CN112057610A - 一种超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种超小纳米免疫增强剂‑抗原复合纳米粒子及其制备方法和应用。所述复合纳米粒子包括纳米材料、抗原;避免了自由抗原免疫原性弱所导致的无法达到理想肿瘤免疫效果的缺点并解决了目前转移性恶性肿瘤难以治疗的问题,达到了转移性恶性肿瘤的免疫治疗及预防的双重目的。
Description
技术领域
本申请涉及一种超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子及其制备方法和应用,属于材料制备方法及应用领域。
背景技术
根据世界卫生组织预测,2020年肿瘤新发病例将达到2000万,其中死亡病例1200万,肿瘤将成为新世纪人类的第一杀手。而恶性肿瘤具有严重的侵略性,容易发生局部或远端转移,尤其是肺部转移。现有的治疗方法对其几乎无效,导致许多恶性肿瘤患者死于肿瘤转移。对转移性恶性肿瘤的治疗及预防始终是肿瘤领域一大难点,肿瘤免疫治疗基于其优势使之成为可能有效的解决方法。
肿瘤免疫治疗通常通过调动宿主的防御机制或者借助生物制剂的作用,以调节机体的抗肿瘤免疫应答,从而杀伤或者抑制肿瘤生长的治疗方法。目前常用的肿瘤免疫治疗手段主要包括肿瘤疫苗,免疫检查点抑制剂,细胞治疗,细胞因子以及基因治疗等。肿瘤疫苗的研发倍受重视,是利用疫苗导致抗原提呈细胞成熟,并引发特异性抗肿瘤T细胞反应并产生记忆T细胞,从而消灭及预防肿瘤的一种治疗型与预防型疫苗。
纳米体系已用于靶向传递治疗性药物、纳米器件以及诊断治疗的分析体系。其中无机纳米材料具有优异的治疗及成像效果,但在众多已上市的纳米材料中,只有四氧化三铁纳米粒子被批准用于缺铁性贫血,加之具有磁共振成像、肿瘤铁凋亡、光热治疗、磁性过高热效果,故其在生物应用领域具有极大的发展空间。与四氧化三铁纳米粒子具有类似磁共振成像等生物应用的纳米材料还包括四氧化三猛、氧化钆纳米粒子。
发明内容
根据本申请的一个方面,提供了一种超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子及其制备方法,避免了自由抗原免疫原性弱所导致的无法达到理想肿瘤免疫效果的缺点并解决了目前转移性恶性肿瘤难以治疗问题,达到了转移性恶性肿瘤的免疫治疗及预防的双重目的。
一种超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子,所述超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子包括超小纳米材料、抗原;
其中,所述抗原位于超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子内侧;超小纳米材料堆积搭载于抗原外侧并将抗原包覆;
所述超小纳米材料具有羧基官能团;
所述超小纳米材料为金属磁性氧化纳米粒子。
所述超小纳米材料的作用是递送所述抗原并起到纳米免疫增强剂的作用。
可选地,所述超小纳米材料和抗原的质量比为1:50~400。
可选地,所述超小纳米材料和抗原的质量比为1:2~12。
可选地,所述超小纳米材料和抗原的质量比下限选自1:400、1:200、1:100或1:50;上限选自12:1、8:1、4:1、或2:1。
可选地,所述超小纳米材料选自超小单一组元以及多组元金属磁性氧化纳米粒子,所述超小纳米材料的粒径为1~10nm,其中金属为铁、锰、锌、镍、钆、钴等元素。
可选地,所述超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子的粒径为1~200nm。
可选地,所述抗原选自卵清蛋白、肿瘤蛋白。
所述卵清蛋白也即常用的肿瘤抗原蛋白质模型,当抗原为卵清蛋白时,通过诱导抗原提呈细胞成熟等一系列免疫应答来抵御表达卵清蛋白的肿瘤细胞的转移。此外,如果将该卵清蛋白换成任意其他肿瘤蛋白,则会引发机体对表达该特定蛋白的肿瘤细胞产生同样的抗肿瘤免疫应答。
本申请中,将超小金属磁性氧化纳米粒子与具有抗原特性的蛋白通过反应复合,制得包括超小氧化铁/氧化锰/氧化锌/氧化镍/氧化钆/氧化钴-抗原复合纳米粒子在内的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子。
本申请的另一方面,提供了所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子的制备方法,所述制备方法至少包括以下步骤:
