CN104645349A

CN104645349A - 复合型纳米疫苗及其制备方法

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Publication number: CN104645349A
Application number: CN201310603297.6A
Authority: CN
Inventors: 马轶凡; 蔡林涛; 刘兰兰; 易虎强
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2013-11-22
Publication date: 2015-05-27

Abstract

本发明公开了一种以聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸的两亲性三嵌段聚合物作为纳米载体负载肿瘤抗原、免疫佐剂和siRNA的复合型纳米疫苗，及其制备方法。本发明的纳米疫苗能通过纳米胶束负载抗原，提高抗原呈递细胞对抗原的摄取呈递，将siRNA高效地递送至TADCs，通过阻断其免疫抑制信号，协同免疫佐剂诱导活化TADCs，提高肿瘤疫苗的抗肿瘤作用；该疫苗具有所采用的纳米疫苗载体生物相容性好，毒性低的优点，在生物体内可降解，降解产物无毒无害可吸收或代谢；其制备方法简便易行，稳定性良好，便于推广。

Description

复合型纳米疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其是涉及一种以聚合物纳米颗粒为载体的复合型纳米疫苗及其制备方法。

背景技术

肿瘤疫苗介导的抗肿瘤免疫治疗是继手术、化疗、和放疗后的第四种抗肿瘤疗法，主要利用肿瘤细胞的抗原物质刺激机体产生特异性肿瘤细胞免疫杀伤，从而达到消灭肿瘤的目的。与传统的抗肿瘤治疗相比，肿瘤疫苗具有安全性好、特异性高等诸多优点，目前已被广泛用于治疗肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等各类恶性肿瘤，然而其临床疗效仍有待进一步提高。

树突状细胞（DC）作为体内功能最强的抗原递呈细胞，是激发机体产生抗肿瘤免疫应答的首要核心环节。它能迅速摄取抗原，并将抗原信息通过MHCI类分子提呈给CD8+T淋巴细胞，使之活化成为细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicTlymphocyte,CTL），继而杀死肿瘤细胞。此外，DC还通过分泌一系列细胞因子和趋化因子，进一步增强CTL介导的肿瘤细胞杀伤。然而，在肿瘤患者体内，特别是在肿瘤组织中，成熟的DC数量减少且功能明显降低，不能有效刺激机体T细胞活化。这一现象被认为是肿瘤细胞逃逸机体免疫监视、诱导免疫耐受的重要机制之一。因此，诱导肿瘤微环境中的DCs（tumor-associated DCs，TADCs）的成熟和活化，是提高肿瘤疫苗临床疗效的重要策略。

RNA干扰技术（RNAi）被认为是研究功能基因组最有力的工具之一。这种新兴的生物技术为肿瘤分子水平的基因治疗提供了新的技术和方法。RNAi是指通过双链RNA（dsRNA）介导，特异性地降解靶mRNA，导致转录后水平的基因沉默现象。它与传统的基因敲除技术相比，具有投入少，周期短，操作简单等优势。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。最近的研究表明，利用RNAi阻断TADC的免疫抑制信号通路是克服免疫抑制的重要手段。文献报道，利用RNAi技术降低DC细胞分泌抑制性因子（如IL-10和TGF-）的分泌，减少DC表面免疫抑制分子PD-L1的表达水平，显著促进DC的抗原呈递功能和抑瘤效果。然而，由于缺乏合适的载体，利用RNAi技术增强肿瘤疫苗的疗效在体内目前尚难得以实现。处于肿瘤微环境中的肿瘤相关树突状细胞（tumor-associateddendritic cells，TADCs）不但功能受到抑制，而且对免疫佐剂的刺激反应低下，是制约肿瘤疫苗临床疗效的重要原因。目前尚无有效的手段可以活化TADCs，也缺乏高效安全的载体可将siRNA递送到TADCs以阻断其胞内的免疫抑制性信号通路。

