒸水，65℃水化5h，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声10min形成稳定乳液，将稳定乳液采用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒(Lipid-polymer hybrid nanoparticles,LPNPs)溶液。
S3：将S2得到的LPNPs纳米粒溶液和1.5mL1mg/mL的OVA溶液混合后，4℃缓慢震荡孵育1h，得到负载模型抗原和TLR7激动剂的IMQ-OVA-LPNPs疫苗佐剂(负载TLR7激动剂IMQ和抗原OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂)。
实施例3
本实施例提供一种负载TLR4激动剂MPLA和抗原OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂，制备方法包括步骤：
S1：将20mg两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与1mg阳离子磷脂DOTAP、10μgTLR4激动剂MPLA溶于二氯甲烷中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀的薄膜，用氮气吹干残余溶剂，再放入真空干燥箱内，真空干燥12h；其中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％。
S2：在干燥后的产物中加入10mL双蒸水，65℃水化5h，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声10min形成稳定乳液，将稳定乳液采用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒(Lipid-polymer hybrid nanoparticles,LPNPs)溶液。
S3：将S2得到的LPNPs纳米粒溶液和1.5mL 1mg/mL的OVA溶液混合后，4℃缓慢震荡孵育1h，得到共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂(负载TLR4激动剂MPLA和抗原OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂)。
实施例4
本实施例提供一种共载TLR7激动剂、TLR4激动剂和抗原OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂，制备方法包括步骤：
S1：将20mg两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与1mg阳离子磷脂DOTAP、100μgTLR7激动剂IMQ、10μg TLR4激动剂MPLA溶于二氯甲烷中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀的薄膜，用氮气吹干残余溶剂，再放入真空干燥箱内，真空干燥12h；其中，两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％。
S2：在干燥后的产物中加入10mL双蒸水，65℃水化5h，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声10min形成稳定乳液，将稳定乳液采用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒(Lipid-polymer hybrid nanoparticles,LPNPs)溶液。
S3：将S2得到的LPNPs纳米粒溶液和1.5mL 1mg/mL的OVA溶液混合后，4℃缓慢震荡孵育1h，得到共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂(共载TLR7激动剂、TLR4激动剂和抗原OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂)。
实施例5
将本发明实施例4制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂(共载TLR7激动剂、TLR4激动剂和抗原OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂)进行效果测定。载OVA抗原并载IMQ、MPLA佐剂的阳离子脂质聚合物胶束疫苗细胞摄取及溶酶体逃逸情况如图2所示。
图2为游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂与BMDCs共孵育16h后的激光共聚焦图。绿色为用FITC标记的抗原，红色为用Lyso Tracker Red DND-99染色的溶酶体，蓝色为用DAPI染色的细胞核。表明BMDCs对游离OVA的吞噬量较少，且无溶酶体逃逸现象；载OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒能有效促进BMDCs对抗原的吞噬，并促进溶酶体逃逸。
图3为游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂与BMDCs共孵育24h后采用流式细胞术测定的BMDCs表面标记分子图。(A)CD40；(B)CD80；(C)CD86表达：(D)采用MTT法测定的细胞毒性；(E)采用流式细胞术定量分析BMDCs中FITC标记的OVA荧光强度。表明载OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂无细胞毒性、能有效促进BMDCs成熟及对抗原的摄取。
图4为小鼠皮下注射罗丹明标记的OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂后观察注射部位的抗原储库效应和向引流淋巴结的迁移图。图A为注射部位荧光成像，表明游离OVA皮下注射后，注射部位荧光信号迅速下降；而注射OVA-LPNPs 144h后也可以在注射部位检测到强烈的荧光信号，表明其具有良好的储存效应；图B为注射部位OVA抗原的定量荧光强度分析，表明OVA-LPNPs具有良好的抗原储存效应；图C为分别注射游离OVA和OVA-LPNPs疫苗佐剂24h后体内荧光成像，表明OVA-LPNPs疫苗佐剂能可有效地将抗原递送至淋巴结；图D为注射6d后分离出体内淋巴结成像，进一步证实了OVA-LPNPs疫苗佐剂可增强抗原在引流淋巴结中的积聚和滞留。