(1)获得超小纳米材料;
(2)将含有超小纳米材料和抗原的混合物在4℃~100℃的条件下反应16h以上,得到所述超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子。
可选地,步骤(1)中所述超小纳米材料的制备方法为共沉淀法。
可选地,所述共沉淀法的温度为20℃~400℃,反应时间在0.5h以上。
可选地,所述共沉淀法制备得到超小单一组元以及多组元金属磁性氧化纳米粒子,其中金属为铁、锰、锌、镍、钆、钴元素中的至少一种。
可选的,所述金属磁性氧化纳米粒子的制备方法包括:将含有金属盐与沉淀剂和溶剂的混合物在20℃~400℃的条件下,反应时间在0.5h以上,得到所述金属磁性氧化纳米粒子;
所述金属盐选自金属的氯化物、硫酸盐、硝酸盐中的至少一种。
优选地,所述超小金属磁性氧化纳米粒子的制备方法包括:将含有金属盐包括氯化铁、氯化锰、氯化锌、氯化镍、氯化钆、氯化钴与沉淀剂和溶剂的混合物在20℃~400℃的条件下,反应时间在0.5h以上,得到所述超小金属磁性氧化纳米粒子。
可选地,所述氧化铁、氧化锰、氧化锌、氧化镍、氧化钆、氧化钴纳米粒子的制备方法包括共沉淀法。
可选地,所述氧化铁、氧化锰、氧化锌、氧化镍、氧化钆、氧化钴纳米粒子的制备温度为20℃~400℃,反应时间在0.5h以上。
本领域的技术人员可以根据上述制备条件,选择具体的反应温度和反应条件制备得超小氧化铁、氧化锰、氧化锌、氧化镍、氧化钆、氧化钴纳米粒子。
可选地,所述的用于制备超小氧化铁、氧化锰、氧化锌、氧化镍、氧化钆、氧化钴原料包括金属盐、正己烷、油醇以及十八烯酸。
可选地,所述氧化铁、氧化锰、氧化锌、氧化镍、氧化钆、氧化钴的制备方法,至少包括:将FeCl3·6H2O溶于去离子水中,随后加入油酸钠。正己烷以及乙醇混合液加入反应混合液中并加入至70℃保持4小时。反应结束后,通过分液漏斗获取最上方有机层(即油酸铁),并通过去离子水清洗三次。通过低速旋转蒸发去除正己烷,以获得油酸铁纳米颗粒。
通过油酸铁、油醇以及十八烯酸获取四氧化三铁纳米颗粒。将2g油酸铁复合物溶于油醇以及十八烯酸混合液中。经过氮气脱气后,在氮气保护下于300℃回流60分钟。溶液由棕色变为黑色。冷却至室温后,加入丙酮以稳定纳米颗粒,通过离心分离纳米颗粒并溶于环己烷中。
将聚马来酸酐十八醇酯以及甲氧基聚乙二醇以1:30摩尔比混合,加入几滴浓硫酸并在三氯甲烷中于61℃回流12h。溶液降至室温后,加入1M氢氧化钠中和原混合液中浓硫酸。离心后,获得的两亲性聚合物分散于三氯甲烷中,并逐滴地加入250mL乙醚中以获得聚合物沉淀,随之过滤,用乙醚清洗后冷冻干燥。
将溶于1mL环己烷中的四氧化三铁纳米粒子加入10mL三氯甲烷以及2mL上述所得两亲性聚合物(10mg/mL)三氯甲烷溶液中,室温搅拌12h后,加入10mL去离子水,并通过旋转蒸发去除三氯甲烷,最终获得水溶性的超小四氧化三铁纳米粒子。
可选地,所述的超小四氧化三铁纳米粒子通过原料反应后具有羧基官能团,用于制备超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子。
可选地,步骤(2)中所述反应条件为室温反应16~8小时。
可选地,步骤(2)中所述反应温度的上限选自5℃、室温或100℃;下限选自4℃或室温。所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子可以以反应生成物即超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子水溶液的形式装入试剂瓶中,放入-20℃~4℃的冰箱中保存待用;或者,将反应生成物进行冷冻干燥处理后,得到粉末状产物保存待用。
可选地,所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子的制备方法,包括:所述将超小氧化铁、氧化锰、氧化锌、氧化镍、氧化钆、氧化钴纳米粒子与具有抗原特性的蛋白(卵清蛋白、肿瘤蛋白)通过反应复合,制得超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子。
所述方法所制备的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子是一种具有针对转移性恶性肿瘤的治疗及预防双重性质的复合纳米材料,可用作肿瘤免疫治疗及预防的纳米材料。