纳米载体是指可以负载小分子药物、基因和蛋白质等目标物质且具有纳米尺度的系统。其中，基于可降解高分子化合物的聚合物纳米颗粒因其良好的生物相容性和安全性，被广泛用于药物、基因及疫苗载体。例如，聚氨基酸是一种由氨基酸组成的均聚物或共聚物，它的降解产物为氨基酸，是一种人体需要的成分，由于氨基酸的种类很多，可以通过选择不同的氨基酸聚合可以得到各种性质不同的聚氨基酸材料（亲水、疏水、电正性、电负性等），所以聚氨基酸是一种非常有潜力的生物材料。

但是，现有的纳米载体仍然存在许多不足，如多数纳米载体稳定性较差，生物相容性不是非常良好，不能在体内完全降解和代谢，不能同时负载基因和蛋白质等多种物质等，制备复杂且不能很好的控制纳米载体的粒径大小等，这些缺点的存在很大程度上限制了聚合物纳米载体在制备纳米疫苗中的应用。例如，“纳米疫苗及其制备方法”（CN 102068698A）提供了一种采用甘露糖基化的阳离子脂质体复合物作为疫苗载体，负载蛋白质抗原，但该发明中的纳米载体不能同时负载siRNA。又如，“一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺”（CN101690805A），该方案是将α1，3Gal糖脂引入到纳米脂质体表面，制备具有DCs靶向性的纳米瘤苗脂质体，活化DCs以增强抗肿瘤免疫反应，但同样地，该发明也不能联合负载siRNA。另外，“一种高分子基因药物载体及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用”（公开号CN102512683A）使用环糊精羟丙基环糊精作为载体骨架，构建带正电荷的纳米颗粒负载能够抑制肿瘤血管内皮生长因子生成的siRNA进入肿瘤细胞；但是，该发明只用于基因治疗，不能用于纳米疫苗介导的免疫治疗。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种以性三嵌段共聚物为聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸的三嵌段聚合物同时负载肿瘤抗原、免疫佐剂和siRNA的复合型纳米疫苗，具体技术方案如下：

一种复合型纳米疫苗，包括以下组份：

肿瘤抗原：1-20重量份；

免疫佐剂：1-20重量份；

siRNA：大于0小于等于10重量份；

聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸的三嵌段聚合物：50-100重量份。

优选地，所述复合型纳米疫苗包括以下组份：

肿瘤抗原：10～20重量份；

免疫佐剂：1～10重量份；

siRNA：0.5-5重量份；

聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸的三嵌段聚合物：65～100重量份。

在其中一些实施例中，上述纳米疫苗中的所述聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸的三嵌段聚合物（PEG-PLys-PLeu）的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端与所述聚亮氨酸相连，所述聚乙二醇衍生物为单甲醚氨基聚乙二醇（CH₃O-PEG-NH₂）或者氨基聚乙二醇羧酸（NH₂-PEG-COOH），所述聚乙二醇衍生物分子量为1000-10000（更优选为1500-2500），所述聚赖氨酸的聚合度为10-100（更优选为20-50），所述聚亮氨酸的聚合度为10-100（更优选为20-50）。

在其中一些实施例中，上述纳米疫苗中的所述免疫佐剂为Toll样受体激动剂、NOD样受体激动剂、细胞因子、趋化因子或其组合。

在其中一些实施例中，上述纳米疫苗中的所述siRNA为化学合成的siRNA或载体表达的siRNA。

在其中一些实施例中，上述纳米疫苗中的所述肿瘤抗原为肿瘤组织细胞的蛋白抗原提取物或重组的蛋白/多肽抗原。

本发明还提供上述复合型纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：

（1）按重量份称取所述聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸的三嵌段聚合物，完全溶解于超纯水中，形成均一、透明的聚合物纳米胶束水溶液；