一般来说，机体发生免疫反应后，APCs摄取抗原是诱导特异性免疫应答的初始步骤。通过流式细胞仪定量测量抗原摄取结果表明，所有载有OVA的LPNPs均显著增加BMDCs对OVA-FITC的细胞摄取(约20倍)，表明它们具有增强细胞吞噬抗原的强大能力(如图3E)。内吞后的抗原在溶酶体里通过MHCⅡ类分子提呈并激活CD4+T细胞，或者进入细胞质里通过MHCⅠ类分子途径活化CD8+T细胞。有效的抗癌疫苗通常需要活化CD8+T细胞以引发强烈的CTL应答。因此，细胞内抗原加工对于触发T细胞免疫应答是非常重要的。在本研究中，将BMDCs与游离OVA-FITC或各种载OVA-FITC的LPNPs一起孵育，并使用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞内OVA的位置。如图3-4所示，与游离OVA-FITC孵育16小时后，在BMDCs中观察到弱绿色荧光并与溶酶体(Lyso Tracker Red标记)共定位，表明经内吞/溶酶体途径摄取游离OVA的能力差。相反，载OVA的LPNPs显著增强了BMDCs中的绿色荧光强度，证实制备的LPNPs增强了OVA对细胞的摄取。更重要的是，尽管LPNPs大多数的OVA-FITC与溶酶体共定位，但在细胞质中也检测到一些绿色荧光，表明LPNPs促进了OVA抗原的溶酶体逃逸。
实施例6
将本发明实施例4制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂(共载TLR7激动剂、TLR4激动剂和抗原OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂)进行效果测定。载OVA抗原并载IMQ、MPLA佐剂的阳离子脂质聚合物胶束疫苗的体内追踪如图4所示。
图4为小鼠皮下注射罗丹明标记的OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂后观察注射部位的抗原储库效应和向引流淋巴结的迁移图。图A为注射部位荧光成像，表明游离OVA皮下注射后，注射部位荧光信号迅速下降；而注射OVA-LPNPs 144h后也可以在注射部位检测到强烈的荧光信号，表明其具有良好的储存效应；图B为注射部位OVA抗原的定量荧光强度分析，表明OVA-LPNPs具有良好的抗原储存效应；图C为分别注射游离OVA和OVA-LPNPs疫苗佐剂24h后体内荧光成像，表明OVA-LPNPs疫苗佐剂能可有效地将抗原递送至淋巴结；图D为注射6d后分离出体内淋巴结成像，进一步证实了OVA-LPNPs疫苗佐剂可增强抗原在引流淋巴结中的积聚和滞留。
在疫苗接种部位形成贮库可以延长抗原在免疫系统的暴露时间并且增强免疫细胞捕获抗原，因此对于抗原递送系统是非常重要的。而活化的DCs向引流淋巴结—一个免疫细胞聚集和引发初始免疫部位的迁移是启动适应性免疫的另一个重要因素。为了探索抗原储库效应和DCs迁移，并清楚区分注射部位和淋巴结荧光信号，我们选择在特异性引流至腹股沟淋巴结的尾根部皮下注射罗丹明标记的OVA或OVA-LPNPs，并观察注射部位和腹股沟淋巴结处的荧光信号。如图4A所示，游离OVA皮下注射48小时后，注射部位荧光信号迅速下降到几乎消失。然而，对于OVA-LPNPs，即使注射后144小时后也可以在注射部位检测到强烈的荧光信号，表明OVA-LPNPs良好的储存效应。使用CRI Maestro分析软件对荧光强度进行定量分析，结果与上述定性结果一致(图4B)。皮下注射疫苗24小时后，接种OVA-LPNPs小鼠在腹股沟引流淋巴结处荧光信号显著强于接种游离OVA的小鼠，表明OVA-LPNPs可有效地将抗原递送至淋巴结(图4C)。皮下注射6天后，分离出腹股沟引流淋巴结并用于荧光成像。如图4D所示，接种OVA-LPNPs小鼠引流淋巴结中显示出强烈的荧光信号，而接种游离OVA的小鼠引流淋巴结中没有观察到荧光信号，进一步证实了载OVA-LPNPs可增强抗原在引流淋巴结中的积聚和滞留。
实施例7
将本发明实施例4制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂(共载TLR7激动剂、TLR4激动剂和抗原OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂)进行效果测定。载OVA抗原并载IMQ、MPLA佐剂的阳离子脂质聚合物胶束疫苗的肿瘤预防效果如图4所示。
图4为小鼠皮下注射罗丹明标记的OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂后观察注射部位的抗原储库效应和向引流淋巴结的迁移图。图A为注射部位荧光成像，表明游离OVA皮下注射后，注射部位荧光信号迅速下降；而注射OVA-LPNPs 144h后也可以在注射部位检测到强烈的荧光信号，表明其具有良好的储存效应；图B为注射部位OVA抗原的定量荧光强度分析，表明OVA-LPNPs具有良好的抗原储存效应；图C为分别注射游离OVA和OVA-LPNPs疫苗佐剂24h后体内荧光成像，表明OVA-LPNPs疫苗佐剂能可有效地将抗原递送至淋巴结；图D为注射6d后分离出体内淋巴结成像，进一步证实了OVA-LPNPs疫苗佐剂可增强抗原在引流淋巴结中的积聚和滞留。
为了评估载OVA的LPNPs的预防效果，用脂质聚合物纳米疫苗以两周一次的频率免疫C57BL/6小鼠两次。第二次接种后7天，将E.G7OVA肿瘤细胞接种至小鼠皮下，使用电子游标卡尺实时监测肿瘤生长。如图4A所示，在用游离的OVA或无菌PBS溶液处理后的小鼠均在接种肿瘤细胞后第6天观察到可触及的肿瘤，且肿瘤生长速度较快。在第12天，游离OVA和PBS免疫后的小鼠的肿瘤体积分别达到590.8±236.6mm3和838.1±254.5mm3。相反，用阳离子脂质聚合物纳米疫苗免疫后的小鼠肿瘤生长明显受到了抑制。图4B显示在第12天用OVA-LPNPs(62.5％，8只小鼠中的5只)，IMQ-OVA-LPNPs(62.5％，8只小鼠中的5只)，MPLA-OVA-LPNPs(62.5％，8只小鼠中的5只)和IMQ-MPLA-OVA-LPNPs(87.5％，8只小鼠中的7只)免疫后无肿瘤小鼠的百分比。存活率结果表明，与用生理盐水或游离OVA接种的小鼠相比，用纳米疫苗免疫后的小鼠的存活率显著提高。此外，含有MPLA和IMQ免疫佐剂的纳米疫苗进一步提高了小鼠存活率，呈现出最长的存活周期(图4C)。
图5为小鼠在第0天和第14天分别用游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂免疫后小鼠脾细胞的CD4+CD3+、CD8+CD3+细胞群分布图，表明疫苗佐剂能有效促进CD4+和CD8+细胞活化。