作为一种具体的实施方式,所述超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子的制备方法,包括:
将获得的超小纳米材料活化,然后加入去离子水重悬,再加入抗原,反应,得到所述超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子。
具体的,所述超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子的制备方法,包括:取制备的超小氧化铁、氧化锰、氧化锌、氧化镍、氧化钆、氧化钴纳米粒子粉末溶于去离子水,加入EDC室温搅拌后,离心去除多余;加入去离子水重悬超小氧化铁、氧化锰、氧化锌、氧化镍、氧化钆、氧化钴纳米粒子,加入NHS以及卵清蛋白或肿瘤蛋白,室温反应16h,最终获得超小四氧化三铁、四氧化三猛、氧化钆-抗原卵清蛋白或肿瘤蛋白复合纳米粒子水溶液。
可选地,所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子在转移性恶性肿瘤的肿瘤免疫治疗及预防中的应用。
在所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子表面搭载不同的免疫佐剂,通过体内树突状细胞的摄取,能够增强肿瘤免疫效果。
本申请的又一方面,提供了一种肿瘤免疫治疗及预防的纳米材料,包含所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子和/或根据所述的方法制备得到的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子。
可选地,所述纳米材料为针对转移性恶性肿瘤的肿瘤免疫治疗及预防的纳米材料。
可选地,所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子和/或根据所述的方法制备得到的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子在转移性恶性肿瘤的肿瘤免疫治疗及预防材料中的应用。
本申请中,所有涉及数值范围的条件均可独立地选自所述数值范围内的任意中间范围。
本申请中,如无特别说明,所有涉及数值范围的条件均包含端点值。
本申请能产生的有益效果包括:
1)本发明所提供的超小纳米材料的制备方法简单,产物具有小尺寸效应、粒径分布均匀、水溶性好、生物相容性好等优点。
2)本发明所提供的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子的制备方法同样简便,产物粒径分布均匀、水溶性好、免疫原性好等优点,且能够实现转移性恶性肿瘤的肿瘤免疫治疗及预防。
3)本发明所提供的制备方法所制备的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子是一种复合纳米材料;卵清蛋白、肿瘤蛋白具有免疫原性性质,通过与超小纳米材料连接能在体内生理环境汇总保护其抗原不受降解及失活,提供肿瘤免疫治疗功能。基于超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子对转移性恶性肿瘤的肿瘤免疫治疗及预防可以实现高效、无创、低损伤、治疗性与预防性结合的医学治疗方法,在转移性恶性肿瘤等重大疾病的阶段成像及治疗中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为样品Fe1#的TEM图谱。
图2为样品Fe1#的X射线荧光显微镜成像;其中PBS、Fe3O4、Fe-O分别为不同样品,S元素代表细胞,Fe元素代表材料被细胞吞噬,Merge代表合并细胞与材料结果。
图3为样品Fe3#搭载率计算结果图。
图4为样品Fe6#搭载率计算结果图。
图5为超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子对转移性恶性肿瘤的肿瘤免疫治疗结果,表明超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子具有有效治疗转移性恶性肿瘤效果。