（2）按重量份称取所述肿瘤抗原，免疫佐剂，和siRNA，加入到所述聚合物纳米胶束水溶液中，充分混合均匀，室温条件下放置0.5-2小时，制成所需的复合型纳米疫苗。

本发明所述的复合型纳米疫苗可采用皮下注射、皮内注射、和肌肉注射等方法对机体进行免疫，用于肿瘤免疫治疗。

本发明具有如下有益效果：

本发明采用聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段聚合物溶于水后得到的聚多肽纳米胶束作为疫苗载体，联合负载肿瘤抗原、免疫佐剂和针对免疫抑制信号的siRNA，制备一种复合型抗肿瘤疫苗，解决了现有技术中纳米载体制剂稳定性差，生物相容性差，体内循环时间短，不能同时负载小分子药物、基因和蛋白质多种物质等问题。这种纳米疫苗将同时实现以下功能：1、通过纳米胶束负载抗原，提高抗原呈递细胞对抗原的摄取呈递，从而提高肿瘤疫苗的免疫效力；2、将siRNA高效地递送至TADCs，通过阻断其免疫抑制信号，打破免疫耐受；3、协同免疫佐剂（Toll样受体激动剂）诱导活化TADCs，从而进一步提高肿瘤疫苗的抗肿瘤作用。

另外，该疫苗所采用的聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段聚合物载体，具有生物相容性好，毒性低的优点，在生物体内可降解，降解产物无毒无害可吸收或代谢。其制备方法简便易行，稳定性良好，便于推广。

附图说明

图1是实施例2中，聚合物纳米胶束负载疏水性分子的结构图和示意图。

图2是实施例2中，复合型纳米疫苗的合成过程和产物结构示意图。

图3是实施例3中，复合型纳米疫苗促进DC对抗原和siRNA的摄取实验的检测结果。

图4是实施例4中，聚合物胶束负载siRNA和免疫佐剂对TADC中STAT3表达及磷酸化水平的影响实验的Western blot检测结果图。

图5是实施例5中，聚合物胶束负载siRNA和免疫佐剂协同诱导TADC活化实验的流式细胞术检测结果；其中，图5A为CD86在TADC上的表达水平；图5B为CD40在TADC上的表达水平。

图6是实施例6中，复合型纳米疫苗对小鼠肿瘤生长的抑制作用试验结果图；其中，图6A为肿瘤体积随时间（天数）变化图，图6B为小鼠存活率随时间变化图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明进行进一步的详细说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例是本发明所公开的复合型纳米疫苗所采用的聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段聚合物载体的制备过程。

该制备方法包括以下步骤：

（1）将聚合管抽真空后充氮气保护，取1g分子量为2000的CH₃O-PEG-NH₂，用20mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解后加入到聚合管内；

（2）按赖氨酸环状酸酐单体与CH₃O-PEG-NH₂的摩尔比为10：1的比例加入Lys-NCA单体，氮气保护下恒温反应24小时；

然后，按亮氨酸环状酸酐单体与CH₃O-PEG-NH₂的摩尔比为10：1的比例加入Leu-NCA单体，氮气保护下继续恒温反应24小时；

反应结束后，加入10倍的乙醚沉淀、过滤、干燥得到聚乙二醇-侧链保护的聚赖氨酸-聚亮氨酸（PEG-PLZ-PLeu）三嵌段聚合物；

（3）将以上所得PEG-PLZ-PLeu聚合物溶于0℃的三氟乙酸，加入2倍量的HBr体积含量为30%的HBr/HA_c反应2小时后，加入10倍的乙醚沉淀、过滤；

将所得产物溶解于N，N-二甲基甲酰胺，使用截留分子量为2000的透析袋在水中透析48小时，每2小时换透析水一次，随后冻干，得到聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸（PEG-PLys-PLeu）的三嵌段聚合物（PEG-PLL₃₀-PLLeu₄₀），平均分子量为2700。

聚赖氨酸链段聚合度为30，聚亮氨酸链段的聚合度为40。

实施例2

本实施例是用实施例1中所制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物、肿瘤抗原（OVA）、TLR3激动剂（PIC）、合成STAT3siRNA制备复合型纳米疫苗的过程，所得聚合物胶束在水溶液中的结构和复合型纳米疫苗的结构分别如图1和图2所示。

（1）称取实施例1制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物1mg，溶于1ml超纯水中，形成均一、透明的聚合物纳米胶束水溶液（图1）；