图6为小鼠在第0天和第14天分别用游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂免疫后的CD4+T细胞活化、CD8+T细胞活化、B细胞活化、体内交叉提呈及效应性T细胞激活和IFN-γ细胞因子的分泌图。其中，(A)CD4+T细胞活化；(B)CD8+T细胞活化；(C)B细胞活化；(D)体内交叉提呈及效应性T细胞激活；(E)IFN-γ细胞因子的分泌。表明载OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂能有效促进淋巴细胞及效应性T细胞的激活。
图7为小鼠在第0天和第14天分别用游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂免疫后效应性与记忆性T细胞图。其中，图(A)和(B)为效应(CD44hiCD62Llow)和中央(CD44hiCD62Lhi)记忆CD4+T细胞中的比例；图(C)和(D)为效应(CD44hiCD62Llow)和中央(CD44hiCD62Lhi)记忆CD8+T细胞中的比例。表明载OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂能有效促进记忆性T细胞免疫应答。
图8为小鼠在第0天和第14天分别用游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂免疫后的体液免疫效果图。其中，图(A)为初次免疫14、21d后抗原特异性IgG滴度；图(B)为由IgG2a/IgG1比值检测Th1极化。表明载OVA的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂能有效增加抗体产生并促进Th1极化。
图9为小鼠在第0天和第14天分别用游离OVA、本发明实施例4中制备得到的共负载模型抗原和TLR7、TLR4激动剂的IMQ-MPLA-OVA-LPNPs疫苗佐剂免疫后动物体内接种E.G7OVA肿瘤细胞的预防型肿瘤免疫效果图。其中，图(A)为无肿瘤小鼠的百分比；图(B)为接种E.G7OVA肿瘤细胞后第12天的小鼠图片；图(C)为荷瘤小鼠的存活率。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与阳离子磷脂DOTAP溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，用氮气吹干残余溶剂后干燥；
在干燥后的产物中加入溶剂进行水化，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声形成稳定乳液，将所述稳定乳液过滤，收集滤液，得到纳米粒溶液；
将所述纳米粒溶液和抗原溶液混合后孵育，得到所述负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂。
2.根据权利要求1所述的负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：
还包括将TLR7激动剂和/或TLR4激动剂溶于有机溶剂的步骤；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与所述TLR7激动剂的质量比为20mg：(50-200)μg，所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与所述TLR4激动剂的质量比为20mg：(5-20)μg；
优选地，所述TLR7激动剂为IMQ和/或R848，所述TLR4激动剂为MPLA。
3.根据权利要求1所述的负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：
所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL与所述阳离子磷脂DOTAP的质量比为20mg：(0.5-2)mg。
4.根据权利要求1所述的负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：
所述有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；
所述干燥为真空干燥，所述干燥的时间为12-24h。
5.根据权利要求1所述的负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：
所述溶剂为水或PBS溶液，所述水优选为双蒸水；所述溶剂的体积和所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量的比值为(2-10)mL：20mg；
所述水化的温度为65℃，所述水化的时间为2-12h，所述超声的时间为5-35min，所述过滤采用的是0.45μm滤膜。
6.根据权利要求1所述的负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：
所述抗原溶液中的抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物；
所述抗原溶液中抗原的浓度为1mg/mL，所述抗原和所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为(1-3)mg：20mg。
7.根据权利要求1所述的负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：
所述孵育的温度为4℃，所述孵育的时间为0.5-3h，孵育过程伴随缓慢震荡。
8.根据权利要求1所述的负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：
所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，优选为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％。
9.权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂。
10.权利要求9所述的负载抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂在制备预防肿瘤和抗肿瘤免疫疗法药物中的应用。
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