图6为超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子对转移性恶性肿瘤的肿瘤免疫预防结果,表明超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子几乎能完全预防恶性肿瘤的转移。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请,但本申请并不局限于这些实施例。
下面结合实施例详述本申请,但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明,本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
本申请的实施例中分析方法如下:
利用日本电子JEOL-2100F进行TEM分析。
利用上海同步辐射装置进行X射线荧光显微镜成像分析。
利用酶标仪进行二喹啉甲酸(BCA)检测。
所述卵清蛋白购自Sigma。
实施例1
首先制备四氧化三铁纳米粒子,将3.4g FeCl3·6H2O溶于12ml去离子水中,随后加入10.5g油酸钠,得到反应混合液。45ml正己烷以及25mL乙醇混合液加入反应混合液中并加入至70℃保持4小时。反应结束后,通过分液漏斗获取最上方有机层(即油酸铁),并通过去离子水清洗三次。通过低速旋转蒸发去除正己烷,以获得油酸铁纳米颗粒。
通过油酸铁、油醇以及十八烯酸获取四氧化三铁纳米颗粒。将2g油酸铁复合物溶于20ml油醇以及0.3ml十八烯酸混合液中。经过氮气脱气后,在氮气保护下于300℃回流60分钟。溶液由棕色变为黑色。冷却至室温后,加入丙酮以稳定纳米颗粒,通过离心分离纳米颗粒并溶于环己烷中。
将聚(马来酸酐-alt-1-十八碳烯)(购自Sigma公司,Mn=30000Da,后以及聚乙二醇甲醚(购自Sigma公司,Mn=550Da)以1:30摩尔比混合,加入几滴浓硫酸并在20mL三氯甲烷中于61℃回流12h。溶液降至室温后,加入1M氢氧化钠中和原混合液中浓硫酸。离心后,获得的两亲性聚合物分散于三氯甲烷中,并逐滴地加入250mL乙醚中以获得聚合物沉淀,随之过滤,用乙醚清洗后冷冻干燥。
将溶于1mL环己烷中的四氧化三铁纳米粒子加入10mL三氯甲烷以及2mL上述所得两亲性聚合物(10mg/mL)三氯甲烷溶液中,室温搅拌12h后,加入10mL去离子水,并通过旋转蒸发去除三氯甲烷,最终获得水溶性的超小四氧化三铁纳米粒子,记为样品Fe1#。
取4份制备的四氧化三铁纳米粒子粉末20μg溶于去离子水,加入10mg/mL EDC0.5mL室温搅拌30min后,3000Da超滤管3500g离心30min去除多余EDC;加入2mL去离子水重悬四氧化三铁纳米粒子,加入10mg/mL NHS 0.5mL以及分别加入10mg/mL卵清蛋白0.1、0.2、0.4、0.8mL,并补足去离子水0.9、0.8、0.6、0.2mL,室温反应16h,最终获得四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子水溶液。所得四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子记为样品Fe2#、Fe3#、Fe4#、Fe5#。
实施例2
首先制备四氧化三铁纳米粒子,将FeCl3·6H2O溶于去离子水中,随后加入油酸钠。正己烷以及乙醇混合液加入反应混合液中并加入至70℃保持4小时。反应结束后,通过分液漏斗获取最上方有机层(即油酸铁),并通过去离子水清洗三次。通过低速旋转蒸发去除正己烷,以获得油酸铁纳米颗粒。
通过油酸铁、油醇以及十八烯酸获取四氧化三铁纳米颗粒。将2g油酸铁复合物溶于油醇以及十八烯酸混合液中。经过氮气脱气后,在氮气保护下于300℃回流60分钟。溶液由棕色变为黑色。冷却至室温后,加入丙酮以稳定纳米颗粒,通过离心分离纳米颗粒并溶于环己烷中。
将聚马来酸酐十八醇酯以及甲氧基聚乙二醇以1:30摩尔比混合,加入几滴浓硫酸并在20mL三氯甲烷中于61℃回流12h。溶液降至室温后,加入1M氢氧化钠中和原混合液中浓硫酸。离心后,获得的两亲性聚合物分散于三氯甲烷中,并逐滴地加入250mL乙醚中以获得聚合物沉淀,随之过滤,用乙醚清洗后冷冻干燥。
将溶于1mL环己烷中的四氧化三铁纳米粒子加入10mL三氯甲烷以及2mL上述所得两亲性聚合物(10mg/mL)三氯甲烷溶液中,室温搅拌12h后,加入10mL去离子水,并通过旋转蒸发去除三氯甲烷,最终获得水溶性的超小四氧化三铁纳米粒子,记为样品Fe1#。