（2）将肿瘤抗原（OVA）、TLR3激动剂（PIC）、合成STAT3siRNA（5′-GGAAAUUUAACAUUCUGGGCACGAA-3′，SEQIDNO.1）与聚多肽纳米胶束水溶液进行混合振荡（OVA：PIC：siRNA：NPPEG-PLL₃₀-PLLeu₄₀=16：4：1：79，w/w）1小时，于室温下静置30分钟，获得复合型纳米疫苗（疫苗结构见图2）。

实施例3

本实施例是采用游离态或聚多肽纳米胶束包裹的siRNA-FAM的情况下，TADC对OVA及siRNA摄取量的对比实验，实验结果如图3所示。

一、实验步骤：

1、将PEG-PLL₃₀-PLLeu₄₀聚多肽纳米胶束水溶液（50μg/ml）与TLR3激动剂（PIC）,肿瘤抗原（OVA-Alexa555）和FAM标记的STAT3siRNA（SEQ IDNO.1）进行混合振荡，于室温下静置30分钟，获得聚多肽纳米胶束包裹的复合疫苗（OVA：PIC：siRNA：NPPEG-PLL₃₀-PLLeu₄₀=5：5：1：50，w/w），即NP/siRNA/OVA；

2、将游离siRNA-FAM、游离OVA-Alexa555或NP/siRNA/OVA与TADCs（tumour-associated dendritic cells，肿瘤相关树突细胞）共孵育2小时。用共聚焦显微镜检测TADC对siRNA和OVA的摄取。

二、实验结果：

与游离的OVA-Alexa555及游离FAM-siRNA相比，聚多肽纳米胶束显著提高TADC对OVA（红色荧光）及siRNA（绿色荧光）的摄取（图3）。

实施例4

本实施例是聚多肽纳米胶束包裹的STAT3siRNA对肿瘤相关树突状细胞（tumor-associated dendritic cells，TADCs）表达STAT3及其磷酸化水平的影响的实验，实验结果如图4所示。

一、实验步骤

1、将1mlPEG-PLL₃₀-PLLeu₄₀聚多肽纳米胶束水溶液(50μg/ml)与5μgTLR3激动剂（PIC）混合振荡，于室温下静置30分钟，获得聚多肽纳米胶束包裹PIC（PIC:NP=1:10)，即NP；

2、将1mlPEG-PLL₃₀-PLLeu₄₀聚多肽纳米胶束水溶液(50μg/ml)与5μgTLR3激动剂（PIC）和1μg合成STAT3 siRNA（SEQ ID NO.1）进行混合振荡，于室温下静置30分钟，获得聚多肽纳米胶束包裹PIC和STAT3 siRNA（PIC:siRNA:NP=5:1:50)，即NP/siRNA；

3、将TADCs与培养基（NS）、聚多肽纳米胶束包裹PIC（NP）、PIC、聚多肽纳米胶束包裹PIC和STAT3siRNA（SEQ ID NO.1）（NP/siRNA）共孵育48h，PIC和siRNA的终浓度分别为5μg/ml和100nM；

4、用Westernblot法检测TADC的STAT3蛋白水平和磷酸化水平，所得结果如图4所示。

二、实验结果

结果表明，聚多肽纳米胶束联合负载STAT3 siRNA和免疫佐剂PIC可显著降低STAT3及其磷酸化水平（图4）。

实施例5

本实施例是聚多肽纳米胶束包裹STAT3 siRNA和PIC协同活化TADCs的实验，实验结果如图5所示。

一、实验步骤

1、将1mlPEG-PLL₃₀-PLLeu₄₀聚多肽纳米胶束水溶液(50μg/ml)与5μg TLR3激动剂（PIC）混合振荡，于室温下静置30分钟，获得聚多肽纳米胶束包裹PIC（PIC:NP=1:10)，即NP；

2、将1mlPEG-PLL₃₀-PLLeu₄₀聚多肽纳米胶束水溶液(50μg/ml)与5μgTLR3激动剂（PIC）和1μg合成STAT3 siRNA进行混合振荡，于室温下静置30分钟，获得聚多肽纳米胶束包裹PIC和STAT3siRNA（PIC:siRNA:NP=5:1:50)，即NP/siRNA；