取4份制备的四氧化三铁纳米粒子粉末100μg溶于去离子水,加入10mg/mL EDC0.5mL室温搅拌30min后,3000Da超滤管3500g离心30min去除多余EDC;加入2mL去离子水重悬四氧化三铁纳米粒子,加入10mg/mL NHS 0.5mL以及分别加入2mg/mL卵清蛋白0.1、0.2、0.4、0.6mL,并补足去离子水0.9、0.8、0.6、0.4mL,室温反应16h,最终获得四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子水溶液。所得四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子记为样品Fe6#、Fe7#、Fe8#、Fe9#。
实施例3
首先制备四氧化三铁纳米粒子,用氮气净化20mL聚丙烯酸水溶液(Mw=1800,浓度为5mg/mL)60分钟用于除去氧气,再将溶液在100℃条件下加热回流。随后,向溶液中快速加入0.4mL氯化铁(500mM)以及500mM硫酸铁,并加入6mL氨水(28%),并继续保持100℃条件下磁力搅拌。1小时后,将溶液冷却至室温。获得超小四氧化三铁纳米粒子,并将其在超纯水环境中透析5天(截断分子量为6-8kDa)。随后将透析后的溶液进行超滤离心(截断分子量为10kDa),获得浓缩后的超小四氧化三铁纳米粒子,记为样品Fe10#。
随后,取4份制备的四氧化三铁纳米粒子粉末20μg溶于去离子水,加入10mg/mLEDC 0.5mL室温搅拌30min后,3000Da超滤管3500g离心30min去除多余EDC;加入2mL去离子水重悬四氧化三铁纳米粒子,加入10mg/mL NHS 0.5mL以及分别加入10mg/mL卵清蛋白0.1、0.2、0.4、0.8mL,并补足去离子水0.9、0.8、0.6、0.2mL,室温反应16h,最终获得四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子水溶液。所得四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子记为样品Fe11#、Fe12#、Fe13#、Fe14#。
实施例4
首先制备四氧化三铁纳米粒子,将FeCl3·6H2O溶于去离子水中,随后加入油酸钠。正己烷以及乙醇混合液加入反应混合液中并加入至70℃保持4小时。反应结束后,通过分液漏斗获取最上方有机层(即油酸铁),并通过去离子水清洗三次。通过低速旋转蒸发去除正己烷,以获得油酸铁纳米颗粒。
通过油酸铁、油醇以及十八烯酸获取四氧化三铁纳米颗粒。将2g油酸铁复合物溶于油醇以及十八烯酸混合液中。经过氮气脱气后,在氮气保护下于300℃回流60分钟。溶液由棕色变为黑色。冷却至室温后,加入丙酮以稳定纳米颗粒,通过离心分离纳米颗粒并溶于环己烷中。
将聚马来酸酐十八醇酯以及甲氧基聚乙二醇以1:30摩尔比混合,加入几滴浓硫酸并在20mL三氯甲烷中于61℃回流12h。溶液降至室温后,加入1M氢氧化钠中和原混合液中浓硫酸。离心后,获得的两亲性聚合物分散于三氯甲烷中,并逐滴地加入250mL乙醚中以获得聚合物沉淀,随之过滤,用乙醚清洗后冷冻干燥。
将溶于1mL环己烷中的四氧化三铁纳米粒子加入10mL三氯甲烷以及2mL上述所得两亲性聚合物(10mg/mL)三氯甲烷溶液中,室温搅拌12h后,加入10mL去离子水,并通过旋转蒸发去除三氯甲烷,最终获得水溶性的超小四氧化三铁纳米粒子,记为样品Fe1#。
取4份制备的四氧化三铁纳米粒子粉末100μg溶于去离子水,加入10mg/mL EDC0.5mL室温搅拌30min后,3000Da超滤管3500g离心30min去除多余EDC;加入2mL去离子水重悬四氧化三铁纳米粒子,加入10mg/mL NHS 0.5mL以及分别加入2mg/mL乳腺癌组织提取蛋白0.1、0.2、0.4、0.6mL,并补足去离子水0.9、0.8、0.6、0.4mL,室温反应16h,最终获得四氧化三铁-抗原肿瘤蛋白复合纳米粒子水溶液。所得四氧化三铁-抗原肿瘤蛋白复合纳米粒子记为样品Fe15#、Fe16#、Fe17#、Fe18#。
实施例5形貌测试
分别对样品Fe1#、Fe7#进行TEM表征,结果显示所述抗原位于功能化纳米材料-抗原复合纳米粒子内侧;超小四氧化三铁纳米粒子堆积搭载于抗原卵清蛋白外侧并将抗原包覆。超小四氧化三铁纳米粒子Fe1#的粒径在1~10nm之间,超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子样品Fe7#的粒径在1~200nm之间。