3、将1mlPEG-PLL₃₀-PLLeu₄₀聚多肽纳米胶束水溶液(50μg/ml)与5μg TLR3激动剂（PIC）和1μg合成对照siRNA（5′-GGAUUUCAAUUAGUCCGGCAAAGAA-3′，SEQ ID NO.2）进行混合振荡，于室温下静置30分钟，获得聚多肽纳米胶束包裹PIC和对照siRNA（PIC:siRNA:NP=5:1:50)，即NP/CNsiRNA；

4、将TADCs与X-vivo培养基（NS）、聚多肽纳米胶束包裹PIC（NP）、聚多肽纳米胶束包裹PIC和STAT3siRNA（NP/siRNA）、或聚多肽纳米胶束包裹PIC和对照siRNA（NP/CN siRNA）共孵育48h；

5、以流式细胞术检测共刺激分子CD40和CD86在TADC的表达。

二、实验结果

流式细胞术结果表明，聚多肽纳米胶束联合负载STAT3siRNA及免疫佐剂PIC可显著上调CD40和CD86的比例，诱导TADC活化（图5）。

实施例6

本实施例是聚多肽纳米胶束包裹抗原、STAT3 siRNA和PIC对小鼠肿瘤生长的抑制试验，实验结果如图6所示。以下NP/OVA、NP/siRNA/OVA、NP/CNsiRNA/OVA的制备方法如实施例4和5所述。

一、实验步骤

1、6-8周C57雌性小鼠于皮下接种B16黑色素瘤细胞（10⁵/只）

2、荷瘤小鼠于肿瘤接种后第7，14，和21天腹腔分别注射：

（1）PBS；

（2）抗原（OVA）；

（3）聚多肽纳米胶束包裹PIC和OVA（NP/OVA）；

（4）聚多肽纳米胶束包裹PIC、OVA和STAT3siRNA（NP/siRNA/OVA）；

（5）聚多肽纳米胶束包裹PIC、OVA和对照siRNA（NP/CNsiRNA/OVA）；

其中，PIC、OVA、siRNA、PEG-PLL₃₀-PLLeu₄₀（纳米颗粒）的剂量分别为10μg、20μg、5μg、100μg/只/剂。每组6-10只小鼠。

3、定期测量肿瘤的尺寸，计算小鼠的存活率。

二、实验结果

实验结果表明负载OVA抗原、STAT3 siRNA和PIC抗原的复合型疫苗显著抑制肿瘤生长（图6）。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种复合型纳米疫苗，其特征在于，其包括以下组份：

肿瘤抗原：1-20重量份；

免疫佐剂：1-20重量份；

siRNA：大于0小于等于10重量份；

2.根据权利要求1所述复合型纳米疫苗，其特征在于，包括以下组份：

肿瘤抗原：10～20重量份；

免疫佐剂：1～10重量份；

siRNA：0.5-5重量份；

3.根据权利要求1或2所述的复合型纳米疫苗，其特征在于，

所述聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸的三嵌段聚合物的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端与所述聚亮氨酸相连，所述聚乙二醇衍生物为单甲醚氨基聚乙二醇或氨基聚乙二醇羧酸，所述聚乙二醇衍生物分子量为1000-10000，所述聚赖氨酸的聚合度为10-100，所述聚亮氨酸的聚合度为10-100。

4.根据权利要求1或2中任一项所述的复合型纳米疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为Toll样受体激动剂、NOD样受体激动剂、细胞因子、趋化因子或其组合。

5.根据权利要求1或2中任一项所述的复合型纳米疫苗，其特征在于，所述siRNA为化学合成的siRNA或载体表达的siRNA。

6.根据权利要求1或2中任一项所述的复合型纳米疫苗，其特征在于，所述肿瘤抗原为肿瘤组织细胞的蛋白抗原提取物或重组的蛋白/多肽抗原。

7.一种权利要求1-6中任一项所述的复合型纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）按重量份称取所述肿瘤抗原、免疫佐剂和siRNA，加入到所述聚合物纳米胶束水溶液中，充分混合均匀，室温条件下放置0.5-2小时，制成所需的复合型纳米疫苗。