典型代表如样品Fe7#,其TEM照片如图1所示。
从图1中可以看出该复合纳米粒子粒径分布在40~100nm,其内侧为卵清蛋白,粒径分布在1~10nm的超小四氧化三铁纳米粒子堆积搭载于卵清蛋白外侧并将其包覆。
实施例6 X射线荧光分析
对样品Fe1#、Fe7#进行硬X射线分析,得到的X射线荧光显微镜成像,结果显示,样品Fe1#和Fe7#均存在Fe元素硬X射线吸收,表明其被细胞成功吞噬,有利于后续转移性恶性肿瘤的肿瘤治疗或预防实验的发展。
典型代表如样品Fe1#、Fe7#,其与小鼠树突状细胞共孵育的共聚焦显微镜成像如图2所示。
从图2中可以看出,样品Fe1#和Fe7#均存在Fe元素硬X射线吸收,且X射线荧光信号在细胞膜轮廓之内,表明大量超小四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子成功被小鼠树突状细胞吞噬,被吞噬的抗原卵清蛋白能引起后续的肿瘤免疫效应刺激树突状细胞,从而诱导激活T细胞介导的肿瘤免疫。
其余样品的测试结果与样品Fe7#的测试结果类似。
实施例7
实施例1与2中制备得到的超小四氧化三铁纳米粒子与抗原卵清蛋白室温反应16h后,3000Da超滤管3500g离心45min,获得复合纳米粒子,对其进行BCA蛋白浓度测定分析得知搭载卵清蛋白质量,从而能计算出已结合于超小四氧化三铁纳米粒子表面的抗原卵清蛋白。结果如图3与图4所示。
其中,所述搭载率的计算公式为:
搭载率=BCA测定的卵清蛋白质量/(BCA测定的卵清蛋白质量+超小四氧化三铁加入质量)×100%
从图中可以看出,抗原与纳米粒子的结合,可以通过BCA方法测定搭载上的抗原蛋白质量,即可计算出搭载于纳米粒子上的抗原量,从而证明抗原能与纳米粒子结合。
其他样品的测试结果与上述样品的测试结果类似。
实施例8
实施例1与2中制备得到的超小四氧化三铁纳米粒子与抗原卵清蛋白室温反应16h后,3000Da超滤管3500g离心45min,获得复合纳米粒子,对其进行转移性恶性肿瘤免疫治疗实验。
第0天,将50万4T1高转移性乳腺癌细胞通过尾静脉注射Balb/c小鼠,其能自主形成乳腺癌肺转移模型,分为5组,每组5只小鼠。第4、7、10天分别向小鼠皮下注射PBS、单独卵清蛋白、Fe1#、Fe3#、Fe7#(20ug卵清蛋白/只)。第13天,解剖小鼠,提取肺部组织,计数肿瘤结节数量代表肺转移程度。
第0天,将50万B16-OVA黑色素瘤细胞尾静脉注射C57BL/6小鼠,其能自主形成黑色素瘤肺转移模型,分为5组,每组5只小鼠。第4、7、10天分别向小鼠皮下注射PBS、单独卵清蛋白、Fe1#、Fe3#、Fe7#(20ug卵清蛋白/只)。第13天,解剖小鼠,提取肺部组织,计数肿瘤结节数量代表肺转移程度。结果如图5所示。在图5中,##代表该组与对照组相比较时P<0.01;**代表箭头所指两组相比较时P<0.01。
从图中可知,超小四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子Fe3#以及Fe7#均能高效治疗黑色素瘤肺转移,并且单独的超小四氧化三铁纳米粒子Fe1#也能对黑色素瘤肺转移具有有效治疗效果,体现出其明显的纳米免疫增强剂效果。
实施例9
实施例1与2中制备得到的超小四氧化三铁纳米粒子与抗原卵清蛋白室温反应16h后,3000Da超滤管3500g离心45min,获得复合纳米粒子,对其进行黑色素瘤肺转移免疫预防实验。
将Balb/c小鼠分为5组,每组5只,并在第0、4、8天,分别向小鼠皮下注射PBS、单独卵清蛋白、Fe1#、Fe3#、Fe7#(20ug卵清蛋白/只)。第12天,将50万4T1乳腺癌细胞通过尾静脉注射Balb/c小鼠,其能自主形成乳腺癌肺转移模型。第25天,解剖小鼠,提取肺部组织,计数肿瘤结节数量代表肺转移程度。
将C57BL/6小鼠分为5组,每组5只,并在第0、4、8天,分别向小鼠皮下注射PBS、单独卵清蛋白、Fe1#、Fe3#、Fe7#(20ug卵清蛋白/只)。第12天,将50万B16-OVA黑色素瘤细胞尾静脉注射C57BL/6小鼠,其能自主形成黑色素瘤肺转移模型。第25天,解剖小鼠,提取肺部组织,计数肿瘤结节数量代表肺转移程度。结果如图6所示。在图6中,##代表该组与对照组相比较时P<0.01;**代表箭头所指两组相比较时P<0.01。
从图中可知,超小四氧化三铁-抗原卵清蛋白复合纳米粒子Fe3#以及Fe7#均能高效预防黑色素瘤肺转移,其中样品Fe7#能完全预防小鼠黑色素瘤肺转移情况,单独的超小四氧化三铁纳米粒子Fe1#对黑色素瘤肺转移不具有预防效果。
以上所述,仅是本申请的几个实施例,并非对本申请做任何形式的限制,虽然本申请以较佳实施例揭示如上,然而并非用以限制本申请,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本申请技术方案的范围内,利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例,均属于技术方案范围内。
Claims (10)
1.一种超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子,其特征在于,所述超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子包括超小纳米材料、抗原;
其中,所述抗原位于超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子内侧;超小纳米材料堆积搭载于抗原外侧并将抗原包覆;
所述超小纳米材料具有羧基官能团;
所述超小纳米材料为金属磁性氧化纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子,其特征在于,所述金属磁性氧化纳米粒子为单一组元或多组元金属磁性氧化纳米粒子,其中的金属为铁、锰、锌、镍、钆或钴元素中的至少一种;
所述抗原选自卵清蛋白、肿瘤蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子,其特征在于,所述超小纳米材料与抗原的质量比为1:2~400;
优选地,所述超小纳米材料与抗原的质量比为1:50~400;
优选地,所述超小纳米材料与抗原的质量比为1:2~12;
优选地,所述超小纳米材料的粒径为1~10nm;
优选地,所述超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子的粒径为1~200nm。
4.权利要求1至3任一项所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述制备方法至少包括以下步骤:
(1)获得超小纳米材料;
(2)将含有超小纳米材料与抗原的混合物在4℃~100℃的条件下反应16h以上,得到所述超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述超小纳米材料的制备方法为共沉淀法。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述共沉淀法的温度为20℃~400℃,反应时间在0.5h以上;
优选地,所述共沉淀法制备得到超小单一组元以及多组元金属磁性氧化纳米粒子,其中金属为铁、锰、锌、镍、钆、钴元素中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述金属磁性氧化纳米粒子的制备方法包括:将含有金属盐与沉淀剂和溶剂的混合物在20℃~400℃的条件下,反应时间在0.5h以上,得到所述金属磁性氧化纳米粒子;
所述金属盐选自金属的氯化物、硫酸盐、硝酸盐中的至少一种。
8.一种肿瘤免疫治疗的纳米材料,其特征在于,包含权利要求1至3任一项所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子和/或根据权利要求4至7任一项所述的制备方法制备得到的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子。
9.权利要求1至3任一项所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子和/或根据权利要求4至7任一项所述的制备方法制备得到的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子在转移性恶性肿瘤治疗材料中的应用。
10.权利要求1至3任一项所述的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子和/或根据权利要求4至7任一项所述的方法制备得到的超小纳米免疫增强剂-抗原复合纳米粒子在转移性恶性肿瘤预防材料中的应用。
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